紅葉石楠離體葉片體細胞胚誘導快繁培養方法

2023-10-08 06:56:39 2

專利名稱：紅葉石楠離體葉片體細胞胚誘導快繁培養方法
技術領域：
本發明涉及一種紅葉石楠離體葉片體細胞胚誘導快繁培養方法，屬於植物學領 域。
背景技術：
紅葉石楠iPhotinia χ frasery)是光葉石楠(P. glabra)和石楠(P. serrulata) 的雜交種，屬於薔薇科石楠屬常綠闊葉小喬木或多枝叢生灌木，其廣泛分布於日本、美國 及歐洲等地，因其新梢和嫩葉鮮豔如火，亮麗持久，修剪後萌芽力強，株形緊湊，在園林景 觀中常用做高檔色帶；或培育成獨幹、球形樹冠，在綠地中孤植；或作行道樹；或盆栽後布 置於門廊或室內，效果均佳，其為一種觀賞價值極高的園林植物。自上世紀九十年代紅葉石楠被引入我國以來，其就被列為具有較高開發價值的彩 葉樹種，但紅葉石楠與我國許多原產樹種相比，在我國種源稀少，至今未見有結實的報導， 而從國外引入的優良品種也因長期扦插繁殖，易感染葉斑病等真菌性病害，春夏季其又易 受蚜蟲危害，其病毒嚴重，葉片花斑易脫落，觀賞性下降，良種化程度降低；而劣質種苗的使 用又導致紅葉石楠固有的優良特性日益喪失，這在一定程度上約束了該樹種的發展和推廣 應用，因此，選擇、繁育優良紅葉石楠品系成為一個十分突出的生產問題，組培快繁是紅 葉石楠良種產業化的一種有效途徑，相關方面的報導也較多，但有關紅葉石楠葉片直接誘 導體細胞胚及再生快繁系統的技術研究未見有成功的報導。

發明內容
為了克服現有技術的不足，本發明的目的在於提供一種取材方便但種子繁殖困難 的優良紅葉石楠株系葉片直接誘導體胚的形成並獲得再生植株的紅葉石楠離體葉片體細 胞胚誘導快繁培養方法，以及利用胚狀體再生植株葉片誘導體胚和不定芽的形成或直接誘 導不定芽的形成獲得高頻再生植株，以解決優良種苗種質退化的問題，為生產上提供量大 質優、提純復壯的脫毒紅葉石楠苗木；
本發明的另一目的是提供一種為紅葉石楠遺傳轉化或誘變育種選育新品種提供一個 理想的受體系統。為了實現上述發明目的，本發明是通過以下技術方案來實現的 一種紅葉石楠離體葉片體細胞胚誘導快繁培養方法，包括以下步驟 (1)建立紅葉石楠無菌試管苗再生體系
(1. 1)選材與材料處理於春季晴天上午選取生長健壯、性狀表現優良的單株，用 5%多菌靈噴灑選取的枝條，每周噴灑一次，連續噴灑一個月，之後剪取剛萌發的無病蟲 嫩枝，包括前端未木質化和半木質化部分，除去多餘的莖葉，將需要部分用洗潔精溶液 浸泡5-lOmin，然後用棉球仔細清洗後，再用流水衝洗1小時，最後用2%NaC10溶液浸泡 15-20min,再用無菌水衝洗乾淨，用滅菌濾紙吸乾水分後備用；
(1. 2)選材消毒與芽啟動萌發培養將步驟(1. 1)所述的處理過的材料置於超淨工作
5臺上，用75%的酒精消毒15-20s，無菌水衝洗5-6次，再用0. 1 %升汞滅菌8-15min，無菌 水衝洗6—8次，用滅菌濾紙吸乾水分，然後剪取l-2cm左右帶一個腋芽或頂芽的莖段，以生 態學下段垂直插入芽啟動培養基上，每瓶接種3個外植體，誘導頂芽和腋芽萌發，在培養室 溫度白天25士2°C，夜晚20士2°C，光照強度1500—2000 lx，光照時間14 h / d的條件下， 進行15-20d的培養，莖段腋芽開始萌動，莖尖明顯伸長，40-50d後芽點長成2-4cm的新梢， 形成無菌試管苗；
(1. 3)無菌試管苗增殖培養將步驟(1. 2)誘導出的無菌試管苗去掉基部葉片，切成含 1-2個腋芽的莖段或莖尖接種在試管苗增殖培養基上，2518d後繼代1次，通過上述試管苗 增殖培養基的NAA濃度在0. 1 0. SmgL-1的可控範圍內調整變化，獲得大量無菌試管苗，建 立起紅葉石楠無菌試管苗再生體系；
(2)建立離體葉片體胚和不定芽誘導的高頻快繁體系
(2. 1)誘導體胚和不定芽的形成以試管苗第3到第6片展開葉為外植體，葉片帶短葉 柄，將葉片周圍帶鋸齒狀葉緣切去，之後做以下處理一、葉片沿主脈切成左右兩半，視葉片 大小輕劃1-2刀；二、葉片沿主脈橫切2-3刀，分別接種在第一誘導體胚和/或不定芽形成 培養基、第二誘導體胚和/或不定芽形成培養基和第三誘導體胚和/或不定芽形成培養基 上，要求外植體葉背朝下緊貼各自的培養基放置，於黑暗培養7-10d，誘導體胚的形成，於黑 暗培養15-20d，誘導不定芽的形成；
