用於預防、診斷和治療呼吸道合胞病毒感染的嵌合抗原及其抗體的製作方法

2023-10-28 16:07:27 3

專利名稱：用於預防、診斷和治療呼吸道合胞病毒感染的嵌合抗原及其抗體的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於預防、診斷和治療呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytial virus，RSV)感染的嵌合抗原及其抗體，特別是可用於RSV疫苗製備的新抗原。
背景技術：
RSV屬於副粘病毒科肺病毒屬，是一種具被膜的非節段單鏈RNA(負鏈)病毒。RSV感染遍布全球，是引起嬰幼兒嚴重下呼吸道感染的最主要的原因，也是引起嚴重老年性併發症的主要病原體。RSV感染率和患者的住院率都很高，而且患者在短時間內和終身發生多次重複感染。在發達國家，有0.5-1.5％的住院嬰幼兒死於RSV感染。RSV在老人聚居地易發生暴發性流行，患病率和死亡率極高。全世界每年有6千5百萬例感染，16萬人死亡。
目前治療RSV的藥物限於利巴韋林(Ribavirin)，雖然它廣泛用於治療骨髓移植病人的RSV感染，但對兒童的RSV感染的療效仍存爭議。用大劑量的人免疫球蛋白或者人源化的單克隆抗體預防高危嬰幼兒的RSV感染有一定的療效，但抗體治療的費用向來是很昂貴的。因此，在全球範圍內，特別是發展中國家推廣十分困難。然而，目前還沒有研製出成功的RSV疫苗。所以研製安全、有效的疫苗是一項十分緊迫的任務。與治療和預防相關的一個問題是成人RSV感染的臨床上診斷，其可靠性仍待提高。

發明內容
RSV基因組編碼10個蛋白，其中G蛋白是具有免疫原性的兩種被膜蛋白之一。G蛋白含有中和抗體表位，可誘導中和抗體產生。RSV的另一個重要蛋白M2蛋白，含有CTL表位，可激發CTL反應。本發明中出乎意料地發現，特定的G蛋白片段和/或CTL表位特別適用於以下用途(1)通過化學偶聯或者DNA重組技術，與載體蛋白偶聯或者融合，所形成的新的綴合/重組抗原分子可用於構建預防RSV感染的疫苗；(2)編碼這些綴合/重組抗原的DNA分子可用於構建預防RSV感染的核酸疫苗；(3)這些新的綴合/重組抗原分子可用於免疫宿主，產生可用於治療和預防RSV感染的有效抗體；這些抗原以及相應的抗體可作為診斷試劑的組成成份，用於診斷RSV感染。其中包含來源於RSV A或B亞型的G蛋白片段，CTL表位和載體蛋白中的至少兩種，即其中必有RSV A或B亞型的G蛋白片段或者CTL表位。
本發明的另一目的是提供編碼所述抗原的核酸分子，以及含有所述核酸的重組表達載體。
本發明的又一目的是提供重組生產所述抗原的方法。
本發明還涉及針對所述抗原的抗體。
本發明最後涉及所述抗原、相應的核酸分子、抗體在預防、診斷和治療呼吸道合胞病毒感染中的用途。


圖1顯示了重組質粒的PCR鑑定結果。其中各泳道說明如下AM為分子量標準DL-2000(大連TaKaRa公司產品)；1pET-DsbA-G151；2pET-DsbA-G126；3pET-DsbA-G101.B1陰性對照；2陽性對照；3398bp的DNA分子量標準；4-6分別為pET-CKS-G126，pET-GST-G126和pMBP-P-G126.C1陰性對照；2陽性對照；3353bp的DNA分子量標準；4-6分別為pET-CKS-G101 pET-GST-G101和pMBP-P-G101。
圖2顯示了部分重組抗原在E.coli中的表達產物的SDS-PAGE(12％)分析。其中各泳道說明如下A1-4分別為pET-DsbA，pET-DsbA-G101，pET-DsbA-G126和pET-DsbA-G151；5-7分別為pET-CKS，pET-CKS-G101和pET-CKS-G126；8，9分別為pET-GST和pET-GST-G101.B1，pET-MBP；2和4，pET-MBP-G126；3，pET-MBP-G101。
圖3圖示了重組蛋白在細菌裂解物中所佔的比例。
圖4是雙向免疫擴散實驗檢測抗原-抗體結合的示意圖。其中A 說明RSV與抗血清的結合。中心孔為原倍抗血清，A-F分別為不同倍數稀釋的RSV抗原；B 說明重組抗原與抗血清的結合。中心孔為原倍抗血清，A-C為不同倍數稀釋DsbA-G101，D-F為DsbA-G126；C 說明重組抗原與抗血清的結合。中心孔為原倍抗血清，A-C為不同倍數稀釋DsbA-G151，D-F為DsbA。
圖5顯示了空斑抑制試驗檢測融合蛋白動物水平活性的結果。
圖6顯示了血清對RSV的抑制作用實驗結果。
圖7顯示了含有G101和CTL表位的重組蛋白抗原DsbA-G101-Linker-F/M2的結構。
圖8顯示了小鼠肺勻漿上清中抗RSV的IgG抗體。
圖9顯示了小鼠血清中抗RSV的IgG抗體。
圖10顯示了小鼠肺勻漿上清中抗重組蛋白D-G1-F/M2和D-G1-L-F/M2的IgG抗體。
圖11顯示了小鼠血清中抗重組蛋白D-G1-F/M2和D-G1-L-F/M2的IgG抗體。
圖12顯示了小鼠血清中抗RSV的中和抗體滴度。
圖13顯示了D-G1-F/M2和D-G1LF/M2誘導的RSV特異性的CTL應答。
圖14顯示了血清抗體在體外對RSV病毒的抑制作用。
圖15顯示了鼻腔黏膜抗體在體外對RSV病毒的抑制作用。
圖16顯示了D-G1加強D-F/M2誘導產生的CTL應答。
圖17顯示了小鼠血清中抗G1和抗RSV的IgG抗體滴度。
具體實施例方式
為描述簡便，在本發明中，G蛋白片段在表示抗原組成的示式中用「FG」表示，載體蛋白用「CP」表示，CTL表位用「CTL」表示。
G蛋白片段(FG)可以具有G蛋白的胺基酸序列中第m-n位胺基酸所示的序列，或其保留功能的變體，其中m是10-150之間的任何整數，n是180-300之間的任何整數。m優選是25-140，更優選是50-130，最優選是75-125。n優選是190-275，更優選是200-250，最優選是220-230，尤其是225。最優選地，G蛋白片段(FG)可以具有G蛋白的胺基酸序列中第75-225位、第100-225位或第125-225位胺基酸殘基間的肽序列，或其保留功能的變體。
