miRNA檢測方法及應用的製作方法

2023-10-22 16:27:37 1

miRNA檢測方法及應用的製作方法
【專利摘要】本發明提供了一種miRNA檢測方法及應用。具體地，本發明提供了一種檢測miRNA的新方法(稱為aLHCD)，該方法包括：(a)將含miRNA的樣品與雙髮夾核酸雜交探針進行液相雜交，從而形成含「miRNA-雜交探針」的第一複合物的液相混合物；(b)對第一複合物，用限制性內切酶進行消化，形成一端保留髮夾結構區的第二複合物；(c)用單鏈外切酶對第二複合物進行消化，形成第三複合物；(d)以經雙重消化的核酸探針為模板，用引物進行PCR擴增；(e)檢測PCR擴增產物的存在與否和/或數量，得出待測miRNA的檢測結果。本發明方法具有高特異、高靈敏和便利性等特點，不僅可同時檢測多種miRNA，還可區分miRNA及其前體。本發明方法可應用於生物學檢測和臨床醫學。
【專利說明】miRNA檢測方法及應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物【技術領域】，具體地涉及一種檢測miRNA的新方法（稱為aLHCD)、及 其在生物學檢測和臨床醫學中的應用。

【背景技術】
[0002] miRNA是約22個鹼基長的微型非編碼RNA，它的產生是一個梯級的過程。RNA 聚合酶II或III轉錄產生的長非編碼RNA(稱為pri-miRNAs)，首先由RNA酶DR0SHA剪 切，產生約60-70bp長的前體分子（稱為pre-miRNAs)，再經由DICER剪切，產生成熟的 miRNA[D.P.Bartel,Cell,116 (2), 281(2004),K.Okamura,WileyInterdiscipRevRNA, 3(3)，351 (2011)】。
[0003] 現今，業已證明miRNA是基因表達調控的一個關鍵子，它可影響幾乎每個細胞 生物學事件，並能參與大部分的人類疾病【Y.Huang,X.J.Shen，Q.Zouetal.，JPhysiol Biochem，67(1)，129(2010)】。
[0004] 由於miRNA如此重要，對其研究呈爆炸性的增長，但miRNA檢測方法的研究明顯滯 後於miRNA自身的研究。
[0005]MiRNA檢測方法明顯滯後的原因，主要是由miRNA自身獨特的特點所決定的 【K.A.Cissell，S.Shrestha，andS.K.Deo,AnalyticalChemistry79 (13)，4754 (2007) ;M.de Planell-SaguerandM.C.Rodicio,AnalChimActa699 (2), 134 (2011)]：一是miRNA分子喊 基序列特別短，雜交時的退火溫度低，從而影響雜交的嚴緊性；二是miRNA與其家族成員僅 有幾個鹼基乃至單個鹼基的區別，與其多個靶基因也有相似的序列，與其前體更是有完全 相同的序列【P.ChughandD.P.Dittmer,WileyInterdiscipRevRNA3 (5) ,601 (2012) ;H. Zhou,M.L.Arcila,Z.Lietal.,NucleicAcidsRes40 (13), 5864 (2012) ;M.Thomas,J. Lieberman,andA.Lai,NatStructMolBioll7(10), 1169(2010)】，這對miRNA的檢測特異 性提出了極大的挑戰；三是miRNA沒有poly-A尾巴和5'帽子，這阻止了常規方法對其特異 性的純化，從而影響檢測的靈敏度和特異性；四是miRNA極短的鹼基序列也使引物的設計 十分困難，從而影響PCR方法的運用；五是不同的GC含量需要不同的退火溫度，特別是對 miRNA這樣很小的分子而言更為明顯，這就嚴重影響了多個miRNA的同時檢測。
