一種豬鏈球菌2型表面細胞壁蛋白、其製備方法及用途的製作方法
2023-10-26 17:26:37
專利名稱：一種豬鏈球菌2型表面細胞壁蛋白、其製備方法及用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種細菌蛋白，具體地說涉及一種豬鏈球菌的表面細胞壁蛋 白，還涉及該蛋白質的製備方法以及用途。
背景技術：
豬鏈球菌(S^^tococcws^^),屬於蘭氏分類法的R群，有35個血清型， 以豬鏈球菌2型流行最廣，致病性最強。自丹麥在1968年最早報導人感染豬鏈 球菌病後，20世紀70年代以來，歐美部分國家和香港地區均報導過豬鏈球菌 病例，主要以腦膜炎為主，中毒性休克症候群(TSS)少見，未見暴發流行。 我國於1998年和2005年兩次在江蘇和四川暴發人感染豬鏈球菌2型疫情，不同 於國外人感染病例以腦膜炎為主的特點，臨床表現為休克型和腦膜炎型。多 數病例死於中毒性休克症候群(TSS)，病理改變主要表現為全身多器官受損， 敗血症伴瀰漫性血管內凝血(DIC)。人豬鏈球菌病已成為嚴重威脅我國人民 健康的一種新的人畜共患病，如何有效地預防和控制豬鏈球菌感染已成為科 學家們面臨的重要研究難題。
由於對毒力因子和保護性抗原了解甚少，同一血清型的菌株在不同的地 區毒力也不盡相同，高致病性豬鏈球菌感染缺乏有效的診斷耙標對該類病 原的分離鑑定主要依靠傳統的分離培養和生化鑑定，然後用豬鏈球菌高免血清進行凝集試驗分型。但家畜廣泛攜帶鏈球菌，許多菌株毒力低，因此僅僅 靠生化反應檢測豬鏈球菌是遠遠不夠的，必須建立針對特異毒力因子的檢測 手段，以區分弱毒株和強毒株。以上情況都阻礙了有效的豬鏈球菌病疫苗的 研製及對感染的及時診斷與控制。
縱觀國外豬鏈球菌病疫苗的研製情況，主要經歷了全菌免疫和抗原蛋白
免疫兩個階段。上世紀90年代，有研究者以福馬林滅活的豬鏈球菌進行靜 脈注射能剌激被免疫豬產生調理化的抗體[HoltME， EnrightMR， Alexander TJ. (1990 ) Immunisation of pigs with killed cultures of 5if，tococcws type 2. feit^48:23-7]。也有研究者通過篩選無毒力的豬鏈球菌突變體，如溫度 敏感性突變體、鏈黴素依賴性突變體等來獲得具有保護性的全菌疫苗[Kebede M， Chengappa MM, Stuart JG. ( 1990 ) Isolation and characterization of temperature-sensitive mutants of浙取ococcws sw&: efficacy trial of the mutant vaccine in mice.版M/cra6fo/. 22:249-57. Foster N， Staats JJ， Chengappa MM.
(1994 ) Isolation, characterization and protection studies in mice of a streptomycin-dependent mutant of Sfre; tococcws細's type 1/2. Cowi腦w. 18:155-63.]，但是滅活的全菌免疫常會引起免疫症候群等副作用。後續有研究 者利用豬鏈球菌相關毒力因子溶菌酶釋放蛋白(MRP)、胞外因子(EF)結 合油包水型乳劑(WO)和氫氧化鋁佐劑(AH)作為疫苗，對其保護性和毒副作用 作了評價，發現用MRP+EF/WO免疫的豬與用全菌/WO免疫的豬具有同等有 效的抗-MRP和抗-EF滴度，而且在免疫後的存活豬中，沒有觀察到明顯的 臨床表徵[WisselinkHJ， VechtU， Stockhofe-Zurwieden N， Smith HE. (2001) Protection of pigs against challenge with virulent微》serotype 2 strains by a muramidase曙released protein and extracellular factor vaccine. Vet Rec.148:473-7.]。也有人用純化的溶血素(SLY)作為疫苗免疫小鼠，發現能對小 鼠產生完全保護作用，免受毒力株的傷害[Jacobs AA， Loeffen PL， van den Berg AJ， Storm PK. (1994) Identification, purification, and characterization of a thiol-activated hemolysin (suilysin) of Sfreptococcws Infect Immun.
