萎葉葉子提取物抗利什曼原蟲的活性的製作方法
2023-10-26 21:26:22
專利名稱：萎葉葉子提取物抗利什曼原蟲的活性的製作方法
技術領域：
本發明涉及萎葉提取物治療動物包括人的利什曼病的用途。近些年對內臟利什曼病的化學療法進展很小。萎葉葉子提取物抗利什曼原蟲的活性提示它在治療人內臟利什曼病的潛在用途。
背景技術：
在印度通常稱為黑熱病的利什曼病是一個全球性的健康問題。利什曼原蟲屬的多個種和株系的感染會引發人的許多疾病，並且這些疾病的臨床症狀有許多不同。疾病的嚴重程度主要取決於被感染個體的免疫狀態和所涉及的利什曼原蟲屬的種。在80個國家，估計約有350百萬人受到此疾病的威脅。世界衛生組織(WHO)估計全世界有12百萬例利什曼病，每年有超過400,000新病例。內臟型利什曼病或稱黑熱病，是由寄生蟲多氏利什曼蟲(Leishmania donovani)引起的，並且經常是致命的。近年來，雖然在對利什曼原蟲的生物化學和分子生物學的認識方面有了很大進展，但用化學療法進行的治療卻幾乎沒有進展。有毒的五價銻劑仍是治療利什曼病的主要方法。雖然臨床使用二線藥物，噴他脒和兩性黴素B，但它們存在嚴重的毒副作用。因此對利什曼病的改進藥物療法仍然是吸引人的。最近吲哚基喹啉衍生物已在體外顯示出對多氏利什曼蟲前鞭毛型和無鞭毛型的細胞毒性，並且對治療鼠類內臟利什曼病是有效的(GanesChakrabarti，Anirban Basu，Partha Pratim Manna，Sashi Bhusahan Mahato，Nirup Bikash Mandal和Santu Bandyopadhyay，Journal of AntimicrobialChemotherapy(1999)Vol.43pp.359-366)。
萎葉葉子有強的刺激性的芳香氣味並作為咀嚼劑在廣泛應用。通常將已停止生長但還未變脆的成熟或過熟的葉用於咀嚼。咀嚼用的鹼性製劑由塗有熟石灰和兒茶的萎葉葉子並加入檳榔果的碎屑組成；根據個人口味還使用調味料如椰蓉、丁香、小豆蔻、茴香、甘草粉、肉豆蔻以及菸草。在一些地方，製備用鍋鍍有銀或金葉。作為咀嚼劑有許多性質是可信的它是芳香的，可助消化，可引起刺激和驅風止痛。在藥學上，可用於黏膜炎和肺部疾患；它也用於泥敷劑。將萎葉和檳榔果及其他輔劑一起咀嚼的效果是興奮唾液腺和刺激口腔黏膜。產生的紅色是由於檳榔果中的色素所致，這一現象表明它本身受到石灰中的鹼和兒茶的作用。產生了溫和的刺激，除有令人愉快的氣味外，還導致溫暖和良好的感覺。判斷該葉作為芳香劑價值的最重要的因素是所含精油的量和特別是其性質。來自不同區域的萎葉葉子氣味和味道不同。刺激性最強的是三七類(Sanchi type)，而最溫和、甜的是來源於馬德拉斯的(Madras)。萎葉葉子含精油，根據葉的種類的不同，油的含量從0.7％至2.6％。油由酚類和萜類組成。酚油的比例越高，質量越好。稱為萎葉酚(萎葉酚；4-烯丙基-2-羥基-1-甲氧基苯)的丁子香酚的一種異構體被認為是萎葉油的特徵組分。然而在印度的樣品中不含該組分。印度種的萎葉油主要含有酚類組分。萎葉油已用於各種呼吸道黏膜炎的治療中，如在治療白喉時採用漱口劑或吸入劑作為局部應用。它具有驅風性能。它對哺乳動物的中樞神經系統顯示不同的作用；致死量產生在幾個小時內導致死亡的深度昏迷。葉子的精油和提取物有抗多種格蘭氏陽性和格蘭氏陰性菌-例如白色化膿微球菌(Micrococcus pyogenes var.A1bus)和金黃色化膿微球菌(var.aureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和巨大芽孢桿菌(B.Megaterium)、肺炎雙球菌(Diplococcus pneumoniae)、釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)、大腸埃希氏菌(Escherichia coli)、傷寒沙門氏菌(Salmonella typhosa)、逗號弧菌(Vibrio comma)、痢疾志賀氏菌(Shigella dysenteriae)、普通變形桿菌(Proteus vulgaris)、茄伯克霍爾德氏菌(Pseudomonas solanacaerum)、藤黃八疊球菌(Sarcina lutea)和胡蘿蔔軟腐歐文氏菌(Erwinia carotovora)-的活性。