[0006] 儘管困難重重，各種各樣的miRNA檢測方法也湧現出來【K.A.Cisselland S.K.Deo,AnalBioanalChem394 (4), 1109 (2009) ;S.TakadaandH.Asahara,Mod Rheumatol(2012)】。目前為止，常用的miRNA檢測方法主要有三大類，其中Northern blotting被看成是檢測單個miRNA的金標準，PCR適合高靈敏的檢測，晶片適合高通量 的分析【P.ChughandD.P.Dittmer,WileyInterdiscipRevRNA3 (5) ,601 (2012) ;M.de Planell-SaguerandM.C.Rodicio,AnalChimActa699 (2), 134 (2011);E.vanRooij,Circ Resl08 (2), 219 (2011)】。但是Northernblotting方法操作複雜，費時費力，靈敏度低，不 適合高通量分析。stemloop-PCR因為引物的設計有很大的困難限制了它的應用。晶片雖 然可用於多通量的分析，但特異性和可重複性低。
[0007] 總之，目前的方法很難做到對miRNA高特異、高靈敏和便利性的檢測【P.Chugh andD.P.Dittmer,ffileyInterdiscipRevRNA3 (5), 601 (2012);K.A.Cisselland S.K.Deo,AnalBioanalChem394(4), 1109(2009)】。因此，本領域迫切需要開發高特異、高 靈敏和便利性的、可同時檢測多種miRNA的方法。


【發明內容】

[0008] 本發明的目的就是提供一種高特異、高靈敏和便利性的、可同時檢測多種miRNA 的方法。
[0009] 在本發明的第一方面，提供了一種miRNA檢測方法，包括步驟：
[0010] (a)將含miRNA的樣品與核酸雜交探針進行液相雜交，從而形成含"miRNA-雜交探 針"的第一複合物的液相混合物，其中所述的核酸雜交探針為雙髮夾核酸探針，並且所述的 雙髮夾核酸探針具有：
[0011] (i)位於5'端的第一髮夾結構區；
[0012] (ii)位於3'端的第二髮夾結構區；以及
[0013] (iii)位於所述第一髮夾結構區和第二髮夾結構區之間的、與待檢測的miRNA互 補的互補結合區；
[0014] (b)對所述的"miRNA-雜交探針"第一複合物，用限制性內切酶進行消化，從而從 所述第一複合物中切除第一髮夾結構區或第二髮夾結構區，形成一端保留髮夾結構區的、 經酶切的第二複合物，其中所述的限制性內切酶僅切除第一髮夾結構區或第二髮夾結構區 而不切割第一複合物的其他區域；
[0015] (c)用單鏈外切酶對所述第二複合物進行消化，從而切除所述第二複合物中在步 驟（b)中切除髮夾結構區所暴露出的核酸單鏈，形成第三複合物，並同時切除多餘的未雜 交探針，其中所述第三複合物由經雙重消化後的核酸探針和miRNA構成；
[0016] ⑷以所述的經雙重消化的核酸探針為模板，用引物進行PCR擴增，從而獲得PCR 擴增產物，其中所述擴增產物含有對應於所述待測miRNA序列的核酸序列區；
[0017] (e)檢測所述PCR擴增產物的存在與否和/或數量，從而得出待測miRNA的檢測結 果。
[0018] 在另一優選例中，所述的檢測結果為定性或定量結果。
[0019] 在另一優選例中，所述的互補是完全互補。
[0020] 在另一優選例中，在步驟（d)中，所述的PCR擴增為橋接PCR擴增。
[0021] 在另一優選例中，在步驟（d)中，在所述的橋接PCR擴增中同時使用橋接引物對和 通用引物對，其中，橋接引物對特異性結合於所述的經雙重消化的核酸探針，而所述通用引 物對特異性結合於所述橋接引物對的外側。
[0022] 在另一優選例中，所述的橋接引物對由第一橋接引物和第二橋接引物構成，其中 第一橋接引物特異性結合於所述經雙重消化的核酸探針中殘留的髮夾結構區，而第二橋接 引物特異性結合於所述經雙重消化的核酸探針中互補結合區。
[0023] 在另一優選例中，在步驟（d)中，通過親和素_生物素複合物信號放大技術，檢測 所述PCR擴增產物。
