生物膠原對抗生藥物的化學穩定性改善方法
2023-10-22 14:42:27
專利名稱：生物膠原對抗生藥物的化學穩定性改善方法
技術領域：
本發明用牛膠原並修飾，對抗生藥物鹽酸米諾環素的化學穩定性的改善 方法，適用口腔醫學的藥物緩釋系統，屬於藥劑領域。
技術背景藥物緩釋系統是控制釋放給藥系統(Controled Releases Drug Delivery System)，簡稱CRD。 CRD比傳統劑型有其優越性。牙周炎是口腔常見病，發病率為70-80%。在牙周局部用藥是牙周治療中 重要的一項。目前牙周炎局部有效緩釋劑有多種。合成的聚合物載體材料越 來越受重視。如半合成高分子，常用的是纖維素衍生物，如甲基纖維素醚。 合成高分子材料，常用的有聚乙烯醇、聚乳酸，還有美國的FDA。在我國臨 床上使用的是日制派麗奧鹽酸米諾環軟膏。但他們的共同特點為不可吸收的 物質，在深牙周、冠周袋內載體可成異物，經緩釋後如不修復，異物被吸收， 加重再感染，增加治療費用和患者的痛苦，如氰基丙烯酸烷基酯P(ACA)，它 可生物降解，但在體內反應會生成甲醛，酯解生成水溶液的P(ACA)，產物有 毒性，這一點限制了它的應用。總之目前巿場及臨床使用的為不可吸收物質， 載體僅起到緩釋作用。我們研究的是一種膠原生物載體，它不僅起到緩釋作 用，而且有組織可吸收，對牙周有修復功能。發明內容膠原作為一種常見的蛋白質，其特性有別於上述合成高分子。這種特性 就在於膠原與人體接觸模式於其他高分子不同。膠原作載體，則接近人體組 織成分，是人細胞間質物質。膠原在組織與器官形成過程中所起到的重要作用，是與許多不同細胞表達功能相關的。研究表明膠原在組織再生過程中 起到作用，膠原同時也表現出生物可降解性、弱抗原性和優越的生物相容性。本發明用牛皮膠原作可吸收的、促進組織修復的牙周炎緩釋系統載體。 但膠原的a >^112具有活躍的化學性質，活躍的氨基基團就會與醛類化合物發 生反應，生成弱鹼，即所謂西夫鹼，反應產物會進一步生成有色物質，該反 應式如下所示formula see original document page 4而口腔醫學常用的抗生素鹽酸米諾環素含有兩個醛基如下圖，很容易與 膠原的氨基基團發生反應，從而使得藥物變色繼而變性失效，療效降低，治 療效果大打折扣。formula see original document page 4本發明首先將膠原通過酶法水解製成可溶性膠原；膠原在溶液中與酸酐 進行膠原氨基化學修飾，將膠原的"-NH2〃基蒙蔽，膠原結構由H2N-R-COOH 生成R-OOH成為W相；另外，把鹽酸米諾環與油混合，藥物外層包有油層 增加其與膠原化學反應難度成為0相；再用增稠劑加入到修飾膠原W相與油 混鹽酸米諾環0相製成0/W均一溶液，因W相中為R-00H，所以0/W乳 液具有低pH值。本發明利用膠原氨基化學修飾，增強了生物膠原對鹽酸米諾 環抗生素的化學穩定性，製成0/W系統。膠原載體的鹽酸米諾環素緩釋劑能 夠在口腔醫學中得到應用。本發明改善生物膠原對鹽酸米諾環素抗生藥物的化學穩定性，分四個步驟1)可溶性膠原的調製；2)膠原修飾；3)油相調製；4) OAV系統調製。 步驟l)可溶性膠原的調製將牛二層皮製成灰皮，加入質量百分濃度為2 4。/。的浸灰劑Ca(OH)2，以 及10倍於灰皮質量的水進行浸灰，室溫反應24 48h後，充分水洗；再用質量百分濃度為4 8。/。的脫灰劑NH4Cl或(NH4)2S04，以及5倍於灰皮 的水進行脫灰，室溫反應3 10h後，充分水洗；破碎；用質量百分濃度為1 5。