(2. 2)體胚和不定芽的生長與分化將第一誘導體胚和/或不定芽形成培養基和第二 誘導體胚和/或不定芽形成培養基上培養的外植體轉接到第一體胚和/或不定芽生長與 分化培養基上，然後放入人工氣候箱，溫度為10士2°C時，暗培養3-5d之後轉入培養室暗培 養35-40d，或直接在培養室暗培養40-45d，中間繼代一次；而將第三誘導體胚和/或不定芽 形成培養基上的外植體轉接到第二體胚和/或不定芽生長與分化培養基上，在培養室培養 40-45d，中間繼代一次，光照強度1000— 15001x，經過上述第一體胚和/或不定芽生長與分 化培養基和第二體胚和/或不定芽生長與分化培養的培養，在外植體上形成許多叢生芽， 芽高在2cm 5cm ；
(2. 3)叢生芽增殖快繁培養將上述步驟(2. 2)誘導形成的叢生芽切成含1-2個腋芽的 莖段或莖尖轉接到試管苗增殖培養基或第二體胚和/或不定芽生長與分化培養基上交替 繼代，進行增殖快繁培養，每18-22d繼代一次，增殖頻率為10-15 ；
(3)試管苗生根煉苗移栽
(3.1)壯苗生根培養
將上述步驟(2. 3)生長發育健壯的長到3-4cm後的叢生芽切成單株轉接到壯苗生根培 養基上，培養25-35d，保證莖葉發育正常，根系生長健壯，根長至1. 5cm以上時，進行煉苗移 栽；
(3. 2)煉苗移栽
首先將試管苗瓶蓋打開，在培養室適應Id後移到遮光度70-80%的遮蔭網塑料大棚， 在溫室條件下煉苗2-3d，用鑷子將苗夾出，清水洗去基部殘留的培養基，移栽到裝有混合 育苗基質的穴盤中，利用間歇噴霧裝置或人工噴水保持相對溼度在80%以上，經馴化煉苗 5-10d後，在新根新芽萌出後，逐漸減少澆水次數並移栽到花盆進行常規管理；
所述的芽啟動培養基為改良MS + 0. 5 1. 0 Higr1BA + 0. 5 1. OmgL^1KT + 0. 1 0. 2mgL"1NAA + 6. 0 7. OgL"1 瓊脂 + 3(^171 蔗糖，且 pH 值為 5. 8 6. 0 ；
所述的試管苗增殖培養基為改良MS + 1. 0 2. OmgL-1BA + 1. 0 2. OmgL^KT +
0.1 0. 5mgL,AA + 6. 0 7. OgL"1 瓊脂 + 30gL_1 蔗糖，且 pH 值為 5. 8 6. 0 ；
所述的第一誘導體胚和/或不定芽形成培養基為改良MS + 0. SmgL-^, 4-D + 0. 5
1.OmgL-1BA + 0. 5 2. OmgL-1NAA + 3. 0 3. 5gL、hytagel + 20gL_1 蔗糖，且 pH 值為
5.8 6. 0 ；
所述的第二誘導體胚和/或不定芽形成培養基為改良MS + 0. ImgL-^, 4-D + 0. 5mgL_1BA + 10 30 mgl^NM + 3. 0 3. SgI^phytagel + 2(^171 蔗糖，且pH值為 5. 8
6.0 ；
所述的第三誘導體胚和/或不定芽形成培養基為改良MS + 2.0 4. OmgI/1 NAA + 0. 2 0. 5mgL_12, 4-D + 0· 5 2. OmgL-1BA+ 0· 5 2· 0 mgl^KT+ 6· 0 7. OgL-1 瓊月旨 + SOgL-1蔗糖，且pH值為5. 8 6. 0 ；
所述的第一體胚和/或不定芽生長與分化培養基為改良MS + 2.0 4. Omg L^1BA + 3. 0 3. SgL-1Phytagel + 20gL_1 蔗糖，且 pH 值為 5. 8 6. 0 ；
所述的第二體胚和/或不定芽生長與分化培養基為改良MS + 2. OmgL-1 BA + 1.0 mgL-1 IBA + 2.0 mgL-1 KT + 6. 0 7. OgL"1 瓊脂 + 30gL_1 蔗糖，且 pH 值為 5. 8 6. 0 ；
所述的壯苗生根培養基為1/2改良MS + 0. 2 0. 5mgL_1 IBA + 0 0. 05mgL_1NAA + 6. 0 7. OgL"1瓊脂+ 20§υ'蔗糖，且pH值為5. 8 6. 0。上述的改良MS包括常量營養元素、微量營養元素和有機試劑。其中，常量營養元素的組分和其對應的濃度如下