[0024] 在另一優選例中，所述的通用引物對的部分或全部引物帶有生物素標記；
[0025] 或者所述的通用引物對的上遊引物和/或下遊引物帶有生物素標記。
[0026] 在步驟（d)中，通過親和素_生物素複合物信號放大技術，檢測所述PCR擴增產 物。
[0027] 在另一優選例中，在步驟（e)中，通過標記酶顯色進行顯色判讀；或通過印跡法或 macroarray方法進行檢測。
[0028] 在另一優選例中，所述的限制性內切酶是識別6個鹼基的限制性內切酶；
[0029] 而所述的單鏈外切酶為3'到5'的外切酶。
[0030] 在另一優選例中，所述的限制性內切酶為BamHI;和/或單鏈外切酶為Exol。
[0031] 在另一優選例中，所述的限制性內切酶在所述的第一複合物上僅具有一個對應的 酶切位點，且所述酶切位點位於第一或第二髮夾結構區的配對區。
[0032] 在另一優選例中，所述方法具有選自下組的一個或多個特徵：
[0033] ?第一髮夾結構區具有雙鏈的第一莖部區和單鏈的第一莖環區（loop);
[0034] ?第二髮夾結構區具有雙鏈的第二莖部區和單鏈的第二莖環區（loop);
[0035] ?所述各莖部區的長度為6_12bp，較佳地7-10bp;
[0036] ?所述各莖環區的長度為4-12bp，較佳地4-10bp，更佳地4-8bp;
[0037] ?所述的互補結合區與所述第一髮夾結構區和/或第二髮夾結構區之間存在 〇-3bp的間隔區；較佳地，間隔區的長度為l_2bp;
[0038] ?所述互補結合區的長度與待檢測的miRNA的長度一致，為18_30bp。
[0039] 在本發明的第二方面，提供了一種用於檢測miRNA的試劑盒，所述試劑盒含有：
[0040] (a)用於與miRNA進行雜交的核酸雜交探針，其中所述的核酸雜交探針為雙髮夾 核酸探針，並且所述的雙髮夾核酸探針具有：
[0041] (i)位於5'端的第一髮夾結構區；
[0042] (ii)位於3'端的第二髮夾結構區；以及
[0043] (iii)位於所述第一髮夾結構區和第二髮夾結構區之間的、與待檢測的miRNA互 補的互補結合區；
[0044] (b)使用說明書。
[0045] 在另一優選例中，所述的試劑盒還含有一種或多種以下組分：
[0046]?用於擴增反應的試劑；
[0047]?用於酶切反應的試劑；
[0048] ?用於顯色反應的試劑。
[0049] 在另一優選例中，所述的用於酶切反應的試劑包括限制性內切酶和/或單鏈外切 酶。
[0050] 在另一優選例中，所述試劑盒中含有二種或多種針對不同miRNA的核酸雜交探 針。
[0051] 在本發明的第三方面，提供了一種用於與miRNA進行雜交的核酸雜交探針，所述 的核酸雜交探針為雙髮夾核酸探針，並且所述的雙髮夾核酸探針具有：
[0052] (i)位於5'端的第一髮夾結構區；
[0053] (ii)位於3'端的第二髮夾結構區；以及
[0054] (iii)位於所述第一髮夾結構區和第二髮夾結構區之間的、與待檢測的miRNA互 補的互補結合區。
[0055] 在另一優選例中，所述的核酸雜交探針具有選自下組的一個或多個特徵 ：
[0056] ?第一髮夾結構區具有雙鏈的第一莖部區和單鏈的第一莖環區（loop);
[0057] ?第二髮夾結構區具有雙鏈的第二莖部區和單鏈的第二莖環區（loop);
[0058] ?所述各莖部區的長度為6_12bp，較佳地7-10bp ;
[0059] ?所述各莖環區的長度為4-12bp，較佳地4-10bp，更佳地4-8bp;
[0060] ?所述互補結合區的長度與待檢測的miRNA的長度一致，為18-30bp。
[0061] 所述的互補結合區與所述第一髮夾結構區和/或第二髮夾結構區之間存在〇_3bp 的間隔區；較佳地，間隔區的長度為l_2bp。
[0062] 在另一優選例中，所述第一髮夾結構區的序列為 5'-ACGTGCGAAAACGCGCGAT-3'（SEQIDN0. :1)。
