一種細胞株的篩選方法
2023-10-22 17:13:52 2
專利名稱:一種細胞株的篩選方法
技術領域:
本發明涉及基因工程技術,特別涉及在CHO哺乳動物細胞中重組表達單克隆抗體,並篩選穩定的高表達細胞株的工藝。
背景技術:
目前單克隆抗體已越來越廣泛地用於治療傳統藥物難以治癒的疾病,如自身免疫疾病、腫瘤等對人類密切相關的疾病。由於抗體藥物在臨床使用時需要的劑量大,而且主要是通過靜脈滴注進入人體,因此高表達和高純度是抗體進入臨床應用的必要環節(Doner et al. 1989, J Bio Chem,264 :20602-7 ;Malm, 1987, J Immunol Methods,104 :103-9)。所以獲得穩定高表達的細胞株成為非常關鍵的因素(Nature Biotechnology,2004,22 1393)。常用的CHO細胞系有兩種CH0和CHO (dhfr_),CHO (dhfr_)是缺失二氫葉酸還原酶的細胞株。CHO表達系統是目前應用最廣泛的真核表達系統之一,與其它表達系統相比, 它具有許多優點。選擇標記和基因擴增CHO細胞表達載體主要有兩類選擇標記。一類是 neo等非擴增基因。另一類具有基因擴增的功能,也稱共擴增基因,如二氫葉酸還原酶基因 (dihydrofolate reductase, DHFR),(glutamine synthetase,GS)。目前,真核細胞DHFR表達系統主要是通過生長代謝選擇壓力來獲得高表達的細胞株(Birch and Racher, Advanced Drug Delivery Reviews 2006,58:671)。通過增加MTX的培養濃度來增加DHFR基因在染色體年拷貝數,來達到增加外源基因的表達水平的,而更高的MTX濃度更易導致細胞株的不穩定(Kim et al. 1998, Biotechnology Bioengineering,58 :73-84)。所以選擇低的MTX濃度有利於篩選得到穩定的細胞株。 抗體的表達很大程度上依賴於輕鏈的表達,合適的H/L比例可以促進完整抗體的分泌 (Schlatter et al.,2005,Biotechnology Progress, 21 :122-133)。目前,國內報導的真核細胞表達人源化抗體的產量均較低,難以實現產業化並實際應用。抗體產量最好在50mg/L 以上(Beidler et al,1988,J Immunol, 141 :4053-60),如此才能達到產業化的最低要求。
發明內容
本發明是針對現有細胞表達系統效率低,難以獲得穩定高表達細胞株的問題,公開了一種引入抗性篩選的細胞表達系統。一種細胞株的篩選方法,包括將輕重鏈序列轉入不同質粒載體,然後轉染細胞和利用選擇標記進行細胞篩選的步驟,其特徵在於,將所述的重鏈序列插入帶有選擇標記的篩選基因的載體,將所述的輕鏈序列插入帶有抗性基因的載體上,二者共同轉染共擴增基因表達系統細胞後,先用抗性培養基篩選陽性克隆,然後進行壓力篩選擴增表達。所述重鏈序列插入帶有DHFR篩選基因的載體,所述輕鏈序列插入帶有kocin抗性基因載體上。在一個實施方案中,所述的抗性篩選培養基為含有^ocin抗性篩選培養基。所述的 kocin 篩選濃度為 100-400ug/ml,優選為 200_250ug/ml。
在本發明的實施例中,應用CHO細胞DHFR表達系統,將輕重鏈分別插入二種表達載體中共轉染CHO細胞,為保證細胞能同時表達HL鏈,也為了增加篩選概率,同時加入了 Zeocin抗性篩選。抗體的表達水平很大程度上依賴於輕鏈的表達,所以在高表達的細胞株中,輕鏈的過度表達有利於完整抗體分子的分泌,且有利於後續工藝中的蛋白純化。本發明的一具體實施例的篩選方案包括以下工藝步驟在一個實施方案中,篩選培養基選用含有HT成分的DMEM/F12培養基。為獲得高表達的細胞株,選擇合適的培養基同樣非常重要,在本發明的一實施例中,篩選培養基選用含有HT成分的DMEM/F12培養基,以補償單細胞培養過程中DHFR缺陷型細胞的代謝,有利於克隆的形成,進而篩選到高表達的細胞株。隨培養的時間延長,不斷增加MTX的濃度。待細胞恢復活力後,以有限稀釋法進行單克隆的篩選工作,以每孔1個細胞的密度鋪96孔板,每孔加入150ul的培養基培養。待培養5天後,加入MTX終濃度為IOOnM的DMEM培養基,繼續培養至克隆形成。取培養的單克隆細胞上清,進行ELISA測定,然後挑取表達高的克隆,分別依次擴增到M孔板、6孔板、 T75細胞培養瓶。培養的細胞克隆繼續在無血清培養基302中馴化成懸浮培養,並凍存細胞株於液氮中。
