含有α－糖基神經醯胺的用於增強細胞免疫原性的組合物的製作方法

2023-10-22 03:37:17 3

專利名稱：含有α－糖基神經醯胺的用於增強細胞免疫原性的組合物的製作方法
發明的背景發明領域本發明涉及通過具有α—糖基神經醯胺結構的化合物來增強腫瘤細胞及病原體感染細胞的免疫原性的方法，更詳細的說，涉及使用增強了免疫原性的腫瘤細胞的腫瘤治療方法。
背景技術：
通過給癌症患者接種採用化療製劑及經放射線照射殺死的自己或非己的腫瘤細胞，在癌症宿主中誘導腫瘤特異免疫，從而有效治療癌症的腫瘤治療方法(Tumor Therapy)正在逐步對黑素瘤(melanoma)(Mitchell，M．S．et al．，J．Clin．Oncol．，8，409(1990))、腎癌(Neidart，J．A．et al．，Cancer，46，1128(1980))、卵巢癌(Freedman，R．S．et al．，Gynecol．Oncol．，29，337(1988))、大腸癌(Hoover，H．C．，Cancer，55，1236(1985))等癌症患者進行試驗。但是，腫瘤細胞不同於生物體內的細菌類異物，是由原來宿主細胞改變了特徵而產生的細胞，所以免疫原性低下。因此，不能得期望的效果，只不過可以認為對黑素瘤及腎癌等免疫原性比較高的癌種多少有一些效果(Mullen，C．A．et al．，in Cancer Chemotherapy andBio1ogical Response Modifiers，eds．Pinedo，H．M．et al．，(Elsevier Science B．V．)，pp285—294(1996))。
近年來，伴隨著分子生物學、基因工程學的發展，使基因的導入成為可能，已經嘗試運用基因導入法使用導入與癌症相關抗原基因的腫瘤細胞的腫瘤治療方法。也就是說，已經嘗試把與腫瘤相關的抗原基因導入自身的腫瘤細胞或者如果這樣比較困難時導入非己腫瘤細胞，將較原來腫瘤細胞提高了免疫原性的腫瘤細胞用於腫瘤治療方法。但是，這種嘗試由於可以鑑定為與腫瘤相關抗原的抗原極少，所以現狀是只能在極有限的癌種中實施。(Conry，R．M．，et al．，CancerRes．，54，1164(1994))。進一步發現，癌症宿主的免疫力由於腫瘤細胞產生因子等而顯著受損，所以只提高腫瘤細胞的抗原性，並不能得到預期的治療效果，莫不如重要的是修復癌症宿主的免疫力。因此，現在主要是嘗試以下研究通過接種導入了細胞因子基因及、適合主要組織的抗原基因、costimulatory molecule等的細胞，改善癌症宿主受損的免疫力，從而提高治療效果的研究。例如，使用導入IL—2(Connor，J．et al．，J．Exp．Med．，177，1127(1993))、IL—4(Golumbek，P．T．et al．，Science，254，713(1991))、IL—6(Porgador，A．et al．，Cancer Res．，52，3679(1992))、IFN—g(Belldegrun，A．et al．，J．Natl．Cancer Inst．，85，207(1993))、GM—CSF(Dranoff，G．et al．，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，90，3539(1993))、IL—12(Tahara，H．et al．，Gene Therapy，2，96(1995))等細胞因子基因的腫瘤細胞，或導入MHC class Ⅱ及B7—1基因的腫瘤細胞(Travis，J．et al．，Science，259，310(1993)；Basker，S．etal．，J．Exp．Med，181，619(1995))的方法已有報導。
目前，世界上這種使用通過導入基因進行修飾的腫瘤細胞的腫瘤治療方法正在嘗試用於臨床上(Roth，J．A．，et al．，J．Natl．CancerInst．，89，21(1997))。但是，這種方法中基因的操作複雜(Pardoll，D．M．，Immunol．Today，14，310(1993))，而且也不能得到令人滿意治療效果的充分有效導入基因的媒介物，這就要求進一步改善上述腫瘤治療方法(Mullen，C．A．et al．，in Cancer Chemotherapy andBiological Response Modifiers，eds．Pinedo，H．M．et al．(El sevier Science B．V．)，pp285—294(1996))。
這裡，生物體內存在各種糖與神經醯胺以β鍵結合的β—糖基神經醯胺(Svennerholm L．et al．，Biochem．Biophys．Acta，280，626(1972)；Karlsson，K．et al．，Biochem．Biophys．Acta，316，317(1973))。另一方面，已知α—糖基神經醯胺具有顯著的免疫激活作用及抗腫瘤作用(Morita，M．et al．，J．Med．Chem．，38，21 76(1995))，以及α—糖基神經醯胺的這些作用遠遠超出β—糖基神經醯胺的作用(Motoki，K．et al．，Biol．Pharm．Bull．，18，1487(1995))。而且，已知具有α—糖基神經醯胺結構的化合物具有活化抗原提示細胞的作用，使用經具有α—糖基神經醯胺結構的化合物活化的抗原提示細胞的抗原提示細胞療法對癌症治療是極為有效的(Yamaguchi，Y．et al．，Oncol．Res．，8，399(1997))。另外，已知具有α—糖基神經醯胺結構的化合物在投到生物體內時，有防護放射線的作用(Motoki，K．etal．，Bioorg．Med．Chem．Lett．，5，2413(1995))，以及增加血小板數及白細胞數的作用(Motoki，K．etal．，Bio1．Pharm．Bull．，19，952(1996))。
但是，關於用α—糖基神經醯胺處理的腫瘤細胞肯定對腫瘤療法有效、以及α—糖基神經醯胺能夠增強腫瘤細胞的免疫原性，除本發明人知道以外尚未被報導。
發明概要本發明者發現在含有有α—糖基神經醯胺結構的化舍物的培養基中體外培養的腫瘤細胞具有高免疫原性，如果給與癌症動物該細胞或對該細胞進行放射線照射後的物質則能夠得到顯著的抗腫瘤效果，而且，由於該腫瘤細胞產生腫瘤的性質消失，所以在腫瘤治療方面安全性也很優良。本發明就是基於這些發現完成的。
本發明的目的在於提供能夠簡單製備對腫瘤治療方法有效的腫瘤細胞用於增強腫瘤細胞免疫原性的組合物，能夠簡單製備對感染病症等治療有效的病原體感染細胞用於增強病原體感染細胞免疫原性的組合物，增強細胞免疫原性的方法，通過α—糖基神經醯胺增強了免疫原性的細胞，含有上述細胞用於治療這些細胞引起的疾病(特別是腫瘤)的藥物組合物，上述細胞在製備上述藥物組合物中的應用，以及由上述細胞引起的疾病(特別是腫瘤)的治療方法。