硝酸鉀 硫酸銨 七水硫酸鎂 二水氯化鈣 無水磷酸二氫鉀 乙二胺四乙酸二鈉 七水硫酸亞鐵
1900 mg/L ； 1650 mg/L ； 370mg/L ； 440 mg/L ； 170 mg/L ； 37. 3 mg/L ； 27. 8 mg/L。 微量營養元素的組分和其對應的濃度如下
四水硫酸錳
硫酸鋅
硼酸
碘化鉀
鉬酸鈉
硫酸銅
氯化鈷
22. 3 mg/L ； 8. 6 mg/L ； 6. 2 mg/L ； 0.83 mg/L ； 0.25 mg/L ； 0.025 mg/L ； 0.025 mg/L。 有機試劑的組分和其對應的濃度如下 鹽酸硫胺素 10. 0 mg/L ； 煙酸1. 0 mg/L ；
鹽酸吡哆醇 1. Omg/L ；
7肌醇100. 0 mg/L。而上述的混合育苗基質的成分以體積比計為蛭石草炭土 園土 = 3 5 :2。本發明的有益效果是本發明所述的紅葉石楠離體葉片體細胞胚誘導快繁培養方 法通過選擇適宜外植體、改良基本培養基及成分、調整培養條件等配套措施，使得植株移栽 成活率可達到95%以上，種苗生長健壯，可有效解決優良種苗種質退化問題，也可為生產上 提供大量優質提純復壯的脫毒紅葉石楠苗木，此外，還可為紅葉石楠遺傳轉化或誘變育種 選育新品種提供一個理想的受體體系。


圖1為本發明所述的增值培養的試管苗；
圖2為本發明所述的紅葉石楠的葉片在不同時期的體細胞胚； 圖3為本發明所述的紅葉石楠的葉片體胚形成的不定芽； 圖4為本發明所述的紅葉石楠的葉片直接形成的不定芽； 圖5為本發明所述的增殖快繁形成的叢生芽； 圖6為本發明所述的經過生根培養及煉苗後的試管苗； 圖7為本發明所述的經過移栽長成的植株。
具體實施例方式下面將結合附圖和具體實施例，詳細說明本發明的
具體實施例方式
圖1為本發明所述的增值培養的試管苗；圖2為本發明所述的紅葉石楠的葉片在不同 時期的體細胞胚；圖3為本發明所述的紅葉石楠的葉片體胚形成的不定芽；圖4為本發明 所述的紅葉石楠的葉片直接形成的不定牙；圖5為本發明所述的增殖快繁形成的叢生芽； 圖6為本發明所述的經過生根培養及煉苗後的試管苗；圖7為本發明所述的經過移栽長成 的植株。如圖1-圖7所示 實施例1
紅葉石楠離體葉片體細胞胚誘導快繁培養方法，包括以下步驟 (1)建立紅葉石楠無菌試管苗再生體系
(1. 1)選材與材料處理於春季晴天上午選取生長健壯、性狀表現優良的單株，用5%多 菌靈噴灑選取的枝條，每周噴灑一次，連續噴灑一個月，之後剪取剛萌發的無病蟲嫩枝，包 括前端未木質化和半木質化部分，除去多餘的莖葉，將需要部分用洗潔精溶液浸泡5min，然 後用棉球仔細清洗後，再用流水衝洗1小時，最後用2%Na(nO溶液浸泡15min，再用無菌水 衝洗乾淨，用滅菌濾紙吸乾水分後備用；
(1. 2)選材消毒與芽啟動萌發培養將步驟(1. 1)所述的處理過的材料置於超淨工作 臺上，用75%的酒精消毒15s，無菌水衝洗5次，再用0. 升汞滅菌8min，無菌水衝洗6 次，用滅菌濾紙吸乾水分，然後剪取Icm左右帶一個腋芽或頂芽的莖段，以生態學下段垂直 插入芽啟動培養基上，芽啟動培養基為改良MS + 0. Smgr1BA + 0. SmgL^1KT + 0. ImgL^1NAA + 6. OgL-1瓊脂+ SOgL-1蔗糖，且pH值為5. 8，每瓶接種3個外植體，誘導頂芽和腋芽萌發， 在培養室溫度白天25士2°C，夜晚20士2°C，光照強度1500— 2000 lx，光照時間14 h / d的條件下，進行15d的培養，莖段腋芽開始萌動，莖尖明顯伸長，40d左右芽點長成2cm左右 的新梢，形成無菌試管苗；
(1. 3)無菌試管苗增殖培養將步驟(1. 2)誘導出的無菌試管苗去掉基部葉片，切成 含1-2個腋芽的莖段或莖尖接種在試管苗增殖培養基上，試管苗增殖培養基為改良MS + 1. OmgL-1BA + 1. OmgL-1KT + 0. 1 0. 5mgL_1NAA + 6. OgL-1 瓊脂 + 30gL_1 蔗糖，且 pH 值 為5. 8，一般莖基部有少量愈傷產生並從愈傷處長出2-3個小芽，25天繼代1次，通過上述 試管苗增殖培養基的NAA濃度在0. 1 0. SmgL-1的可控範圍內調整變化，且通過莖基部芽 叢不斷切割繁殖，可獲得大量無菌試管苗，建立起紅葉石楠無菌試管苗再生體系； (2)建立離體葉片體胚和不定芽誘導的高頻快繁體系
