一種脫氧膽酸基-氧化可德蘭多糖納米粒子及製備方法
2023-10-07 23:05:34 1
一種脫氧膽酸基-氧化可德蘭多糖納米粒子及製備方法
【專利摘要】本發明涉及一種脫氧膽酸基-氧化可德蘭多糖納米粒子及製備方法，屬於生物納米材料【技術領域】。以脫氧膽酸、氧化可德蘭多糖為原料，脫氧膽酸的羧基經1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)和N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)首先活化再與氧化可德蘭多糖反應合成，得到的兩親性共聚物經探頭超聲法製備自組裝納米粒子。本發明得到的自組裝納米粒子，製備方法簡單，重現性好，易於工業化生產，可作為抗腫瘤藥物載體使用。
【專利說明】一種脫氧膽酸基-氧化可德蘭多糖納米粒子及製備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種脫氧膽酸基-氧化可德蘭多糖納米粒子及製備方法，特指將水不溶性的可德蘭多糖用4-乙醯胺-2，2，6，6-四甲基哌啶氧自由基進行選擇性氧化，再用活化的脫氧膽酸與氧化可德蘭多糖偶聯形成脫氧膽酸基-氧化可德蘭多糖共聚物，以及該共聚物多糖納米粒子的製備方法，屬於生物納米材料【技術領域】。
【背景技術】
[0002]腫瘤是對人類健康和生命威脅最大的疾病之一，但是由於傳統的抗腫瘤藥物缺乏選擇性，在治療腫瘤的同時也對正常組織造成一定的毒副作用，從而限制了抗腫瘤藥物的臨床使用劑量。為了有效地治療腫瘤，理想的抗腫瘤製劑必須有選擇性，保證一定的藥物治療濃度並能夠降低毒副作用等。隨著納米科學技術研究的不斷深入，負載抗腫瘤藥物的納米給藥系統正成為攻克這一難題的有效手段。
[0003]隨著新材料、新方法、新技術的不斷湧現，基於合成聚合物和天然高分子材料(尤其是可生物降解的多糖)製備納米粒子得到廣泛的關注。多糖是自然界豐富的天然高分子聚合物，許多多糖還具有抗腫瘤、免疫調節、抗病毒和抗氧化等多種生理活性，因此對多糖及其衍生物進行修飾形成兩親性共聚物在醫藥和生物【技術領域】有著廣泛的應用。可德蘭多糖(Curdlan)作為一種天然高分子聚合物，有著良好的生物相容性、可生物降解性、無毒性等特點，可通過化學反應引入各種改性基團，形成不同化學結構、不同性質和功能的衍生物。羧甲基取代是提高許多多糖水溶性和功能特性的方法，可德蘭多糖的羧甲基衍生物有著良好的水溶性和抗腫瘤活性。目前，國內外科技工作者已通過疏水改性製備了兩親性羧甲基可德蘭多糖衍生物(Carboxymethyl curdlan)共聚物,並製備了納米粒子用於抗腫瘤藥物載體。然而，在可德蘭多糖進行羧甲基化反應過程中使用的氯乙酸為易揮發、有毒的有機試劑，不符合「綠色」化學的要求。
[0004]近年來，利用穩定的2，2，6，6-四甲基哌啶氧自由基(TEMPO)及其衍生物來催化伯位羥基的氧化，已成為選擇性氧化多糖伯羥基的一種重要的新方法。利用該氧化體系已經成功地製備了高水溶性和高羧基含量的C-6位氧化的可德蘭多糖衍生物(Tamura et al.，Carbohydrate Polymers, 2010, 81: 592-598.)。脫氧膽酸是一種內源性生理物質，生物相溶性好，具有兩親性，在水中可自組裝形成膠束。但是，脫氧膽酸與氧化可德蘭多糖共聚物，通過超聲法製備納米粒子作為抗腫瘤藥物載體的研究尚未見任何文獻或專利報導。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在於提供一種脫氧膽酸基-氧化可德蘭多糖納米粒子及製備方法。本發明是一種新型，綠色，價廉易得，可規模化生產的納米載體，並可用於抗腫瘤藥物的包載，降低毒副作用，提高靶向性。
[0006]本發明提供的一種脫氧膽酸基-氧化可德蘭多糖納米粒子，它是以氧化可德蘭多糖、脫氧膽酸為原料，脫氧膽酸的羧基經1-乙基-(3- 二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCl)和N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)首先活化再與氧化可德蘭多糖反應合成。[0007]以醋酸鈉緩衝液為可德蘭多糖和4-乙醯胺-2，2，6，6-四甲基哌啶氧自由基反應，反應液在過量95%乙醇中沉澱，離心收集沉澱，水中溶解，透析，冷凍乾燥得到氧化可德蘭多糖；脫氧膽酸在無水二甲基亞碸中用1-乙基-(3- 二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCl)和N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)活化，再與氧化可德蘭多糖反應，產物在95%乙醇中沉澱，離心收集沉澱，水中溶解，透析，冷凍乾燥；最後水中分散，振搖，超聲，經微孔濾膜過濾，即得自組裝納米粒子。