62:1742-8.]。但豬鏈球菌的毒力因子較常時間以來就呈現出時空上的相對多樣 性，雖然MRP、 EF與毒力高度相關，但與歐洲致病株不同的是多數加拿大 致病株不表達MRP和EF，且MRP和EF的2-型豬鏈球菌缺失突變體與野生 型一樣同樣具備毒力[Gottshalk M， Lebrun A， Wisselink HJ， Dubreuil JD， Smith HE, Vecht U. (1998) Production of virulence-related proteins by Canadian strains of 5^e/ tococcws sm's capsular type 2. Can J Vet Res 62:75-79.]。我國流行株禾口非 流行株都表達MRP，且動物實驗顯示流行株培養分泌的上清並不引起病變， 單靠現了解的MRP、 EF、 SLY等毒力因子不足以解釋我國2-型豬鏈球菌的致 病機理，使用MRP作為人免疫疫苗產生抗體中和MRP可能難以達到理想的 效果。而在國內，豬鏈球菌疫苗的研製還處於起步狀態，即滅活的全菌疫苗[王 卓，舒秀偉,王文成.豬鏈球菌病二價滅活疫苗候選株培養條件的優化及其安 全性試驗.(2004)中國藥獸雜誌.38: 34-36.]。因此有必要根據我國實際情況， 研製適合我國的2-型豬鏈球菌的新型疫苗，發掘新的具有免疫原性的毒力因 子是尋找新型疫苗的重要途徑。
一般來說，表面暴露蛋白和細胞壁附著蛋白常被作為疫苗的候選耙標和 血清學診斷試劑。近10年來，也有研究者試圖尋找有免疫原性的豬鏈球菌表 面細胞壁蛋白作為疫苗的候選分子，1996年Haataja S等分離並鑑定出一種半 乳糖抑制型黏附素，在23種血清型的豬鏈球菌中，用免疫印跡的方法均能檢 測到這種黏附素的存在，發現具有很強的免疫原性和調理功能，適合作為疫苗候選分子[HaatajaS, TikkanenK， HytonenJ， Finne J. (1996)The Gal alpha 1-4 Gal-binding adhesin of 5^ptococcus sm's， a gram-positive meningitis-associated bacterium. Adv Exp Med Biol. 408:25-34.] 。 2005年 Okwumabua O等人通過對2-型豬鏈球菌的全基因組進行篩選，發現一種分子 量為38kDa蛋白，具有很好的免疫原性和保護性,認為這種蛋白是較好的疫苗
候選分子並且適合用作診斷試劑的開發，這種蛋白的生物學功能以及與致病 機理的關係正在進一步研究中[OkwumabuaO， Chinnapapakkagari S. (2005) Identification of the gene encoding a 38-kilodalton immunogenic and protective antigen of 5^/ tococc^ Clin Diagn Lab Immunol. 12:484-90]。
目前在獲得具有免疫原性的蛋白方面，還缺乏有力的手段，傳統生物學 方法鑑定免疫原性蛋白是困難的，需要構建基因文庫，然後用相應血清篩選， 該方法耗時較長，不能實現高通量篩選，並可能存在假陽性反應。免疫蛋白 質組是一種快速、高效篩選候選診斷靶標的方法，通過將2D電泳解析度高 和質譜直接鑑定蛋白質的優勢結合，直接選取2D電泳膠上有免疫反應的蛋 白點，以質譜方法進行鑑定，因此，藉助免疫蛋白質組學手段則完全可能在 較短時間內快速高效的篩選並鑑定免疫原性蛋白，尤其對豬鏈球菌研究相對 較少的病原微生物來說，更有可能短時間內鑑定多個全新的免疫原性蛋白。
發明內容
本發明公開了一種豬鏈球菌2型新型表面細胞壁蛋白、其製備方法及用 途。本發明所公開的豬鏈球菌2型表面細胞壁蛋白具有序列表中序列1所示 的胺基酸序列，編碼該表面細胞壁蛋白的基因具有序列表中序列2所示的核 苷酸序列。該蛋白命名為SSU98—0267，其genebank編號為gi| 146320114。編碼該蛋白的基因在豬鏈球菌2型強致病力菌株中廣泛存在。
該表面細胞壁蛋白是通過免疫蛋白質組鑑定的2型豬鏈球菌新的免疫原 性抗原分子，目前根據豬鏈球菌基因組注釋的結果，僅有該基因開放閱讀框 架的預測，尚未有該蛋白在豬鏈球菌中表達的報導，也未有該基因功能的線 索。
