治療糖尿病的方法
2023-10-07 22:21:39
專利名稱：：治療糖尿病的方法糖尿病是一種代謝性疾病，特徵在於機體組織不能以正常速率貯存碳水化合物。對胰島素作用的抗性是II型糖尿病的最重要因素。當該抗性超過β細胞產生胰島素的能力時，人就會患糖尿病。在70年代末期，患糖尿病的人十分得益於接受了控制量的胰島素。肥胖，尤其是過度機體肥胖，常與非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM)有關。這些稱為II型糖尿病的對胰島素沒有絕對需求，因為他們的β細胞能夠分泌胰島素，儘管通常是以降低的水平分泌。此外，這類患者通常肥胖並且對胰島素不產生反應。對於治療肥胖II型糖尿病所熟知的最佳方法是飲食調整和通過鍛鍊減肥。不幸的是，這些方案一般都不成功。減肥的失敗是由於遺傳因素，主要是食慾好、對高卡路裡食品的喜好、體育活動少和脂肪生成代謝高。儘管他們對疾病鬥爭付出了努力，但繼承了這些遺傳因素的人易於肥胖，常成為II型糖尿病患者。ob/ob小鼠是一種肥胖和糖尿病模型，它已知攜帶與第六染色體的突變有關的常染色體隱性遺傳特性。最近，YiyingZhang和協作者發表了與該疾病有關的小鼠基因(ob)的位置克隆(positionalcloning)。YiyingZhang等，自然(Nature)372425-32(1994)。該報導公開了專門在脂肪組織中表達的編碼167個胺基酸蛋白質(下文leptin)的基因，該蛋白質帶有21個胺基酸信號肽。據顯示肥胖者中leptin的循環水平差異很大。結果，現在人們認為使用leptin治療肥胖性II型糖尿病患者亞群十分順理成章。因此有生物活性的、並具有leptin相似活性的藥理學物質可用於治療肥胖性II型糖尿病，尤其是循環leptin水平異常高或低的患者。一方面，本發明是一種治療或預防糖尿病的方法，包括給肥胖性II型糖尿病患者服用有效量的leptin、leptin類似物或它們的可藥用鹽。在優選的實施方案中，本發明包括治療低內源性leptin水平的肥胖性II型糖尿病的方法。肥胖是指個體的身體質量指數大於27公斤/平方米的一種疾病。leptin是指由肥胖基因經下列途經生產的蛋白質轉錄和缺失內含子，翻譯為蛋白並加工成帶有分泌信號肽的成熟蛋白質(例如除去成熟蛋白的N末端纈氨酸-脯氨酸至C末端半胱氨酸)。Zhang等在自然(Nature)372425-32(1994)中公開了小鼠和人的leptin蛋白序列。Murakami等在生物化學和生物物理學研究通訊(BiochemicalandBiophysicalResearchComm.)209(3)944-52(1995)中公開了大鼠leptin序列。在人、鼠和大鼠的leptin中與二硫化物形成有關的Cys位於96和145位。但是在使用鼠和人leptin時，觀察到了desGln(28)變體。因此，與二硫鍵形成有關的Cys可位於95或96位和145或146位。本說明書中Leptin還可以指肥胖蛋白、OB或ob基因產物。因而，leptin包括SEQIDNos1-6。本領域專業技術人員將認識到某些胺基酸易發生重排。例如，Asp可重排為天冬醯亞胺和異天冬醯胺，正如1.Schn等在國際肽和蛋白質研究雜誌(InternationalJournalofPeptideandProteinResearch)，14485-94(1979)中所述，該文獻引入本文以供參考。這些重排衍生物也包括在本發明的範圍之中。除非另有說明，胺基酸均是L構型的。用於本權利要求方法的優選形式的Leptin是天然序列。更優選使用人leptin。用於本發明方法的最優選的leptins包括蛋白質的SEQIDNos1-6鼠LeptinSEQIDNO1ValProIleGlnLysValGlnAspAspThrLysThrLeuIleLysThr151015IleValThrArgIleAshAspIleSerHisThrXaaSerValSerSer202530LysGlnLysValThrGlyLeuAspPheIleProGlyLeuHisProIle354045LeuThrLeuSerLysMetAspGlnThrLeuAlaValTyrGlnGlnIle505560LeuThrSerMetProSerArgAsnValIleGlnIleSerAsnAspLeu65707580GluAsnLeuArgAspLeuLeuHisValLeuAlaPheSerLysSerCys859095HisLeuProGlnAlaSerGlyLeuGluThrLeuGluSerLeuGlyGly100105110ValLeuGluAlaSerGlyTyrSerThrGluValValAlaLeuSerArg115120125LeuGlnGlySerLeuGlnAspMetLeuGlnGlnLeuAspLeuSerPro130135140GlyCys145其中28位的Xaa是Gln或沒有。