以試管苗第3到第6片展開葉為外植體，葉片帶短葉柄，將葉片周圍帶鋸齒狀葉緣切 去，葉片沿主脈切成左右兩半，在葉片上輕劃1刀，葉背朝下緊貼培養基放置，接種在第一 誘導體胚和/或不定芽形成培養基內，其中第一誘導體胚和/或不定芽形成培養基為改良 MS + 0. 5mgL_12, 4-D + 0. 5mgL_1BA + 1. OmgL-1NAA + 3. OgL^phytagel + 20gL_1 蔗糖，且 PH值為5. 8，於黑暗培養10d，誘導體胚的形成；
將上述外植體轉接到第一體胚和/或不定芽生長及分化培養基內，第一體胚和/或不 定芽生長及分化培養基為改良MS+ 2. Omg^1BA + 3. SgL^phytagel + 2(^171蔗糖，PH值 5. 8，在培養室暗培養40d，中間繼代一次，IOd左右就可在體視顯微鏡下看到體細胞胚，發 育時期可從球形胚、心形胚到魚雷胚，35d左右芽高2-3cm左右；
將上述步驟誘導形成的芽苗切成含1-2個腋芽的莖段或莖尖轉接到MS + 1. OmgL-1BA + 1. OmgL^1KT + 0. ImgL^1NAA + 6. SgL4 瓊脂 + 3(^171 蔗糖的培養基上，或MS + 2. OmgL^1BA + 1. Omg^1IBA + 2. OmgLlT + 6. SgL—1 瓊脂 + 3(^171 蔗糖的培養基上，pH 值 5. 8，兩培養 基交替繼代進行，每20d繼代一次，增殖頻率平均達12，增殖係數較單獨使用試管苗增殖培 養提高3倍以上。(3)試管苗生根煉苗移栽 (3.1)壯苗生根培養
將上述生長發育健壯的叢芽長到4cm時切成單株轉接到壯苗生根培養基上，培養25d， 保證莖葉發育正常，根系生長健壯，根長至1. 5-2. 5cm並有2-3條側根時，即可煉苗移栽。(3. 2)煉苗移栽
首先將試管苗瓶蓋打開，在培養室適應ld，之後移到遮光度70-80%的遮蔭網塑料大棚 溫室條件下煉苗2-3d，用鑷子將苗夾出，清水洗去基部殘留的培養基，移栽到裝有混合育苗 基質的穴盤中，利用間歇噴霧裝置或人工噴水保持相對溼度在80%以上，經馴化煉苗5-10d 後，待新根新芽萌出逐漸減少澆水次數並移栽到花盆進行常規管理。穴盤或花盆混合育苗基質的成分以體積比計為蛭石草炭土 園土 =3 5 :2。 實施例2
紅葉石楠離體葉片體細胞胚誘導快繁培養方法，包括以下步驟 (1)建立紅葉石楠無菌試管苗再生體系
(1. 1)選材與材料處理於春季晴天上午選取生長健壯、性狀表現優良的單株，用5%多 菌靈噴灑選取的枝條，每周噴灑一次，連續噴灑一個月，之後剪取剛萌發的無病蟲嫩枝，包括前端未木質化和半木質化部分，除去多餘的莖葉，將需要部分用洗潔精溶液浸泡lOmin， 然後用棉球仔細清洗後，再用流水衝洗1小時，最後用2%NaC10溶液浸泡15min，再用無菌 水衝洗乾淨，用滅菌濾紙吸乾水分後備用；
(1. 2)選材消毒與芽啟動萌發培養將步驟(1. 1)所述的處理過的材料置於超淨工作 臺上，用75%的酒精消毒20s，無菌水衝洗6次，再用0. 升汞滅菌15min，無菌水衝洗8 次，用滅菌濾紙吸乾水分，然後剪取2cm左右帶一個腋芽或頂芽的莖段，以生態學下段垂直 插入芽啟動培養基上，芽啟動培養基為改良MS + 1. Omgr1BA + 0. SmgL^1KT + 0. 2mgL"1NAA + 6. ^L-1瓊脂+ SOgL-1蔗糖，且pH值為5. 8，每瓶接種3個外植體，誘導頂芽和腋芽萌發， 在培養室溫度白天25士2°C，夜晚20士2°C，光照強度1500— 2000 lx，光照時間14 h / d 的條件下，進行15d的培養，莖段腋芽開始萌動，莖尖明顯伸長，45d左右芽點長成3cm左右 的新梢，形成無菌試管苗；
(1. 3)無菌試管苗增殖培養將步驟(1. 2)誘導出的無菌試管苗去掉基部葉片，切成 含1-2個腋芽的莖段或莖尖接種在試管苗增殖培養基上，試管苗增殖培養基為改良MS + LOmgr1BA + 2. OmgL^1KT + 0. 1 0. SmgL-1NM + e.SgL-1 瓊月旨 + 3(^171 蔗糖，且 pH值為 6. 0，一般莖基部有較多愈傷產生並從愈傷處長出3-4個小芽二8天繼代1次，通過上述試管 苗增殖培養基的NAA生長素的濃度在0. 1 0. SmgL-1的控制範圍內調整變化，且通過莖基 部芽叢不斷切割繁殖，可獲得大量無菌試管苗，建立起紅葉石楠無菌試管苗再生體系；