%。的胃蛋白酶或胰蛋白酶之一或者兩者混合 進行酶水解；離心，轉速為10000 20000rpm;用NaOH調節pH值至7，採用質 量百分濃度為4。/。的NaCl進行鹽析，室溫靜置24h以上；二次離心，轉速為 10000 20000rpm;用0.5mol/L的醋酸，進行酸溶解，得到可溶性膠原；步驟2)膠原修飾將可溶性膠原溶液用NaOH或NaHC03調至pH7 9，加入丁二酸酐使 pH=3~4，室溫反應18h以上，將膠原的a-NH2蒙蔽，修飾成為羧基化合物， 反應式如下formula see original document page 5其中P代表膠原蛋白冷凍乾燥，l(TC以下保存； 步驟3)油相調製將鹽酸米諾環抗生素與三乙酸甘油酯以質量比1:5 1:10，在室溫下混合， 調製成油相；步驟4) 0/W系統調製將上述步驟2)冷凍乾燥物採用0.5mol/L的醋酸或鹽酸進行酸溶解，成 為水相，將調製油相分散到水相中，再用增稠劑丙三醇配製成相對質量比^^^^=5%的O/W系統。 丙二醇+水相+油相製備成以膠原為載體的鹽酸米諾環素緩釋劑。化學穩定性改善說明對膠原氨基進行修飾，膠原分子上側鏈氨基轉變 為醯氨基，改變氨基活性，改善膠原的化學穩定性。將膠原分子上側鏈氨基 轉變為醯氨基，同時衍生出羧基，增加了側鏈的羧基基團，使系統的pH值降 低，創造了鹽酸米諾環素的穩定環境；膠原為水相，鹽酸米諾環素為油相， 膠原與藥相互蒙蔽，又使系統增加了化學穩定性。以上提高生物膠原對鹽酸 米諾環素抗生藥物的化學穩定性，適用口腔醫學的藥物緩釋劑系統。本發明的效益膠原材料在藥物緩釋載體有廣闊的應用空間。就其良好 的生物相容性和生物降解性來說，是金屬、陶瓷和其他高分子材料不可比擬 和代替的一種優良天然高分子材料。近年來，蛋白質修飾技術現已廣泛應用 於改善膠原蛋白生物材料的機能和生物穩定性。對膠原進行定量可控的化學 修飾，研製出新一代生物醫用材料，可以賦予膠原新的特性。在提高生物醫 用材料科技含量的基礎上，擴大了我國醫用生物材料市場份額，為我國人民 的生活健康質量提供保證。可以說，本發明的原料由於使用製革廢棄物，不僅緩解了製革產業的環境壓力，實現了生物資源的再生循環利用，具有重大 的經濟及社會意義，而且為實現生物材料的更廣泛應用開闢了新的道路。
圖1用蛋白酶去除非螺旋區 圖2膠原修飾前後的紅外線圖譜 圖3膠原修飾前後的等電點具體實施方式
鹽酸米諾環抗生素在低pH範圍裡較穩定.但其分子結構含有"=0〃化學 鍵易與膠原中的"-NH/基發生"西夫鹼〃 化學反應生成物為黑色，失去藥 效。本發明膠原在溶液中與酸酐進行膠原氨基化學修飾，將膠原的、、-NH/ 基蒙蔽，膠原結構由H2N-R-COOH生成R-OOH成為W相；另外，把鹽酸米 諾環與油混合，藥物外層包有油層增加其與膠原化學反應難度成為O相；再 用增稠劑加入到修飾膠原W相與油混鹽酸米諾環O相製成0/W均一溶液， 因W相中為R-00H，所以O/W乳液具有低pH值。本發明利用膠原氨基化 學修飾，增強了生物膠原對鹽酸米諾環抗生素的化學穩定性，製成0/W系統。例採用NH4C1 -胃蛋白酶-NaHC03調製的0/W系統 步驟l)可溶性膠原的調製將牛二層皮製成灰皮，稱取10g，破碎。加入質量百分濃度為3%的浸灰劑 Ca(OH)2，水100ml，浸灰，在室溫反應24h後，充分水洗，再用質量百分濃度 為6。/。的脫灰劑NH4Cl，水50ml，進行脫灰，室溫反應6h;充分水洗；絞碎； 用質量百分濃度3^的胃蛋白酶水解，4"72h;離心，轉速為15000rpm;用NaOH 調節pH值至7，採用質量百分濃度為4。