本發明還公開了表達上述豬鏈球菌2型表面細胞壁蛋白的重組表達質 粒，其含有序列表中序列2的核苷酸序列。上述表達質粒可以為大腸桿菌表 達質粒，具體質粒可以是pET32a等。
本發明還公開了含有上述表達豬鏈球菌2型表面細胞壁蛋白的重組表達 質粒的菌株，該菌株為大腸桿菌，可以為BL21菌株。
本發明還公開了上述豬鏈球菌2型表面細胞壁蛋白的製備方法，該方法 包括如下步驟
首先克隆該表面細胞壁蛋白基因可通過PCR方法進行，首先設計合成 引物，在引物兩端可添加酶切位點和保護性鹼基，然後按照PCR方法，用豬 鏈球菌製備的模板，在一定條件下進行擴增，將擴增產物進行瓊脂糖凝膠電 泳，並回收產物並進行酶切，確定表面細胞壁蛋白基因。然後是表達該表面 細胞壁蛋白基因的重組質粒製備將製備的表面細胞壁蛋白基因與大腸桿菌 表達載體相連接，表達載體可以為原核表達載體，可採用商業的原核表達載 體，如大腸桿菌表達載體pET32a，製備表達載體，並轉化大腸桿菌，製備重 組菌，利用菌落PCR和限制性內切酶進行重組菌的篩選和鑑定；對重組菌進 行IPTG誘導表達；超聲波破碎重組菌，收集上清，以GE鎳親和層析柱進行 純化。
本發明還公開了上述表面細胞壁蛋白的用途。該蛋白可用作診斷靶標，在豬鏈球菌感染的動物和人血清中針對該蛋白的抗體明顯上升，因而可用於 開發豬鏈球菌感染的診斷試劑，同時又是重要的保護性抗原，可用於製備疫
苗。本發明還公開了表面細胞壁蛋白在製備豬鏈球菌2型疫苗中的應用。該 蛋白製備的免疫血清調理的全血殺傷實驗發現該蛋白具有相當的保護性，可 作為重點疫苗候選和診斷分子。
本發明首先將該表面細胞壁蛋白鑑定為豬鏈球菌2型新的免疫原性抗原 分子。己通過基因工程方法製備了該抗原並製備了相應抗體。通過抗體調理
的全血殺菌試驗證實該蛋白製備的免疫血清可顯著提高人全血的殺菌作用， 與豬鏈球菌全菌免疫血清的調理殺菌作用相當，是新的高效保護性抗原，可 作為重點疫苗候選分子。
圖1為重組質粒酶切圖譜。其中1為DNA分子量標準DL15000， 2為重 組質粒經EcoRI和Xhol酶雙酶切。
圖2為重組質粒表達圖譜，其中l-5為誘導後，6為誘導前，7為低分子 量蛋白標準，從上至下依次為97.4 kDa， 66.2 kDa， 43.0 kDa， 31.0kDa， 20.0kDa。
圖3針對SSU98—0267特異抗體的比較。病人和健康人的抗體水平比較 (A)，豬感染前後的抗體水平比較(B)。 ELISA實驗用於評價針對SSU98—0267 特異的抗體反應，硫氧還蛋白(Trx)用作陰性對照。
具體實施例方式
實施例一 豬鏈球菌2型表面細胞壁 蛋白SSU98一0267的表達純化及抗體製備1材料和方法 1.1菌株和質粒
豬鏈球菌2型98HAH12株[Chen C， Tang J， Dong W， Wang C， Feng Y， et al (2007) A Glimpse of Streptococcal Toxic Shock Syndrome from Comparative Genomics of S.suis 2 Chinese Isolates. PLoS ONE 2(3): e315]; BL21 ，均為國際 標準株；表達載體pET32a(+)為Novagen公司產品。 1.2酶和試劑
EcoRI和XhoI等限制性內切酶以及Taq酶、dNTPs 、 DL15000^ 量標準等 PCR所用試劑均為寶生物工程(大連)有限公司產品；DNA回收試劑盒為天 為公司產品；鎳親和層析柱為GE公司產品；質粒提取盒為V-gene公司產品； 弗氏完全佐劑及弗氏不完全佐劑為Sigma公司產品；Amp為中諾藥業產品。
1.3 PCR引物設計及SSU98J)267核酸序列，蛋白序列
根據所要擴增的片段,設計一對引物,引物兩端分別添加EcoRI和XhoI酶切 位點和保護性鹼基，引物P1和P2可擴增豬鏈球菌2型SSU98—0267基因開放 閱讀框(ORF)全長片斷。引物序列分別為
上遊弓I物P1: 5'國tagaattcagcaagcag咖gttgtgtc誦3，見序歹據中序歹lj3; 下遊引物P2: 5，-gcctcgagttcttcttttttgtttttgaatag -3，見序列表中序列4。 核酸序列> SSU98—0267 見序列表中序列2。 蛋白序列>SSU98_0267 見序列表中序列l。