CTL表位主要來自M2蛋白。
載體蛋白(carrier protein，CP)選自熱休克蛋白(HSPs)、牛血清白蛋白BSA、匙孔血藍蛋白KLH、霍亂毒素亞單位CTB和TT蛋白、DsbA、CKS、GST和MBP，或其功能性片段，優選熱休克蛋白(HSPs)、DsbA(二硫鍵合成酶)、CKS(CMP-KDO合成酶)、GST(穀胱甘肽轉移酶)或MBP(分泌型麥芽糖結合蛋白)或其保留功能的變體或者它們的功能性片段。本發明優選的熱休克蛋白載體蛋白，是一類分子伴侶，在正常情況下，它幫助蛋白質的正確摺疊和裝配，而且HSPs在保護性免疫中扮演著非常重要的角色。HSPs可以加強體液免疫和細胞免疫，尤其可進一步增加MHC I類分子限制的CD8+T細胞的激活，提高CTL活性，而CD8+CTL應答不僅可直接殺傷病毒感染細胞，而且可下調Th2應答，使免疫反應更加平衡。HSPs是第一類哺乳動物原性佐劑，HSPs不產生抗體，僅起佐劑作用誘導肽特異性的抗體和CD8+T細胞應答，可以避免象破傷風類毒素-肽和白喉類毒素-肽複合物所引起的疫苗之間的交叉免疫抑制。本發明優選的DsbA、CKS、GST和MBP載體蛋白，一方面可以輔助G蛋白片段的摺疊，形成正確的空間構象，有利於保持抗原的自然特性。另一方面，可以增強G蛋白片段的穩定性和免疫原性。此外，還可以促進抗原在大腸桿菌內以可溶形式表達，這對下遊的分離純化是有利的，可以降低製備抗原樣品的成本。
在本發明中，保留功能的變體是指與親本多肽在胺基酸序列上具有至少80％同源性，優選至少90％同源性，更優選至少95％或98％同源性，或者因一或多個胺基酸殘基的缺失、插入和/或取代而有所不同的多肽，該多肽仍保留了親本多肽的功能活性。優選這種取代是小的變化或保守性取代。
通常視為保守的取代是脂肪族胺基酸Ala，Val，Leu和Ile中相互之間的取代；羥基殘基Ser和Thr的互換，酸性殘基Asp和Glu的互換，醯胺殘基Asn和Gln之間的取代，鹼性殘基Lys和Arg的互換以及芳香族殘基Phe和Tyr的相互取代。
有關何種胺基酸變化很可能是表型沉默的(即不會對功能有顯著不利的影響)的其它指南例見Bowie，J.U.等人的「譯解蛋白質序列中的信息對胺基酸取代的耐受」，科學，2471306-1310(1990)。
本發明的載體蛋白、G蛋白片段與CTL表位間的連接方式是可變的，可以是由N端到C端為CP+FG+CTL，CP+CTL+FG，FG+CTL+CP，CTL+FG+CP，FG+CP+CTL，CTL+CP+FG，CTL+FG，FG+CTL，CP+FG，FG+CP，CP+CTL，或者CTL+CP。分子內伴侶和G蛋白片段可以重複出現在一個抗原分子中。本發明的載體蛋白與G蛋白片段間、載體蛋白與CTL表位間，以及G蛋白片段和CTL表位間還可以通過連接蛋白連接，連接蛋白可以選自存在於黏膜細胞表面的受體。
本發明的G蛋白片段、CTL表位與載體分子，G蛋白片段與CTL表位間，載體蛋白分子與CTL表位間的連接可以通過DNA重組或者化學偶聯的方式實現。
本發明的抗原可以化學合成，或者由相應的組成成分經化學綴合方法產生，或者可以由其編碼核酸分子經重組方法生產。
本發明也涉及編碼本發明抗原的DNA分子，包含本發明DNA分子的重組載體，用重組載體進行基因工程改造的宿主細胞，和通過重組技術生產本發明所述抗原的方法。
用本發明的載體對宿主細胞進行基因工程改造(轉導或轉化或轉染)，所述載體可以是例如克隆載體或表達載體。載體的形式可以是例如質粒，病毒顆粒，噬菌體等等。可在適當的常規營養培養基中培養經改造的宿主細胞。如溫度，pH等的培養條件是選用來表達的宿主細胞以前所用的那些條件，這對於本領域技術人員而言應是顯而易見的。
通過重組技術可將本發明的多核苷酸用於生產多肽，因此，例如，所述多核苷酸可包含在多種表達載體中的任一種中以表達多肽。這種載體包括染色體的、非染色體的和合成的DNA序列，如SV40的衍生物；細菌質粒；噬菌體DNA；杆狀病毒；酵母質粒；衍生自質粒和噬菌體DNA、病毒DNA(如痘苗病毒，腺病毒，禽痘病毒和假狂犬病病毒)之聯合的載體。然而，只要能在宿主中複製和存活，任何其它的載體都可使用。
用於表達的宿主可以是原核系統，如最普遍使用的E.coli，或真核生物或者它們的細胞系，包括但不限於酵母細胞、真菌細胞、昆蟲細胞、哺乳細胞、鳥細胞和高等植物細胞。
表達載體中的DNA序列與適當的表達控制序列(啟動子)可操作連接，以指導其表達。至於這種啟動子的代表性例子，應提及的有LTR或SV40啟動子，大腸桿菌lac或trp，噬菌體λPL啟動子和已知能控制原核細胞或真核細胞或它們的病毒中的基因表達的其它啟動子。表達載體也含有用於起始翻譯的核糖體結合位點和轉錄終止子。載體也包括用於增強表達的適當序列。
另外，表達載體優選含有一個或多個選擇性標記基因以提供可用於選擇已轉化的宿主細胞的表型性狀，如用於真核細胞培養物的二氫葉酸還原酶或新黴素抗性，或大腸桿菌中的四環素和氨苄青黴素抗性。
可使用含有上文所述適當的DNA序列以及適當的啟動子或控制序列的載體來轉化適當的宿主以使宿主表達蛋白質。
至於適當宿主的代表性例子，應提及的有細菌細胞，如大腸桿菌，鏈黴菌，鼠傷寒沙門氏菌；真菌細胞，如酵母；昆蟲細胞，如果蠅S2和Spodoptera Sf9；動物細胞，如CHO，COS或Bowes黑素瘤細胞；腺病毒；植物細胞等。根據本文的教導，本領域技術人員應能掌握如何選擇適當的宿主。
更具體地，本發明也包括含有一個或多個上文廣泛描述的序列的重組構建體。這些構建體含有載體，如質粒或病毒載體，其中插入了本發明的序列。大量的適當的載體和啟動子是本領域技術人員熟知的，並可商購，例如用於細菌中的載體有pQE70(Qiagen)等，用於真核細胞中的有pSV2CAT(Stratagene)等。然而，只要能在宿主中複製和存活，任何其它的質粒或載體都可使用。