豬LeptinSEQIDNO2ValProIleTrpArgValGlnAspAspThrLysThrLeuIleLysThr151015IleValThrArgIleSerAspIleSerHisMetGlnSerValSerSer202530LysGlnArgValThrGlyLeuAspPheIleProGlyLeuHisProVal354045LeuSerLeuSerLysMetAspGlnThrLeuAlaIleTyrGlnGlnIle505560LeuThrSerLeuProSerArgAsnValIleGlnIleSerAsnAspLeu65707580GluAsnLeuArgAspLeuLeuHisLeuLeuAlaSerSerLysSerCys859095ProLeuProGlnAlaArgAlaLeuGluThrLeuGluSerLeuGlyGly100105110ValLeuGluAlaSerLeuTyrSerThrGluValValAlaLeuSerArg115120125LeuGlnGlyAlaLeuGlnAspMetLeuArgGlnLeuAspLeuSerPro130135140GlyCys145牛LeptinSEQIDNO3ValProIleCysLysValGlnAspAspThrLysThrLeuIleLysThrl51015IleValThrArgIleAsnAspIleSerHisThrXaaSerValSerSer202530LysGlnArgValThrGlyLeuAspPheIleProGlyLeuHisProLeu354045LeuSerLeuSerLysMetAspGlnThrLeuAlaIleTyrGlnGlnIle505560LeuThrSerLeuProSerArgAsnValValGlnIleSerAsnAspLeu65707580GluAsnLeuArgAspLeuLeuHisLeuLeuAlaAlaSerLysSerCys859095ProLeuProGlnValArgAlaLeuGluSerLeuGluSerLeuGlyVal100105110ValLeuGluAlaSerLeuTyrSerThrGluValValAlaLeuSerArg115120125LeuGlnGlySerLeuGlnAspMetLeuArgGlnLeuAspLeuSerPro130135140GlyCys145其中28位的Xaa是Gln或沒有。人LeptinSEQIDNO4ValProIleGlnLysValGlnAspAspThrLysThrLeuIleLysThr151015IleValThrArgIleAshAspIleSerHisXaaXaaSerValSerSer202530LvsGlnLysValThrGlyLeuAspPheIleProGlyLeuHisProIle354045LeuThrLeuSerLysMetAspGlnThrLeuAlaValTyrGlnGlnIle505360LeuThrSerMetProSerArgAsnValIleGlnIleSerAsnAspLeu65707580GluAsnLeuArgAspLeuLeuHisValLeuAlaPheSerLysSerCys859095HisLeuProTrpAlaSerGlyLeuGluThrLeuAspSerLeuGlyGly100105110ValLeuGluAlaSerGlyTyrSerThrGluValValAlaLeuSerArg115120125LeuGlnGlySerLeuGlnAspMetLeuTrpGlnLeuAspLeuSerPro130135140145GlyCys其中27位的Xaa是Thr或Ala；並且28位的Xaa是Gln或沒有。恆河猴LeptinSEQIDNO5ValProIleGlnLysValGlnSerAspThrLysThrLeuIleLys151015ThrIleValThrArgIleAsnAspIleSerHisThrGlnSerVal202530SerSerLysGlnArgValThrGlyLeuAspPheIleProGlyLeu354045HisProValLeuThrLeuSerGlnMetAspGlnThrLeuAlaIle505560TyrGlnGlnIleLeuIleAsnLeuProSerArgAsnValIleGln657075IleSerAsnAspLeuGluAsnLeuArgAspLeuLeuHisLeuLeu808590AlaPheSerLysSerCysHisLeuProLeuAlaSerGlyLeuGlu95100105ThrLeuGluSerLeuGlyAspValLeuGluAlaSerLeuTyrSer110115120ThrGluValValAlaLeuSerArgLeuGlnGlySerLeuGlnAsp125130135MetLeuTrpGlnLeuAspLeuSerProGlyCys140145大鼠LeptinSEQIDNO6ValProIleHisLysValGlnAspAspThrLysThrLeuIleLysThr151015IleValThrArgIleAsnAspIleSerHisThrGlnSerValSerAla202530ArgGlnArgValThrGlyLeuAspPheIleProGlyLeuHisProIle354045LeuSerLeuSerLysMetAspGlnThrLeuAlaValTyrGlnGlnILe505560LeuThrSerLeuProSerGlnAsnValLeuGlnIleAlaHisAspLeu65707580GluAsnLeuArgAspLeuLeuHisLeuLeuAlaPheSerLysSerCys859095SerLeuProGlnThrArgGlyLeuGlnLysProGluSerLeuAspGly100105110ValLeuGluAlaSerLeuTyrSerThrGluValValAlaLeuSerArg115120125LeuGlnGlySerLeuGlnAspIleLeuGlnGlnLeuAspLeuSerPro130135140GluCys145除上述確定的蛋白序列外，通常認為使用一種或兩種胺基酸前導序列，尤其是包含甲硫氨酸的前導序列製備這類抗糖尿病的蛋白質是高效的。兩種經常使用的前導序列是Met-Arg和Met-Asp。這些蛋白質在下文可以鑑定為Met-Arg-leptin或Met-Asp-leptin，或者標記為Met-Arg-SEQIDNOX，其中X是1-6。Leptin類似物和片斷也可用於本發明的方法。Leptin類似物通常由下式(I)(SEQIDNO7)所定義ValProIleGlnLysValGlnAspAspThrLysThrLeuIleLysThr151015IleValThrArgIleXaaAspIleSerHisXaaXaaSerValSerSer202530LysGlnLysValThrGlyLeuAspPheIleProGlyLeuHisProIle354045LeuThrLeuSerLysXaaAspGlnThrLeuAlaValTyrGlnGlnIle505560LeuThrSerXaaProSerArgXaaValIleGlnIleXaaAsnAspLeu65707580GluAsnLeuArgAspLeuLeuHisValLeuAlaPheSerLysSerCys859095HisLeuProTrpAlaSerGlyLeuGluThrLeuAspSerLeuGlyGly100105110ValLeuGluAlaSerXaaTyrSerThrGluValValAlaLeuSerArg115120125LeuGlnGlySerLeuGlnAspMetLeuTrpGlnLeuAspLeuSerPro130135140145GlyCys其中22位的Xaa是Asn，Asp或Glu；27位的Xaa是Thr或Ala；28位的Xaa是Gln，Glu或沒有；54位的Xaa是Met或Ala；68位的Xaa是Met或Leu；72位的Xaa是Asn，Asp或Glu；77位的Xaa是Ser或Ala；118位的Xaa是Gly或Leu；所述蛋白質具有至少一個選自下述的取代基97位的His被Ser或Pro替代；100位的Trp被Gln，Ala或Leu替代；101位的Ala被Thr或Val替代；102位的Ser被Arg替代；103位的Gly被Ala替代；105位的Glu被Gln替代；106位的Thr被Lys或Ser替代；107位的Leu被Pro替代；108位的Asp被Glu替代；或者111位的Gly被Asp替代。Leptin類似物優選是如下式(II)(SEQIDNO8)所示的化合物ValProIleGlnLysValGlnAspAspThrLysThrLeuIleLysThr151015IleValThrArgIleAsnAspIleSerHisXaaGlnSerValSerSer202530LysGlnLysValThrGlyLeuAspPheIleProGlyLeuHisProIle354045LeuThrLeuSerLysMetAspGlnThrLeuAlaValTyrGlnGlnIle505560LeuThrSerMetProSerArgAsnValIleGlnIleXaaAsnAspLeu65707580GluAsnLeuArgAspLeuLeuHisValLeuAlaPheSerLysSerCys859095HisLeuProTrpAlaSerGlyLeuGluThrLeuAspSerLeuGlyGly100105110ValLeuGluAlaSerXaaTyrSerThrGluValValAlaLeuSerArg115120125LeuGlnGlySerLeuGlnAspMetLeuTrpGlnLeuAspLeuSerPro130135140145GlyCys其中27位的Xaa是Thr或Ala；77位的Xaa是Ser或Ala；118位的Xaa是Gly或Leu；所述蛋白質具有至少一個取代基，優選具有一至五個取代基，最優選具有一至二個取代基，所述取代基選自97位的His被Ser替代；100位的Trp被Gln替代；101位的Ala被Thr替代；105位的Glu被Gln替代；106位的Thr被Lys替代；107位的Leu被Pro替代；108位的Asp被Glu替代；或者111位的Gly被Asp替代。