精油和葉子的提取物也顯示對抗黑色曲菌(Asperigillus niger)、米曲菌(A.oryzae)、新月彎孢(Curvularia lunata)和尖孢鐮孢(Fusarium oxysporum)的抗真菌活性。人們發現該油使原生動物門大草履蟲(Paramaecium caudatum)在約5分鐘內致死(印度財富(Wealth of India)，第8卷，84-94頁)。
發明目的本發明的主要目的是通過施用萎葉葉子提取物、凍幹提取物或含有萎葉葉子提取物的組合物的方式用萎葉葉子提取物治療動物-包括人利什曼病。
本發明的另一目的是提供可用於治療人利什曼病的含有萎葉葉子提取物的組合物。
本發明的又一個目的是萎葉葉子水提取物的製備方法。
在另一實施方案中，以不影響萎葉葉子提取物的活性的方式選擇添加劑。
在另一實施方案中，添加劑選自含有蛋白質、碳水化合物、糖、滑石、硬脂酸鎂、纖維素、碳酸鈣、澱粉-明膠漿和/或藥學可接受的載體的營養物組。
在另一實施方案中，萎葉葉子提取物經口或肌內給藥。
在又一實施方案中，將萎葉葉子提取物配製成口服的膠嚢、糖漿劑、濃縮物、粉劑或顆粒劑。
在另一實施方案中，萎葉葉子提取物與添加劑的比例在10-1的範圍內。
在另一實施方案中，萎葉葉子提取物是以10-20mg/kg體重的劑量水平給藥的。
在另一實施方案中，萎葉葉子提取物或含萎葉葉子提取物的組合物隔天給藥至少3周，優選1周。
在另一實施方案中，萎葉葉子提取物可以在體外降低前鞭毛型多氏利什曼蟲生存力57-79％，並降低脾和肝寄生蟲荷載量93-95％。
在本發明的另一實施方案中，萎葉葉子提取物或組合物用於治療內臟利什曼病或黑熱病。
在本發明的另一實施方案中，萎葉葉子提取物或凍幹提取物或組合物與藥學可接受的添加劑共同或聯合給藥。
在本發明的另一實施方案中，選擇不影響萎葉葉子提取物的活性的添加劑。
在本發明的另一實施方案中，添加劑選自含有蛋白質、碳水化物、糖和藥學可接受的載體的營養物組。
在本發明的另一實施方案中，萎葉葉子提取物或組合物經口或肌內給藥。
在另一實施方案中，將萎葉葉子提取物配製成口服的膠囊劑、糖漿劑、濃縮劑、粉劑或顆粒劑。
在本發明的另一實施方案中，萎葉葉子提取物與添加劑的比例在10-1的範圍內。
在本發明的另一實施方案中，萎葉葉子提取物以10-20mg/kg體重的劑量水平給藥。
在本發明的另一實施方案中，萎葉葉子提取物或含萎葉葉子提取物的組合物隔天給藥至少3周，優選1個月。
在本發明的另一實施方案中，萎葉葉子提取物在體外降低前鞭毛型多氏利什曼蟲生存力達57-79％，並降低脾和肝寄生蟲荷載量93-95％。
在本發明的另一實施方案中，通過將萎葉葉子提取物或凍幹提取物的藥學可接受的組合物給藥以治療內臟利什曼病或黑熱病的方法。
在另一實施方案中，通過粉碎萎葉葉子，或用水或有機溶劑如醇、四氯化碳、氯仿和丙酮提取粉碎後的葉子，得到萎葉葉子提取物。
本發明的另一個實施方案涉及製備萎葉葉子提取物，包括以下步驟i)洗萎葉的鮮葉，並在混合攪拌器內均質化；ii)在超聲浴中用每15分鐘2-3個超聲脈衝發射波(burst)超聲提取，並過濾提取物，如果需要，重複提取過程至少1次並乾燥；並iii)凍幹提取物得到半固體團塊。
在本發明的另一實施方案中，萎葉葉子選自野生型(Wild type)、攀援型(Climber type)、Bangla型和甜蜜型(Sweet type)。
萎葉葉子提取物在體外對前鞭毛型多氏利什曼蟲生存力的作用從野生型、Bangla型和甜蜜型萎葉葉子製備的提取物在以劑賴方式降低多氏利什曼蟲前鞭毛型生存力方面幾乎等效(表1)。終濃度為12mg/ml的從野生類型萎葉葉子得到的提取物降低前鞭毛型多氏利什曼蟲的生存力79％。另一方面，從Bangla型或甜蜜型萎葉葉子得到的提取物在同樣的濃度-即12mg/ml降低前鞭毛型生存力分別為57.5％和68.9％。因此，野生型的萎葉葉子提取物比其他類型萎葉葉子提取物顯示稍強的抗利什曼原蟲活性。