(2)建立離體葉片體胚和不定芽誘導的高頻快繁體系
以試管苗第3到第6片展開葉為外植體，葉片帶短葉柄，將葉片周圍帶鋸齒狀葉緣切 去，葉片沿主脈橫切2刀，葉背朝下緊貼培養基放置，接種在第二誘導體胚和/或不定芽 形成培養基內，其中第二誘導體胚和/或不定芽形成培養基為改良MS + 0. ImgL-^, 4-D + 0. SmgL^BA +IOmgL-1NAA + 3. SgL^phytagel + 2(^171 蔗糖，且 pH 值為 5. 8，於黑暗培養 7d，誘導體胚的形成；
將上述外植體轉接到改良MS + 2. Omg^1BA + 3. SgL^phytagel + 2(^171蔗糖的培養 基上，PH值為5. 8，將其放入人工氣候箱，溫度為10°C暗培養5d，之後轉入培養室暗培養 35d，中間繼代一次，20d左右就可觀察到魚雷胚或子葉胚或由其萌發形成的叢生芽，35d左 右芽高3-4cm左右；
將上述步驟誘導形成的芽苗切成含1-2個腋芽的莖段或莖尖轉接到MS + 1. OmgL-1BA + 1. OmgL^1KT + 0. ImgL^1NAA + 6. SgL4 瓊脂 + 3(^171 蔗糖的培養基上，或MS + 2. OmgL^1BA + 1. Omg^1IBA + 2. OmgLlT + 6. SgL—1 瓊脂 + 3(^171 蔗糖的培養基上，pH 值 5. 8，兩培養 基交替繼代進行，每20d繼代一次，增殖頻率平均達15，增殖係數較單獨使用試管苗增殖培 養提高3倍以上；
(3)試管苗生根煉苗移栽
(3.1)壯苗生根培養
將上述生長發育健壯的叢芽長到4cm切成單株轉接到壯苗生根培養基上，培養30d，保 證莖葉發育正常，根系生長健壯，根長至1. 5cm以上並有3-4條側根時，即可煉苗移栽；
(3. 2)煉苗移栽
首先將試管苗瓶蓋打開，在培養室適應ld，之後移到遮光度70-80%的遮蔭網塑料大棚 溫室條件下煉苗2-3d，用鑷子將苗夾出，清水洗去基部殘留的培養基，移栽到裝有混合育苗
10基質的穴盤中，利用間歇噴霧裝置或人工噴水保持相對溼度在80%以上，經馴化煉苗5-10d 後，待新根新芽萌出逐漸減少澆水次數並移栽到花盆進行常規管理。穴盤或花盆混合育苗基質的成分以體積比計為蛭石草炭土 園土 =3 5 :2。實施例3
紅葉石楠離體葉片體細胞胚誘導快繁培養方法，包括以下步驟
(1)建立紅葉石楠無菌試管苗再生體系
(1. 1)選材與材料處理於春季晴天上午選取生長健壯、性狀表現優良的單株，用5%多 菌靈噴灑選取的枝條，每周噴灑一次，連續噴灑一個月，之後剪取剛萌發的無病蟲嫩枝，包 括前端未木質化和半木質化部分，除去多餘的莖葉，將需要部分用洗潔精溶液浸泡5min，然 後用棉球仔細清洗後，再用流水衝洗1小時，最後用2%Na(nO溶液浸泡20min，再用無菌水 衝洗乾淨，用滅菌濾紙吸乾水分後備用；
(1. 2)選材消毒與芽啟動萌發培養將步驟(1. 1)所述的處理過的材料置於超淨工作 臺上，用75%的酒精消毒15s，無菌水衝洗6次，再用0. 1 %升汞滅菌15min，無菌水衝洗8 次，用滅菌濾紙吸乾水分，然後剪取2cm左右帶一個腋芽或頂芽的莖段，以生態學下段垂直 插入芽啟動培養基上，芽啟動培養基為改良MS + 0. Smgr1BA + 1. OmgL^KT + 0. ImgL^1NAA + 7. OgL-1瓊脂+ SOgL-1蔗糖，且pH值為5. 8，每瓶接種3個外植體，誘導頂芽和腋芽萌發， 在培養室溫度白天25士2°C，夜晚20士2°C，光照強度1500— 2000 lx，光照時間14 h / d 的條件下，進行20d的培養，莖段腋芽開始萌動，莖尖明顯伸長，50d左右芽點長成4cm左右 的新梢，形成無菌試管苗；