本發明優選蛋白質的實施例包括SEQIDNO8的蛋白質，其中27位的Xaa是Thr；77位的Xaa是Ser；118位的Xaa是Gly；並且97、100、101、105、106、107、108和111位的胺基酸殘基是如下表I所述的殘基。提供該天然的人序列與用於本發明方法的蛋白質進行比較。表I其它優選的蛋白質是那些其中27位的Xaa是Ala；77位的Xaa是Ser；118位的Xaa是Gly；並且97、100、101、105、106、107、108和111位的氨基殘基如表I所述的。本發明提供可有效治療肥胖性II型糖尿病的生物活性蛋白質。出乎意料地是，表I的leptin蛋白質由於帶有相對於人肥胖蛋白的特定取代基而具有改進特性。這些蛋白質比小鼠和人的肥胖蛋白都更穩定，因此是更卓越的治療藥物。使用JacksonLaboratories(BarHarbor，Maine)或Harlan(英格蘭)的五至六月齡雄性近交正常ICR小鼠、近交正常(ob/+)、肥胖-糖尿病小鼠(ob/ob)和肥胖-糖尿病(db/db)小鼠進行實驗。將正常的和糖尿病小鼠都圈養在帶墊的塑料籠中，每個籠中三或六隻，並不限量地給予水和食物。動物室的溫度保持在23±2℃，光強為0600-1800h。從尾靜脈收集血樣。因此，最密切相關的生物試驗是通過數種給藥途徑中的任一種(如靜脈、皮下、腹膜內或藉助微型泵或導管)注射試驗物質，然後監測不同時間段的食物和水的消耗、體重增加、血漿化學或激素(葡萄糖、胰島素、ACTH、皮質酮、GH、T4)水平。適宜的實驗動物包括正常小鼠(ICR等)和肥胖小鼠(ob/ob，Avy/a，KK-Ay，矮胖，肥胖)。對這些注射非特效的對照試驗可以通過給相同動物使用含有或不含試驗物質的類似組合物的載體監測相同參數進行或給認為缺乏所述受體的動物(db/db小鼠，fa/fa或cp/cp大鼠)施用試驗物質本身進行對照試驗。血葡糖水平通過葡萄糖氧化酶方法或偶聯己糖激酶方法測定。血漿胰島素使用放射免疫試劑盒、以大鼠胰島素為標準進行測定。血漿甘油三酯使用市售試劑盒、用甘油為標準進行測定。上述研究證明leptin和leptin類似物調節正常ICR和遺傳肥胖ob/ob小鼠的食物攝取和體重。長期給予ob/ob小鼠leptin和leptin類似物可總體改善這些動物的糖尿病症狀，顯示出這些抗糖尿病蛋白質作為治療肥胖性II型糖尿病藥物的潛在希望。本發明提供治療肥胖性II型糖尿病，尤其是那些具有低leptin循環水平的糖尿病的方法。本發明的化合物可採用本領域已知的化學方法生產，例如液相或固相肽合成法或通過常規溶液方法由蛋白片段偶聯開始在溶液中的半合成法。這類方法是已知的，記述於本領域的普通教科書，例如H.Dugas和C.Penney的生物有機化學(BIOORGANICCHEMISTRY)，(1981)54-92頁。用於本權利要求方法的蛋白質也可採用熟知的重組DNA技術製備，例如Maniatis等(1988)分子克隆實驗室手冊(MolecularCloningALaboratoryManual)，ColdSpringHarborPress，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，NewYork或者CurrentProtocolsinMolecularBiology(1989)和增補。在已知序列DNA的預定位置上進行取代突變的技術是熟知的，例如M13引物誘變法。在編碼本發明抗糖尿病蛋白質的DNA上產生的突變必須不位於閱讀框架之外的序列，並優選所述突變不會產生可導致二級mRNA結構的互補區。參見DeBoer等，歐洲專利公開075444A(1983)。本發明提供一種治療肥胖性II型糖尿病的方法。該方法包括施用有效量的leptin或leptin類似物，劑量為約1-10000μg/kg。優選劑量為約20-10000μg/kg。更優選劑量為約200-600μg/kg。在實踐該方法中，抗糖尿病蛋白質可每日給藥一次或多次劑量。治療方案可要求長時間給藥。每劑的給藥量或給藥總量可由醫師決定，取決於如下因素例如患者體重、年齡和患者健康狀況及對化合物的耐受量。本發明還提供含有本發明化合物的藥物製劑。蛋白質、優選是可藥用鹽形式的蛋白質可配製成非胃腸給藥的製劑。例如可將化合物與常規藥物載體和賦形劑混合。含有所要求保護的蛋白質的組合物含約0.1-90％重量的活性蛋白質、優選是可溶形式的活性蛋白質，更優選10-30％。另外，本發明的蛋白質可單獨給藥或與其它抗肥胖症的藥物或用於治療糖尿病的藥物聯合給藥。對於靜脈給藥，蛋白質常以常用的靜脈流體並通過靜脈輸注給藥。對於肌內製劑、無菌製劑，優選將適宜的可溶鹽形式的蛋白質，例如鹽酸鹽，溶解在藥物稀釋劑中如去熱源水或生理鹽水中給藥。適宜的不溶形式的化合物可製備成水基或可藥用油基中的懸浮液，例如長鏈脂肪酸的酯如油酸乙酯的懸浮液給藥。在優選的實施方案中，本發明提供一種治療低leptin水平的肥胖性II型糖尿病的方法，儘管具有高內源性leptin水平的糖尿病患者也受益於本發明所要求保護的方法。測定血清或血漿leptin水平的方法可使用標準基於抗體的方法學完成。Leptin測試試劑盒可從LincoResearch，Inc.(14ResearchParkDr.，StLouis，MO63304)購得。