而且，本發明中用於增強細胞免疫原性的組合物含有下式(Ⅰ)的化合物或其鹽或它們的溶劑合物 (上式中，R1為H或OH，X為7—27的任何一個整數R2為選自下述(a)—(e)中的取代基(這裡，Y是5—17的任意整數)(a)—CH2(CH2)YCH3(b)—CH(OH)(CH2)YCH3(c)—CH(OH)(CH2)YCH(CH3)2(d)—CH=CH(CH2)YCH3(e)—CH(OH)(CH3)YCH(CH3)CH2CH3, 而且R3—R9是在下述ⅰ)或ⅱ)中的任意一種情況下定義的取代基ⅰ)當R3、R6、及R8是H時R4為H、OH、NH2、NHCOCH3、或選自下述基團(A)—(D)中的取代基 R5是OH、或選自下述基團(E)及(F)的取代基 R7是OH或選自下述基團(A)—(D)中的取代基 R9是H、CH3、CH2OH、或選自下述基團(A』)—(D』)中的取代基 ⅱ)當R3、R6、及R7是H時R4是H、OH、NH2、NHCOCH3、或選自下述基團(A)—(D)中的取代基 R5是OH、或選自下述基團(E)及(F)的取代基 R8是OH或選自下述基團(A)—(D)中的取代基 R9是H、CH3、CH2OH、或選自下述基團(A』)—(D』)組成的群體中選擇的取代基)。 附圖的簡單說明

圖1表示α—糖基神經醯胺對腫瘤細胞免疫原性的效果。免疫原性以小鼠脾細胞的細胞損害活性為指標。○對照，●EL—4／V，□EL—4／KRN，△EL—4／583。
圖2表示α—糖基神經醯胺處理的腫瘤細胞對EL—4肝轉移模型小鼠的效果。○對照，●EL—4／V，□EL—4／KRN，△EL—4/583。
圖3表示α—糖基神經醯胺處理的腫瘤細胞對B16黑素瘤肺轉移模型小鼠的效果。○控制，●B16／V，□B16／KRN。
圖4表示α—糖基神經醯胺對腫瘤細胞產生腫瘤性的效果。○未處理的腫瘤細胞，●用媒介物處理的腫瘤細胞，■用KRN7000處理的腫瘤細胞。
圖5表示α—糖基神經醯胺經放射線照射處理及未照射腫瘤細胞對B16肺轉移模型的效果。○對照，△放射線未照射B16／V，□放射線照射B16／V，▲放射線未照射B16／K，■放射線照射B16／K。
圖6是表示本發明中所用α—糖基神經醯胺化合物代表例(KRN7000)的合成反應路徑的簡圖。
反應路線中pyr表示吡啶，BrPPh3(CH2)12CH3表示十三烷三苯基溴化鏻，n—BuLi表示正丁基鋰，MsCl表示甲磺醯氯，BnBr表示溴代苯甲基，1—PrOH表示丙醇。
圖7表示接著圖6的合成路線的簡圖。
反應路線中WSC—HCl是1—乙基—3—(3′—二甲氨基丙基)—碳化二亞胺·鹽酸鹽，MS4A是分子篩4A，Hex4NBr是四己基溴化銨。
圖8表示實施例1—3化合物的化學式。
圖9表示實施例1—3化合物的化學式。是圖8的繼續。
發明的具體說明式(Ⅰ)的化合物上述式(Ⅰ)化合物中神經醯胺部分的X優選11—25的整數。
R2中的Y優選9—17的整數，更優選11—15。
式(Ⅰ)的神經醯胺部分中的X及R2的優選組合是X為21—25的整數，R2表示取代基(b)(式中Y是11—15)的化合物。
式(Ⅰ)的糖部分中R3—R9的優選組合是R3及R6表示H，R4表示OH或基團(A)—(D)中的任意取代基，R5表示OH或基團(E)或基團(F)的取代基，R7及R8分別表示H或OH中的任意一個(但是，R7及R8兩者不能表示同一基團)，R9表示CH2OH、CH3、H、或基團(A′)—(D′)中的任意取代基的化合物。
更優選的組合例如R3及R6為H，R4及R5為OH，R7及R8各自為H或OH中的任意一個(但是，R7及R8兩者不能表示同一基團)，而且R9表示CH2OH或基團(A′)—(D′)中的任意取代基的化合物，以及R3、R6及R8為H，R4、R5及R7為OH，而且R9為CH2OH的化合物。
作為式(Ⅰ)化合物優選的例子，可以舉出X是21—25的整數，R2是取代基(b)(式中Y是11—15的整數)，R3和R6是H，R4是OH或選自基團(A)—(D)中的基團，R5是OH或選自基團(E)和(F)的基團，R7及R8分別是H或OH(但是，兩者不表示同一基團)，R9是CH2OH或選自基團(A′)—(D′)中的基團的化合物；X是21—25的整數，R2是取代基(b)(式中Y是11—15的整數)，R3及R6是H，R4及R5是OH，R7及R8分別為H或OH(但是，兩者不表示同一基團)，R9是CH2OH或選自基團(A′)—(D′)中的基團的化合物；以及X是21—25的整數，R2是取代基(b)(式中Y是11—15的整數)，R3、R6及R8是H，R4、R5及R7是OH，R9是CH2OH的化合物。
作為增強細胞免疫原性的化合物，優選的化合物是(2S，3S，4R)—1—(α—D—吡喃半乳糖氧)—2—二十六烷醯胺基—3，4—十八烷二醇(KRN7000)。
式(Ⅰ)的化合物可以是無毒性的可藥用鹽。式(Ⅰ)化合物的鹽如酸加成鹽，例如，與無機酸(例如鹽酸、硫酸、硝酸、磷酸)形成的鹽，或與有機酸(醋酸、丙酸、馬來酸、油酸、棕櫚酸、檸檬酸、琥珀酸、酒石酸、富馬酸、穀氨酸、泛酸、十二烷基磺酸、甲磺酸及鄰苯二甲酸)形成的鹽。
式(Ⅰ)化合物可以是溶劑合物(例如水合物)。
式(Ⅰ)化合物可以採用能達到合成α—糖基神經醯胺的目的的任意方法製備。
首先，以D—來蘇糖為原料合成神經醯胺部分，接著，通過在該神經醯胺中導入糖能夠製得式(Ⅰ)的化合物。關於這樣合成α—糖基神經醯胺的一般方法，可以參照例如WO93／5055號、WO94／2168號、WO94／9020號、及WO94／24142號。
另外，式(Ⅰ)的化合物也可以由自然界(生物等)通過柱色譜分析法分離·精製得到。用於增強細胞免疫原性的組合物式(Ⅰ)的化合物對增強細胞免疫原性有效(藥理實驗例1—5)。這裡所謂「免疫原性」是指細胞在生物體內引起免疫應答的活性及通過其結果誘導產生的免疫系統來識別的活性。
本發明中用於增強免疫原性的組合物通過在體外與欲增強免疫原性的細胞的接觸來使用。例如，向細胞培養基中加入本發明用於增強免疫原性的組合物，使式(Ⅰ)化合物的最終濃度達到0．1－10000ng／ml(優選1－1000ng／ml)，培養該細胞30分鐘—4天(優選3小時—2天)，能夠增強細胞的免疫原性。細胞的培養條件及使用的培養基可以採用常規技術進行選擇。
本發明用於增強細胞免疫原性的組合物能夠以溶液、懸濁液、乳液形式添加到欲增強免疫原性的細胞培養液中。
這些各種溶液可以含有可藥用載體或稀釋劑等添加劑，具體的說是溶劑(例如水、生理鹽水)、助溶劑(例如乙醇、聚山梨醇酯)、等滲劑、防腐劑、抗氧化劑、賦形劑(例如乳糖、澱粉、結晶纖維素、甘露醇、麥芽糖、磷酸氫鈣、軟質矽酸酐、碳酸鈣)、粘合劑(例如澱粉、聚乙烯吡咯烷酮、羥丙基纖維素、乙基纖維素、羧甲基纖維素、阿拉伯膠)、穩定劑(例如乳糖、甘露醇、麥芽糖、聚山梨醇酯類、聚乙二醇類、聚氧乙烯硬化蓖麻油)、崩解劑(例如澱粉、羧甲基纖維素鈣)、潤滑劑(例如硬脂酸鎂、滑石粉、硬化油)等。
另外，必要時也可以添加甘油、二甲基乙醯胺、70％乳酸鈉、表面活性劑、鹼性物質(例如乙二胺、乙醇胺、碳酸鈉、精氨酸、葡甲胺、三氨基甲烷)。
如果把與式(Ⅰ)化合物接觸的腫瘤細胞投給小鼠，對該腫瘤細胞可以誘導免疫(細胞毒性活性)。另外，意外地發現對該腫瘤細胞以外的腫瘤細胞也可以誘導免疫(細胞毒性活性)(參照藥理實驗例1)。
作為欲增強免疫原性的細胞可以舉出腫瘤細胞與病原體感染細胞。它們可以是從患有腫瘤的患者或被病原體感染的患者分離得到的物質，也可以是在體外人為製造的物質。
作為欲增強免疫原性的腫瘤細胞基本可以舉出包括黑素瘤、腎癌、子宮癌、胰腺癌、腦腫瘤、成神經膠質細胞瘤、大腸癌、肺癌、肝癌、淋巴癌、白血病、纖維肉瘤等所有腫瘤，特別優選黑素瘤及腎癌。