(1. 3)無菌試管苗增殖培養將步驟(1. 2)誘導出的無菌試管苗去掉基部葉片，切成 含1-2個腋芽的莖段或莖尖接種在試管苗增殖培養基上，試管苗增殖培養基為改良MS + 2. OmgL^1BA + 2. OmgL^1KT + 0. 1 0. SmgL-1NM + 7. OgL-1 瓊月旨 + 3(^171 蔗糖，且 pH值為 5. 9，一般莖基部有較多愈傷產生並從愈傷處長出4. 5個小芽二8天繼代1次，通過上述試管 苗增殖培養基的NAA生長素的濃度在0. 1 0. SmgL-1控制範圍內的調整變化，且通過莖基 部芽叢不斷切割繁殖，可獲得大量無菌試管苗，建立起紅葉石楠無菌試管苗再生體系；
(2)建立離體葉片體胚和不定芽誘導的高頻快繁體系
以試管苗第3到第6片展開葉為外植體，葉片帶短葉柄，將葉片周圍帶鋸齒狀葉緣切 去，葉片沿主脈橫切3刀，葉背朝下緊貼誘導培養基放置，接種在MS + 2.0 Higr1NAA + 0.5 mgL"^, 4-D + 0. Smg^1BA + 6. SgL—1 瓊脂 + 3(^171 蔗糖的培養基上，pH值 5. 8，暗培養 15d， 誘導不定芽的形成；
將上述外植體轉接到 MS + 2. OmgL4BA + 1. OmgL^1IBA + 2. OmgL4KT + 6. 5gL-1 瓊月旨 + SOgL-1蔗糖的培養基上，pH值5. 9，在培養室光培養40d，中間繼代一次，光照強度1000— 15001x。經過上述培養，外植體上可形成許多叢生芽，芽高可從2cm到5cm都有；
將上述步驟誘導形成的芽苗切成含1-2個腋芽的莖段或莖尖轉接到MS + 1. OmgL-1BA + 1. OmgL^1KT + 0. ImgL^1NAA + 6. SgL4 瓊脂 + 3(^171 蔗糖的培養基上，或MS + 2. OmgL^1BA + IBA 1. OmgL"1 + 2. OmgL4KT + 6. SgL—1 瓊脂 + 3(^171 蔗糖的培養基上， !1值5.8，兩培 養基交替繼代進行，每20d繼代一次，增殖頻率平均達10，增殖係數較單獨使用試管苗增殖 培養提高2倍以上；
(3)試管苗生根煉苗移栽(3.1)壯苗生根培養
將上述生長發育健壯的叢芽長到3cm切成單株轉接到壯苗生根培養基上，培養35d，保 證莖葉發育正常，根系生長健壯，根長至1. 5cm以上並有3-4條側根時，即可煉苗移栽； (3. 2)煉苗移栽
首先將試管苗瓶蓋打開，在培養室適應ld，之後移到遮光度70-80%的遮蔭網塑料大棚 溫室條件下煉苗2-3d，用鑷子將苗夾出，清水洗去基部殘留的培養基，移栽到裝有混合育苗 基質的穴盤或花盆中，利用間歇噴霧裝置或人工噴水保持相對溼度在80%以上，經馴化煉 苗5-10d後，待新根新芽萌出逐漸減少澆水次數並進行常規管理。穴盤或花盆混合育苗基質的成分以體積比計為蛭石草炭土 園土 =3 5 :2。其中上述的3個實施例中，改良MS包括常量營養元素、微量營養元素和有機試劑， 其中，常量營養元素的組分和其對應的濃度如下
硝酸鉀 硫酸銨 七水硫酸鎂 二水氯化鈣 無水磷酸二氫鉀 乙二胺四乙酸二鈉 七水硫酸亞鐵
1900 mg/L ； 1650 mg/L ； 370mg/L ； 440 mg/L ； 170 mg/L ； 37. 3 mg/L ； 27. 8 mg/L。微量營養元素的組分和其對應的濃度如下 四水硫酸錳22. 3 mg/L ；
硫酸鋅8. 6 mg/L ；
硼酸6. 2 mg/L ；
碘化鉀0. 83 mg/L ；
鉬酸鈉0. 25 mg/L ；
硫酸銅0. 025 mg/L ；
氯化鈷0. 025 mg/L。有機試劑的組分和其對應的濃度如下 鹽酸硫胺素 10. 0 mg/L ；
煙酸1. 0 mg/L ；
鹽酸吡哆醇 1. Omg/L ； 肌醇100. O mg/L。本發明利用近幾年植物細胞和組織培養中的熱點研究植物體細胞胚胎發生技術 快繁種子繁殖困難的紅葉石楠才是解決上述問題的根本途徑，它不但能解決紅葉石楠種 質退化的問題，達到優良種苗脫毒、提純復壯及快速繁殖的目的，而且也是高效再生種子來 源的重要途徑，還是進行遺傳轉化或誘變育種選育新品種的理想受體材料。以上已以較佳實施例公開了本發明，然其並非用以限制本發明，凡採用等同替換 或者等效變換方式所獲得的技術方案，均落在本發明的保護範圍之內。
權利要求