1.4 PCR擴增
按下列順序和條件依次加入各反應物並進行PCR擴增。豬鏈球菌2型模 板DNA 2pL， lOXbuffer 5|tiL,2.5 mmol/L dNTPs 3 P L，引物P1和P2 ( 5 y mol/L ) 各l[iL, ddH20 37pL， LA-7b《酶(5U/uL) lpL。擴增的條件為；94 °C 7min;94°C lmin， 55°C lmin， 72°C 2min， 30個循環;72 °C 7min。 1.5PCR產物的回收和酶切
PCR產物在1%瓊脂糖凝膠電泳，後以DNA回收試劑盒回收目的片段， 並以EcoRI和XhoI 37"C酶切3h。 1.6重組質粒的構建和鑑定
在含有100ug/mLAmp的LB肉湯中接種攜帶pET32a空質粒的DH5 a 大腸桿菌單菌落，37T:搖振培養12 16h後，P/。轉接入100ug/mLAmp的 新鮮LB肉湯37匸搖振培養6h,以質粒抽提試劑盒抽提質粒。EcoRI和XhoI雙 酶切後，以DNA回收試劑盒回收酶切產物。將PCR雙酶切回收產物與空質 粒雙酶切回收產物進行連接，並轉化感受態的DH5ci宿主菌。感受態細菌的 製備、轉化均按常規方法進行，禾'」用菌落PCR和限制性內切酶酶切進行重組 菌的篩選和鑑定。 1.7重組質粒的測序和序列分析
重組質粒的序列測定採用Sanger雙脫氧末端終止法，由北京三博遠志生 物技術有限公司完成，以驗證其閱讀框架，並以BLAST軟體進行同源性分析。 1.8重組質粒在大腸桿菌中的表達和純化
將重組質粒按常規方法轉化感受態的大腸桿菌BL21 ，利用Amp抗性篩選 重組菌，挑單菌落接種LB肉湯中(含100ug/mLAmp)， 3(TC劇烈搖振培養2 4h，當菌液濃度OD6oo達0.5 0.6時，加IPTG至終濃度lmmol/L， 3(TC繼續 劇烈搖振培養2 4h。 6000r/min離心10min ，沉澱以蒸餾水重懸，加等體積 的2X電泳上樣緩衝液煮沸10min， SDS-PAGE檢測。含空pET32a(+)的大腸杆 菌BL21亦同樣經IPTG誘導處理後，SDS-PAGE檢測表達情況。以超聲波破碎 誘導的重組菌，收集上清，以GE鎳親和層析柱進行親和層析，具體步驟按使用說明書進行。
1.9重組蛋白動物免疫試驗
將收集的蛋白以PH7.2 10mmol/L的PBS稀釋至0.1mg/ml，加入等量的弗氏 完全佐劑，皮下免疫Wistar大鼠(購自軍事醫學科學院試驗動物中心)，0.5m1/ 只；以後3 — 5周，分別以0.2， 0.4， 0.8， 1.6mg/ml加弗氏不完全佐劑加強免疫， 第7周斷尾取血ELISA法測抗體效價。同時設立全菌免疫對照組和空白對照組 (pET32a空質粒轉化BL21，誘導表達Trx蛋白，以此蛋白免疫大鼠為空白對 照)。以硫酸銨沉澱法製備抗血清。 2.結果
2.1PCR結果PCR產物經電泳後，出現一條2298bp的條帶，大小與預期一 致。
2.2重組質粒的鑑定
SSU98—0267基因片段經回收，以EcoR I和Xho I酶切位點定向克隆至 pET-32a中，獲得重組質粒，命名為SSU98—0267-pET-32a。重組質粒轉化感受 態的DH5a宿主菌，經Amp抗性篩選得到重組菌。提取重組質粒，經EcoR I 和XhoI雙酶切，可切出約3000bp左右的片斷，說明SSU98一0267片段已成功 克隆，見圖l。 2.3重組質粒的表達
重組BL21轉化菌經IPTG誘導後，菌體SDS-PAGE顯示有一條100kD的蛋 白帶，而含誘導前的菌在該處無特異條帶，見圖2。經鎳柱純化獲得純化的 SSU98J)267蛋白。 2.4測序結果和序列分析
克隆的序列長度經測序為2298bp，如序列表中序列2所示，翻譯後為765個胺基酸殘基，見序列表中序列l。
實施例二豬鏈球菌2型表面細胞壁蛋白 SSU98一0267的免疫原性及抗體介導的調理吞噬試驗 1.1重組豬鏈球菌2型表面細胞壁蛋白SSU98一0267和多抗的製備見實施例
1.2 SSU98一0267抗體介導的調理吞噬