另外，作為病原體感染細胞，可以舉出病毒感染細胞。這裡所謂的「病原體」包括衣原體、立克次氏體、單核細胞增多性李司特氏菌、利什曼原蟲、錐蟲、及朊病毒蛋白類病原因子。
按照本發明可以提供一種包括使細胞與式(Ⅰ)化合物或其鹽或其溶劑合物接觸的增強細胞免疫原性的方法。細胞與式(Ⅰ)化合物的接觸可以按照與上述相同的方法進行。免疫原性增強細胞本發明的免疫原性增強細胞可以通過式(Ⅰ)化合物或其鹽或其溶劑合物與體外欲增強免疫原性的細胞接觸而得到。免疫原性增強細胞的製備可以按照上述條件進行。
如果將增強了免疫原性的細胞作為抗原投給哺乳類動物，對該細胞的免疫得到強力誘導，從而能夠治療該細胞引起的疾病。
因此，按照本發明可以提供一種含有通過在體外與式(Ⅰ)化合物或其鹽或溶劑合物接觸而得到的細胞的，用於治療該細胞引起疾病的治療藥。在本說明書中，「治療」也包括「預防」的意思。
另外，按照本發明可以提供一種包括投給通過在體外與式(Ⅰ)化合物或其鹽或溶劑合物接觸而得到的細胞，以治療該細胞引起疾病的治療方法。
使用增強了免疫原性的某種腫瘤細胞作為有效成分時，能夠治療該腫瘤；使用增強了免疫原性的病原體細胞作為有效成分時，能夠治療其感染症。
如果將通過式(Ⅰ)化合物增強免疫原性的腫瘤細胞投給生物體，對腫瘤細胞能夠誘發產生強免疫力，其結果是通過生物體的免疫系統使腫瘤受到攻擊，從而能夠縮小或消滅腫瘤。本發明的腫瘤細胞不只是黑素瘤類高免疫原性的腫瘤，對T淋巴腫瘤也能誘發產生強免疫力(參照藥理實驗例2及3)。
因此，按照本發明可以提供一種含有通過在體外與式(Ⅰ)化合物或其鹽或溶劑合物接觸而得到的腫瘤細胞(增強免疫原性的腫瘤細胞)的用於治療腫瘤的藥物組合物。
另外，按照本發明還可以提供一種包括投給增強了免疫原性的腫瘤細胞的腫瘤治療方法。
本說明書中所謂的「腫瘤」包括黑素瘤、腎癌、子宮癌、胰腺癌、腦腫瘤、成神經膠質細胞瘤、大腸癌、肺癌、肝癌、淋巴癌、白血病、纖維肉瘤等癌症。
另外，本說明書中所謂「用於治療腫瘤的藥物組合物」包括腫瘤疫苗及腫瘤細胞疫苗類腫瘤治療藥。
本發明中免疫原性增強細胞可以採用能達到目的的任意給藥途徑給藥，具體的說可以通過腹腔內給藥、皮下給藥、靜脈或動脈血管給藥、通過注射的局部給藥等方法給與。另外，人的場合，可以通過靜脈給藥、動脈給藥、採用注射的局部給藥、腹腔或胸腔給藥、皮下給藥、肌肉給藥等方法給與。最優選靜脈給藥。
本發明中免疫原性增強細胞可以基於常規方法，以注射劑、懸濁劑、乳劑等形式給藥，必要時，為了進一步增強細胞的免疫原性，可以懸濁到弗羅因德氏完全佐劑中，或者可以同時投給BCG類具有佐劑活性的物質。本發明中用於腫瘤治療的藥物組合物能夠含有上述可藥用載體或添加劑。
本發明藥物組合物的各種有效成分可以根據個體的狀況連續或間歇給藥。具體的給藥量隨給藥方法、患者的各種條件、例如年齡、體重、性別、敏感性、給藥時間、聯合用藥等而變化。例如增強免疫原性的腫瘤細胞表現出其活性的必要給藥量，如果是靜脈給藥，對成人是每日1×105—1×109個細胞／體重(1kg)，優選1×106－5×108個細胞／體重(kg)。免疫原性增強細胞，優選注射劑，可以直接投給預先調節到規定濃度的物質，或給藥前用注射用生理鹽水等稀釋到規定濃度後給藥。
本發明的免疫原性增強細胞在投給患者前，也可以先用通過放射線或有細胞毒性的藥劑處理，從而使之滅亡(喪失增殖能力)。
實施例結合以下的實施例詳細說明本發明，但是本發明並不只限定於此。
化合物的合成及分離·精製實施例1(2S，3S，4R)—1—(α—D—吡喃半乳糖氧基)—2—二十六烷醯胺基—3，4—十八烷二醇(KRN7000)的合成標題化合物的合成步驟如圖6及7所示。
(1)化合物G1的合成向D—來蘇糖(200g、1．33ml)的用氯化鈣乾燥的丙酮溶液(3．0L)中加入硫酸(0．5mL)，室溫下攪拌18小時。加入分子篩4A的粉末(100g)，中和反應液後，用硅藻土過濾，用丙酮洗滌殘渣。合併濾液與洗滌液，減壓濃縮，得到G1的粗產物。收量為240g(95％)。不進行精製直接用於下一步。分析用樣品以己烷丙酮(9:1)為洗脫溶劑採用矽膠柱色譜法進行精製。
mp76—78℃； FDMS m/z 191 (M+1)+；1H—NMR(500MHz， CDCl3)δ5．45(1H，d，J=1．8Hz)，4．83(1H，dd，J=3．7，5．5Hz)，4．64(1H，d，J=6．1Hz)，4．27—4．30(1H，m)，3．90—3．99(2H，m)，1．48(3H，s)，1．32(3H，s)。
(2)化合物G2的合成向化合物G1(239g、約1．26mmol)的二氯甲烷溶液(168ml)中加入吡啶(10ml)、三苯甲基氯(39．0g)，32℃下攪拌4小時。滴加乙醇(8ml)，室溫下攪拌2小時。用飽和氯化銨水溶液、飽和碳酸氫鈉水溶液、食鹽水洗滌後，減壓濃縮。將殘渣溶解於乙酸乙酯中，冷卻到0℃使之結晶。收量為501g(按D—來蘇糖計算為87％)。
mp174—176℃；FDMS m/z 432M+；1H—NMR(500MHz，CDCl3)δ7．21—7．49(15H，m)，5．38(1H，d，J=2．4Hz)，4．75(1H，dd，J=3，7，6．1Hz)，4．59(1H，d，J=6．1Hz)，4．31—4．35(1H，m)，3．43(1H，dd，J=4．9，9．8Hz)，3．39(1H，dd，J=6．7，9．8Hz)，1．29(3H，s)，1．28(3H，s)。
(3)化合物G3的合成在0℃、氫氣環境中，向十三烷三苯基溴化鏻(962g、1．16mol；通過將1—溴代十三烷、三苯基膦在140℃加熱4．5小時製得)的THF溶液(1500ml)中滴加正丁基鋰的2．5M己烷溶液(462mL；366mmol)。滴加結束後，攪拌15分鐘，滴加化合物G2(250g、579mmol)的THF溶液(450ml)。一邊慢慢將溫度上升到室溫，一邊攪拌18個小時。減壓濃縮反應液，向殘渣中加入己烷∶甲醇∶水(10∶7∶3、1000ml)的混合液，用飽和氯化銨水溶液洗滌。用己烷(500ml)萃取水層，合併所有的有機層，用無水硫酸鎂乾燥後，減壓濃縮，得到G3的粗產物。不進行精製直接用於下一步。收量為339g(98％)。分析用樣品以己烷∶乙酸乙酯(9∶1)為洗脫溶劑採用矽膠柱色譜法精製。
FDMS m/z 598M+；1H—NMR(500MHz，CDCl3)δ7．21—7．45(15H，m)，5．48—5．59(2H，m)，4．91(0．7H，t，J=7．3Hz)，4．44(0．3H，t，J=7．3Hz)，4．26(0．3H，dd，J=4．3，7．3Hz)，4．21(0．7H，dd，J=4．3，6．7Hz)，3．75(0．7H，m)，3．69(0．3H，m)，3．24(0．3H，dd，J=4．9，9．8Hz)，3．17(0．7H，dd，J=4．9，9．8Hz)，3．09—3．14[1H，(3．11，dd，J=4．9，9．2Hz)，HlbEover[apped]，1．75—2．03(2H，m)，1．49(3H，s)，1．39and1．38(3H，each s)，1．21—1．34(20H，m)，0．88(3H，t，J=6．7Hz)。