優選治療具有0-80ng/ml的leptin水平的肥胖性II型糖尿病。較優選治療leptin水平在0-50ng/ml的肥胖性II型糖尿病。更優選治療leptin水平在0-30ng/ml的肥胖性II型糖尿病。最優選治療leptin水平在0-15ng/ml的肥胖性II型糖尿病。提供下列實施例以說明如何實施和實踐本發明的各種實施方案。這些實施例並不旨在限定本發明的範圍。實施例1採用標準PCR方法，從人脂肪細胞文庫(從CLONETECH購得)得到編碼下列蛋白序列Met-Arg-SEQIDNO4。的DNA序列，概括地說，根據所公開的人ob基因的胺基酸序列設計簡併引物。使用Model308ADNA合成儀(PE-AppliedBiosystem，Inc.，850LincolncenterDrive，FosterCity，CA94404)以聚合物酶鏈反應(PCR)擴增方法製備引物。接下來，將引物OB.F1M(5-GGGGCATATGAGGGTACCTATCCAGAAAGTCCAGGATGACAC)和OB.F2H(5-GGGGCATATGAGGGTACCCATCCAGAAGGTGCAGGACGA)(和逆轉錄引物OB.R1M(5-GGGGGGATCGATAATTTAGCATCCAGGGCTAAGATCCAACTGCCAAAGCAT)和OB.R2H(5-GGGGGGATCCTATTAGCACCCGGGAGACAGGTCCAGCTGCCACAACAT)與作為模板的PCR-準備好的(PCR-ready)人脂肪細胞cDNA(ClontechLaboratories，Inc.，4030FabianWay，PaloAlto，CA94303；Item#7128-1)混合。使用2.5單位的AmplitagDNA聚合物酶(PerkinElmerCetus)或2單位的VentDNA聚合物酶(NewEnglandBiolabs)在100ul的反應中進行2組PCR擴增反應。PCR反應包含1ul人脂肪細胞cDNA，10pmol每種引物(將全部四種混合)。對「TouchdownPCR」採用下列條件2個循環94℃×30秒，60℃×30秒，72℃×45秒；2個循環94℃×30秒，56℃×30秒，72℃×45秒；2次循環94℃×30秒，52℃×30秒，72℃×45秒；2個循環94℃×30秒，48℃×30秒，72℃×45秒；2個循環94℃×30秒，44℃×30秒，72℃×45秒；28個循環94℃×30秒，52℃×30秒，72℃×45秒。將所得PCR反應產物在1％瓊脂糖凝膠上展開，經溴化乙啶染色可見一條約450bp大小的譜帶。該譜帶在兩組PCR反應中均存在。切下該帶並以上述條件(94℃×30秒，52℃×30秒，72℃×45秒)再擴增30次循環。將使用VentDNA聚合物酶得到的PCR產物進行凝膠純化並克隆到pCR-SCRIPT克隆載體(Stratagene)中。然後使用該載體轉化E.coli細胞。從20個E.coli的白色茵落中分離質粒DNA並將從3個克隆得到的樣品進行排序。將兩個這樣的菌落，即E.coliDH10B/pOJ717知E.coliDH10B/pOJ718依布達佩斯條約寄存於NorthernRegionalResearchLaboratories(NRRL)，保藏號分別為B-21408和B-21409。實施例2載體構建構建含編碼所需蛋白質的DNA順序的質粒以包括NdeI和BamHI限制位點。用NdeI和BamHI限制酶消化攜帶克隆的PCR產物的質粒。凝膠純化小的～450bp片段，然後連接載體pRB182，從該載體中缺失了A-C-B胰島素原的編碼序列。將連接產物轉化到大腸桿菌(E.coli)DH10B(可從市場上購買的)中，分析在用10μg/ml四環素補充的胰腖-酵母平板上生長的菌落。分離質粒DNA，用NdeI和BamHI消化，瓊脂糖凝膠電泳分離所得的片段。保留含期望的～450bpNdeI-BamHI片段的質粒。用所述的第二質粒轉化大腸桿菌BBL21(DE3)，該質粒表達適合進行蛋白質生產的培養。使用所述的載體轉化細胞的技術是本領域已知的，常見於普通文獻例如Maniatis等的分子克隆實驗室手冊，ColdSpringHarbourPress，ColdSpringHargorLaboratory，ColdSpringHarbor，NewYork(1988)，或者CRURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY，(F.Ausabel，ed.，1989)和其增補。本發明的實踐中作為舉例說明使用的涉及E.coli細胞轉化的技術是本領域所熟知的。培養轉化E.coli細胞的具體條件取決於所用E.coli宿主細胞系和表達或克隆載體的性質。例如摻入到可熱誘導啟動子-操作子區域(例如c1857可熱誘導λ噬茵體啟動子-操作子區域)的載體需要的培養條件溫度在約30℃-約40℃內變化，以引導蛋白質的合成。在本發明的優選實施方案中，使用的宿主細胞是E.coliK12RV308細胞，但也可使用其它細胞，例如但不限於E.coliK12L201，L687，L693，L507，L640，L641，L695，L814(E.coliB)。