/。的NaCl鹽析，靜置24h; 二次離心，轉 速為15000rpm;用0.5mol/L的醋酸200ml進行酸溶解，得到可溶性膠原，10g 灰皮得到0.9g膠原。酶水解提取膠原蛋白的原理如圖l所示(a)為前膠原蛋白的原始存在狀 態，中間是規則的螺旋區域，兩端是非螺旋區，正是由於兩端非螺旋區域的 存在導致膠原蛋白不可溶，所以需要選擇合適的方法除去非螺旋區以使膠原能夠溶解。本發明選用胃蛋白酶作催化劑，該酶能夠有選擇性地切斷非螺旋 區域的N-端和C-端伸展肽，如圖(b)，規則螺旋區的膠原得以成可溶性膠原。 步驟2)膠原修飾將可溶性膠原溶液用NaHC03調至pH8，加入丁二酸酐，使溶液pH-3.5， 室溫反應24h，溶液冷凍乾燥，l(TC以下保存。由圖2可以看出未修飾膠原 中醯胺I帶位於1641cm—1，為C二O鍵伸縮振動峰，醯胺II帶位於1539cm"， 為N-H彎曲和C-N伸縮振動峰的混頻峰，醯胺II—帶位於1235cm—1 ，為C-N伸 縮振動峰。這些膠原蛋白的FT-IR特徵吸收峰證明了膠原的結構。修飾後膠 原位於3430 cm—處N-H伸縮振動峰向短波方向發生位移，這主要與膠原中 NH及H鍵有關，在一定程度上破壞了螺旋之間的氫鍵，-NH2被蒙蔽，氨基 轉變為醯胺基，同時衍生出羧基，-COOH數量增加，系統的pH值向酸性方 向移動，故等電點由pH5.5降低至pH4.5，如圖3。膠原中的氨基得到了修飾， 修飾率達到85%。步驟3)油相調製將鹽酸米諾環抗生素與三乙酸甘油酯以1:5的質量比室溫混合，調製成油相。步驟4) 0/W系統調製上述2)修飾膠原凍乾物用0.5mol/L的醋酸充分溶解，製成2%的膠原溶 液，將調製油相分散到水相，再用添加劑丙三醇配製成相對質量比^i^/L韭=5%的Q/W系統。製成以膠原為載體的鹽酸米諾環素緩釋 丙二醇+水相+油相劑。例2:採用NH4C1 -胃蛋白酶-NaOH調製的0/W系統 步驟l)可溶性膠原的調製將牛二層皮製成灰皮，稱取10g，破碎。加入質量百分濃度為"/。的浸灰劑 Ca(OH)2，水100ml，浸灰，在室溫反應48h後，充分水洗，再用質量百分濃度 為4%的脫灰劑,4(:1，水50ml，進行脫灰，室溫反應10h;充分水洗；絞碎； 用質量百分濃度2^的胃蛋白酶水解，4。C72h;離心，轉速為15000rpm;用NaOH 調節pH值至7，採用質量百分濃度為4。/。的NaCl進行鹽析，靜置48h; 二次離心， 轉速為15000rpm;用0,5mol/L的醋酸200ml進行酸溶解，得到可溶性膠原。步驟2)膠原修飾將可溶性膠原溶液用NaOH調至pH7，加入丁二酸酐，使溶液pH=4,室 溫反應18h，溶液冷凍乾燥，l(TC以下保存。修飾前後膠原的紅外圖譜與例1 中圖2的紅外圖譜大致相似。且修飾後膠原的等電點由原來的pH5.3降低至 pH4.4。說明膠原中的氨基得到了修飾。在本例中用NaOH替代例1弱鹼性 NaHC03目的是為了提高系統的溶液濃度，但是帶來了負面影響，修飾率為 66%。這是由於NaOH的鹼性較強，破壞了膠原的一級結構。步驟3)油相調製及步驟4) 0/W系統調製同例1步驟3) 、 4)。例3:採用(NH4)2S04-胃蛋白酶-NaHC03調製的0/W系統 步驟l)可溶性膠原的調製將牛二層皮製成灰皮，稱取10g，破碎。