圖1為本發明一實施例的克隆篩選工藝流程圖。圖2為構建的分別表達重組抗體輕重鏈的質粒圖加為表達重組抗體輕鏈的質粒。圖2b為表達重組抗體重鏈的質粒。圖3為本發明一實施例的Wfestern Blotting檢測結果。其中,圖3a為非還原 Western Blotting 結果1_8 為 1G2,7A3,4H5,7B7,5H9,2C12,5F1,7D7 克隆樣品的培養上清;9為蛋白Marker ;10為陽性對照。圖3b為還原^festern Blotting結果1_8為1G2, 7A3,4H5,7B7,5H9,2C12,5F1,7D7克隆樣品的培養上清;9為蛋白Marker ;10為陽性對照。圖4為本發明一實施例的細胞懸浮培養的生長曲線圖。圖5為本發明一實施例的抗體表達水平的檢測圖。圖6為本發明一實施例連續培養60天的細胞生長和表達情況。
具體實施例方式本發明的技術方案包括分子構建,轉染CHO細胞,克隆篩選,細胞馴化等過程,通過在轉染後的初期,待細胞活性恢復後,先加入^ocin壓力篩選^ocin抗性的細胞;然後將陽性克隆轉入含MTX的篩選培養基進行篩選,方法如圖1所示。本發明的一具體實施例的篩選方案包括以下工藝步驟1)、用二個表達載體分別構建抗體的輕重鏈序列,其中H鏈序列插入帶有DHFR篩選基因的載體,L鏈序列插入帶有&0(^11抗性基因的載體上,二者共同轉染CHO DHFR-細胞;2)、在IOcm培養皿中細胞培養,選擇壓力的使用是先用kocin抗性篩選陽性細胞,然後用MTX壓力梯度提高的方式來增加表達;3)克隆擴增的培養基選用DMEM/F12培養基,其中F12培養基是含HT的培養基。對於單細胞形成克隆過程中,細胞此時的生長是處於不利的條件下,對於高表達的細胞而言, 外源提供H、T成分,提供營養更為豐富的培養基更有利於克隆的形成;4)擴增的細胞克隆經302培養基馴化後,進行細胞表達檢測和連續培養,觀察細胞的生長和表達穩定性;5)凍存篩選到的穩定高表達細胞株。本發明描述的有關附圖,其中顯示了本發明的優選實施方案。本發明能夠以不同方式體現並且不應該解釋為本發明局限於本文列出的實施方案。更確切地說,提供了這些實施方案能充分公開、徹底和全面完全地向本領域的技術人員傳遞本發明的範圍。此外,文中所建議的對實施方案的多種變更和補充對於本領域的技術人員是顯而易見的,其不脫離本發明所要保護的範圍。除非另外定義,本文中所使用的所有技術科學術語都具有與本發明所屬領域普通技術人員通常理解的相同的含義。在本發明描述中使用的術語只是為了描述特定實施方案,而不是旨在對本發明進行限制。如在本文中所使用的「輕、重鏈」,是指構成抗體的肽鏈結構。抗體是具有4條多肽鏈的對稱結構,其中2條較長、相對分子量較大的相同的重鏈(H鏈);2條較短、相對分子量較小的相同的輕鏈(L鏈)。鏈間由二硫鍵和非共價鍵聯結形成一個由4條多肽鏈構成的單體分子。輕鏈有K和λ兩種,重鏈有μ、δ、Υ、ε和α五種。整個抗體分子可分為恆定區和可變區兩部分。在給定的物種中,不同抗體分子的恆定區都具有相同的或幾乎相同的胺基酸序列。可變區位於"Y"的兩臂末端。在可變區內有一小部分胺基酸殘基變化特別強烈,這些區域稱高變區,也叫⑶R區。高變區位於分子表面,高變區胺基酸序列決定了該抗體結合抗原抗原的特異性(通常包括⑶R1、⑶R2和⑶R3三個高變區)。不同種屬來源的抗體在結構上有很大的相似性,包含有可變區、恆定區,特別在恆定區,有著同源性非常接近的序列。不同抗體之間的差別主要在於可變區的序列,而這一部分僅佔抗體分子的一小部分。本發明所用的抗體輕重鏈序列有一定的代表性。實施例1.表達載體的構建以人工合成的輕重鏈作為模板(抗體的輕鏈DNA及胺基酸序列分別為SEQ ID NO 1和SEQ ID NO :2 ;抗體的重鏈DNA及胺基酸序列分別為SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4)。當然在不同的具體實施方式
中,所述的輕重鏈可以是根據具體實驗設計需要而人工合成的, 或者是野生型。PCR擴增相應的輕重鏈片段,割膠回收目標片段,HindIIIAhoI酶切,將H鏈片段連入經相同酶切的ρΖ1。ρΖ1載體改造自pcDNA3. 1表達載體(購自hvitrogen公司),採用常規方法,用合成的DHFR基因片段(Genebank accession number :ΝΜ_010049)替換(Xmal/ Csp45I)pcDNA3. 1上的Neomycin基因;L鏈片段連入經相同酶切的pcDNA4載體上(購自 Invitrogen公司)。當然,在符合本發明目的情況下,還可以選用其他種類質粒。轉化DH5 α感受態細胞,鋪氨卞抗性的LB平板,37°C培養過夜挑取陽性菌落,搖床培養過夜,提取質粒,並進行酶切鑑定。對於陽性的克隆進行測序鑑定。最終分別表達H、L 鏈的載體如圖2所示。2.轉染哺乳動物細胞