[0063] 在另一優選例中，所述第二髮夾結構區的序列為5'-TTTATAGGATCCAATAAAAATTGGA TCCTATAC-3'（SEQIDN0. :2)。
[0064] 在本發明的第四方面，提供了一種探針組合，所述組合包括二種或多種針對不同 miRNA的、本發明第三方面中所述的核酸雜交探針。
[0065] 應理解，在本發明範圍內中，本發明的上述各技術特徵和在下文（如實施例）中具 體描述的各技術特徵之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限於篇幅，在 此不再一一累述。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0066] 圖1顯示了本發明方法的流程示意圖。
[0067] 圖2顯示了本發明一個實例中所用核酸雜交探針和引物的序列，其中包括探針的 髮夾結構區序列、PCR搭橋序列、BIOTIN標記的PCR通用引物；
[0068] 圖3顯示了本發明方法與常規northernblotting方法對比，本方法的檢測靈敏 度。其中，本發明方法顯示的是線性動力學範圍內的靈敏度，即單獨用PCR，可達到lamol水 平（fg級水平）；本發明方法顯示的顯色反應，即PCR後再用ABC檢測放大信號，顯色靈敏 度至少為20zmol(ag級水平）。圖3A顯示了PCR反應的線性動力學範圍；圖3B顯示了PCR 反應的線性相關及相關係數；圖3C顯了顯色反應不同條件下的檢測靈敏度。圖3D顯示了 現有技術中，常規Northernblotting法（即Northern印跡法）檢測miR-65的靈敏度。 其中顯示常規northernblotting的檢測靈敏度僅為lfmol(pg級水平）。其中，按圖中所 不量的Rn〇-miR-65寡聚脫氧核苷酸及其5pmol反義探針通過傳統的基於放射性同位素的 Northern印跡法在42°C下雜交。放射自顯影時間為12小時。圖中，Rno表示大鼠。
[0069] 圖4顯示了實際應用中本發明方法（aLHCD)比常規Northern印跡法更靈 敏。其中，來自於JEG-3,MG-63,U-20S，5637和T24細胞的總RNA，使用不同方法分別與 rn〇-mir_29aDNA探針進行雜交。（A)使用傳統的基於放射性同位素的Northern印跡法。 (B)使用aLHCD法，PCR擴增進行20個循環。Northern印跡法的起始RNA的20iig，aLHCD 為1iig。Northern印跡法的探針量為5pmol，aLHCD為4pmol。Northern印跡法的雜交溫 度為42°C，aLHCD為45°C。放射自顯影的時間為12h，使用BCIP/NBT顯色時間為2min。
[0070] 圖5顯色了本發明方法與常規Stem-loop法對比，本方法可有效區分特定類型 miRNA及其前體。其中的特定類型miRNA是指成熟體miRNA位於前體序列的3'末端。圖 5A通過展示序列方式顯示了這種特定miRNA及其前體都可與常規的RT-Primer匹配結合， 導致無法區分。圖5B通過展示序列方式顯示了這種特定miRNA可與本發明的特異性探針 匹配結合，miRNA前體不可與本發明的特異性探針匹配結合，從而導致可以有效區分。圖5C 用實驗證明方式顯示，用常規方法（Stem-loopmethod)無法區分miRNA及其前體，而用本 發明方法（LH-PCR)可以對兩種miRNA及其前體進行有效區分。
[0071] 圖6顯示了本發明方法可以有效區分miR-122及其前體。圖中，Rno表示大鼠。圖 6A通過展示序列方式顯示了miR-122前體不能與本發明探針結合，而成熟的miR-122則可 與本發明探針結合。圖6B通過實驗證明方式顯示了對本發明可有效區分miR-122及其前 體。其中，preRNA表示miRNA-122的前體。
[0072] 圖7顯示本發明方法可在實際樣品應用中可以有效區分miR-138及其前體。圖 7A通過展示序列方式顯示了miR-138前體不能與本發明探針結合，而成熟的miR-138則可 與本發明探針結合。圖7B通過實驗證明方式顯示了本發明可有效區分miR-138及其前體。 其中，pre表示miRNA-138的前體。
