一種鏈黴菌發酵代謝產物新奧黴素的分離提取方法
2023-10-22 17:37:42 1
一種鏈黴菌發酵代謝產物新奧黴素的分離提取方法
【專利摘要】本發明公開一種鏈黴菌發酵代謝產物新奧黴素的分離提取方法，方法包括：首先將發酵液先加熱升溫至60℃，殺滅發酵液中的鏈黴菌活菌體，通過濾布或陶瓷微濾膜除去新奧黴素發酵液中培養基固形物和菌體雜質後，除去固形物的發酵液經大孔吸附樹脂吸附處理，然後，用陽離子交換樹脂吸附富集大孔吸附樹脂流出液中的新奧黴素，最後，採用0.5-5.0％氨水進行解析、濃縮，製成新奧黴素母液，或添加載體，烘乾製成粉劑。本發明提供了一種新的低成本製備新型生物農藥新奧黴素母藥或製劑的方法。
【專利說明】一種鏈黴菌發酵代謝產物新奧黴素的分離提取方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物農藥製造【技術領域】，具體涉及到一种放線菌發酵代謝產物新奧黴素的分離提取方法。
【背景技術】
[0002]微生物來源的活性化合物是高效低毒農用抗生素的主要來源，以微生物代謝產物研製開發的抗生素是生物農藥的重要組成部分，也是世界農藥開發的主要研究方向。
[0003]我國農用抗生素的研究起步較早，早期，我國成功研製了春雷黴素，慶豐黴素，井崗黴素，多抗黴素，公主黴素，多效黴素，農抗120等。近十多年來，一些新的農用抗生素如中生黴素，武夷黴素，寧南黴素、華光黴素、嘧肽黴素等獲得開發。目前，我國農用殺菌劑產品除了井R黴素外，進入實用化的還有春雷黴素、農用鏈黴素、寧南黴素等有限的幾種，作為殺菌劑的抗生素類生物農藥品種非常少，產業化水平較低，遠不能滿足市場需求。
[0004]新型核苷二肽類農用抗生素新奧黴素由一株諾爾斯鏈黴菌的發酵液中分離得到的。具有廣譜的抗植物病毒病和細菌病害的活性尤其對革蘭氏陽性菌、植物病毒的抑制活性很強。
[0005]在國內多個省、地區進行了小區和大田應用示範等試驗，表明對菸草、辣椒、番茄花葉病毒病等具有很強的抗植物病毒病活性，還能夠防治水稻白葉枯病、青枯病、軟腐病等細菌病害，抗菌作用譜廣。新奧黴素製劑毒理學試驗結果表明屬於微毒。產新奧黴素的鏈黴菌經多輪誘變選育，已獲得了一株有產業化價值的高產菌株，並且，新奧黴素發酵生產技術及放大發酵生產技術已比較成熟。相對鏈黴菌發酵產物來說，在發酵產物中活性物質新奧黴素的量還是很低的，加之在發酵液中還存在與新奧黴素共存的其它大量雜質和副產物，如微生物細胞、蛋白質、色素、其它細胞代謝產物及末用完的培養基，因此，從發酵液中提取新奧黴素是一個比較複雜的過程。，
[0006]由於微生物發酵產生新奧黴素類的嘧啶核苷二肽的產量一直比較低，因此，近20年來，微生物學家研究的重點主要側重於與用微生物發酵生產嘧啶核苷二肽類抗生素的方法，有關從微生物發酵液中提取嘧啶核苷二肽類抗生素的工作開展得不多。發明專利ZL200910060121.4公開了涉及微量新奧黴素樣品(mg級)的製備技術，包括新奧黴素發酵結束後，通過添加2-4倍發酵液體積的甲醇或乙醇，從上述發酵培養液中收集新奧黴素，再通過正相矽膠層析和反相矽膠層析分離，得到的新奧黴素樣品，用高效液相色譜進一步分離純化，製備得到微量的新奧黴素。該提取技術方法步驟繁瑣，耗用大量的有機溶劑，提取周期長，活性損失大，不適合大量新奧黴素的製備。發明專利ZL201110261822.1公開了的矽膠層析三元洗脫體系改變為二元洗脫體系的提取技術方法，並去掉了反相矽膠層析分離和高效液相色譜純化步驟，具有耗用有機溶劑少等優點，但矽膠柱的再生和使用次數使放大生產受到了一定的限制。目前，非常缺乏從發酵液中提取新奧黴素的發酵工程下遊技術。
[0007]為了解決現 有新奧黴素提取技術的不足，在充分進行了新奧黴素發酵產物理化性質研究的基礎上，本發明提出了一種新的從鏈黴菌發酵代謝產物中提取新奧黴素的技術方案。
【發明內容】