(4)化合物G4的合成向化合物G3(338g、約565mmol)的二氯甲烷溶液(1500ml)中加入吡啶(500ml)，再滴加甲磺醯氯(49ml、633mmol)，31℃下攪拌24小時。滴加乙醇(40ml)，室溫下攪拌1小時。減壓濃縮後，向殘渣中加入己烷∶甲醇∶水(10∶7∶3、1000ml)的混合液，分液。用己烷(200ml)萃取水層3次，合併所有的有機層，用無水硫酸鎂乾燥後，減壓濃縮，得到G4的粗生成物。不進行精製直接用於下一步。收量為363g(95％)。分析用樣品以己烷∶乙酸乙酯(9∶1)為洗脫溶劑採用矽膠柱色譜法精製。
FDMS m/z 676M+；1H—NMR(500MHz，CDCl3)δ7．21—7．47(15H，m)，5．41(0．7H，ddd，J=5．5，9．2，11．0Hz)，5．32(0．7H，bt，J=11．0Hz)，5．22(0．3H，bdd，J=9．2，15．0Hz)，5．02(0．3H，dt，Jt=7．3Hz，Jd=15．0Hz)，4．8(0．7H，ddd，J=3．1，5．5，7．9Hz)，4．73(0．7H，dd，J=5．5，9．8Hz)，4．64—4．67(0. 3H，m)，4．61(0．3H，dd，J=5．5，9．2Hz)，4．48(0．7H，dd，J=5．5，7．9Hz)，4．22(0．3H，dd，J=5．5，9．2Hz)，3．55(0．3H，dd，J=2．4，11．6Hz)，3．45(0．7H，dd，J=3．2，11．0Hz)，3．06—3．12[4H，(3．12，s)，(3．11，s)，(3．09，dd，J=3．1，11．0Hz)]，1．66—1．82(2H，m)，1．47andl．46(3H，each s)，1．39(3H，s)，1．13—1．35(20H，m)，0．88(3H，t，J=6．8Hz)。
(5)化合物G5的合成向化合物G4(362g、約536mmol)的二氯甲烷溶液(1500ml)中加入甲醇(350ml)，再向其中滴加濃鹽酸(200ml)，室溫下攪拌5小時。向反應液中加入碳酸氫鈉中和後，過濾。減壓濃縮濾液，向殘渣中加入乙酸乙酯，用食鹽水洗滌。用乙酸乙酯萃取水層，合併所有的有機層，用無水硫酸鎂乾燥後，減壓濃縮。通過己烷使之結晶。收量為161g(由G2為70％)。
mp66—67℃；FDMS m/z 377(M—H2O)+；1H—NMR(500MHz，CDCl3+D2O)δ5．86(0．3H，dt，Jt=7．3Hz，Jd=14．7Hz)，5．77(0．7H，dt，Jt=7．3，Jd=10．4Hz)，5．55(0．3H，br，dd，J=7．3，14．7Hz)，5．49(0．7H，bt，J=9．8Hz)，4．91—4．97(1H，m)，4．51(0．7H，bt，J=9．8Hz)，4．11(0．3H，bt，J=7．3Hz)，3．94—4．03(2H，m)，3．67—3．73[1H，(3．70，dd，J=3．1，6．7Hz)，(3．69，dd，J=3．1，7．3Hz)]，3．20and3．19(3H，eachs)，2．05—2．22(2H，m)，1．22—1．43(20H，m)，0．88(3H，t，J=6．7Hz)。
(6)化合物G6的合成向化合物G5(160g、405mmol)的THF溶液(780ml)中加入5％鈀—硫酸鋇(16g)，在反應容器通入氫氣後，室溫下攪拌20小時。用硅藻土過濾反應液後，用氯仿∶甲醇的混合液(1∶1)洗滌。合併濾液與洗滌液，減壓濃縮。用乙酸乙酯使殘渣結晶。收量為146g(91％)。
23D+12°(c1，CHCl3/MeOH=1 : 1)；mp124—126℃；FDMS m/z 397 (M+1)+；1H—NMR(500MHz，CDCl3/CD3OD=1∶1)δ4．93—4．96(1H，m，H2)，3．91(1H，dd，J=6．7，12．2Hz)，3．85(1H，dd，J=4．9，12．2Hz)，3．54—3．60(1H，m)，3，50(1H，dd，J=1．8，8．5Hz)，3．19(3H，s)，1．75—1．83(1H，m)，1．53—1．62(1H，m)，1．21—1．45(24H，m)，0．89(3H，t，J=6．7Hz)。
(7)化合物G7的合成向化合物G6(145g、365mmol)的DMF溶液(1000ml)中加入疊氮化鈉(47g、730mmol)，95℃下攪拌4小時。濃縮反應液，向殘渣中加入乙酸乙酯(450ml)，用水洗滌。用乙酸乙酯再次萃取水層。合併所有的有機層，用食鹽水洗滌後，用無水硫酸鎂乾燥，減壓濃縮，得到G7的粗產物。收量為122g(97％)。不進行精製直接用於下一步。收量為126g(95％)。分析用樣品以己烷乙酸乙酯(9:1)為洗脫溶劑採用矽膠柱色譜法精製。
23D+16．5°(c0．5，CHCl3—MeOH，1∶1)；mp92—93℃；FDMS m/z 344 (M+1)+；1H—NMR(500MHz，CD3OD)δ3．91(1H，dd，J=3．7，11．6Hz)，3．75(1H，dd，J=7．9，11．6Hz)，3．49—3．61(3H，m)，1．50—1．71(2H．m)，1．22—1．46(24H，m)，0．90(3H，t，J=6．7Hz)。
(8)化合物G8的合成向化合物G7(121g、約352mmol)的二氯甲烷溶液(750ml)中加入吡啶(250ml)、三苯甲基氯(124g、445mmol)，室溫下攪拌16小時。滴加乙醇(30ml)，室溫下攪拌30分鐘後，用飽和碳酸氫鈉水溶液、飽和氯化銨水溶液、食鹽水洗滌後，用無水硫酸鎂乾燥，減壓濃縮。將殘渣以己烷∶乙酸乙酯(10∶1)為洗脫溶劑採用矽膠柱色譜法精製。收量為34．4g(由G6為52％)。
24D+11．9°(c0．9，CHCl3)，FDMS m/z 585M+；1H—NMR(500MHz，CDCl3+D2O)δ7．24—7．61(15H，m)，3．62—3．66(2H，m)，3．51—3．57(2H，m)，3．42(1H，dd，J=6．0，10．4Hz)，1．23—1．56(26H．m)，0．88(3H，t，J=6．7Hz)。
(9)化合物G9的合成向化合物G8(33．5g、57．3mmol)的DMF溶液(300ml)中加入60％氫化鈉(5．5g、作為NaH約138mmol)，室溫下攪拌40分鐘。將反應液冷卻至0℃，滴加溴化苯甲基(15ml、120mmol)。一邊慢慢升溫至室溫，一邊攪拌18小時。向反應液中加入冰水(100ml)，停止反應後，用乙酸乙酯萃取。用食鹽水洗滌萃取液3次，合併所有的有機層，用無水硫酸鎂乾燥後，減壓濃縮，得到G9的粗產物。不進行精製直接用於下一步。收量為42．2g(96％)。分析用樣品以己烷∶乙酸乙酯(100∶1)為洗脫溶劑採用矽膠柱色譜法精製。
24D+9．8°(c1．O，CHCl3)，FDMS m/z 738(M—N2)+；1H—NMR(500MHz，CDCl3)δ7．07—7．48(25H，m)，4．57(1H，d，J=11．6Hz)，4．44(1H，d，J=11．6Hz)，4．41(2H，s)，3．73—3．79(1H，m)，3．46—3．56(2H，m)，3．37(1H，dd，J=8．6，10．4Hz)，1．20—1．64(26H，m)，0．88(3H，t，J=6．7Hz)。