[0073] 圖8顯示了本發明方法可以有效區分同一miRNA家族中的不同成員。圖8A通過展 示序列方式顯示了miR-200家族中的不同成員中，僅miR-200b可與本發明探針完全匹配。 圖8B通過實驗證明方式顯示了本發明可有效將miR-200b與同一家族中不同成員區分開。 圖8C通過序列展示方式顯示了miR-29家族中的不同成員中，僅miR-29a可與本發明探針 完全匹配。圖8D通過實驗證明方式顯示了本發明可有效將miR-29a與同一家族中不同成 員區分開。
[0074] 圖9顯示了用本發明方法對不同組織中多個miRNA的檢測結果。

【具體實施方式】
[0075] 本發明人經過廣泛而深入的研究，首次開發了一種新型的檢測miRNA的方法（取 名liquidhybridizationandcolordevelopmentwithsignalamplification,簡寫為 aLHCD)。該方法採用設計獨特的雙髮夾探針，利用獨特的兩步特異性酶切，通過獨特的橋接 PCR擴增，並與液相雜交顯色法（LHCD)系統連接起來，從而構成一個完整的檢測系統，實現 了對miRNA的高特異，高靈敏，多通量和便利化檢測，使用安全，操作簡單。在此基礎上完成 了本發明。
[0076]aLHCD方法解決了目前的blotting方法，PCR方法和microarray方法對miRNA檢 測的困難，提供了一個可多樣化使用的方法，即aLHCD可以根據用戶需要變成blotting方 法，PCR方法和macroarray方法，這為miRNA的檢測提供了一個高潛能的方法。而且本發 明的aLHCD方法所用的試劑均為商品化中的大眾試劑，使用方便安全，實驗操作簡單，很容 易推廣使用。
[0077] 術語
[0078] aLHCD或LH-CD指liquid hybridization and color development with signal amplification,即液相雜交信號放大顯色。
[0079]ABC指親和素-生物素複合物（avidin-biotincomplex)。
[0080] IHC指免疫組化（immunohistochemistry)。
[0081]AP指喊性憐酸酶（alkalinephosphatase)。
[0082]BCIP/NBT指 5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸 / 硝基四氮唑藍（5-brom〇-4-chlor〇-3-indolyl-phosphate/nitrobluetetrazolium)〇
[0083]TBS指Tris緩衝液（tris-bufferedsaline)。
[0084] 如本文所用，術語"本發明探針"、"雙髮夾核酸雜交探針"或"具有雙髮夾結構的核 酸雜交探針"可互換使用，指具有以下結構（區）的雙髮夾核酸探針：
[0085] (i)位於5'端的第一髮夾結構區；
[0086] (ii)位於3'端的第二髮夾結構區；以及
[0087] (iii)位於所述第一髮夾結構區和第二髮夾結構區之間的、與待檢測的miRNA互 補的互補結合區。
[0088] 如本文所用，術語"本發明方法"指aLHCD法或其變化形式 LH-PCR，LH_macroarray〇
[0089] 檢測方法
[0090] 本發明提供了一種可用於檢測微小RNA(miRNA)的新方法（aLHCD)。
[0091] 本發明檢測方法是採用創新設計的雙髮夾DNA探針與提取的RNA進行液相雜交， 然後用BAMHI和EX0I兩步酶切後，用引物進行橋接PCR擴增，再進行親和素生物素複合物 (ABC)信號放大，最後通過標記酶顯色進行顯色判讀。從而形成了一個高特異，高靈敏，多通 量和便利化的新型miRNA檢測系統。
[0092] 參見圖1。在本發明中，一個典型的miRNA檢測方法包括如下基本步驟：