然後在對應於表達質粒中存在的抗性基因的抗生素的選擇壓力下，將轉化的宿主細胞平鋪於適當的培養基中。之後將培養物在適於所用的宿主細胞系的溫度下保溫一段時間。在高水平細菌表達系統中表達的蛋白質特徵性地以顆粒或包合體形式聚集，它們含有高水平的過表達蛋白。參見例如Kreuger等，PROTEINFOLDING(Gierasch和King，eds.，1990)，136-142頁。AmericanAssociationfortheAdvancementofSciencePublicationNo.89-18S，Washington，D.C.。這類蛋白質聚集物必須被溶解以進一步純化分離所需蛋白質產物。出處同上。可採用各種技術使用強烈變性溶液例如鹽酸胍和/或弱變性溶液例如二硫蘇糖醇(DTT)溶解這些蛋白質。在溶液中逐漸地除去變性試劑(通常通過透析)，使變性蛋白質恢復天然構型。具體的變性和摺疊條件取決於具體的蛋白質表達體系和/或所述的蛋白質。本發明的蛋白質優選表達為Met-Arg-SEQIDNOX，這樣所表達的蛋白質可快速地轉化為要求保護的具有組織蛋白酶C的蛋白質(還稱為二氨基肽酶)。蛋白質的純化是本領域的已知技術，包括反相色譜、親和色譜和空間排阻色譜法。所要求的蛋白質包含兩個半胱氨酸殘基。因此，可形成二硫鍵以穩定蛋白質。本發明包括其中96位Cys與146位Cys交聯的蛋白質以及那些不含該二硫鍵的蛋白質。蛋白質，除本發明使用的蛋白質外，特別的當配製時，還可作為二聚物、三聚物、四聚物和其它多聚物存在。此類多聚物均包括在本發明的範圍內。權利要求1.leptin或leptin類似物用於製備治療或預防糖尿病的藥物的用途。2.權利要求1的方法，其中所述的leptin或leptin類似物選自(a)ValProIleGlnLysValGlnAspAspThrLysThrLeuIleLysThr151015IleValThrArgIleAsnAspIleSerHisThrXaaSerValSerSer202530LysGlnLysValThrGlyLeuAspPheIleProGlyLeuHisProIle354045LeuThrLeuSerLysMetAspGlnThrLeuAlaValTyrGlnGlnIle505560LeuThrSerMetProSerArgAsnValIleGlnIleSerAsnAspLeu65707580GluAsnLeuArgAspLeuLeuHisValLeuAlaPheSerLysSerCys859095HisLeuProQlnAlaSerGlyLeuGluThrLeuGluSerLeuGlyGly100105110ValLeuGluAlaSerGlyTyrSerThrGluValValAlaLeuSerArg115120125LeuGlnGlySerLeuGlnAspMetLeuGlnGlnLeuAspLeuSerPro130135140GlyCys145其中28位的Xaa是Gln或沒有；(SEQIDNO1)(b)ValproIleTrpArgValGlnAspAspThrLysThrLeuIleLysThrl51015IleValThrArgIleSerAspIleSerHisMetGlnSerValSerSer202530LysGlnArgValThrGlyLeuAspPheIleProGlyLeuHisProVal354045LeuSerLeuSerLysMetAspGlnThrLeuAlaIleTyrGlnGlnIle505560LeuThrSerLeuProSerArgAsnValIleGlnIleSerAsnAspLeu65707580GluAsnLeuArgAspLeuLeuHisLeuLeuAlaSerSerLysSerCys859095ProLeuProGlnAlaArgAlaLeuGluThrLeuGluSerLeuGlyGly100105110ValLeuGluAlaSerLeuTyrSerThrGluValValAlaLeuSerArg115120125LeuGlnGlyAlaLeuGlnAspMetLeuArgGlnLeuAspLeuSerPro130135140GlyCys145(SEQIDNO2)(c)ValProIleCysLysValGlnAspAspThrLysThrLeuIleLysThr151015IleValThrArgIleAsnAspIleSerHisThrXaaSerValSerSer202530LysGlnArgValThrGlyLeuAspPheIleProGlyLeuHisProLeu354045LeuSerLeuSerLysMetAspGlnThrLeuAlaIleTyrGlnGlnIle505560LeuThrSerLeuProSerArgAsnValValGlnIleSerAsnAspLeu65707580GluAsnLeuArgAspLeuLeuHisLeuLeuAlaAlaSerLysSerCys859095ProLeuProGlnValArgAlaLeuGluSerLeuGluSerLeuGlyVal100105110ValLeuGluAlaSerLeuIyrSerThrGluValValAlaLeuSerArg115120125LeuGlnGlySerLeuGlnAspMetLeuArgGlnLeuAspLeuSerPro130135140GlyCys145其中28位的Xaa是Gln或沒有；(SEQIDNO3)(d)ValProIleGlnLysValGlnAspAspThrLysThrLeuIleLysThr151015IleValThrArgIleAsnAspIleSerHisXaaXaaSerValSerSer202530LysGlnLysValThrGlyLeuAspPheIleProGlyLeuHisProIle354045LeuThrLeuSerLysMetAspGlnThrLeuAlaValTyrGlnGlnIle505560LeuThrSerMetProSerArgAsnValIleGlnIleSerAsnAspLeu65707580GluAsnLeuArgAspLeuLeuHisValLeuAlaPheSerLysSerCys859095HisLeuProTrpAlaSerGlyLeuGluThrLeuAspSerLeuGlyGly100105110ValLeuGluAlaSerGlyTyrSerThrGluValValAlaLeuSerArg115120125LeuGlnGlvSerLeuGlnAspMetLeuTrpGlnLeuAspLeuSerPro130135140145GlyCys其中27位的Xaa是Thr或Ala；並且28位的Xaa是Gln或沒有；(SEQIDNO4)(e)ValProIleGlnLysValGlnSerAspThrLysThrLeuIleLys15l015ThrIleValThrArgIleAsnAspIleSerHisThrGlnSerVal202530SerSerLysGlnArgValThrGlyLeuAspPheIleProGlyLeu354045HisProValLeuThrLeuSerGlnMetAspGlnThrLeuAlaIle505560TyrGlnGlnIleLeuIleAsnLeuProSerArgAsnValIleGln657075IleSerAsnAspLeuGluAsnLeuArgAspLeuLeuHisLeuLeu808590AlaPheSerLysSerCysHisLeuProLeuAlaSerGlyLeuGlu95100105ThrLeuGluSerLeuGlyAspValLeuGluAlaSerLeuTyrSer110115120ThrGluValValAlaLeuSerArgLeuGlnGlySerLeuGlnAsp125130135MetLeuTrpGlnLeuAspLeuSerProGlyCys140145；(SEQIDNO5)(f)ValProIleHisLysValGlnAspAspThrLysThrLeuIleLysThr151015IleValThrArgIleAsnAspIleSerHisThrGlnSerValSerAla202530ArgGlnArgValThrGlyLeuAspPheIleProGlyLeuHisProIle354045LeuSerLeuSerLysMetAspGlnThrLeuAlaValTyrGlnGlnIle505560LeuThrSerLeuProSerGlnAsnValLeuGlnIleAlaH1sAspLeu65707580GluAsnLeuArgAspLeuLeuHisLeuLeuAlaPheSerLysSerCys859095SerLeuProGlnThrArgGlyLeuGlnLysProGluSerLeuAspGly100105110ValLeuGluAlaSerLeuTyrSerThrGluValValAlaLeuSerArg115120125LeuGlnGlySerLeuGlnAspIleLeuGlnGlnLeuAspLeuSerPro130135140GluCys145，(SEQIDNO5)(g)ValProIleGlnLysValGlnAspAspThrLysThrLeuIleLysThr151015IleValThrArgIleXaaAspIleSerHisXaaXaaSerValSerSer202530LysGlnLysValThrGlyLeuAspPheIleProGlyLeuHisProIle354045LeuThrLeuSerLysXaaAspGlnThrLeuAlaValTyrGlnGlnIle505560LeuThrSerXaaProSerArgXaaValIleGlnIleXaaAsnAspLeu65707580GluAsnLeuArgAspLeuLeuHisValLeuAlaPheSerLysSerCys859095HisLeuProTrpAlaSerGlyLeuGluThrLeuAspSerLeuGlyGly100105110ValLeuGluAlaSerXaaTyrSerThrGluValValAlaLeuSerArg115120125LeuGlnGlySerLeuGlnAspMetLeuTrpGlnLeuAspLeuSerPro130135140