對附圖的簡要說明
圖1多氏利什曼蟲感染的金倉鼠經用PBS和萎葉葉子提取物治療後，以吉姆薩染色的肝和脾塗片的顯微照片。
以解釋的方式給出以下實施例，只用來詳細說明，不應將這些實施例理解為以任何方式來限制本發明的範圍。
iii.用Intersil ODS-3(4.6×250mm)分析柱對活性物質進行HPLC分析，溶劑系統為甲醇-水(4∶1)，流速為1.0ml/min.，在217nm檢測，發現此物質分為11個峰，保留時間分別為2.69、4.27、5.95、6.97、7.49、9.39、11.20、12.40、15.53、18.90和21.49分鐘。
表1
萎葉葉子提取物降低前鞭毛型多氏利什曼蟲的體外生存活力
實施例5萎葉葉子提取物體內抗利什曼原蟲活性在金倉鼠體內測定萎葉葉子提取物抗利什曼原蟲的活性。心內注射新鮮製備的無鞭毛型多氏利什曼蟲(1×107/只倉鼠)使金倉鼠(4-6周齡)感染。感染1天後將金倉鼠分成3組(5隻動物/組)；一組接受肌內注射野生型萎葉葉子提取物(10mg/kg體重，隔日)，每隻動物接受共15次注射。另一組通過經口途徑接受同樣劑量(10-mg/kg體重，隔日)的野生型萎葉葉子提取物。對照組的動物經口隔日接受PBS。末次處理後1周，即注射5周後處死全部動物。用吉姆薩染色後，從壓制的塗片檢查脾和肝的寄生蟲荷載量。用下式表示每個器官中所荷載的寄生蟲量器官重量(mg)×每細胞核的無鞭毛型數量×[2×105]濃度為10mg/kg體重的萎葉葉子提取物對降低多氏利什曼蟲感染的倉鼠脾和肝中寄生蟲荷載量是有效的。肌內和經口兩種途徑是等效的。採用這兩種途徑，寄生蟲荷載量降低百分數在93-95％之間。結果示於表2和
圖1。
表2用萎葉葉子提取物治療多氏利什曼蟲感染的金倉鼠
*-3-5個動物的平均值±S.D**-2個動物的平均值如表-2和
圖1所示，濃度為10mg/kg體重的萎葉葉子提取物在降低多氏利什曼蟲感染的金倉鼠脾和肝寄生蟲荷載量方面是有效的。注意的是兩種途徑，即肌內或經口幾乎等效。採用這兩個途徑，寄生蟲荷載量降低的百分數為93-95％。
權利要求
1.萎葉葉子提取物或含萎葉葉子提取物的組合物治療動物包括人內臟利什曼病或黑熱病的用途，包括將藥學有效量的萎葉葉子提取物單獨或與添加劑組合對動物包括人給藥的步聚。
2.根據權利要求1所述的用途，其中萎葉葉子提取物或含萎葉葉子提取物的組合物與藥學可接受的添加劑聯合或組合給藥。
3.根據權利要求1所述的用途，其中選擇的添加劑不幹擾萎葉葉子提取物的活性。
4.根據權利要求1所述的用途其中添加劑選自含有蛋白質、碳水化合物、糖、滑石、硬脂酸鎂、纖維素、碳酸鈣、澱粉-明膠糊和/或藥學可接受的載體的營養物組。
5.根據權利要求1所述的用途，其中萎葉葉子提取物或含萎葉葉子提取物的組合物經口或肌內途徑給藥。
6.根據權利要求1所述的用途，其中將萎葉葉子提取物製成經口給藥的片劑、糖漿劑、濃縮物、粉劑或顆粒劑。
7.根據權利要求1所述的用途，其中萎葉葉子提取物與添加劑的比例在1-10∶10-1之間。
8.根據權利要求1所述的用途，其中萎葉葉子提取物或組合物以10-20mg/kg體重的劑量水平給藥。
9.根據權利要求1所述的用途，其中萎葉葉子提取物或含提取物的組合物隔天給藥至少3周，優選1周。
10.根據權利要求1所述的用途，其中萎葉葉子提取物或組合物降低前鞭毛型多氏利什曼蟲體外生存力57-79％，降低脾和肝寄生蟲荷載量93-95％。