特別合適的細菌啟動子包括lacI啟動子，lacZ啟動子，T3啟動子，T7啟動子，gpt啟動子，λPR、PL啟動子和trp啟動子。真核啟動子包括CMV即早期啟動子，HSV胸苷激酶啟動子，早期和晚期SV40啟動子，逆轉錄病毒的LTR啟動子和小鼠金屬硫蛋白-I啟動子。適當載體和啟動子的選擇是本領域技術人員熟知的。
在另一個實施方案中，本發明涉及含有上述構建體的宿主細胞。宿主細胞可以是高等真核細胞如哺乳動物細胞，或低等真核細胞如酵母細胞；或者宿主細胞也可以是原核細胞如細菌細胞。可通過磷酸鈣轉染，DEAE-葡聚糖介導的轉染，或電穿孔將構建體導入宿主細胞中。
可以常規方式使用宿主細胞中的構建體以產生由重組序列編碼的基因產物。或者，也可通過常規的肽合成儀合成生產本發明的多肽。
在適當啟動子的控制下，成熟的蛋白質可在哺乳動物細胞、酵母、細菌或其它細胞中表達。使用衍生自本發明DNA構建體的RNA，也可利用無細胞的翻譯系統來產生這種蛋白質。可在原核和真核宿主中使用的適當的克隆和表達載體描述於Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊，第2版，冷泉港，紐約(1989)，該文獻已列入本文作為參考。
為了將翻譯的蛋白質分泌到內質網腔、外周質空間或胞外環境中，可將適當的分泌信號摻入被表達的多肽中。所述信號對於該多肽而言可以是內源的，也可以是外源的。
多肽可以經修飾的形式，如融合蛋白的形式被表達，多肽不僅可包括分泌信號，也可包括其它的異源功能區域。例如，可在多肽的N-末端加上另外的胺基酸區域，尤其是帶電的胺基酸以改善多肽在宿主細胞中、純化過程中或隨後的處理和儲存過程中的穩定性和持久性。也可以在多肽中加入肽組成成分以便於純化，最終製備多肽之前可除去這類區域。本領域技術人員熟知在多肽中加入肽組成成分以引發分泌或外泌，改善穩定性和便於純化等等，這是本領域內的常規技術。優選的融合蛋白含有得自免疫球蛋白的異源區域，該區域可用於增溶受體。
用於轉化的合適的原核宿主包括大腸桿菌，枯草芽孢桿菌，鼠傷寒沙門氏菌，以及假單胞菌屬、鏈黴菌屬和葡萄球菌屬的多個種，但並不限於此。
轉化合適的宿主菌株並將宿主菌株培養至適當的細胞密度之後，通過適當的方式(如溫度變化或化學誘導)誘導選定的啟動子，並將細胞再培養一段時間。
一般通過離心收穫細胞，通過物理或化學方法破碎細胞，保留所得的粗提取物以進一步純化。
通過包括冷凍-融化循環，超聲處理，機械破碎，或使用細胞裂解劑等在內的任何便利方法可破碎用於表達蛋白質的微生物細胞，這些方法是本領域技術人員所熟知的。
可使用多種哺乳動物細胞培養系統來表達重組蛋白，哺乳動物表達系統的例子包括Gluzman，細胞，23175(1981)所述的猴腎成纖維細胞COS-7系，以及能表達可容性載體的其它細胞系，如C127，3T3，CHO，HeLa和BHK細胞系。
通過包括硫酸銨或乙醇沉澱，酸提取，陽離子或陰離子交換層析，磷酸纖維素層析，疏水作用層析，親和層析，羥基磷灰石層析和凝集素層析等的方法從重組細胞培養物中回收和純化KGF-2多肽。必要時，可進行蛋白質的重摺疊步驟來完成成熟蛋白質的構型。最後，可使用高效液相層析(HPLC)完成最終的純化步驟。
本發明的抗原可以是化學合成方法的產物，或由原核或真核宿主(如培養中的細菌，酵母，高等植物，昆蟲和哺乳動物細胞)通過重組技術產生。宿主的選擇取決於重組生產所用的方法。本發明的多肽可以是糖基化的，也可以是非糖基化的。本發明的多肽也可以包括起始甲硫氨酸胺基酸殘基。
本發明還涉及編碼所述抗原的RNA分子。獲得抗原的方法還可以是但不限於體外無細胞體系，如麥胚提取物翻譯體系、網織細胞裂解物翻譯體系或其它人工翻譯體系。
本發明還涉及對應於所述抗原的抗體，無論抗體的製備方式如何，如本領域專業人員所知的噬菌體庫篩選法，或者通過雜交瘤細胞產生，或者免疫實驗動物產生。
本發明的抗體可由本領域技術人員已知的眾多技術製備。參閱，如Harlow和Lane，《抗體實驗室手冊》，冷泉港實驗室，1988。在一種此類技術中，首先將含抗原性多肽的免疫原注射入多種哺乳動物(如小鼠、大鼠、兔、綿羊和山羊等)中的任一種中。在這一步中，本發明的多肽不需修飾即可作為免疫原。或者，特別是對於相對短的多肽而言，可將多肽與載體蛋白(如牛血清白蛋白或匙孔蟲戚血藍蛋白)連接在一起，以激發更強的免疫應答。將免疫原注射入動物宿主，優選根據預定的時間表，再注射一次或多次加強免疫，並定時對動物取血。對多肽特異的多克隆抗體可以從抗血清中，通過例如利用了偶聯至合適固相支持物上的多肽的親和層析法純化得到。
特異於目的抗原性多肽的單克隆抗體，舉例而言，可以用Kohler和Milstein，歐洲免疫學雜誌，6511-519，1976的技術和改進方法製備。簡單的說，這些方法涉及製備能產生具有所需特異性(也就是與目的多肽的反應性)的抗體的永久細胞系。這種細胞系，可以由例如上述免疫動物的脾臟細胞獲取。接著將脾臟細胞永生化，例如通過與骨髓瘤細胞融合夥伴、最好是與免疫動物同系的骨髓瘤細胞融合夥伴融合。可以採用多種融合技術。例如，將脾臟細胞和骨髓瘤細胞與非離子型表面活性劑混合幾分鐘，然後以低密度平鋪在能夠支持雜合細胞生長而不能支持骨髓瘤細胞生長的選擇性培養基上。優選的選擇技術中利用了HAT(次黃嘌呤、氨基喋呤、胸苷)篩選。經過足夠時間，通常大約1到2周後，就可觀察到雜合體集落。挑取單個集落，檢測其與多肽的結合活性。優選具有高反應活性和特異性的雜交瘤。
單克隆抗體可以從正在生長的雜交瘤集落上清液中分離得到。此外，可採用多種技術提高產量，例如將雜交瘤細胞系注射到合適的脊椎動物宿主如小鼠的腹腔中，然後可從腹水或血液中收穫單克隆抗體。抗體中的汙染物可以用常規技術除去，如層析法、凝膠過濾、沉澱和抽提。本發明的多肽可在純化過程中用於例如親和層析步驟。