大量抽提質粒pZl-H和pcDNA4-L DNA,以總量40ug DNA,以H L= 1 2的摩爾比例,電擊轉染處於對數生長期的CHO DHFR-細胞(ATCC,CRL-9096),(Bio-Rad GenePulse, 參數300V,900uF)。取電擊後的細胞放置於含有10% dFBS的DMEM培養基(PAA,E15-810) 的培養皿中,加入HT培養。3.抗性篩選上述的細胞培養M小時後換細胞上清,不加入HT培養,加入終濃度為200ug/ml 的kocin培養;連續培養3代以上。4.分板篩選轉染後的細胞,加入終濃度為5nM MTX加壓培養,隨培養的時間的延長,不斷增加 MTX壓力,最終MTX的濃度為ΙΟΟηΜ。用胰酶消化轉染的CHO細胞,在血紅細胞計數板上計數,以1細胞/孔的細胞密度鋪96孔細胞培養板,培養基為含10% dFBS DMEM/F12 = 1 1, 終體積為150ul,37°C ,5% CO2後培養5天後,加入50ul含有終濃度為IOOnM的MTX的DMEM 培養基,繼續培養10天左右,至克隆形成。然後取細胞培養上清進行表達水平的檢測。5.表達水平的檢測(I)ELISA篩選以羊抗human IgGl kappa多抗包被ELISA板,5%脫脂奶粉封閉過夜,清洗後,加入以PBS 20倍稀釋的細胞培養上清,37。C反應1小時,洗板三次後,加入抗 human IgGlFab-HRP抗體,37C反應1小時,洗板三次後,加入TMB顯色液,15分鐘後加入2% H2SO4終止反應,於酶標儀上45nm處讀數。結果見表1。(2) Western Blotting 取培養一段時間後的細胞上清,加入loading Buffer後, 進行12% SDS-PAGE電泳,轉膜,封閉,加入相應的抗體反應1小時後,PBS洗,加入Dab顯色。結果見圖3,與陽性對照相比較,篩選的細胞的上清可以清楚地看到表達,無論是還原的還是非還原的^festern Blotting蛋白大小與對照蛋白大小相一致。(3) HPLC Protein A檢測抗體表達取細胞上清,離心棄沉澱,上清0. 45um過濾後,過ftOtein A柱,A280檢測抗體的峰面積,與標準品比較來計算抗體的表達水平。表1、96孔板ELISA檢測結果(部分,濃度單位ug/ml)
權利要求
1.一種細胞株的篩選方法,包括將輕重鏈序列轉入不同質粒載體,然後轉染細胞和利用選擇標記進行細胞篩選的步驟,其特徵在於,將所述的重鏈序列插入帶有選擇標記的篩選基因的載體,將所述的輕鏈序列插入帶有抗性基因的載體上,二者共同轉染共擴增基因表達系統細胞,先用抗性培養基篩選陽性克隆,然後進行壓力篩選擴增表達。
2.如權利要求1所述的細胞株的篩選方法,其特徵在於,所述重鏈序列插入帶有DHFR 篩選基因的載體,所述輕鏈序列插入帶有^ocin抗性基因載體。
3.如權利要求1所述的細胞株的篩選方法,其特徵在於,所述的抗性培養基為含有 Zeocin的培養基。
4.如權利要求3所述的細胞株的篩選方法,其特徵在於,所述的^ocin篩選濃度為 100-400ug/ml。
5.如權利要求3所述的細胞株的篩選方法,其特徵在於,所述的^ocin篩選濃度為 200-250ug/mlo
6.如權利要求1所述的細胞株的篩選方法,其特徵在於,所述的表達系統為CHO細胞 DHFR擴增系統,通過在轉染後的初期,待細胞活性恢復後,先加入kocin壓力篩選kocin 抗性的細胞;然後將陽性克隆轉入含MTX的篩選培養基進行篩選。
7.如權利要求1-6任一項所述的細胞株的篩選方法,其特徵在於,所述的篩選培養基選用含有HT成分的DMEM/F12培養基。
全文摘要
本發明公開了一種細胞株的篩選方法,包括將輕重鏈序列轉入不同質粒載體,然後轉染細胞和利用選擇標記進行細胞篩選的步驟,將所述的重鏈序列插入帶有選擇標記的篩選基因的載體,將所述的輕鏈序列插入帶有抗性基因的載體上,二者共同轉染共擴增基因表達系統細胞後,先用抗性培養基篩選陽性克隆,然後進行壓力篩選擴增表達,最終獲得了穩定高表達的細胞株。
文檔編號C12N15/11GK102533656SQ20101061973
公開日2012年7月4日 申請日期2010年12月29日 優先權日2010年12月29日
發明者應勖, 薛建華 申請人:嘉和生物藥業有限公司