血平板刮取豬鏈球菌2型單菌落，接入THB培養基，37°C， C02孵箱培養 8h後轉接新鮮THB培養基培養8h至對數生長期。取lml菌液(約l X 108CFU/ml) 13，000rpm， lmin集菌，PBS洗菌並重懸，調整至l(^CFU/ml，塗血平板，記 為初始菌量。取50pl (^106CFU/ml)菌液加入10(Hd抗體，37。Cl5min後冰上 15min;加入350pl健康人全血37。C ， 3h;加入551 % saponin,冰上20min; 反覆吹打後稀釋塗血平板，16h後血平板記數單克隆。 1.3感染豬與人中SSU98—0267蛋白特異抗體測定
採用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定病人和感染動物中針對該蛋白的 特異抗體，採用健康人的血清和感染前的動物血清作為對照。採用5pg/ml的 重組蛋白包被酶聯板，包被緩衝液為0.05 M NaHC03 (PH 9.6) ， 4。C包被過 夜，然後採用3% BSA 37 °C封閉3 h。病人和健康人血清樣品1:500稀釋， 感染前後豬血清均1:200稀釋，反應信號通過辣根過氧化物酶(HRP)標記 的二抗進行檢測。 2.結果
2.1重組蛋白抗體介導的調理吞噬作用
經GE鎳親和層析柱層析獲得純化的重組蛋白SSU98J)267，分別加弗氏完全和不完全佐劑免疫後，製備抗血清，進行間接殺菌試驗。殺菌率計算
(CFUrTrx—CFUr98—0267) /CFUrTrx。 Trx為從含pET32a (+)空載體的大腸杆 菌BL21鎳柱純化的硫氧還蛋白。
抗體介導的調理吞噬試驗分別用SSU98J)267重組蛋白；MRP重組蛋白 免疫大鼠後的大鼠血清調理健康人血，進行人全血對豬鏈球菌2型活菌的殺傷 試驗。SSU98—0267重組蛋白的抗血清調理人全血對豬鏈球菌2型的殺傷率為 50%左右，但略低於MRP蛋白的抗血清，同樣條件下MRP蛋白的抗血清調理 人全血對豬鏈球菌2型的殺傷率為90%左右。 2.2感染的人和豬血清中SSU98—0267特異抗體檢測
我們檢測了 6名豬鏈球菌2型感染的病人和5名健康人血清中 SSU98—0267特異抗體的存在狀況，結果發現與健康人相比，病人SSU98—0267 特異抗體水平明顯升高，見圖3A。我們檢測了豬鏈球菌2型感染豬前後血清 中SSU98—0267特異抗體的存在狀況，結果發現與感染前相比，感染後血清 中SSU98—0267特異抗體水平顯著升高，見圖3B。上述實驗結果表明 SSU98 0267可作為診斷耙標用於豬鏈球菌2型感染的血清學診斷。<110〉
<120〉
<160〉
<170〉
<210〉 <212〉 <213〉
<400〉
豬鍊表面細胞壁蛋白0267. SEQ 序歹U 表
中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所 一種豬鏈球菌2型表面細胞壁蛋白、其製備方法及用途
4
Patentln version 3.2 1
765 PRT
1
Met Ser Lys Gin Lys Val Val Ser Ser Leu Leu Leu Ser Thr Val Val
1 5
10
15
Leu Gly Gly Leu Ala Phe Tyr Ser Thr Thr Thr Val Lys Ala Glu Ser 20 25 30
Leu Glu Pro Asp Val Thr Ser Val Asn Ala Ser Asp Ala Thr Asn Lys
35 40
45
Pro Val Val Pro Asn Glu Glu Gly Gly Asp Phe Leu Ala Glu Glu Glu
50 55
60
Leu Glu Asp Asp Asp Thr Leu Glu Glu Glu Leu Asn Glu Lys Ala Glu 65 70 75 80
Glu Val Thr Glu Pro Ser Ser Pro Glu Ala Leu Leu Gin Pro Arg Ala 85 90 95
Met Met Ser Asp Ser Glu Thr Ser Gly Met Glu Glu lie Pro Met Asn 100 105 110