加入質量百分濃度為4%的浸灰劑 Ca(OH)2，水100ml，浸灰，室溫反應24h後，充分水洗，再用質量百分濃度4% 的脫灰劑(NH4)2S04，水50ml，進行脫灰，室溫反應5h後，充分水洗；絞碎； 用質量百分濃度5^的胃蛋白酶水解，4°C36h;離心，轉速為20000rpm;用NaOH 調節pH值至7，釆用質量百分濃度為4。/。的NaCl鹽析，靜置36h; 二次離心，轉 速為20000rpm;用0.5mol/L的醋酸200ml進行酸溶解，得到可溶性膠原。相對 例l，得到相同的可溶性膠原，製備工藝縮短了25h，工業成本下降，但是排 除水中增加了SO/.離子，增加了廢水處理的難度及費用。步驟2)膠原修飾同例1步驟2)。紅外檢測結果表明修飾前後膠原的紅外圖譜與例1中 圖2的紅外圖譜大致相似。且修飾後膠原的等電點由原來的pH5.4降低至 pH4.2。說明膠原中的氨基得到了修飾，修飾率為83%。步驟3)油相調製.-將鹽酸米諾環抗生素與三乙酸甘油酯以1:10的質量比室溫混合，調製成 油相。步驟4) 0/W系統調製 同例1步驟4)。例4:採用(NH4)2S04-胃蛋白酶-NaOH調製的0/W系統步驟l)可溶性膠原的調製將牛二層皮製成灰皮，稱取10g，破碎。加入質量百分濃度為3%的浸灰劑Ca(OH)2，水100ml，浸灰，室溫反應48h後，充分水洗，再用質量百分濃度6% 的脫灰劑(NH4)2S04，水50ml，進行脫灰，室溫反應3h後；充分水洗；絞碎； 用質量百分濃度為1%。的胃蛋白酶水解，4"C72h;離心，轉速為10000rpm;用 NaOH調節pH值至7，採用質量百分比4。/。的NaCl進行鹽析，靜置12h; 二次離 心，轉速為10000rpm;用0.5mol/L的醋酸200ml進行酸溶解，得到可溶性膠原。 步驟2)膠原修飾將可溶性膠原溶液用NaOH調至pH9，加入丁二酸酐，使溶液pEN3，室 溫反應20h，溶液冷凍乾燥，l(TC以下保存。修飾前後膠原的紅外圖譜與例1 中圖2的紅外圖譜大致相似。且修飾後膠原的等電點由原來的pH5.6降低至 pH4.8。說明膠原中的氨基得到了修飾，修飾率達到63%。步驟3)油相調製及步驟4) 0/W系統調製同例1步驟3) 、 4)。例5:採用NH4C1 -胰蛋白酶-NaHC03調製的0/W系統 步驟l)可溶性膠原的調製將牛二層皮製成灰皮，稱取10g，破碎。加入質量百分濃度為4%的浸灰劑 Ca(OH)2，水100ml，浸灰，室溫反應48h後；充分水洗，再用質量百分濃度為 8e/。的脫灰劑NH4Cl，水50ml，脫灰，室溫反應6h後，充分水洗；絞碎；用質 量百分濃度為3%。的胰蛋白酶水解，4°C96h;離心，轉速為15000rpm;用NaOH 調節pH值至7，採用質量百分比4。/。的NaCl鹽析，靜置24h; 二次離心，轉速為 15000rpm;用0.5mol/L的醋酸200ml進行酸溶解，得到可溶性膠原。各種酶具有專一性，胃蛋白酶對苯丙氨酸、亮氨酸和穀氨酸作用力較強， 消化力為14.06，而胰蛋白酶對賴氨酸、精氨酸作用力較強，消化力為11.32， 對於本實驗胰蛋白酶和胃蛋白酶在膠原酶解的得率上區別不大。步驟2)膠原修飾同例1步驟2)。紅外檢測結果表明修飾前後膠原的紅外圖譜與例1中 圖2的紅外圖譜大致相似。且修飾後膠原的等電點由原來的pH5.5降低至 pH4.3。說明膠原中的氨基得到了修飾，修飾率為84%。步驟3)油相調製以及步驟4) OAV系統調製 同例1步驟3) 、 4)。例6:採用NH4C1 -胃蛋白酶順蛋白酶-NaHC03調製的0/W系統步驟1)可溶性膠原的調製將牛二層皮製成灰皮，稱取10g，破碎。