(10)化合物G10及G11的合成向化合物G9(41．2g、約54mmol)的1—丙醇溶液(250ml)中加入甲醇(30ml)，再加入5％鈀碳(4．1g)、甲酸銨(27．1g、4．3mol)。室溫下攪拌16小時後，用乙酸乙酯稀釋，用硅藻土過濾。減壓濃縮濾液，用乙酸乙酯溶解後，用飽和碳酸氫鈉水溶液、食鹽水洗滌3次，合併所有的有機層，用無水硫酸鎂乾燥後，減壓濃縮，得到G10的粗產物。收量為38．9g(98％)。得到的G10不進行精製直接用於下一步。
向化合物G10的二氯甲烷溶液(300ml)中加入二十六烷酸(22．4g、56．5mmol)、WSC鹽酸鹽(12．6g、64．6mmol)，加熱回流2小時。冷卻至室溫後，減壓濃縮。向殘渣中加入乙酸乙酯(500ml)，用0．5M鹽酸水溶液、食鹽水、飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌，再用食鹽水洗滌。合併所有的有機層，用無水硫酸鎂乾燥後，減壓濃縮，得到G11的粗產物。收量為53．2g(88％)。得到的G11不進行精製直接用於下一步。分析用樣品以己烷∶乙酸乙酯(100∶1)為洗脫溶劑採用矽膠柱色譜法精製。
24D+5．3°(c0．4，CHCl3)；FDMS m/z 1118M+；1H—NMR(500MHz，CDCl3)δ7．20—7．38(25H，m)，5．57(1H，d，J=9．Hz)，4．80(1H，d，J=11．6Hz)，4．48—4．50(3H，m)，4．24—4．32(1H，m)，3．83(1H，dd，J=3．0，6．7Hz)，3．43—3．51(2H，m，Hla)，3．29(1H，dd，J=4．3，9．8Hz)，1．92(2H，t，J=7．3Hz)，1．28—1．60(72H，m)，0．88(6H，t，J=6．7Hz)。
(11)化合物G12的合成向化合物G11(52．2g、約47mmol)的二氯甲烷溶液(180ml)中加入甲醇(36ml)，接著滴加10％鹽酸甲醇溶液(3．0ml)，室溫下攪拌2小時。用粉末狀的碳酸氫鈉(18g)中和反應液，用硅藻土過濾。用二氯甲烷洗滌殘渣。合併濾液與洗滌液，用食鹽水洗滌，用無水硫酸鎂乾燥有機層後，減壓濃縮。將殘渣加熱溶解於丙酮中，冷卻至0℃使之沉澱進行精製。收量為38．6g(由G9為77％)。
24D—29．7°(c0．7，CHCl3)；mp75—76．5℃；FDMS m/z 876M+；1H—NMR(500MHz，CDCl3)δ7．30—7．47(10H，m)，6．03(1H，d，J=7．9Hz)，4．72(1H，d，J=11．6Hz)，4．66(1H，d，J=11．6Hz)，4．61(1H，d，J=11．6Hz)，4．45(1H，d，J=11．6Hz)，4．12—4．17(1H，m)，4．00(1H，dt，Jt=4．3，Jd=7．3Hz)，3．67—3．72(2H，m)，3．61(1H，ddd，J=4．3，8．6，11．6Hz)，1．94—2．05(2H，m)，1．15—1．69(72H，m)，0．88(6H，t，J=6．1Hz)。
(12)化合物G13的合成1)將2，3，4，6—四—O—苄基—D—吡喃半乳糖乙酸酯(79．8g)溶解在甲苯(160ml)及異丙醚(520ml)的混合液中，冷卻至—10—0℃。再向其中加入含有2．0當量HBr的異丙醚溶液(2．8mmol／ml、約100ml)。在—10—0℃下攪拌約90分鐘後，向反應液中注入5％的碳酸氫鈉水溶液，攪拌，中和過剩的HBr。全部移至分液漏鬥中，分液後，棄掉水層，用10％氯化鈉水溶液洗滌2次。減壓濃縮，得到2，3，4，6—四—O—苯甲基—α—D—吡喃半乳糖溴化物(GalBr)的糖漿。
2)向化合物G12(60．0g、68．6mmol)、四己基溴化銨(89．4g、206mmol)、分子篩4A(60g)的甲苯溶液(420ml)中加入DMF(140ml)，接著加入GalBr(約137mmol)的甲苯溶液(250ml)，室溫下攪拌72小時。向反應液中加入甲醇(12ml)，攪拌2小時。用硅藻土過濾後，用飽和碳酸氫鈉水溶液、食鹽水洗滌後，用無水硫酸鎂乾燥，減壓濃縮。向殘渣中加入乙腈，攪拌2小時，得到沉澱。減壓乾燥得到的沉澱，得到乾燥粉末。以己烷∶乙酸乙酯(8∶1)為洗脫溶劑採用矽膠柱色譜法對其進行精製。收量為70．9g(74％)。
24D+18．8°(c0．9，CHCl3)；mp74—75℃；FDMSm／z 1399(M+1)+；1H—NMR(500MHz，CDCl3)δ7．21—7．37(30H，m)，6．12(1H，d，J=9．0Hz)，4．91(1H，d，J=11．6Hz)，4．84(1H，d，J=3．7Hz)，4．72—4．80(4H，m)，4．35—4．65(7H，m)，4．12—4．18(1H，m)，3．99—4．05(2H，m)，3．84—3．93(4H，m)，3．73(1H，dd，J=3．7，11．0Hz)，3．47—3．51(2H，m)，3．42(1H，dd，J=6．1，9．1Hz)，1．87—1．99(2H，m)，1．18—1．70(72H，m)，0．88(6H，t，J=7．4Hz)。
(13)化合物KRN7000的合成向化合物13(60．0g、42．9mmol)中加入乙醇(960ml)，使之懸濁，再向其中加入20％氫氧化鈀(6．0g)的乙醇懸濁液。再加入成為氫源的4—甲基環己烯(120ml、93．5mmol)，加熱回流4小時後，過濾，除去催化劑。將殘渣用加熱的乙醇洗滌。通過室溫放置濾液而得到白色沉澱，過濾沉澱，減壓乾燥。將得到的粉末懸濁在乙醇∶水(92∶8、3．5L)中，邊攪拌邊加熱溶解後，通過室溫放置再次沉澱。過濾沉澱，減壓乾燥過濾得到的濾餅，得到白色粉末。收量為35．0g(95％)。
23D+43．6°(c1．0，pyridine)；mp189．5—190．5℃；negative FABMS m/z 857 (M—H)—；IR(cm—1，KBr)3300，2930，2850，1640，1540，1470，1070；1H—NMR(500MHz，C5D5N)δ8．47(1H，d，J=8．5Hz)，5．58(1H，d，J=3．7Hz)，5．27(1H，m)，4．63—4．70(2H，m)，4．56(1H，m)，4．52(1H，t，J=6．1Hz)，4．37—4．47(4H，m)，4．33(2H，m)，2．45(2H，t，J=7．3Hz)，2．25—2．34(1H，m)，1．87—1．97(2H，m)，1．78—1．85(2H，m)，1．62—1．72(1H，m)，1．26—1．45(66H，m)，0．88(6H，t，J=6．7Hz)，13C—NMR(125MHz，C5D5N)δ173．2(s)，101．5(d)，76．7(d)，73．0(d)，72．5(d)，71．6(d)，71．0(d)，70．3(d)，68．7(t)，62．7(t)，51．4(d)，36．8(t)，34．4(t)，32．1(t)，30．4(t)，30．2(t)，30．03(t)，30．00(t)，29．93(t)，29．87(t)，29．81(t)，29．76(t)，29．6(t)，26．5(t)，26．4(t)，22．9(t)，14．3(q)。