11.根據權利要求1所述的用途，其中所用萎葉葉子提取物有以下性質i)乾燥的樣品是深色的物質，溶於水和二甲基亞碸；ii)在正丁醇、醋酸、水的比例分別為9∶5∶7的溶劑系統中，活性物質的薄層色譜顯示Rf分別為0.75、0.64、0.50、0.40和0.33的5個點；iii)用Intersil ODS-3(4.6×250mm)分析柱對活性物質進行HPLC分析，溶劑系統為4∶1比例的甲醇-水，流速為1.0ml/min.，在217nm檢測，發現此物質分成11個峰，保留時間分別為2.69、4.27、5.95、6.97、7.49、9.39、11.20、12.40、15.53、18.90和21.49分鐘。
12.治療動物包括人類內臟利什曼病或黑熱病的藥物組合物，此組合物含有有效量的萎葉葉子提取物及藥學可接受的添加劑。
13.根據權利要求12所述的組合物，其中選擇的添加劑不影響萎葉葉子提取物的活性。
14.根據權利要求12所述的組合物，其中的添加劑選自含有蛋白質、碳水化合物、糖、滑石、硬脂酸鎂、纖維素、碳酸鈣、澱粉-明膠漿和/或藥學可接受的載體的營養物組
15.根據權利要求12所述的組合物，其中組合物經口或肌肉內途徑給藥。
16.權利要求12所述的組合物，其中將萎葉葉子提取物製成經口給藥的膠囊劑、糖漿劑、濃縮物、粉劑或顆粒劑。
17.根據權利要求12所述的組合物，其中萎葉葉子提取物與添加劑的比例在1-10∶10-1之間。
18.根據權利要求12所述的組合物，其中萎葉葉子提取物或組合物以10-20mg/kg體重的劑量水平給藥。
19.根據權利要求12所述的組合物，其中萎葉葉子提取物或含提取物的組合物隔天給藥至少3周，優選1周。
20.根據權利要求12所述的組合物，其中組合物降低前鞭毛型多氏利什曼蟲體外生存力57-79％，降低脾和肝寄生蟲荷載量93-95％。
21.根據權利要求12所述的組合物，其中所用的萎葉葉子提取物有以下性質i)乾燥的樣品是深色的物質，溶於水和二甲基亞碸；ii)在正丁醇、醋酸、水的比例分別為9∶5∶7的溶劑系統中，活性物質的薄層色譜顯示Rf分別為0.75、0.64、0.50、0.40和0.33的5個點；iii)用Intersil ODS-3(4.6×250mm)分析柱對活性物質進行HPLC分析，溶劑系統為4∶1比例的甲醇-水，流速為1.0ml/min.，在217nm檢測，發現此物質分成11個峰，保留時間分別為2.69、4.27、5.95、6.97、7.49、9.39、11.20、12.40、15.53、18.90和21.49分鐘。
21.治療動物包括人內臟利什曼病或黑熱病的方法，包括將藥學有效量的萎葉葉子提取物或含萎葉葉子提取物的組合物對動物給藥。
22.根據權利要求22所述的方法，其中組合物含有效量的萎葉葉子提取物與藥學可接受的添加劑。
23.根據權利要求22所述的方法，其中的添加劑選自營養物，例如蛋白質、碳水化合物、糖、滑石、硬脂酸鎂、纖維素、碳酸鈣、澱粉-明膠漿和/或藥學可接受的載體、賦形劑、稀釋劑或溶劑。
24.根據權利要求22所述的方法，其中萎葉葉子提取物或含萎葉葉子提取物的組合物經口或肌內途徑給藥。
25.根據權利要求22所述的方法，其中經口途徑是以膠囊劑、糖漿劑、濃縮物、粉劑或顆粒劑形式進行的。
26.根據權利要求22所述的方法，其中萎葉葉子提取物與添加劑的比例在1-10∶10-1之間。
27.根據權利要求22所述的方法，其中通過粉碎萎葉葉子或提取粉碎的葉子得到萎葉葉子提取物，提取溶劑為水或有機溶劑如醇、四氯化碳、氯仿和丙酮。
28.根據權利要求22所述的方法，其中萎葉葉子提取物或含有萎葉葉子提取物的組合物以10-20mg/kg體重的劑量水平隔天給藥一個月。
29.根據權利要求22所述的方法，其中萎葉葉子提取物或含有萎葉葉子提取物的組合物降低多氏利什曼蟲前鞭毛型體外生存力57-79％，降低脾和肝寄生蟲荷載量93-95％。
全文摘要
本發明涉及用有效量的萎葉葉子提取物或凍幹的提取物與添加劑，或含萎葉葉子提取物及藥學可接受的添加劑的組合物給藥，以治療內臟利什曼病或黑熱病的方法。
文檔編號C12N9/02GK1454096SQ00819919
公開日2003年11月5日 申請日期2000年12月4日 優先權日2000年12月4日
發明者S·班迪奧帕迪亞雅, B·佩爾, S·巴塔查裡亞, M·雷, K·C·羅伊 申請人:科學與工業研究會