加入質量百分濃度為3%的浸灰劑 Ca(OH)2，水100ml，浸灰，室溫反應24h後，充分水洗，再用質量百分濃度為 6。/。的脫灰劑NH4C1，水50ml，進行脫灰，室溫反應6h後，充分水洗；絞碎；用質量百分濃度為3%。的胃蛋白酶和胰蛋白酶水解，二者質量比為l: l的混合酶，4'C72h;離心，轉速為15000rpm;用NaOH調節pH值至7，採月j質量百分 比4。/。的NaCl進行鹽析，靜置24h; 二次離心，轉速為15000rpm;用0.5mol/L 的醋酸200ml進行酸溶解，得到可溶性膠原。膠原的產率相對例l提高將近八 個百分點，10g灰皮得到1.5g膠原，比單獨一種酶提取膠原的優越性大。 步驟2)膠原修飾同例1步驟2)。紅外檢測結果表明修飾前後膠原的紅外圖譜與例1中 圖2的紅外圖譜大致相似。且修飾後膠原的等電點由原來的pH5.6降低至 pH4.2。說明膠原中的氨基得到了修飾，修飾率為87%。步驟3)油相調製以及步驟4) 0/W系統調製同例1步驟3) 、 4)。
權利要求
1、一種生物膠原對抗生藥物的化學穩定性的改善方法，其特徵在於，包括以下步驟步驟1)可溶性膠原的調製將牛二層皮製成灰皮，加入質量百分濃度為2～4％的浸灰劑Ca(OH)2，以及10倍於灰皮質量的水進行浸灰，室溫反應24～48h後，充分水洗；再用質量百分濃度為4～8％的脫灰劑NH4Cl或(NH4)2SO4，以及5倍於灰皮的水進行脫灰，室溫反應3～10h後，充分水洗；破碎；用質量百分濃度為1～5‰的胃蛋白酶或胰蛋白酶之一或者兩者混合進行酶水解；離心，轉速為10000～20000rpm；用NaOH調節pH值至7，採用質量百分濃度為4％的NaCl進行鹽析，室溫靜置24h以上；二次離心，轉速為10000～20000rpm；用0.5mol/L的醋酸，進行酸溶解，得到可溶性膠原；步驟2)膠原修飾將可溶性膠原溶液用NaOH或NaHCO3調至pH7～9，加入丁二酸酐使pH＝3～4，室溫反應18h以上，將膠原的α-NH2蒙蔽，修飾成為羧基化合物，反應式如下其中P代表膠原蛋白冷凍乾燥，10℃以下保存；步驟3)油相調製將鹽酸米諾環抗生素與三乙酸甘油酯以質量比1∶5～1∶10，在室溫下混合，調製成油相；步驟4)O/W系統調製將上述步驟2)冷凍乾燥物採用0.5mol/L的醋酸或鹽酸進行酸溶解，成為水相，將調製油相分散到水相中，再用增稠劑丙三醇配製成相對質量比的O/W系統。
全文摘要
生物膠原對抗生藥物的化學穩定性改善方法屬藥劑領域。鹽酸米諾環抗生素在低pH較穩定，但結構含有「＝O」化學鍵易與「-NH2」基發生「西夫鹼」反應，而膠原具有「-NH2」、「-COOH」基的兩性蛋白質做其載體易發生如上反應。本發明首先將膠原通過低溫酶法水解製成可溶性膠原；膠原在溶液中與酸酐進行膠原氨基化學修飾，將膠原的「-NH2」基蒙蔽，膠原結構由H2N-R-COOH生成R-OOH成為W相；另把鹽酸米諾環與油混合，藥物外層包有油層增加其與膠原化學反應難度成為O相；再用增稠劑加入到修飾膠原W相與油混鹽酸米諾環O相製成O/W均一溶液，O/W乳液具有低pH值。本發明利用膠原氨基化學修飾，增強了生物膠原對鹽酸米諾環抗生素的化學穩定性，有望應用在生物醫用材料中。
文檔編號A61K31/65GK101239188SQ200810057378
公開日2008年8月13日 申請日期2008年2月1日 優先權日2008年2月1日
發明者劉晶冰, 張文熊, 芳 武, 長南康正, 馬明霞 申請人:北京工業大學