Asp Glu Pro Ser Asp Asn Thr Glu Glu Lys Val Glu Lys Gin Gin Ser
115 120
125
Pro Leu lie Gin Thr Ser Asn Ala Asp Tyr Lys Ser Gly Lys Asp Gin
130 135
140
Glu Lys Leu Arg Thr Ser Val Ser lie Asn Leu Leu Lys Ala Glu Glu
145 150
155
160
Gly Gin lie Gin Trp Lys Val Thr Phe Asp Thr Ser Glu Trp Ser Phe 165 170 175
Asn Val Lys His Gly Gly Val Tyr Phe lie Leu Pro Asn Gly Leu Asp 180 185 190
Leu Thr Lys lie Val Asp Asn Asn Gin His Asp lie Thr Ala Ser Phe195
200
豬鍊表面細胞壁蛋白0267. SEQ 205
Pro Thr Asp lie Asn Asp Tyr Arg Asn Ser Gly Gin Glu Lys Tyr Arg 210 215 220
Phe Phe Ser Ser Lys Gin Gly Leu Asp Asn Glu Asn Gly Phe Asn Ser
225
230 235
240
Gin Trp Asn Trp Ser Ala Gly Gin Ala Asn Pro Ser Glu Thr Val Asn
245 250
255
Ser Trp Lys Ser Gly Asn Arg Leu Ser Lys lie Tyr Phe lie Asn Gin
260 265
270
lie Thr Asp Thr Thr Glu Leu Thr Tyr Thr Leu Thr Ala Lys Val Thr 275 280 285
Glu Pro Asn Gin Gin Ser Phe Pro Leu Leu Ala Val Met Lys Ser Phe 290 295 300
Thr Tyr Thr Asn Ser Lys Ser Thr Glu Val Thr Ser Leu Gly Ala Arg
305
310 315
320
Glu lie Thr Leu Glu Lys Glu Lys Thr Leu Pro Pro Lys Glu Asn Pro
325 330
335
Lys Pro Glu Pro Glu Ala Pro Lys Pro Asp Ala Pro Gin Ala Pro Ser
340 345
350
Ala Pro Glu Ser Pro Thr Glu Glu Pro Lys Lys Glu Asp Ala Pro Gin 355 360 365
Thr Pro Gin Ala Pro Ser Thr Pro Glu Lys Gin Pro Glu Val Pro Glu 370 375 380
Ser Pro Asn Pro Glu Thr Pro Asp Ala Pro Ser Thr Pro Lys Asp Glu 385 390 395 400
Pro Gin Ala Pro Ser lie Pro Glu Glu Lys Pro Gin Val Pro Glu Glu
405 410
415
Pro Lys Gin Glu Ala Pro Ser Ala Pro Ser Thr Pro Glu Lys Gin Pro
420 425
430
Glu Ala Pro Glu Ser Pro Thr Glu Glu Pro Lys Lys Glu Asp Ala Pro 435 440 445
Ala Pro Ser Thr Pro Glu Lys Gin Pro Glu Val Pro Glu Ser Pro Asn 450 455 460
Pro Glu Thr Pro Asp Ala Pro Ser Thr Pro Lys Asp Glu Pro Gin Val豬鍊表面細胞壁蛋白0267. SEQ 465 470 475 480