[0008]本發明提供的一種脫氧膽酸基-氧化可德蘭多糖納米粒子及製備方法，按照下述步驟進行:
I)將可德蘭多糖、4-乙醯胺-2，2，6，6-四甲基哌啶氧自由基和氯酸鈉置於容器中，然後加入0.2 mol/L醋酸鈉緩衝液，用磁力攪拌器充分混勻，置於35°C恆溫水浴中，迅速加入次氯酸鈉，反應4 h，加入過量95%乙醇沉澱，離心收集沉澱，水中溶解，透析，冷凍乾燥，得到氧化可德蘭多糖；其中所述的可德蘭多糖、4-乙醯胺-2，2，6，6-四甲基哌啶、氯酸鈉、次氯酸鈉的摩爾比為6.0:0.45:6.0:1.0。
[0009]2)將脫氧膽酸溶於無水二甲基亞碸中，加入1-乙基-(3- 二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDOHCl)和N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)活化劑進行羧基活化反應，室溫下攪拌30 min ;其中所述的脫氧膽酸、1-乙基_ (3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀醯亞胺的摩爾比為1.0:2.5:2.0。
[0010]3)氧化可德蘭多糖通過加熱攪拌溶於無水二甲基亞碸中，加入活化的脫氧膽酸混合液，繼續在室溫下反應48 h，將混合液倒入95%乙醇中沉澱，離心並收集沉澱，水中溶解，透析，冷凍乾燥，得到白色絮狀物質；其中所述氧化可德蘭多糖重複糖單元、活化脫氧膽酸的摩爾比為1:0.5。
[0011]4)將脫氧膽酸基-氧化可德蘭多糖分散於水中，37°C恆溫水浴振蕩鍋中搖晃12^24 h，然後用探頭超聲儀100 W超聲2 min，採用間歇脈衝工作方式，超聲過程在冰浴中進行，重複兩次，經微孔濾膜過濾，即得脫氧膽酸基-氧化可德蘭多糖自組裝納米粒子。
[0012]所述的脫氧膽酸(疏水基團)可用膽酸、5 β_去羥基膽酸、亞油酸、亞麻酸、硬脂酸、軟脂酸等替換。
[0013]所述的可德蘭多糖的分子量為890000 Da。
[0014]所述的透析袋的截留分子量為800(Tl2000 Da。
[0015]本發明公開了一種脫氧膽酸基-氧化可德蘭多糖的合成及其納米粒子的製備方法。首先通過對可德蘭多糖進行選擇性氧化增強其水溶性，然後用活化的脫氧膽酸對其進行疏水改性，以得到一種兩親性的共聚物，以利於納米粒子的製備。探頭超聲法製備自組裝納米粒子方法簡單，重現性好，易於工業化生產。
[0016]本發明所述的脫氧膽酸基-氧化可德蘭多糖自組裝納米粒子形態呈球形，粒徑呈單峰分布。本載體由脫氧膽酸和氧化可德蘭多糖經化學結合而成，結構穩定，能夠用作抗腫瘤藥物載體，實現藥物緩釋和降低藥物毒副作用；該材料具有良好的生物相容性、可降解性，而且各種原料廉價易得，製備工藝簡單方便、條件溫和，是一種理想的抗腫瘤藥物的載體材料。【專利附圖】
【附圖說明】
[0017]圖1為氧化可德蘭多糖的13C-NMR譜圖。
[0018]圖2為脫氧膽酸基-氧化可德蘭多糖共聚物的1H-NMR譜圖。
[0019]圖3為脫氧膽酸基-氧化可德蘭多糖自組裝納米粒子的透射電鏡照片。
[0020]圖4為脫氧膽酸基-氧化可德蘭多糖自組裝納米粒子的粒徑分布圖。
【具體實施方式】
[0021]實施例1:氧化可德蘭多糖的化學合成
分別稱取1.4 g氯酸鈉、0.2 g 4-乙醯胺-2，2，6，6-四甲基哌啶氧自由基和2.0 g分子量為890000 Da的可德蘭多糖置於250 mL具塞錐形瓶中，加入200 mL 0.2 mol/L的醋酸鈉緩衝液，充分溶解後，置於35°C恆溫水浴中，迅速加入1.2 mL次氯酸鈉，反應4 h，加入過量95%乙醇沉澱，產物離心收集，蒸餾水透析三天，冷凍乾燥得白色絮狀物質。電導滴定法測得羧基含量為2.1 mmol/g。
[0022]氧化可德蘭多糖的碳核磁共振光譜(13C-NMR)見圖1 (溶劑:氘代重水:D20):與可德蘭多糖相比，在S 175 ppm出現羧基的碳信號峰，表明可德蘭多糖發生氧化。