實施例2 O—α—D—吡喃半乳糖基—(1→2)—O—α—D—吡喃半乳糖基—(1→1)—(2S，3S，4R)—2—氨基—N—〔(R)—2—羥基二十四烷醯基〕—1，3，4—十八烷三醇(S1140B—9)的分離及精製將在衝繩縣久米島的水深15～25m的海底採集的海綿冷凍乾燥，用氯仿和甲醇的混合液萃取冷凍乾燥的粉末447．1g，減壓濃縮萃取液，得到51．28g浸膏。將其用乙酸乙酯與水分液後，用無水硫酸鎂乾燥上層與中層後，減壓濃縮，分別得到18．37g與9．44g的餾分。由上層得到的餾分用10％水性甲醇與正己烷分液得到的醇層以及由中層得到的餾分合併，濃縮後，反覆進行矽膠柱色譜分析，從而在正相TLC上得到單一的活性成分169．9mg。再用ODS—AM柱(YMC制、250mmx 20mm徑，甲醇，9．0ml／Min)的反相HPLC精製(保留時間30．3分)，得到純的標題化合物(S1140B—9)10．2mg。
另外，標題化合物也可以參照F．Cafieri et a1．，Liebigs Ann．Chem．1995，1477—1481進行分離·精製。
negative FABMS m/z 1007[(M—H)—]；IR；1HNMR(500MHz，C5D5N，24℃)δ(ppm)8．55(1H，d，J=9．2Hz，NH)，5．60(1H，d，J=3．7Hz，H1")，5．57(1H，d，J=3．7Hz，H1)，5．13(1H，m，H2)，4．75(1H，dd，J=3．7，10．4Hz，H2")，4．62(2H，m)，4．54(4H，m)，4．25—4．47(10H，m)，2．17(2H，m)，1．99 (1H，m)，1．87(2H，m)，1．75(1H，m)，1．65(2H，m)，1．12—1．49(60H，m)，0．85(6H，m，terminal methyl)；13C NMR(125MHz，C5D5N，45℃)δ(ppm)175．5(s，C1′)，99．5(d，C1)，98．6(d，C1")，76．7(d，C2")，76．0(d，C3)，72．8(d，C4)，72．6(d，C5")，72．6(d，C4″)，72．5(d，C2)，71．3(d，C3)，71．0(d)，70．8(d)，70．5(d，C2)，69．7(d，C3″)，63．6(t，C1)，62．7(t)，62．5(t)，51．2(t，C2)，39．4(t)，35．6(t)，33．7(t)，32．2(t)，30．5(t)，30．3(t)，30．1(t)，30．0(t)，29．7(t)，29．6(t)，26．7(t)，26．0(t)，23．0(t)，22．9(t)，14．3(q，terminal methyl)。
實施例3
下面左欄記載的化合物，按照其右欄文獻中記載的方法合成。化合物名稱 文獻名(2S，3R)—1—(α—D—吡喃半乳糖氧基)—2—十四烷WO93／5055醯胺基—3—十八烷醇(AGL—517)(2S，3R)—1—(α—D—吡喃葡萄糖氧基)—2—十四烷WO94／9020醯胺基—3—十八烷醇(AGL—563)(2S，3R)—1—(6′—脫氧—α—D—吡喃半乳糖氧基)WO(94／9020—2—十四烷醯胺基—3—十八烷醇(AGL—571)(2S，3R)—1—(β—L—吡喃阿拉伯糖氧基)—2—十四 WO94／9020烷醯胺基—3—十八烷醇(AGL—577)O—α—D—吡喃半乳糖基—(1→6)—O—α—D—吡喃半WO94／24142乳糖基—(1→1)—(2S，3S，4R)—2—氨基—N—二十六烷醯基—1，3，4—十八烷三醇(AGL—586)O—α—D—吡喃半乳糖基—(1→6)—O—α—D—吡喃葡WO94／24142萄糖基—(1→1)—(2S，3S，4R)—2—氨基—N—二十六烷醯基—1，3，4—十八烷三醇(AGL—584)O—α—D—呋喃半乳糖基—(1→3)—O—α—D—吡喃半乳WO94／24142糖基—(1→1)—(2S，3S，4R)—2—氨基—N—〔(R)—2—羥基二十四烷醯基〕—1，3，4—十八烷三醇(719—7)O—(N—乙醯基—2—氨基—2—脫氧—α—D—吡喃半WO94／24142乳糖基—(1→3)—O—〔α—D—吡喃葡萄糖基—(1→2)〕—O—α—D—吡喃半乳糖基—(1→1)—(2S，3S，4R)—2—氨基—N—〔(R)—2—羥基二十四烷醯基〕—1，3，4—十八烷三醇(STL—8)(2S，3S，4R)—1—(β—D—吡喃半乳糖氧基)—2—二Bioorganic ＆十六烷醯胺基—3，4—十八烷二醇(AGL583) MedicinalChemistryLetters，Vol．5．No．7，pp699—704(1995)式(Ⅰ)的化合物與上述實施例記載的化合物(除AGL583之外)之間的對應如下述表1所示。
表1

生物學實驗藥理實驗1α-糖基神經醯胺對腫瘤細胞免疫原性的效果使用由日本SLC株式會社購買的C57BL／6小鼠進行實驗。作為具有α-糖基神經醯胺結構化合物的代表，在以下實驗中使用實施例1合成的KRN7000。另外，作為陰性對照，使用實施例3合成的具有β-糖基神經醯胺構造的化合物AGL-583。
首先研究媒介物、KRN7000及AGL-583對腫瘤細胞的免疫原性的效果。對腫瘤細胞使用小鼠T淋巴腫瘤EL-4細胞(大日本製藥株式會社)，使之浮遊在含有10％FCS(牛胎兒血清)、穀氨酸及抗生素的RPMI1640培養基中，在體外進行培養。用各種藥劑開始進行處理時，回收EL—4細胞，在新鮮的培養基中接種後，立即在體外添加媒介物(0．1％、DMSO)、KRN7000(100ng／ml)、或AGL—583(100ng／ml)，培養1天。1天後，回收在媒介物、KRN7000或AGL—583共存的情況下培養的EL—4／V、EL—4／KRN或EL—4／583 3種腫瘤細胞，用培養基洗滌2次後，再次懸濁於新鮮培養基中，對C57BL／6小鼠(8周齡，雌性)按照5×105細胞數／小鼠的比例由尾靜脈接種。3天後，製備(1)什麼都未接種的健康正常小鼠(對照)的脾細胞、(2)接種EL—4／V的小鼠的脾細胞、(3)接種EL—4／KRN的小鼠的脾細胞、或(4)接種EL—4／583的小鼠的脾細胞分別作為效應細胞。另外，靶細胞使用的是用51Cr標記的YAC—1(大日本製藥株式會社)及EL—4小鼠腫瘤細胞，將效應細胞與目標細胞接種到培養板上，使E／T(效應細胞／靶細胞)的比達到25∶1、50∶1以及100∶1，培養4小時後，用γ—計數器測定51Cr的游離量，按下式計算出各小鼠脾細胞的細胞抑制活性。 這裡，最大游離量表示添加HCl進行培養時的51Cr游離量，自然游離量表示不添加任何物質進行培養時的51Cr游離量，另外，實驗游離量表示添加各種脾細胞時的51Cr游離量。結果如圖1所示。
如圖1A所示，對接種了EL—4／V及EL—4／583小鼠脾細胞YAC—1的細胞抑制活性，與什麼都未接種的正常小鼠的活性相比，基本上沒有變化。與此相對，接種了EL—4／KRN的小鼠脾細胞則表現出非常顯著的細胞抑制活性。
另—方面，對於EL—4，如圖1B所示，即使是接種了EL—4／V及EL—4／583的小鼠脾細胞，與健康正常小鼠脾細胞相比也具有較高的細胞抑制活性，而接種了EL—4／KRN的小鼠脾細胞則有更高的細胞抑制活性。
由以上結果可以判斷出，通過添加α—糖基神經醯胺培養腫瘤細胞，腫瘤細胞免疫原性增加，結果對於接種該物質的小鼠，能夠誘導產生非常強的腫瘤免疫。另外，接種了EL—4／V及EL—4／583的小鼠脾細胞中，只不過誘導產生一些對EL—4的免疫力，即腫瘤特異的抗腫瘤免疫；但是對於接種了EL—4／KRN的小鼠，誘導產生了不只對EL—4、對NK感應細胞YAC—1也非常強的腫瘤免疫。由此可知不只誘導特異免疫，也誘導非特異免疫。