Pro Ser lie Pro Glu Glu Gin Pro Lys Glu Thr Pro Ala Pro Glu Glu 485 490 495
Pro Lys Lys Glu Asp Thr Pro Gin Thr Pro Gin Ala Pro Ser Thr Pro 500 505 510
Lys Glu Glu Ala Pro Lys Glu Glu Val Pro Thr Pro Pro Ala Pro Ser 515 520 525
Val Pro Glu Glu Gin Pro Lys Glu Thr Pro Thr Pro Glu Val Pro Lys 530 535 540
Gin Glu Asp Val Gin Pro Glu Ala Pro Lys Ser Asp Lys Val Glu Ser 545 550 555 560
Asp Lys Gin Met Pro Glu Thr Lys Lys Pro Asp Met Lys Gin Pro Lys 565 570 575
Ala Asp Asp Met Pro Lys Glu Gin Lys Pro Lys Ala Asp Glu Pro Lys 580 585 590
Ala Glu Gin Pro Gin Met Asp Lys Pro Gin Met Glu Ala Pro Lys Lys 595 600 605
Asp Ser Glu Ala Pro Lys Ser Asp Lys Val Glu Thr Asp Lys Gin Leu 610 615 620
Pro Glu Thr Lys Gin Pro Asp Met Lys Gin Pro Lys Ala Asp Asp Met 625 630 635 640
Pro Lys Glu Gin Lys Pro Lys Ala Asp Glu Pro Lys Ala Glu Gin Pro 645 650 655
Gin Met Asp Lys Pro Gin Met Glu Ala Pro Lys Lys Asp Ser Glu Ala 660 665 670
Pro Lys Ser Asp Lys Val Glu Thr Asp Lys Pro Met Pro Glu Thr Lys 675 680 685
Gin Pro Asp Met Lys Gin Pro Lys Ala Asp Lys Pro Glu Ala Glu Lys 690 695 700
Ala Gin Met Pro Arg Thr Glu Gly Met Lys Pro Glu Ser Lys Ala Ser 705 710 715 720
Met Met Pro Lys Ala Glu Ala Pro Lys Ala Thr Leu Pro Asn Thr Gly 725 730 735
Glu Ala Ser Ser Ala lie Gly Trp Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Leu豬鍊表面細胞壁蛋白0267. SEQ 740 745 750
Ala Thr Gly Leu Tyr Leu Phe Lys Asn Lys Lys Glu Glu 755 760 765
2
2298
<212〉 腿
2
atgagcaagc3g犯agttgtgtccagtttattattaagcacagtcgtatt3ggggg3tta60
gccttttattc犯cg3caacggttaaagcagaatcgctagaaccagatgttacatcagtt120
aatgcaagcgatgctactaagtaccaaatg犯g鄉g鄉cgacttttta180
gctgaagagg3gCttg犯g3tgatgacactttggaagaagaattaaatgagaaagccgaa240
gaggttactgagccatcttcacctgaagcacttctccaacctcgtgcgatgatgagtgat300
tctgaaactagtggtatggaaga犯ttccgaaccttcagataatacggaa360
g,aggtagagaagcaacagtcgccattaattcaaacctcaaatgcagattat幼aagt420