145GlyCys其中22位的Xaa是Asn，Asp或Glu；27位的Xaa是Thr或Ala；28位的Xaa是Gln，Glu或沒有；54位的Xaa是Met或Ala；68位的Xaa是Met或Leu；72位的Xaa是Asn，Asp或Glu；77位的Xaa是Ser或Ala；118位的Xaa是Gly或Leu；所述蛋白質具有至少一個選自下述的取代基97位的His被Ser或Pro替代；100位的Trp被Gln，Ala或Leu替代；101位的Ala被Thr或Val替代；102位的Ser被Arg替代；103位的Gly被Ala替代；105位的Glu被Gln替代；106位的Thr被Lys或Ser替代；107位的Leu被Pro替代；108位的Asp被Glu替代；或者111位的Gly被Asp替代；和，(SEQIDNO7)(h)ValProIleGlnLysValGlnAspAspThrLysThrLeuIleLysThrl51015IleValThrArgIleAsnAspIleSerHisXaaGlnSerValSerSer202530LysGlnLysValThrGlyLeuAspPheIleProGlyLeuHisProIle354045LeuThrLeuSerLysMetAspGlnThrLeuAlaValTyrGlnGlnIle505560LeuThrSerMetProSerArgAsnValIleGlnIleXaaAsnAspLeu65707580GluAsnLeuArgAspLeuLeuHisValLeuAlaPheSerLysSerCys859095HisLeuProTrpAlaSerGlyLeuGluThrLeuAspSerLeuGlyGly100105110ValLeuGluAlaSerXaaTyrSerThrGluValValAlaLeuSerArg115120125LeuGlnGlySerLeuGlnAspMetLeuTrpGlnLeuAspLeuSerPro130135140145GlyCys其中27位的Xaa是Thr或Ala；77位的Xaa是Ser或Ala；118位的Xaa是Gly或Leu；所述蛋白質具有至少一個取代基，優選具有一至五個取代基，和最優選具有一至二個取代基，所述取代基選自97位的His被Ser替代；100位的Trp被Gln替代；101位的Ala被Thr替代；105位的Glu被Gln替代；106位的Thr被Lys替代；107位的Leu被Pro替代；108位的Asp被Glu替代；或111位的Gly被Asp替代；或者它們的可藥用鹽或溶劑化物。(SEQIDNO8)3.權利要求1或2任一項的方法，其中的糖尿病與高內源性leptin水平有關。4.權利要求1或3任一項的方法，其中的糖尿病與低內源性leptin水平有關。5.權利要求1或3任一項的方法，其中所述的肥胖性II型糖尿病的內源性leptin水平為0-80ng/ml。6.權利要求1或3任一項的方法，其中所述的肥胖性II型糖尿病的內源性leptin水平為0-50ng/ml。7.權利要求1或3任一項的方法，其中所述的肥胖性II型糖尿病的內源性leptin水平為0-30ng/ml。8.權利要求1或3任一項的方法，其中所述的肥胖性II型糖尿病的內源性leptin水平為0-15ng/ml。9.一種治療或預防糖尿病的方法，該方法包括給糖尿病患者施用leptin或leptin類似物。10.權利要求9的方法，其中所述的leptin或leptin類似選自SEQIDNO1、SEQIDNO2、SEQIDNO3、SEQIDNO4、SEQIDNO5、SEQIDNO6、SEQIDNO7和SEQIDNO8。11.如權利要求9或10任一項的方法，其中糖尿病與高內源性leptin水平有關。12.如權利要求9或10任一項的方法，其中糖尿病與低內源性leptin水平有關。13.權利要求9或10任一項的方法，其中所述的肥胖性II型糖尿病的內源性leptin水平為0-80ng/ml。14.權利要求9或10任一項的方法，其中所述的肥胖性II型糖尿病的內源性leptin水平為0-50ng/ml。15.權利要求9或10任一項的方法，其中所述的肥胖性II型糖尿病的內源性leptin水平為0-30ng/ml。16.權利要求9或10任一項的方法，其中所述的肥胖性II型糖尿病的內源性leptin水平為0-15ng/ml。17.一種治療或預防糖尿病的製劑，該製劑含有作為活性成分的leptin或leptin類似物。18.權利要求17的製劑，其中所述的leptin或leptin類似物選自SEQIDNO1、SEQIDNO2、SEQIDNO3、SEQIDNO4、SEQIDNO5、SEQIDNO6、SEQIDNO7和SEQIDNO8。19.權利要求17或18任一項的方法，其中糖尿病與高或低內源性leptin水平有關。全文摘要本發明描述治療肥胖性Ⅱ型糖尿病患者的糖尿病的方法。具體地說,要求保護的是與各種內源性leptin水平有關的肥胖性Ⅱ型糖尿病的治療方法。文檔編號A61K38/22GK1195293SQ96196457公開日1998年10月7日申請日期1996年6月26日優先權日1995年6月30日發明者T·W·斯特芬斯申請人:伊萊利利公司