[0008]本發明的目的是提供一種鏈黴菌發酵液中新奧黴素的富集及分離提取方法，建立一種新奧黴素發酵工程下遊提取技術，並且容易放大生產，而且分離效果好，產品收率高。
[0009]為達到上述目的，本發明的具體技術方案是:提供一種鏈黴菌發酵代謝產物新奧黴素的分離提取方法，該方法包括以下步驟:
[0010](I)將能發酵產生新奧黴素的一株諾爾斯鏈黴菌(Streptomyces noursei)的遺傳改良菌株「諾爾斯鏈黴菌XiAo-3」接種到發酵培養基中進行液體深層培養得到含有新奧黴素的發酵液，首先將發酵液先加熱升溫至60°C -80°C進行殺菌處理，再用濾布過濾或採用陶瓷微濾膜除去上述發酵液中的培養基固形物和菌體雜質，得到預處理髮酵液；
[0011](2)用大孔吸附樹脂處理步驟(1)中得到的預處理髮酵液得到吸附樹脂處理液；
[0012](3)使用陽離子樹脂富集分離吸附樹脂處理液中的新奧黴素:將步驟(2)得到的吸附樹脂處理液均速流過裝有大孔陽離子樹脂的離子交換柱，控制吸附樹脂處理液的流速使吸附樹脂處理液與大孔陽離子樹脂的接觸時間為90min-180min，當交換後流出液中新奧黴素的生物活性單位達到原始發酵液活性單位的5-10%時停止繼續進吸附樹脂處理液，得到吸附達到飽和的樹脂；
[0013](4)解析:將步驟⑶吸附飽和的樹脂用洗脫劑進行解析得到解析液；
[0014](5)用硫酸或鹽 酸將步驟(4)得到的解析液的pH值調至7後，再濃縮到新奧黴素含量大於12%以上，配製成濃度為8% -12%的新奧黴素農藥母液；或再添加載體烘乾製成粉劑。
[0015]關於步驟(1)中的菌株諾爾斯鏈黴菌XiAo-3 (Streptomyces noursei XiAo-3)的保藏信息是:保藏號為CGMCC N0.2898 ;分類命名為:諾爾斯鏈黴菌(Streptomycesnoursei);於2009年2月9日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，地址是:北京市朝陽區大屯路中國科學院微生物研究所。
[0016]具體地或優選地，本發明上述一種鏈黴菌發酵代謝產物新奧黴素的分離提取方法中:
[0017]步驟(2)中所述的大孔吸附樹脂包括非極性、弱極性和強極性吸附樹脂；優選型號如 S-8、D-101、D-101-1、DA-201、HPD-100、X_5、AB-8、DM130、DM-301 中的一種或幾種的混合物；更優選D-101或D-101和DM130混合物。其作用是吸附除去預處理髮酵液中的一些蛋白質、色素和其它一些會影響下一步交換富集新奧黴素的脂溶性雜質。
[0018]步驟(3)中所述的陽離子交換過程中使用的陽離子樹脂包括但不限於是001X7、002X 7、7320、NKC-9、D72、D001、D151、D113中的一種，優選7320磺酸基聚苯乙烯系凝膠型強酸性陽離子交換樹脂。
[0019]步驟⑷洗脫劑包括但不限於是質量分數為2% HCl溶液、I % NaCl溶液或
0.5-5.0%氨水中的一種，優選3%氨水。洗脫劑的流速控制在每小時1-4倍交換柱的體積。
[0020]步驟(5)中的載體為本領域常規使用的載體，包括但不限於高嶺土、蛭石、白炭黑
坐寸ο
[0021]本發明有益效果:[0022]本發明首先針對諾爾斯鏈黴菌XiAo-3發酵新奧黴素的發酵液含有大量的蛋白質，發現並篩選了用可以重複使用的大孔吸附樹脂提取工藝代替了現有技術中存在的添加2-4倍發酵液體積的甲醇或乙醇方法，不能重複使用的矽膠層析提取技術方法，不僅成本高，而且不易於放大生產。避免了在提取過程中大量有幾溶劑的使用，減少了對環境的影響；以及在進一步富集發酵液中新奧黴素的工藝中，本發明發現了發酵液經除去了大量蛋白質之後，陽離子交換樹脂可以很好的對新奧黴素進行富集，洗脫，而且，陽離子交換樹脂工藝很容易進行規模化生產。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0023]圖1為本發明所述的一種鏈黴菌發酵代謝產物新奧黴素的分離提取方法的提取流程圖。