藥理實驗例2用α—糖基神經醯胺處理的腫瘤細胞對EL—4肝轉移模型小鼠的治療效果由藥理實驗例1的結果，可以看出α—糖基神經醯胺能夠增強腫瘤細胞的免疫原性，所以，接著研究通過用α—糖基神經醯胺處理的腫瘤細胞接種，對原來存在的腫瘤細胞是否具有抗腫瘤效果，即接種增強了免疫原性的腫瘤細胞實際上是否為有效的腫瘤治療方法(Tumor Therapy)。
即，一組6隻BDF1小鼠(6周齡、雌性)(日本SLC株式會社)，由尾靜脈移植小鼠T淋巴腫瘤EL—4細胞4×105細胞數／小鼠，製成患癌小鼠，以移植日為第0天。另一方面，同一天，按照上述藥理實驗例1所示的方法，向接種於新鮮培養基中的EL—4細胞中添加媒介物(0．1％、DMSO)、KRN7000(100ng／ml)、或AGL—583(100ng／ml)。培養開始1天後，回收在媒介物、KRN7000或AGL—583共存的條件下培養的EL—4／V、EL—4／KRN或EL—4／583，用培養基洗滌2次後，分別以1×105細胞數／小鼠的比例由患癌小鼠尾靜脈接種，比較研究各自的抗腫瘤效果。
另外，對移植了EL—4的小鼠，在以肝臟為主的臟器中形成腫瘤，小鼠30天左右死亡。因此，通過觀察癌症宿主的存活期來判斷抗腫瘤效果。結果如圖2所示。
如圖2所示，給患癌小鼠接種用媒介物或AGL—583刺激的腫瘤細胞的組中，與只移植腫瘤的對照組相比，其存活期完全沒有延長，確認沒有明顯的抗腫瘤效果。與此相對，接種用KRN7000刺激的腫瘤細胞的組中，其存活期顯著延長，33．3％的小鼠長期存活。
由以上結果可以看出，即使在腫瘤治療方法中應用用媒介物或具有β—糖基神經醯胺結構的化合物AGL—583處理的腫瘤細胞，也不能得到充分的效果，與此相對，通過在腫瘤治療方法中應用添加具有α—糖基神經醯胺結構的化合物KRN7000培養的腫瘤細胞，能夠得到顯著的抗腫瘤效果。因此，說明用α—糖基神經醯胺處理的腫瘤細胞對腫瘤治療方法有效。
藥理實驗例3用α—糖基神經醯胺處理的腫瘤細胞對B16黑素瘤肺轉移模型小鼠的治療效果進一步，用α—糖基神經醯胺處理與藥理試驗2不同的腫瘤細胞B16黑素瘤(大日本製藥株式會社)，研究這種腫瘤細胞在腫瘤治療方法中是否有效。
即，一組6隻BDF1小鼠(6周齡、雌性)，由尾靜脈移植小鼠B16黑素瘤細胞4×105細胞數／小鼠，製成患癌小鼠，以移植日為第0天。按照上述藥理實驗例2，同日在體外添加媒介物(0．1％、DMSO)或KRN7000(100ng／ml)，開始B16的培養。第1天，回收在媒介物或KRN7000共存的條件下培養1天的B16／V或B16／KRN，用培養基洗滌2次後，按照1×105細胞數／小鼠的比例由上述患癌小鼠尾靜脈接種，比較各自的抗腫瘤效果。
另外，移植B16的小鼠在肺部形成腫瘤，最終會在30天至60天死亡。因此，通過觀察其存活期來判斷抗腫瘤效果。結果如圖3所示。
如圖3所示，接種B16組中，與只移植腫瘤的對照組相比，完全沒有抗腫瘤效果，而存活期與對照組相比有縮短的傾向。與此相對，接種B16／KRN的組中，確認有顯著的抗腫瘤效果，半數(50％)小鼠存活至腫瘤移植後70天。
由以上結果說明，在使用藥理實驗2以外的腫瘤細胞時，通過給患癌小鼠接種用α—糖基神經醯胺處理的腫瘤細胞，能夠得到顯著的抗腫瘤效果。因此，說明用α—糖基神經醯胺處理的腫瘤細胞對腫瘤治療方法有效。
藥理試驗4α—糖基神經醯胺對腫瘤細胞產生腫瘤性的效果根據藥理試驗2和3的結果可知用α—糖基神經醯胺處理的腫瘤細胞對患癌小鼠可以發揮抗腫瘤效果。這裡，在通常的腫瘤治療方法中，通過放射線照射等處理使之喪失增殖能力後接種的方法是常規方法，如果不這樣的話，接種的腫瘤疫苗自身就會形成腫瘤。實際上，藥理試驗3的結果說明接種了用媒介物處理的腫瘤細胞的小鼠其存活期是非常短的，有縮短的趨勢。與此相對，對於用α—糖基神經醯胺處理的腫瘤細胞，確認不僅存活期延長，而且還有完全治癒的病例。因此，認為用α—糖基神經醯胺處理的腫瘤細胞即使不通過放射線照射等處理使之喪失增殖能力也可以用作腫瘤疫苗，對於其腫瘤形成能力(產生腫瘤性)的確認是必要的。因此，研究了關於α—糖基神經醯胺對各種小鼠腫瘤產生腫瘤性的影響。
也就是說，按照上述藥理試驗，通過添加媒介物(0．1％DMSO)或KRN7000(100ng／ml)或不添加，將來自C57BL／6小鼠的腫瘤——小鼠黑素瘤B16細胞(大日本製藥株式會社)、小鼠T淋巴癌EL—4細胞(大日本製藥株式會社)和小鼠肺癌1ewis 1ung catcinoma細胞(大日本製藥株式會社)的3種腫瘤細胞和來自BALB／c小鼠的腫瘤——小鼠大腸癌Colon26細胞(財團法人癌研究會)、小鼠白血病L1210細胞(財團法人癌研究會)和小鼠纖維肉瘤MethA細胞(財團法人癌研究會)的共計6種小鼠腫瘤細胞培養1日。將各種腫瘤細胞用培養基洗滌2次後，再次懸濁於新鮮的培養基中，由同系小鼠的尾靜脈移植。對於B16、EL—4、LLC，分別按照5×105細胞數／小鼠、1×105細胞數／小鼠、5×105細胞數／小鼠的比例移植給C57BL／6(9周齡，雌性)，對於Colon26、MethA、L1210，分別按照2×106細胞數／小鼠、1×105細胞數／小鼠、5×105細胞數／小鼠的比例移植給BALB／c小鼠(9周齡，雌性)。
由尾靜脈移植的各種腫瘤細胞在肝臟或以肺為主體的臟器中形成轉移結節，最終死亡。因此，通過觀察存活期考察對產生腫瘤性的影響。
如圖4所示，移植了用未添加即普通培養基培養的各種腫瘤細胞的小鼠所有病例全部死亡，其產生腫瘤性為100％。同樣，移植了在媒介物存在下培養1日的各種腫瘤細胞的小鼠也是所有病例全部死亡，其產生腫瘤性為100％。與此相對，接種了在FRN7000存在下培養1日的各種腫瘤細胞的組中，有40～100％的小鼠存活，其產生腫瘤性減少或者消失。
由以上可知通過添加以KRN7000為代表的α—糖基神經醯胺進行培養，腫瘤細胞的產生腫瘤性顯著降低。另外，對於KRN7000對腫瘤細胞是否顯示增殖抑制活性進行了研究。結果是在與藥理試驗4相同的條件下添加KRN7000進行培養的腫瘤細胞與未添加或添加媒介物進行培養的腫瘤細胞具有同樣的增殖能力。因此，認為這種效果不是由於直接作用於腫瘤細胞的細胞毒性造成的，而是由於其它作用造成的。
這樣，接種用α—糖基神經醯胺處理的腫瘤細胞時，即使不通過放射線照射使之喪失增殖能力，作為腫瘤疫苗也是有效的。因此，如果概括藥理試驗1至4的結果，可以認為接種用α—糖基神經醯胺處理的腫瘤細胞，接種的腫瘤細胞自身可以通過宿主的免疫幾乎完全排除，同時通過使宿主的免疫細胞活化，即使對原來存在的腫瘤也可以誘導抗腫瘤免疫。
另外，在該研究中，對藥理試驗1至3使用的腫瘤細胞以外也進行了研究，證明通過用α—糖基神經醯胺處理，所有腫瘤細胞的產生腫瘤性均減少或降低。用α—糖基神經醯胺處理的B16和EL—4的治療效果可以認為與其產生腫瘤性的降低密切相關，對於B16和EL—4以外的腫瘤細胞也可以治療腫瘤。