[0023]實施例2:脫氧膽酸基-氧化可德蘭多糖共聚物的合成
將100 mg脫氧膽酸溶於20 mL無水二甲基亞碸中，加入120 mg 1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCl)和60 mg N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)，室溫下攪拌30min。然後將溶有0.2 g氧化可德蘭多糖的無水二甲基亞碸(DMSO)溶液20 mL，加入到上述脫氧膽酸的混合液中，室溫下繼續反應48 h，反應後將混合液倒入過量95%乙醇沉澱，離心收集沉澱，產物溶於水，蒸餾水透析三天，冷凍乾燥得白色絮狀物質，即為脫氧膽酸基-氧化可德蘭多糖共聚物。紫外分光光度法測得脫氧膽酸的取代度為5.0%。
[0024]所得的脫氧膽酸基-氧化可德蘭多糖的氫核磁共振光譜(1H-NMR)見圖2 (溶劑:氘代重水:氘代二甲基亞碸，D20/DMS0-d6，3/l，v/v);與氧化可德蘭多糖相比在δ 0.6-2.0ppm處出現脫氧膽酸的特徵峰，表明脫氧膽酸通過酯鍵連接到氧化可德蘭多糖上。
[0025]實施例3:脫氧膽酸基-氧化可德蘭多糖自組裝納米粒子的製備
取10 mg脫氧膽酸基-氧化可德蘭多糖分散於10 mL蒸餾水中，於37°C恆溫水浴振蕩鍋中輕輕搖晃12~24 h，然後用探頭超聲儀100 W超聲2 min，超聲採用脈衝工作方式，超聲重複兩次，微孔濾膜過濾即得脫氧膽酸基-氧化可德蘭多糖自組裝納米粒子。該納米粒子形態呈均勻的球形，見圖3 ;粒徑呈單峰分布，見圖4。
【權利要求】
1.一種脫氧膽酸基-氧化可德蘭多糖納米粒子及製備方法，其特徵在於按照下述步驟進行: 1)將可德蘭多糖、4-乙醯胺-2，2，6，6-四甲基哌啶氧自由基和氯酸鈉置於容器中，然後加入0.2 mol/L醋酸鈉緩衝液，用磁力攪拌器充分混勻，置於35°C恆溫水浴中，迅速加入次氯酸鈉，反應4 h，加入過量95%乙醇沉澱，離心收集沉澱，水中溶解，透析，冷凍乾燥，得到氧化可德蘭多糖；其中所述的可德蘭多糖、4-乙醯胺-2，2，6，6-四甲基哌啶、氯酸鈉、次氯酸鈉的摩爾比為6.0:0.45:6.0:1.0 ； 2)將脫氧膽酸溶於無水二甲基亞碸中，加入1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDOHCl)和N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)活化劑進行羧基活化反應，室溫下攪拌30min ;其中所述的脫氧膽酸、1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀醯亞胺的摩爾比為1.0:2.5:2.0 ; 3)氧化可德蘭多糖通過加熱攪拌溶於無水二甲基亞碸中，分別加入步驟2)中活化的脫氧膽酸混合液，繼續在室溫下反應48 h，將混合液倒入過量95%乙醇中沉澱，離心並收集沉澱，水中溶解，透析袋透析，冷凍乾燥，得到白色絮狀物質；其中所述氧化可德蘭多糖重複糖單元、活化脫氧膽酸的摩爾比為1:0.5 ; 4)將脫氧膽酸基-氧化可德蘭多糖分散於水中，37°C恆溫水浴振蕩鍋中搖晃12~24h，然後用探頭超聲儀100 W超聲2 min，採用間歇脈衝工作方式，超聲過程在冰浴中進行，重複兩次，經微孔濾膜過濾，即得脫氧膽酸基-氧化可德蘭多糖納米粒子。
2.根據權利要求1所述的一種脫氧膽酸基-氧化可德蘭多糖納米粒子及製備方法，其特徵在於步驟I)所述的可德蘭多糖的分子量為890000 Da。
3.根據權利要求1所述的一種脫氧膽酸基-氧化可德蘭多糖納米粒子及製備方法，其特徵在於步驟2)所述的脫氧膽酸為膽酸、5 β -去羥基膽酸、亞油酸、亞麻酸、硬脂酸、軟脂酸等替換。
4.根據權利要求1所述的一種脫氧膽酸基-氧化可德蘭多糖納米粒子及製備方法，其特徵在於步驟3)所述的透析袋的截留分子量為800(T12000 Da。
【文檔編號】C08J3/075GK103524760SQ201310467173
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月10日 優先權日:2013年10月10日
【發明者】閆景坤, 馬海樂, 王振斌, 裴娟娟 申請人:江蘇大學