本發明的單克隆抗體可用作治療劑，以抑制或消除RSV感染。抗體可單獨使用，或與一種或多種治療藥劑偶聯。在這方面合適的試劑包括放射性核素、分化誘導劑、藥物、毒素和它們的衍生物。
本發明的抗原、抗體以及多核苷酸可用於製備藥物或者診斷試劑，特別是用於診斷、預防和治療RSV A或B亞型的感染的組合物。
可將本發明的抗原、抗體或核酸分子與適當的藥用載體聯合使用以製成藥物組合物。這種組合物含有治療有效量的多肽和藥學可接受的載體或賦形劑。所述載體包括但不限於鹽水，緩衝鹽溶液，葡聚糖，水，甘油，乙醇及其聯合。製劑應適合施用的模式。
考慮到各個患者的臨床條件，藥物組合物釋放的位點，施用的方法，施用的計劃和實際操作人員已知的其它因素，以與良好的醫學實踐一致的方式配製和服用治療所用的藥物組合物。因此，通過上述考慮可確定用於本文目的的「有效量」。
通常通過將本發明的抗原、抗體或核酸分子均勻和密切地與液體載體或精細分開的固體載體或這兩者接觸可製備製劑。然後，如有必要，將產物製成所需的製劑形狀。優選載體是胃腸外載體，更優選為與受體血液等滲的溶液。這種載體的例子包括水，鹽水，Ringer’s溶液和葡萄糖溶液。如固定油和乙基油酸之類的不含水的載體以及脂質體在本文中也是有用的。本領域中已知的適當的製劑見於Remington’s Pharmaceutical Sciences(最新版)，Mack出版公司，Easton，PA。
本發明藥物組合物的可以多種方式施用，例如口服，直腸，胃腸外等。「藥學可接受的載體」是指無毒性的固體，半固體或液體填充劑，稀釋劑，包裹材料或任何形式的製劑輔助物。本文所用的術語「胃腸外」指的是包括靜脈內，肌內，腹膜內，胸骨內，皮下和動脈內注射和灌注等的施用模式。顯然，組合物的精確劑量會因個體的臨床狀況、活性劑的清除速率等而改變。
下面通過實施例對本發明作進一步描述。
實施例實施例1.G蛋白基因全序列的克隆1.1病毒培養A型RSV(Long株，ATCC CCL-23)在宿主細胞HEp-2上繁殖，基本培養基為DMEM，添加2％胎牛血清，pH7.4-7.6。待CPE(致細胞病變效應)達50％-75％時以0.25％的胰酶(pH8.0)消化，300×g離心5min收集細胞，用於RSV RNA分離。
1.2RSV RNA的提取按QIAGEN公司的RNeasyMini Handbook的方法進行。在含有約1×105個細胞的1.5ml EP管內加入350μl RLT裂解液，顛倒混勻充分裂解細胞，加入350μl 70％的乙醇混勻，悉數加載到小柱，10000rpm離心5min，棄去液體。加載500μl RPE於小柱上，10000rpm 15s洗柱，重複一次。最後以30-50μl無RNase的純水洗脫RNA，收集RNA溶液，-20℃保存備用。
1.3RT-PCR獲得G蛋白基因根據GenBank中已知的G蛋白基因兩端的序列設計引物5』端引物AGP1E為5』GCGAATTCGGGGCAAATGCAAACATG 3』，3』端引物AGP2H為5』GCAAGCTTTAACTACTGGCGTGTTGT 3』，其中畫線部分分別為EcoR I和Hind III的酶切位點。合成第一鏈反應條件為在25μl反應體系中含有RNA 2.0μg，Ramdom primer1.0μg，H2O 10.8μl。70℃下保溫5min，冰上冷卻5min，補加First strand 5×buffer 5μl，RNasin 40U.37℃下保溫3min後補加10mM dNTP 2.5μl，AMW 30U，37℃下保溫1h，70℃下保溫15min。冰上冷卻後補加18U RNase H，37℃下保溫20min。合成第二鏈的PCR條件為在50μl反應體系中含有H2O 35.6μl，10×buffer 5.0μl，2.5mM dNTP 4μl，Taqase 2U，cDNA 3μl，5』和3』端引物共3μl。反應條件為94℃2min，94℃45s，45℃45s，72℃1min，30個循環。
1.4G蛋白基因的克隆和鑑定PCR擴增產物經瓊脂糖膠電泳分離，回收大小約為930bp的目標帶，經EcoR I和Hind III雙酶切，與同樣雙酶切的pUC 18載體連接，連接產物轉化感受態大腸桿菌DH5α，挑選重組子，經質粒小量提取後進行酶切和PCR鑑定，將通過雙重鑑定含有目的基因的克隆進行測序，最終獲得含有全長RSV G蛋白基因的重組質粒pUC18-G(10)。
實施例2.表達載體的構建2.1分子內伴侶DsbA基因片段的獲得根據DsbA基因片段兩端的序列設計引物，以重組質粒pUC18-DsbA(博士後出站報告「重組呼吸道合胞病毒蛋白疫苗研究」，範昌發，合作導師-梅興國，博士後號19718，軍事醫學科學院博士後流動站)為模板，通過PCR擴增，獲得目的基因片段。擴增產物經1.2％瓊脂糖膠電泳分離，回收大小約為660bp的片段，純化後4℃保存備用。5』端引物DsbA-F的序列為GCCCATGGGCAGCTCTCATCATCATCATCATCACTCTAGCGGTGCTCAGTACGAAGATGGTAAAC，其中下劃線部分為Nco I位點，斜體部分為6組氨酸標籤。3』端引物DsbA-R的序列為CGGGATCCACGCGGATACATGCTATCTTCATCTTCATCTTCATCACCTTTTTTCTCGGACAG，其中下劃線部分為BamH I位點，粗體部分為凝血酶識別位點。擴增條件為預變性94℃2min後，94℃45s，60℃45s，72℃1min，共30個循環。
2.2G蛋白基因片段的獲得本實施例共獲得了三個G蛋白片段，命名為G101、G126和G151，分別對應於G蛋白基因的第125-225位、第100-225位和第75-225位胺基酸殘基間的肽序列。PCR擴增所用5』端引物的名稱和序列分別為G101-F5』-GCGGATCCAACCTGCAACCCACAACAG-3』，G126-F5』-GCGGATCCAGCTTCTCCAATCTGTCTGA-3』，G151-F5』-GCGGATCCATCATACAAGATGCAACAAGC-3』，其中下畫線部分為BamH I位點。