ggtaaagatca^gaigaaacttaggacatcagtatctataaatctgttgaaggcggaagaa■
ggtcagattcagtggaaagtaacttttgatacaagcgaatggtcttttaatgttaaacat540
gggggtgtttattttattcttccaaatggtttggacttaacaaagattgttgataataat600
caacatgatataacagcctccttccctacggatattaatgattacagaaattctggtcaa660
gtttctttagtagtaaacaaggtcttgacaacgaaaatggttttaattct720
caatggaactggtctgctggtcaagctaatcctagtgaaacagtaaacagttggaaatca780
ggcaatcgtttgtctaagatttatttcataaat c aaat aacagatactaccgaattgacc840
tatactttaactgctaaggtaactgaaccaaatcagcaatcattccctcttctggcagtg900
atgaagagctttacgtatacaaactctaagagtacagaggttacttcgctaggtgcacgt960
gagattacccttgagaaagaaaaaac t c t accacctaaggag犯tccaaaaccagagcca1020
gaagctccaaaaccagacgctccacaagcgccatcagcaccggaatctccaacggaagaa1080
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gaagttcca_￡iaacaagaagatgttcaaccggaagcgccaaaatctgataaetgtagaatct1680豬鍊表面細胞壁蛋白0267.SEQ
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<210〉 3 <211〉 28 <212〉 DNA
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<210〉 4 32 腿
4 gcctcgagttcttcttttttgtttttgaat3權利要求
1.一種豬鏈球菌2型表面細胞壁蛋白，其特徵在於具有序列表中序列1的胺基酸序列。
2. 根據權利要求1的表面細胞壁蛋白，其編碼基因具有序列表中序列2 的核苷酸序列。
3. —種表達豬鏈球菌2型表面細胞壁蛋白的重組表達質粒，其特徵在於 含有序列表中序列2的核苷酸序列。
4. 根據權利要求3所述的重組表達質粒，其中表達質粒為大腸桿菌表達 質粒pET32a。
5. —種表達豬鏈球菌2型表面細胞壁蛋白的菌株，其特徵在於含有權利 要求3所述重組表達質粒。
6. 根據權利要求5所述菌株，其中表達菌株為大腸桿菌BL21。
7. 權利要求1或2所述表面細胞壁蛋白的製備方法，包括如下步驟-(1) 克隆該表面細胞壁蛋白基因；(2) 將基因與大腸桿菌表達質粒相連接，轉化大腸桿菌；(3) 誘導表達；(4) 對表達產物進行分離純化。
8. 根據權利要求7所述方法，其中大腸桿菌表達質粒為pET32a，大腸杆 菌為￡. co//BL21。
9. 權利要求1或2所述的表面細胞壁蛋白在製備豬鏈球菌2型感染診斷 試劑中的應用。
10. 權利要求1或2所述的表面細胞壁蛋白在製備豬鏈球菌2型疫苗中的 應用。
全文摘要
本發明公開了一種豬鏈球菌2型表面細胞壁蛋白，其genebank編號為gi|146320114，還公開了該蛋白質的製備方法及用途。該蛋白質可用作診斷靶標，在豬鏈球菌感染的病人可檢測到該蛋白特異的抗體。同時又是重要的保護性抗原，可用於製備疫苗。
文檔編號C07K14/195GK101613400SQ20081011551
公開日2009年12月30日 申請日期2008年6月25日 優先權日2008年6月25日
發明者姜永強, 煒 張, 李文君, 耿紅冉, 媛 袁, 鄭玉玲 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所