[0093] (1)設計特殊的雜交探針。
[0094] (2)將設計的特殊探針與待檢測樣品進行液相雜交。
[0095] (3)雜交後的混合液採用特定的酶進行第一次酶切。
[0096] (4)酶切後的雜交液採用另一種酶進行第二次酶切。
[0097](5)酶切後的混合液採用PCR擴增進行信號放大。
[0098](6) PCR反應液採用另一種酶進行第三次酶切。
[0099] (7)第三次酶切的混合液採用親和素生物素複合物系統（ABC)進行進一步信號放 大。
[0100] (8)最後通過標記酶顯色再次進行信號放大及判讀。
[0101] 如果aLHCD用作PCR方法，則步驟（6)為用DNA凝膠成像系統檢測。
[0102] 在本發明中，核酸雜交探針具有雙髮夾結構（通常位於兩端）。
[0103] 在本發明中，用於第一步酶切的限制性內切酶沒有特別限制，代表性的例子包括： 例如BamHI或其他限制性內切酶。
[0104] 在本發明中，用於第二步酶切的單鏈外切酶沒有特別限制，代表性的例子包括：例 如EX0I等能消化DNA單鏈的酶。
[0105] 較佳地，PCR擴增時，至少包括一對PCR擴增標記引物和一對搭橋引物。
[0106] 在本發明中，用於第三步酶切的單鏈外切酶沒有特別限制，代表性的例子包括：例 如EX0I等能消化DNA單鏈的酶。
[0107] 在本發明中，可以用常規方法對擴增產物進行檢測，例如通過印跡法方法，PCR方 法和macroarray方法。
[0108] -種優選的檢測方法是，對第三步酶切後的混合液進行生物素親合素複合物系統 (ABC)或其它系統進行信號放大，從而進行檢測。例如，對上述混合液再進行標記酶顯色進 行信號放大和判讀。
[0109] 在本發明的一個具體實例中，使用雙髮夾DNA探針與提取的RNA進行液相雜交， 然後用BAMHI和EX0I兩步酶切後，用引物進行橋接PCR擴增，再進行親和素生物素複合 物（ABC)信號放大，最後通過標記酶顯色進行顯色判讀，例如，通過AP(鹼性磷酸酶）或 HRP(辣根過氧化物酶）顯色。
[0110] 基本原理
[0111] 本發明的基本原理說明如下：
[0112] (1)探針兩端的雙髮夾結構提供雜交時的空間阻礙，防止miRNA前體與之雜交，同 時這個設計還有利於防止其它核酸分子的非特異雜交，再是為後續步驟的PCR放大信號提 供接頭。
[0113] 例如，探針的5'髮夾所加序列為：

【權利要求】
1. 一種miRNA檢測方法，其特徵在於，包括步驟： (a) 將含miRNA的樣品與核酸雜交探針進行液相雜交，從而形成含"miRNA-雜交探針" 的第一複合物的液相混合物，其中所述的核酸雜交探針為雙髮夾核酸探針，並且所述的雙 髮夾核酸探針具有： (i) 位於5'端的第一髮夾結構區； (ii) 位於3'端的第二髮夾結構區；以及 (iii) 位於所述第一髮夾結構區和第二髮夾結構區之間的、與待檢測的miRNA互補的 互補結合區； (b) 對所述的"miRNA-雜交探針"第一複合物，用限制性內切酶進行消化，從而從所述 第一複合物中切除第一髮夾結構區或第二髮夾結構區，形成一端保留髮夾結構區的、經酶 切的第二複合物，其中所述的限制性內切酶僅切除第一髮夾結構區或第二髮夾結構區而不 切割第一複合物的其他區域； (c) 用單鏈外切酶對所述第二複合物進行消化，從而切除所述第二複合物中在步驟 (b)中切除髮夾結構區所暴露出的核酸單鏈，形成第三複合物，並同時切除多餘的未雜交探 針，其中所述第三複合物由經雙重消化後的核酸探針和miRNA構成； (d) 以所述的經雙重消化的核酸探針為模板，用引物進行PCR擴增，從而獲得PCR擴增 產物，其中所述擴增產物含有對應於所述待測miRNA序列的核酸序列區； (e) 檢測所述PCR擴增產物的存在與否和/或數量，從而得出待測miRNA的檢測結果。
2. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於，在步驟（d)中，所述的PCR擴增為橋接PCR 擴增。