所用3』端引物的名稱和序列為Gx-R5』-GCGCGGCTAGCTACTTCCTTCGGTTTAGTGGT-3』其中下劃線部分表示Nhe I位點。以G101-F/Gx-R、G126-F/Gx-R和G151-F/Gx-R引物對分別擴增G101、G126和G151。PCR擴增條件為預變性94℃2min後，94℃45s，55℃45s，72℃1min，共25個循環。擴增產物經瓊脂糖膠電泳分離，回收大小約為300bp、380bp和450bp的片段，純化後4℃保存備用。
2.3基因片段和表達載體的連接將DsbA基因用Nco I完全酶切，純化後用BamH I完全酶切，G蛋白片段用BamH I和Nhe I雙酶切，將表達載體pET以Nco I和Nhe I雙酶切，然後對三者進行連接。連接產物轉化感受態大腸桿菌DH5α，挑選重組子提取質粒。將通過PCR和酶切確認含有目的基因的重組子進行測序，以檢查閱讀框架是否正確。最終獲得表達載體pET-DsbA-G101、pET-DsbA-G126和pET-DsbA-G151，以及不含G蛋白基因片段的空白載體pET-DsbA，它將作為對照使用。
實施例3.誘導表達及檢測將pET-DsbA-G101、pET-DsbA-G126、pET-DsbA-G151和pET-DsbA表達載體轉化E.coli BL21(DE3)感受態菌。塗布有感受態菌的平板在37℃下培養11h左右，挑取單菌落接種於20ml LB培養基(附加葡萄糖至終濃度0.2％，氨苄青黴素至終濃度120μg/ml)，30℃培養至OD600約0.5，加誘導劑IPTG至終濃度100μg/ml，37℃下誘導1.5-3h。
吸取1ml菌液離心收集菌體，棄上清，以50μl PBS重懸，加2×SDS上樣緩衝液，沸水浴8-10min，取適量裂解物走12％的SDS-PAGE電泳，以檢測目的蛋白是否獲得表達。pET-DsbA-G101的表達產物預期分子量為36.8kD，pET-DsbA-G126的表達產物預期分子量為39.8kD，pET-DsbA-G151的表達產物預期分子量為42.8kD，pET-DsbA的表達產物預期分子量為24.7kD。研究結果顯示，所有表達載體均獲得了表達，表達產物的大小與預期的分子量一致。經Gel-Pro IMAGER(美國Media Cybernetics公司)分析，表達產物含量達到很高水平，佔總蛋白的14％-61％，目的蛋白的收率約為4-6mg/g菌體。
經過小樣(20ml)表達測試確認表達的菌株，採用200ml搖瓶發酵確認表達產物是否可溶。按上述方法誘導表達，離心收集菌體，PBS約20ml懸浮菌體，冰浴中超聲破碎，4℃下12000×g離心15min，取適量上清和沉澱分別走SDS-PAGE電泳檢查。結果顯示，表達產物主要以可溶形式存在，可溶部分為80％左右。
實施例4.分離純化目的蛋白在1000ml三角瓶中發酵生長目的蛋白，培養物在4℃下8000×g離心收集菌體，按5μl/ml培養物的比例加入Start buffer重懸菌體，Start buffer為含有10mM咪唑，20mM磷酸鹽和0.5M NaCl，pH7.4-7.6。菌體凍融三次，12000×g 4℃下離心15min，小心轉移上清，0.45μl濾膜過濾，濾液用於純化或者-20℃保存備用。
所用親和層析介質為熬合金屬Ni2+的凝膠(Pharmacia Biotech)，空柱為本室製備，柱床體積為3ml。上樣體積為15ml，總蛋白含量約為36mg，流速為1ml/min。洗脫緩衝液含有300mM咪唑，20mM磷酸鹽和0.5M NaCl，pH7.4-7.6，洗脫時流速為0.5ml/min。
含有目的蛋白的洗脫液用pH7.6的PBS平衡透析至無咪唑，然後冷凍乾燥，溶於適量純水中-20℃保存備用。最終獲得目的蛋白的純度為85％-98％，未發生降解。
實施例5.抗原的免疫反應性測試通過PEG沉澱法製備RSV 10倍濃縮抗原。方法是在3.5TCID50的RSV病毒液中加入NaCl至終濃度0.5M，PEG 8000至6％-10％，4℃下靜置16h，12000×g 4℃下離心30min，棄上清，沉澱以適量PBS溶解，立即於-70℃保存備用。
所用實驗動物為雄性紐西蘭大白兔，體重約2.5kg。初次免疫在背部多點注射2ml完全福氏佐劑-濃縮RSV混懸液，第三、五周再次背部皮下多點注射不完全福氏佐劑-濃縮RSV抗原混懸液2ml，以後間隔一周進行加強免疫，用不完全福氏佐劑。第七周耳靜脈採血，測試效價後，以1ml不加佐劑的濃縮RSV抗原進行耳靜脈注射，促進抗體合成，10天後耳動脈採血，獲得抗血清30ml，於4℃保存備用。
通過雙向免疫擴散實驗測得抗血清效價為1∶64。同樣通過雙向免疫擴散實驗檢測發現，重組蛋白均能與抗血清形成明顯的單一的沉澱線，表面重組蛋白具有良好的免疫反應性。
實施例6融合蛋白動物水平活性檢測結果1.實驗方法抗原蛋白DsbA-G101和DsbA-G126，小鼠昆明鼠和Balb/c，按對照組、實驗組(不同劑量)分組，每組6隻。選擇了兩個劑量，25ug和50ug，免疫了2組Balb/c和一組昆明鼠。
免疫過程中稱重，以考察抗原蛋白的毒性。
30天後採血，病毒攻擊；攻擊後5天，處死取肺，檢測其中RSV滴度。
血樣用於分離血清，測針對抗原和RSV的抗體滴度。
2.結果(1)小鼠的體重考察結果分析初步分析顯示，試驗組和對照組(注射PBS)在體重上無差異。結合解剖後對各臟器的形態學觀察，均未見異常。這表明抗原蛋白無明顯的毒性。