1. 一種紅葉石楠離體葉片體細胞胚誘導快繁培養方法，其特徵在於，包括以下步驟(1)建立紅葉石楠無菌試管苗再生體系(1. 1)選材與材料處理於春季晴天上午選取生長健壯、性狀表現優良的單株，用 5%多菌靈噴灑選取的枝條，每周噴灑一次，連續噴灑一個月，之後剪取剛萌發的無病蟲 嫩枝，包括前端未木質化和半木質化部分，除去多餘的莖葉，將需要部分用洗潔精溶液 浸泡5-lOmin，然後用棉球仔細清洗後，再用流水衝洗1小時，最後用2%Naa0溶液浸泡 15-20min,再用無菌水衝洗乾淨，用滅菌濾紙吸乾水分後備用；(1. 2)選材消毒與芽啟動萌發培養將步驟(1. 1)所述的處理過的材料置於超淨工作 臺上，用75%的酒精消毒15-20s，無菌水衝洗5-6次，再用0. 1 %升汞滅菌8-15min，無菌 水衝洗6—8次，用滅菌濾紙吸乾水分，然後剪取l-2cm左右帶一個腋芽或頂芽的莖段，以生 態學下段垂直插入芽啟動培養基上，每瓶接種3個外植體，誘導頂芽和腋芽萌發，在培養室 溫度白天25士2°C，夜晚20士2°C，光照強度1500—2000 lx，光照時間14 h / d的條件下， 進行15-20d的培養，莖段腋芽開始萌動，莖尖明顯伸長，40-50d後芽點長成2-4cm的新梢， 形成無菌試管苗；(1. 3)無菌試管苗增殖培養將步驟(1. 2)誘導出的無菌試管苗去掉基部葉片，切成含 1-2個腋芽的莖段或莖尖接種在試管苗增殖培養基上，2518d後繼代1次，通過上述試管苗 增殖培養基的NAA濃度在0. 1 0. SmgL-1的可控範圍內調整變化，獲得大量無菌試管苗，建 立起紅葉石楠無菌試管苗再生體系；(2)建立離體葉片體胚和不定芽誘導的高頻快繁體系(2. 1)誘導體胚和不定芽的形成以試管苗第3到第6片展開葉為外植體，葉片帶短葉 柄，將葉片周圍帶鋸齒狀葉緣切去，之後做以下處理一、葉片沿主脈切成左右兩半，視葉片 大小輕劃1-2刀；二、葉片沿主脈橫切2-3刀，分別接種在第一誘導體胚和/或不定芽形成 培養基、第二誘導體胚和/或不定芽形成培養基和第三誘導體胚和/或不定芽形成培養基 上，要求外植體葉背朝下緊貼各自的培養基放置，於黑暗培養7-10d，誘導體胚的形成，於黑 暗培養15-20d，誘導不定芽的形成；(2. 2)體胚和不定芽的生長與分化將第一誘導體胚和/或不定芽形成培養基和第二 誘導體胚和/或不定芽形成培養基上培養的外植體轉接到第一體胚和/或不定芽生長與 分化培養基上，然後放入人工氣候箱，溫度為10士2°C時，暗培養3-5d之後轉入培養室暗培 養35-40d，或直接在培養室暗培養40-45d，中間繼代一次；而將第三誘導體胚和/或不定芽 形成培養基上的外植體轉接到第二體胚和/或不定芽生長與分化培養基上，在培養室培養 40-45d，中間繼代一次，光照強度1000— 15001x，經過上述第一體胚和/或不定芽生長與分 化培養基和第二體胚和/或不定芽生長與分化培養的培養，在外植體上形成許多叢生芽， 芽高在2cm 5cm ；(2. 3)叢生芽增殖快繁培養將上述步驟(2. 2)誘導形成的叢生芽切成含1-2個腋芽的 莖段或莖尖轉接到試管苗增殖培養基或第二體胚和/或不定芽生長與分化培養基上交替 繼代，進行增殖快繁培養，每18-22d繼代一次，增殖頻率為10-15 ；(3)試管苗生根煉苗移栽(3.1)壯苗生根培養將上述步驟(2. 3)生長發育健壯的長到3-4cm後的叢生芽切成單株轉接到壯苗生根培養基上，培養25-35d，保證莖葉發育正常，根系生長健壯，根長至1. 5cm以上時，進行煉苗移 栽；(3. 2)煉苗移栽首先將試管苗瓶蓋打開，在培養室適應Id後移到遮光度70-80%的遮蔭網塑料大棚， 在溫室條件下煉苗2-3d，用鑷子將苗夾出，清水洗去基部殘留的培養基，移栽到裝有混合 育苗基質的穴盤中，利用間歇噴霧裝置或人工噴水保持相對溼度在80%以上，經馴化煉苗 5-10d後，在新根新芽萌出後，逐漸減少澆水次數並移栽到花盆進行常規管理；所述的芽啟動培養基為改良MS + 0. 5 1. 0 Higr1BA + 0. 5 1. OmgL^1KT + 0. 1 0. 2mgL"1NAA + 6. 0 7. OgL"1 瓊脂 + 3(^171 蔗糖，且 pH 值為 5. 8 6. 0 ；所述的試管苗增殖培養基為改良MS + 1. 0 2. OmgL-1BA + 1. 0 2. OmgL^KT +、0.1 0. 5mgL,AA + 6. 