藥理試驗5用α—糖基神經醯胺處理而且用放射線照射的腫瘤細胞對B16黑素瘤肺轉移模型小鼠的治療效果由藥理試驗2～4的結果可知用α—糖基神經醯胺處理的腫瘤細胞即使不通過放射線照射或化療藥等處理使之死亡，作為腫瘤疫苗也是有效的。但是，在通常的腫瘤治療方法中，常常使用經放射線照射等使之死亡的更安全的腫瘤疫苗。因此，對於用α—糖基神經醯胺處理的腫瘤細胞經放射線照射後接種到患癌小鼠時是否可以得到治療效果進行了研究。
C57BL／6小鼠(9周齡，雌性)1組7隻，按5×105細胞／小鼠的比例經尾靜脈移植小鼠B16黑素瘤細胞，製成患癌小鼠，這一天稱為第0天。另外，在同一天按照藥理試驗4向接種於新鮮培養基中的B16細胞中體外添加媒介物(0．1％DMSO)或KRN7000(100ng／ml)，開始培養。第1天，回收在媒介物或KRN7000共存下培養1天的B16／V或B16／KRN，用PBS(Phosphate buffered saline)洗滌2次。然後，將得到的細胞分為200Gy放射線照射組和未照射組2組，按照1×105細胞／小鼠的比例由上述患癌小鼠的尾靜脈接種，比較各種抗腫瘤效果。
如圖5所示，對於接種B16／V的組，無論是否用放射線照射，與僅移植腫瘤的對照組相比，確認完全沒有抗腫瘤效果。另一方面，對於接種B16／KRN的組，不管是否用放射線照射，都有顯著的抗腫瘤效果，約60～70％的小鼠存活到腫瘤移植後50天。
從以上結果可知，如藥理試驗2和3的場合，對於用α—糖基神經醯胺處理的腫瘤細胞，與未用放射線照射的場合相同，用放射線照射的場合也可以得到顯著的抗腫瘤效果。因此，判斷出對於用α—糖基神經醯胺處理的腫瘤細胞，通過進一步用放射線照射等處理，可以更安全的用於腫瘤治療。
權利要求
1．用於增強腫瘤細胞或病原體感染細胞的免疫原性的組合物，含有式(Ⅰ)的化合物或其鹽或它們的溶劑合物， (上式中，R1為H或OH，X為7—27的任何一個整數R2為選自下述(a)—(e)中的取代基(這裡，Y是5—17的任意整數)(a)—CH2(CH2)YCH3(b)—CH(OH)(CH2)YCH3(c)—CH(OH)(CH2)YCH(CH3)2(d)—CH=CH(CH2)YCH3(e)—CH(OH)(CH2)YCH(CH3)CH2CH3， 而且R3—R9是在下述ⅰ)或ⅱ)中的任意一種情況下定義的取代基ⅰ)當R3、R6、及R8是H時R4為H、OH、NH2、NHCOCH3、或選自下述基團(A)—(D)中的取代基 R5是OH、或選自下述基團(E)及(F)的取代基 R7是OH或選自下述基團(A)—(D)中的取代基 R9是H、CH3、CH3OH、或選自下述基團(A』)—(D』)中的取代基 R5是OH、或選自下述基團(E)及(F)的取代基 R8是OH或選自下述基團(A)—(D)中的取代基 R9是H、CH3、CH2OH、或選自下述基團(A』)—(D』)組成的群體中選擇的取代基 )。
2．如權利要求1所述的組合物，在式(Ⅰ)化合物中R3及R6表示H，R4表示OH或基團(A)—(D)中的任意取代基，R5表示OH或基團(E)或基團(F)的取代基，R7及R8分別表示H或OH中的任意一個(但是，R7及R8兩者不能表示同一基團)，R9表示CH2OH、CH3、H、或基團(A』)—(D』)中的任意取代基。
3．如權利要求1或2所述的組合物，式(Ⅰ)化合物中X為21—25的整數，R2表示取代基(b)(式中Y是11—15)。
4．如權利要求1所述的組合物，式(Ⅰ)化合物為(2S，3S，4R)—1—(α—D—吡喃半乳糖氧基)—2—二十六烷醯胺基—3，4—十八烷二醇。
5．如權利要求1所述的組合物，用於增強腫瘤細胞的免疫原性。
6．如權利要求1所述的組合物，在體外使用。
7．如權利要求1所述的組合物，用來製備用於腫瘤療法的腫瘤細胞。
8．增強腫瘤細胞或病原體感染細胞免疫原性的方法，包括使腫瘤細胞或病原體感染細胞與式(Ⅰ)化合物或其鹽或它們的溶劑合物在體外接觸， (上式中，R1為H或OH，X為7—27的任何一個整數R2為選自下述(a)—(e)中的取代基(這裡，Y是5—17的任意整數)(a)—CH2(CH2)YCH3(b)—CH(OH)(CH2)YCH3(c)—CH(OH)(CH3)YCH(CH3)2(d)—CH=CH(CH2)YCH3(e)—CH(OH)(CH2)YCH(CH3)CH2CH3, 而且R3—R9是在下述ⅰ)或ⅱ)中的任意一種情況下定義的取代基ⅰ)當R3、R6、及R8是H時R4為H、OH、NH2、NHCOCH3、或選自下述基團(A)—(D)中的取代基 R5是OH、或選自下述基團(E)及(F)的取代基 R7是OH或選自下述基團(A)—(D)中的取代基 R9是H、CH3、CH2OH、或選自下述基團(A)—(D)中的取代基 ⅱ)當R3、R6、及R7是H時R4是H、OH、NH2、NHCOCH3、或選自下述基團(A)—(D)中的取代基 R5是OH、或選自下述基團(E)及(F)的取代基 R8是OH或選自下述基團(A)—(D)中的取代基 R9是H、CH3、CH2OH、或選自下述基團(A』)—(D』)組成的群體中選擇的取代基 )。
9．如權利要求8所述的方法，其中細胞為腫瘤細胞。
10．增強了免疫原性的腫瘤細胞或病原體感染細胞，通過與式(Ⅰ)化合物或其鹽或它們的溶劑合物體外接觸得到， (上式中，R1為H或OH，X為7—27的任何一個整數R2為選自下述(a)—(e)中的取代基(這裡，Y是5—17的任意整數)(a)—CH2(CH2)YCH3(b)—CH(OH)(CH2)YCH3(c)—CH(OH)(CH2)YCH(CH3)2(d)—CH=CH(CH2)YCH3(e)—CH(OH)(CH2)YCH(CH3)CH2CH3，而且R3—R9是在下述ⅰ)或ⅱ)中的任意一種情況下定義的取代基ⅰ)當R3、R6、及R8是H時R4為H、OH、NH2、NHCOCH3、或選自下述基團(A)—(D)中的取代基 R5是OH、或選自下述基團(E)及(F)的取代基 R7是OH或選自下述基團(A)—(D)中的取代基 R9是H、CH3、CH2OH、或選自下述基團(A』)—(D』)中的取代基 ⅱ)當R3、R6、及R7是H時R4是H、OH、NH2、NHCOCH3、或選自下述基團(A)—(D)中的取代基 R5是OH、或選自下述基團(E)及(F)的取代基 R8是OH或選自下述基團(A)—(D)中的取代基 R9是H，CH3、CH2OH、或選自下述基團(A』)—(D』)組成的群體中選擇的取代基 )。
11．如權利要求10所述的細胞，為腫瘤細胞。
12．含有有效量的權利要求10所述細胞，用於治療該細胞引起的疾病的藥物組合物。
13．用於治療腫瘤的藥物組合物，含有有效量的權利要求11所述細胞。
14．包括將有效量的權利要求10所述細胞投給哺乳類動物以治療該細胞引起的疾病的方法。
15．包括將有效量的權利要求11所述細胞投給哺乳類動物以治療腫瘤的方法。
16．權利要求10所述細胞在製備用於治療該細胞引起的疾病的藥物中的應用。
17．權利要求1l所述細胞在製備用於治療腫瘤的藥物上的應用。
全文摘要
本發明提供一種用於增強腫瘤細胞或病原體感染細胞免疫原性的組合物,其中含有具有α－糖基神經醯胺結構的化合物或其鹽或溶劑合物。通過具有α－糖基神經醯胺結構的化合物增強了免疫原性的腫瘤細胞在腫瘤治療(腫瘤疫苗治療)中是很有效的。
文檔編號C07H15/04GK1279713SQ98811400
公開日2001年1月10日 申請日期1998年9月22日 優先權日1997年9月22日
發明者元木一宏 申請人:麒麟麥酒株式會社