(2)ELISA檢測抗體以抗原蛋白包被酶標板，以免疫後的小鼠血清作為一抗，檢測針對抗原蛋白的抗體滴度。多數血清樣品以10倍和100倍稀釋。結果發現，多數樣品超過了讀數範圍，在抗體稀釋4000倍後，OD492與對照血清(10倍稀釋)的差值為1.3。表明產生了較高濃度的針對抗原蛋白的抗體。
以RSV提取液包被酶標板，檢測產生的針對RSV的抗體。結果發現，減去對照組讀數後，實驗組的OD492最大值為0.881，最低為0.077。這一結果表明，至少部分小鼠產生了針對RSV的抗體。
(3)空斑抑制試驗將Hep-2細胞接種於96孔細胞板，接種量為1.0～1.5×104/孔，37℃下培養17～24h，病毒樣品稀釋至500PFU/mL備用。將30μL以病毒維持液稀釋的血清樣品與等體積的RSV病毒樣品混合，在37℃下結合1h，然後將病毒-血清混合物接種細胞，在37℃下吸附1.5h，然後，每孔加入200μL 0.8(w/v)的甲基纖維素。在5％的CO2培養箱中培養4天後在顯微鏡下(100×)統計病變數。
圖5和圖6顯示了抗原蛋白能誘導產生針對RSV的抗體。
中和抗體滴度更能反應重組蛋白誘導產生的抗體對病毒的抑制作用。本研究採用空斑抑制實驗在細胞水平檢測抗體對病毒的抑制作用。將抗血清以病毒維持液作10倍稀釋後，與已知滴度的病毒樣品結合，然後將細胞-病毒混合物一起加載到單層Hep-2細胞上檢測空斑的形成情況。如圖所示，RSV抗血清陽性對照組能顯著降低空斑的形成。即使在10倍稀釋RSV抗血清的情況下，有很多孔甚至見不到空斑，表明對病毒的抑制作用非常明顯。
3結論(1)抗原蛋白對小鼠無明顯毒性，安全；(2)抗原蛋白能誘導產生較高濃度的抗體，免疫原性強。
(3)抗原蛋白能誘導產生針對RSV的抗體。
(4)誘導產生的抗體具有抑制RSV的能力。
實施例7.融合蛋白同時誘導小鼠產生中和抗體和CTL應答1.表達載體的構建構建過程中使用如下引物(劃線部分為酶切位點)引物1CTL-F 5′-TTCGCGGGCGTTGTGC-3′；引物2CTL-R 5′-GAGCGGCTAGCAGCGCTCTGTTTGGTG-3′(Nhe I)；引物3Linker-F 5′-CGTAGCTTTAACTTTCCGATTCT-3′引物4Linker-R 5′-CATGCTGTTTTCCAGAATCGGAA-3′引物5G101-F 5′-GCGGATCCAACCTGCAACCCACAACAG-3′(BamHI)引物6G101-R 5′-TACTTCCTTCGGTTTAGTGGTTTGAGGTTTATGAT-3′載體構建分兩步進行，首先將連接肽和CTL連接，獲得中間載體pET-15b(LC)。用引物CTL-F和CTL-R從pUC18(CTL)中PCR擴增CTL基因片段，用Nhe I酶切備用。用EcoR I酶切pET-15b(DsbA)後用Klenow大片段補平，再用Nhe I酶切後與上述CTL基因片段和Linker基因進行連接，獲得中間質粒pET(LC)。然後用引物G101-F和G101-R從pUC18(G10)中擴增G蛋白基因片段G101，用BamH I酶切。用引物Linker-F和CTL-R從pET(LC)擴增Linker-CTL片段，用Nhe I酶切。用BamH I和Nhe I雙酶切pET(DsbA)後與上述兩個片段進行連接，構建得到pET-15b(DsbA-GLC)表達載體。通過轉化宿主細胞，表達得到融合蛋白DsbA-G101-Linker-F/M2。其結構見圖7。
2.實驗方法抗原蛋白為D-G1-F/M2和D-G1-L-F/M2(分別為重組蛋白DsbA-G101-F/M2和DsbA-G101-Linker-F/M2的簡寫，其中Linker代表連接肽，F/M2為CTL表位)。取重組蛋白30μg溶解在200μl PBS中，加佐劑Al(OH)3至終濃度0.4mg/200μl。以加佐劑的PBS作為對照。腹腔注射Balb/c小鼠200μl/只；每隔10天加強一次，共免疫3次，最後一次免疫後10天取血、肺和脾進行檢測。用ELISA檢測血清和肺組織中的抗體滴度，以空斑抑制實驗測定血清中中和抗體滴度，以MTT法檢測CTL應答反應。
3.結果圖8～圖11的結果表明重組蛋白D-G1-F/M2和D-G1-L-F/M2注射免疫小鼠後，在血清和肺組織中均誘導了高滴度的針對RSV和各自蛋白的抗體。經ELISA檢測，D-G1-F/M2和D-G1-L-F/M2所誘導的抗體亞型IgG1/IgG2a的比值分別為1.85和2.66，可見D-G1-F/M2比D-G1-L-F/M2所誘導的免疫應答更為平衡。
圖12的結果表明經重組蛋白D-G1-F/M2和D-G1-L-F/M2免疫後的小鼠在其血清中均可檢測到較高滴度的抗RSV的中和抗體。
圖13的結果表明以RSV病毒刺激增殖的效應細胞(重組蛋白免疫的小鼠的脾細胞)按不同的效靶比加入到RSV刺激的靶細胞(p815細胞)中後對靶細胞具有明顯的殺傷作用，可見D-G1-F/M2和D-G1-L-F/M2均誘導了RSV特異性的CTL應答，其中D-G1-F/M2誘導CTL應答的能力更強。
實施例8.重組蛋白抗原對小鼠提供的保護作用1.實驗方法抗原蛋白為D-G1和D-G2(分別為重組蛋白DsbA-G101和DsbA-G126的簡寫)。取重組蛋白50μg溶解在200μl PBS中，加佐劑Al(OH)3至終濃度0.4mg/200μl。以加佐劑的PBS作為對照。腹腔注射Balb/c小鼠200μl/只；每隔10天加強一次，共免疫3次，最後一次免疫後10天以104.95PFU/100μL的RSV進行鼻腔攻擊。5天後處死小鼠取肺和鼻腔衝洗物(NTL)，同時收集血清。以空斑抑制實驗測定血清抗體和NTL對RSV病毒的抑制作用。
2.結果圖14的結果表明PBS和DsbA的血清抗體對病毒無抑制作用，其形成的空斑數與陰性對照組RSV組很接近。RSV陽性對照組能顯著降低空斑的形成。實驗組D-G1和D-G2的抗血清對病毒也表現出明顯的抑制作用，其空斑抑制率可達60％左右。