0 7. OgL"1 瓊脂 + 30gL_1 蔗糖，且 pH 值為 5. 8 6. 0 ；所述的第一誘導體胚和/或不定芽形成培養基為改良MS + 0. SmgL-^, 4-D + 0. 5 、1.OmgL-1BA + 0. 5 2. OmgL-1NAA + 3. 0 3. 5gL、hytagel + 20gL_1 蔗糖，且 pH 值為、5.8 6. 0 ；所述的第二誘導體胚和/或不定芽形成培養基為改良MS + 0. ImgL-^, 4-D + 0. 5mgL_1BA + 10 30 mgl^NM + 3. 0 3. SgI^phytagel + 2(^171 蔗糖，且pH值為 5. 8 、6.0 ；所述的第三誘導體胚和/或不定芽形成培養基為改良MS + 2.0 4. OmgI/1 NAA + 0. 2 0. 5mgL_12, 4-D + 0· 5 2. OmgL-1BA+ 0· 5 2· 0 mgl^KT+ 6· 0 7. OgL-1 瓊月旨 + SOgL-1蔗糖，且pH值為5. 8 6. 0 ；所述的第一體胚和/或不定芽生長與分化培養基為改良MS + 2.0 4. Omg L^1BA + 3. 0 3. SgL-1Phytagel + 20gL_1 蔗糖，且 pH 值為 5. 8 6. 0 ；所述的第二體胚和/或不定芽生長與分化培養基為改良MS + 2. OmgL-1 BA + 1.0 mgL-1 IBA + 2.0 mgL-1 KT + 6. 0 7. OgL"1 瓊脂 + 30gL_1 蔗糖，且 pH 值為 5. 8 6. 0 ；所述的壯苗生根培養基為1/2改良MS + 0. 2 0. 5mgL_1 IBA + 0 0. 05mgL_1NAA + 6. 0 7. OgL"1瓊脂+ 20§υ'蔗糖，且pH值為5. 8 6. 0。
2.根據權利要求1所述的紅葉石楠離體葉片體細胞胚誘導快繁培養方法，其特徵在於 所述的改良MS包括常量營養元素、微量營養元素和有機試劑。
3.根據權利要求2所述的紅葉石楠離體葉片體細胞胚誘導快繁培養方法，其特徵在於 所述的常量營養元素的組分和其對應的濃度如下硝酸鉀1900 mg/L ；硫酸銨1650 mg/L ；七水硫酸鎂370mg/L ；二水氯化鈣440 mg/L ；無水磷酸二氫鉀170 mg/L ；乙二胺四乙酸二鈉37. 3 mg/L;七水硫酸亞鐵27. 8 mg/L。
4.根據權利要求2所述的紅葉石楠離體葉片體細胞胚誘導快繁培養方法，其特徵在於 所述的微量營養元素的組分和其對應的濃度如下四水硫酸錳22. 3 mg/L ；硫酸鋅8. 6 mg/L ；硼酸6. 2 mg/L ；碘化鉀0. 83 mg/L ；鉬酸鈉0. 25 mg/L ；硫酸銅0. 025 mg/L ；氯化鈷0. 025 mg/L。
5.根據權利要求2所述的紅葉石楠離體葉片體細胞胚誘導快繁培養方法，其特徵在於 所述的有機試劑的組分和其對應的濃度如下鹽酸硫胺素 10. O mg/L ； 煙酸1. 0 mg/L ；鹽酸吡哆醇 1. Omg/L ； 肌醇100. O mg/L。
6.根據權利要求1所述的紅葉石楠離體葉片體細胞胚誘導快繁培養方法，其特徵在於 所述的混合育苗基質的成分以體積比計為蛭石草炭土 園土 = 3 5 :2。
全文摘要
一種紅葉石楠離體葉片體細胞胚誘導快繁培養方法，包括以下步驟(1)建立紅葉石楠無菌試管苗再生體系；(2)建立離體葉片體胚和不定芽誘導的高頻快繁體系；(3)試管苗生根煉苗移栽。本發明所述的紅葉石楠離體葉片體細胞胚誘導快繁培養方法通過選擇適宜外植體、改良基本培養基及成分、調整培養條件等配套措施，使種子繁殖困難的紅葉石楠通過體細胞胚胎發生途徑快繁，並使得植株移栽成活率達到95%以上，種苗生長健壯，可有效解決優良種苗種質退化問題，也可為生產上提供大量優質提純復壯的脫毒苗木，此外，還可為紅葉石楠遺傳轉化或誘變育種選育新品種提供一個理想的受體體系。
文檔編號A01H4/00GK102124955SQ20111003370
公開日2011年7月20日 申請日期2011年1月31日 優先權日2011年1月31日
發明者劉翠蘭, 劉豔, 劉進華, 夏陽, 朱曉花, 李雙雲, 梁慧敏, 燕麗萍 申請人:山東省林業科學研究院, 江蘇農林職業技術學院