【具體實施方式】
[0024]以下所給出的實施例是為進一步說明本發明的技術特徵，並非對本發明的技術方案進行限制。對本發明中的技術方案進行的任何修改或局部替換，在不脫離本發明的精神和範圍的情況下，均應涵蓋在本發明的保護範圍中。
[0025]實施例1
[0026]將諾爾斯鏈 黴菌XiAo-3的發酵培養基(甘油1.0%，蔗糖7.0%，硫酸銨0.1%,葡萄糖8.0%，蛋白腖2.0%，酵母粉1.0%，硫酸鎂0.5%，磷酸二氫鉀1.0%，氯化鈉
0.5% ,氯化鈣0.5%)於121°C滅菌30分，冷卻後接種諾爾斯鏈黴菌XiAo-3種子液，在28°C-30°C溫度下，通氣攪拌發酵4天。發酵結束後。首先將發酵液先加熱升溫至60°C，保持30分鐘，殺滅發酵液中的鏈黴菌活菌體，然後將發酵液溫度降至30°C以下，加入2.0%硅藻土助濾劑到滅菌後的發酵液中，攪拌均勻，放置20分鐘，用600目濾布過濾，收集濾液。
[0027]用大孔吸附樹脂吸附處理濾布過濾液。使用的大孔吸附樹脂是D-101非極性大孔吸附樹脂，吸附除去濾布過濾液中的一些蛋白質、色素和其它一些會影響下一步交換富集新奧黴素的脂溶性雜質，得到吸附樹脂處理液；
[0028]使用陽離子樹脂富集分離吸附樹脂處理液中的新奧黴素。陽離子交換過程中使用的是7320磺酸基聚苯乙烯系凝膠型強酸性陽離子交換樹脂。將吸附樹脂處理液均速流過裝有7320陽離子樹脂的離子交換柱，控制吸附樹脂處理液的流速使吸附樹脂處理液與樹脂的接觸時間為150min。
[0029]吸附飽和後的樹脂用3%氨水進行解析，洗脫劑的流速控制在每小時2倍樹脂交換柱的體積。
[0030]用鹽酸將上面得到的解析液的pH值調至7後，根據解析液的新奧黴素濃度大小，濃縮解析液到一定倍數使新奧黴素的濃度達到12%以上，配製成12%新奧黴素農藥母液。
[0031]實施例2
[0032]將諾爾斯鏈黴菌XiAo-3的發酵培養基(甘油1.0%，蔗糖7.0%，硫酸銨0.1%,葡萄糖8.0%，蛋白腖2.0%，酵母粉1.0%，硫酸鎂0.5%，磷酸二氫鉀1.0%，氯化鈉
0.5% ,氯化鈣0.5%)於121°C滅菌30分，冷卻後接種諾爾斯鏈黴菌XiAo-3種子液，在28°C-30°C溫度下，通氣攪拌發酵4天。發酵結束後。首先將發酵液先加熱升溫至60°C，保持30分鐘，殺滅發酵液中的諾爾斯鏈黴菌活菌體，然後將發酵液溫度降至30°C以下，將以上發酵液用陶瓷微濾膜過濾，除去發酵液中的培養基固形物和菌體雜質，分離孔徑為
0.2 μ m，其過濾壓力為0.1MPa,收集過濾液。
[0033]用大孔吸附樹脂吸附處理微濾膜過濾液。使用的大孔吸附樹脂是DM-301中極性大孔吸附樹脂，吸附除去過濾液中的一些蛋白質、色素和其它一些脂溶性雜質，得到吸附樹脂處理液；
[0034]使用陽離子樹脂富集分離吸附樹脂處理液中的新奧黴素。陽離子交換過程中使用的是7320磺酸基聚苯乙烯系凝膠型強酸性陽離子交換樹脂。將吸附樹脂處理液均速流過裝有7320陽離子樹脂的離子交換柱，控制吸附樹脂處理液的流速使吸附樹脂處理液與樹脂的接觸時間為150min。
[0035]吸附飽和後的樹脂用3%氨水進行解析，洗脫劑的流速控制在每小時2倍樹脂交換柱的體積。
[0036]用硫酸或鹽酸將上面得到的解析液的pH值調至7後，根據解析液的新奧黴素濃度大小，濃縮解析液到一定倍數使新奧黴素的濃度達到12%以上，添加白炭黑載體，烘乾製成粉劑。
[0037]實施例3
[0038]除去發酵液中的培養基固形物和菌體雜質的方法同實施例2。處理濾液用大孔吸附樹脂處理。使用的大 孔吸附樹脂是D-101非極性和DM-301中極性大孔吸附樹脂的混合物，得到吸附樹脂處理液；
[0039]使用陽離子樹脂富集分離吸附樹脂處理液中的新奧黴素。陽離子交換過程中使用的是7320磺酸基聚苯乙烯系凝膠型強酸性陽離子交換樹脂。將吸附樹脂處理液均速流過裝有7320陽離子樹脂的離子交換柱，控制吸附樹脂處理液的流速使吸附樹脂處理液與樹脂的接觸時間為150min。