圖15的結果表明從重組蛋白D-G1和D-G2免疫的小鼠鼻腔收集的黏膜抗體也對RSV病毒具有明顯的抑制作用。
表1中列出了用RSV攻擊經各種重組蛋白抗原免疫的小鼠和對照小鼠後其肺和鼻腔衝洗物中的RSV滴度。
表1

由表1中的結果可看出，PBS和DsbA組在鼻腔和肺組織中均檢測到較高滴度的病毒，而重組蛋白D-G1和D-G2免疫組均顯著降低了鼻腔和肺組織中病毒的滴度。
實施例9.D-G1和D-F/M2共免疫1.實驗方法抗原蛋白為D-G1和D-F/M2(分別為重組蛋白DsbA-G101和DsbA-F/M2的簡寫，其中F/M2代表CTL表位)。取重組蛋白50μg溶解在200μl PBS中，加佐劑Al(OH)3至終濃度0.4mg/200μl。以加佐劑的PBS作為對照。腹腔注射Balb/c小鼠200μl/只；每隔10天加強一次，共免疫3次，最後一次免疫後10天取血、肺和脾進行檢測。用ELISA檢測血清和肺組織中的抗體滴度，以空斑抑制實驗測定血清中中和抗體滴度，以MTT法檢測CTL應答反應。另外最後一次免疫後10天以104.95PFU/100μL的RSV進行鼻腔攻擊。5天後處死小鼠取肺和鼻腔衝洗物(NTL)，同時收集血清。以空斑抑制實驗測定血清抗體和NTL對RSV病毒的抑制作用。
2.結果圖16的結果表明D-G1不能誘導明顯的病毒特異性的CTL反應，單獨的D-F/M2可以誘導產生病毒特異性的CTL反應。而經D-G1和D-F/M2共免疫可檢測到更強的CTL活性。
圖17的結果表明D-G1單獨免疫以及D-G1和D-F/M2共免疫可以誘導產生高滴度的針對G1的IgG抗體，而且可以誘導產生較高滴度的針對RSV病毒的IgG抗體。
表2中顯示了用RSV攻擊經重組蛋白免疫的小鼠與對照小鼠後其肺和鼻腔衝洗物中的RSV滴度。
表2

由表2的結果可看出，單獨的D-G1或D-F/M2免疫後可以顯著降低肺組織和鼻腔中病毒的滴度；而經D-G1和D-F/M2共免疫後其病毒的清除作用加強。
除了上述實施例外，本發明還研究了其它分子內伴侶與G蛋白片段的組合CKS-G101、CKS-G126、CKS-G151、GST-G101、GST-G126、GST-G151、MBP-G101、MBP-G126和MBP-G151。它們在不同的載體中也獲得表達，經測試也具有很好的免疫反應性。
表3RSVA亞型G蛋白的核酸序列

RSV A亞型G蛋白的胺基酸序列GANANMSKNKDQRTAKTLEKTWDTLNHLLFISSGLYKLNLKSIAQITLSILAMIISTSLIITAIIFIASANHKVTLTTAIIQDATSQIENTTPTYLTQDPQLGISFSNLSEITSQTTTILASTTPGVKSNLQPTTVKTKNTTTTQTQPSKPTTKQRQNKPPNKPNNDFHFEVFNFVPCSICSNNPTCWAICKRIPNKKPGKKTTTKPTKKPTFKTTKKDLKPQTTKPKEVPTTKPTEEPTINTTKTNITTTLLTNNTTGNPKLTSQMETFHSTSSEGNLSPSQVSTTSEHPSQPSSPPNTTRQ 303G101的核苷酸序列(303bp)AACCTGCAACCCACAACAGTCAAGACTAAAAACACAACAACAACCCAAACACAACCCAGCAAGCCCACTACAAAACAACGCCAAAACAAACCACCAAACAAACCCAATAATGATTTTCACTTCGAAGTGTTTAACTTTGTACCCTGCAGCATATGCAGCAACAATCCAACCTGCTGGGCTATCTGCAAAAGAATACCAAACAAAAAACCAGGAAAGAAAACCACCACCAAGCCTACAAAAAAACCAACCTTCAAGACAACCAAAAAAGATCATAAACCTCAAACCACTAAACCGAAGGAAGTAG101的胺基酸序列(101aa)NLQPTTVKTKNTTTTQTQPSKPTTKQRQNKPPNKPNNDFHFEVFNFVPCSICSNNPTCWAICKRIPNKKPGKKTTTKPTKKPTFKTTKKDHKPQTTKPKEVG126的核苷酸序列(378bp)
AGCTTCTCCAATCTGTCTGAAATTACATCACAAACCACCACCATACTAGCTTCAACAACACCAGGAGTCAAGTCAAACCTGCAACCCACAACAGTCAAGACTAAAAACACAACAACAACCCAAACACAACCCAGCAAGCCCACTACAAAACAACGCCAAAACAAACCACCAAACAAACCCAATAATGATTTTCACTTCGAAGTGTTTAACTTTGTACCCTGCAGCATATGCAGCAACAATCCAACCTGCTGGGCTATCTGCAAAAGAATACCAAACAAAAAACCAGGAAAGAAAACCACCACCAAGCCTACAAAAAAACCAACCTTCAAGACAACCAAAAAAGATCATAAACCTCAAACCACTAAACCGAAGGAAGTAG126的胺基酸序列(126aa)SFSNLSEITSQTTTILASTTPGVKSNLQPTTVKTKNTTTTQTQPSKPTTKQRQNKPPNKPNNDFHFEVFNFVPCSICSNNPTCWAICKRIPNKKPGKKTTTKPTKKPTFKTTKKDHKPQTTKPKEVG151的核苷酸序列(453bp)ATCATACAAGATGCAACAAGCCAGATCGAGAACACAACCCCAACATACCTCACTCAGGATCCTCAGCTTGGAATCAGCTTCTCCAATCTGTCTGAAATTACATCACAAACCACCACCATACTAGCTTCAACAACACCAGGAGTCAAGTCAAACCTGCAACCCACAACAGTCAAGACTAAAAACACAACAACAACCCAAACACAACCCAGCAAGCCCACTACAAAACAACGCCAAAACAAACCACCAAACAAACCCAATAATGATTTTCACTTCGAAGTGTTTAACTTTGTACCCTGCAGCATATGCAGCAACAATCCAACCTGCTGGGCTATCTGCAAAAGAATACCAAACAAAAAACCAGGAAAGAAAACCACCACCAAGCCTACAAAAAAACCAACCTTCAAGACAACCAAAAAAGATCATAAACCTCAAACCACTAAACCGAAGGAAGTAG151的胺基酸序列(151aa)IIQDATSQIENTTPTYLTQDPQLGISFSNLSEITSQTTTILASTTPGVKSNLQPTTVKTKNTTTTQTQPSKPTTKQRQNKPPNKPNNDFH