3. 如權利要求2所述的方法，其特徵在於，在步驟（d)中，在所述的橋接PCR擴增中同 時使用橋接引物對和通用引物對，其中，橋接引物對特異性結合於所述的經雙重消化的核 酸探針，而所述通用引物對特異性結合於所述橋接引物對的外側。
4. 如權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述的橋接引物對由第一橋接引物和第二 橋接引物構成，其中第一橋接引物特異性結合於所述經雙重消化的核酸探針中殘留的髮夾 結構區，而第二橋接引物特異性結合於所述經雙重消化的核酸探針中互補結合區。
5. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於，在步驟（d)中，通過親和素-生物素複合物 信號放大技術，檢測所述PCR擴增產物。
6. 如權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述的通用引物對的部分或全部引物帶有 生物素標記； 或者所述的通用引物對的上遊引物和/或下遊引物帶有生物素標記。 在步驟（d)中，通過親和素-生物素複合物信號放大技術，檢測所述PCR擴增產物。
7. 如權利要求1-6中任一所述的方法，其特徵在於，在步驟（e)中，通過標記酶顯色進 行顯色判讀；或通過印跡法或macroarray方法進行檢測。
8. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述方法具有選自下組的一個或多個特徵： ?第一髮夾結構區具有雙鏈的第一莖部區和單鏈的第一莖環區（loop); ?第二髮夾結構區具有雙鏈的第二莖部區和單鏈的第二莖環區（loop); ?所述各莖部區的長度為6-12bp，較佳地7-10bp ; ?所述各莖環區的長度為4-12bp，較佳地4-10bp，更佳地4-8bp ; ?所述的互補結合區與所述第一髮夾結構區和/或第二髮夾結構區之間存在〇-3bp的 間隔區；較佳地，間隔區的長度為l_2bp ; ?所述互補結合區的長度與待檢測的miRNA的長度一致，為18-30bp。
9. 一種用於檢測miRNA的試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒含有： (a) 用於與miRNA進行雜交的核酸雜交探針，其中所述的核酸雜交探針為雙髮夾核酸 探針，並且所述的雙髮夾核酸探針具有： (i) 位於5'端的第一髮夾結構區； (ii) 位於3'端的第二髮夾結構區；以及 (iii) 位於所述第一髮夾結構區和第二髮夾結構區之間的、與待檢測的miRNA互補的 互補結合區； (b) 使用說明書； 較佳地，所述的核酸雜交探針具有選自下組的一個或多個特徵： ?第一髮夾結構區具有雙鏈的第一莖部區和單鏈的第一莖環區（loop); ?第二髮夾結構區具有雙鏈的第二莖部區和單鏈的第二莖環區（loop); ?所述各莖部區的長度為6-12bp，較佳地7-10bp ; ?所述各莖環區的長度為4-12bp，較佳地4-10bp，更佳地4-8bp ; ?所述互補結合區的長度與待檢測的miRNA的長度一致，為18-30bp。
10. -種用於與miRNA進行雜交的核酸雜交探針或所述探針的組合，其特徵在於，所述 的核酸雜交探針為雙髮夾核酸探針，並且所述的雙髮夾核酸探針具有： (i) 位於5'端的第一髮夾結構區； (ii) 位於3'端的第二髮夾結構區；以及 (iii) 位於所述第一髮夾結構區和第二髮夾結構區之間的、與待檢測的miRNA互補的 互補結合區； 其中，所述組合包括二種或多種針對不同miRNA的所述的核酸雜交探針。
【文檔編號】C12Q1/68GK104342486SQ201310326679
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2013年7月30日 優先權日:2013年7月30日
【發明者】張永蓮, 李湘麒, 倪敏捷, 張朝寶, 馬武斌 申請人:中國科學院上海生命科學研究院