[0040]吸附飽和後的樹脂用2%氨水進行解析，洗脫劑的流速控制在每小時I倍樹脂交換柱的體積。
[0041]用鹽酸將上面得到的解析液的pH值調至7後，根據解析液的新奧黴素濃度大小，濃縮解析液到一定倍數使新奧黴素的濃度達到12%以上，添加高嶺土載體，烘乾製成粉劑。
【權利要求】
1.一種鏈黴菌發酵代謝產物新奧黴素的分離提取方法，其特徵在於，所述方法包括以下步驟: (1)將能發酵產生新奧黴素的一株諾爾斯鏈黴菌(Streptomycesnoursei)的遺傳改良菌株「諾爾斯鏈黴菌XiAo-3」接種到發酵培養基中進行液體深層培養得到含有新奧黴素的發酵液，首先將發酵液先加熱升溫至60°C -80°C進行殺菌處理，再用濾布過濾或採用陶瓷微濾膜除去上述發酵液中的培養基固形物和菌體雜質，得到預處理髮酵液； (2)用大孔吸附樹脂處理步驟(1)中得到的預處理髮酵液得到吸附樹脂處理液； (3)使用陽離子樹脂富集分離吸附樹脂處理液中的新奧黴素:將步驟(2)得到的吸附樹脂處理液均速流過裝有大孔陽離子樹脂的離子交換柱，控制吸附樹脂處理液的流速使吸附樹脂處理液與大孔陽離子樹脂的接觸時間為90min-180min，當交換後流出液中新奧黴素的生物活性單位達到原始發酵液活性單位的5-10%時停止繼續進吸附樹脂處理液，得到吸附達到飽和的樹脂； (4)解析:將步驟 (3)吸附飽和的樹脂用洗脫劑進行解析得到解析液； (5)用硫酸或鹽酸將步驟(4)得到的解析液的pH值調至7後，再濃縮到新奧黴素含量大於12%以上，配製成濃度為8% -12%的新奧黴素農藥母液；或再添加載體烘乾製成粉劑。
2.根據權利要求1所述的鏈黴菌發酵代謝產物新奧黴素的分離提取方法，其特徵在於，步驟(2)中所述的大孔吸附樹脂包括非極性、弱極性和強極性吸附樹脂。
3.根據權利要求2所述的鏈黴菌發酵代謝產物新奧黴素的分離提取方法，其特徵在於，所述的大孔吸附樹脂優選型號為S-8、D-1OU D-101-1、DA-201、HPD-100, X_5、AB-8、DM130、DM-301中的一種或幾種的混合物。
4.根據權利要求2或3所述的鏈黴菌發酵代謝產物新奧黴素的分離提取方法，其特徵在於，步驟(2)中所述的大孔吸附樹脂優選為D-101或D-101和DM130混合物。
5.根據權利要求1-3中任一項所述的鏈黴菌發酵代謝產物新奧黴素的分離提取方法，其特徵在於，步驟(3)中所述的陽離子交換過程中使用的陽離子樹脂包括001X7、002X7、7320、NKC-9、D72、D001、D151、D113 中的一種。
6.根據權利要求5中所述的鏈黴菌發酵代謝產物新奧黴素的分離提取方法，其特徵在於，步驟(3)中所述的陽離子交換過程中使用的陽離子樹脂優選是7320磺酸基聚苯乙烯系凝膠型強酸性陽離子交換樹脂。
7.根據權利要求1-3中任一項所述的鏈黴菌發酵代謝產物新奧黴素的分離提取方法，其特徵在於，步驟(4)中洗脫劑包括質量分數為2% HCl溶液、I % NaCl溶液或0.5-5.0%氨水中的一種。
8.根據權利要求7所述的鏈黴菌發酵代謝產物新奧黴素的分離提取方法，其特徵在於，步驟⑷中洗脫劑優選為3%氨水。
9.根據權利要求7或8所述的鏈黴菌發酵代謝產物新奧黴素的分離提取方法，其特徵在於，步驟⑷中洗脫劑的流速控制在每小時1-4倍交換柱的體積。
10.根據權利要求1-3中任一項所述的鏈黴菌發酵代謝產物新奧黴素的分離提取方法，其特徵在於，步驟(5)中的載體為本領域常規使用的載體，包括但不限於高嶺土、蛭石、白炭黑。
【文檔編號】C12R1/57GK103965275SQ201410225218
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年5月27日 優先權日:2014年5月27日
【發明者】周金燕, 楊傑, 鍾娟, 譚紅 申請人:中國科學院成都生物研究所