FEVFNFVPCSICSNNPTCWAICKRIPNKKPGKKTTTKPTKKPTFKTTKKDHKPQTTKPKEVCTL表位的序列(111bp)GGATCCTTCGCGGGCGTTGTGCTGGCCGGTGCGGCTCTGGGTGTTGCGGCTGCGGCACAGATCGAAAGCTACATCGGCAGCATTAACAACATCACCAAACAGAGCGCTAGCCTL表位的胺基酸序列(37aa)GSFAGVVLAGAALGVAAAAQIESYIGSINNITKQSASDsbA-G101的核苷酸序列(954bp)ATGGGCAGCTCTCATCATCATCATCATCACTCTAGCGGTGCTCAGTACGAAGATGGTAAACAGTACACTACCCTGGAAAAACCGGTAGCTGGCGCGCCGCAAGTGCTGGAGTTTTTCTCCTTCTTCAGCCCGCATTCCTATCAGTTTGAAGAAGTTCTGCATATTTCTGATAATGTGAAGAAAAAACTGCCGGAAGGCGTGAAGATGACTAAATACCACGTCAACTTCATGGGTGGTGACCTGGGCAAAGATCTGACTCAGGCATGGGCTGTGGCGATGGCGCTGGGCGTGGAAGACAAAGTGACTGTTCCGCTGTTTGAAGGCGTACAGAAAACCCAGACCATTCGTTCTGCTTCTGATATCCGCGATGTATTTATCAACGCAGGTATTAAAGGTGAAGAGTACGACGCGGCGTGGAACAGCTTCGTGGTGAAATCTCTGGTCGCTCAGCAGGAAAAAGCTGCAGCTGACGTGCAATTGCGTGGCGTTCCGGCGATGTTTGTTAACGGTAAATATCAGCTGAATCCGCAGGGTATGGATACCAGCAATATGGATGTTTTTGTTCAGCAGTATGCTGATACAGTGAAATATCTGTCCGAGAAAAAAGGTGATGAAGATGAAGATGAAGATAGCATGTATCCGCGTGGATCCAACCTGCAACCCACAACAGTCAAGACTAAAAACACAACAACAACCCAAACACAACCCAGC
AAGCCCACTACAAAACAACGCCAAAACAAACCACCAAACAAACCCAATAATGATTTTCACTTCGAAGTGTTTAACTTTGTACCCTGCAGCATATGCAGCAACAATCCAACCTGCTGGGCTATCTGCAAAAGAATACCAAACAAAAAACCAGGAAAGAAAACCACCACCAAGCCTACAAAAAAACCAACCTTCAAGACAACCAAAAAAGATCATAAACCTCAAACCACTAAACCGAAGGAAGTADsbA-G101的胺基酸序列(318aa)MGSSHHHHHHSSGAQYEDGKQYTTLEKPVAGAPQVLEFFSFFSPHSYQFEEVLHISDNVKKKLPEGVKMTKYHVNFMGGDLGKDLTQAWAVAMALGVEDKVTVPLFEGVQKTQTIRSASDIRDVFINAGIKGEEYDAAWNSFVVKSLVAQQEKAAADVQLRGVPAMFVNGKYQLNPQGMDTSNMDVFVQQYADTVKYLSEKKGDEDEDEDSMYPRGSNLQPTTVKTKNTTTTQTQPSKPTTKQRQNKPPNKPNNDFHFEVFNFVPCSICSNNPTCWAICKRIPNKKPGKKTTTKPTKKPTFKTTKKDHKPQTTKPKEVDsbA-G126的核苷酸序列(1029bp)ATGGGCAGCTCTCATCATCATCATCATCACTCTAGCGGTGCTCAGTACGAAGATGGTAAACAGTACACTACCCTGGAAAAACCGGTAGCTGGCGCGCCGCAAGTGCTGGAGTTTTTCTCCTTCTTCAGCCCGCATTCCTATCAGTTTGAAGAAGTTCTGCATATTTCTGATAATGTGAAGAAAAAACTGCCGGAAGGCGTGAAGATGACTAAATACCACGTCAACTTCATGGGTGGTGACCTGGGCAAAGATCTGACTCAGGCATGGGCTGTGGCGATGGCGCTGGGCGTGGAAGACAAAGTGACTGTTCCGCTGTTTGAAGGCGTACAGAAAACCCAGACCATTCGTTCTGCTTCTGATATCCGCGATGTATTTATCAACGCAGGTATTAAAGGTGAAGAGTACGACGCGGCGTGGAACAGCTTCGTGGTGAAATCTCTGGTCGCTCAGCAGGAAAAAGCTGCAGCTGACGTGCAATTGCGTGGCGTTCCGGCGATGTTT
GTTAACGGTAAATATCAGCTGAATCCGCAGGGTATGGATACCAGCAATATGGATGTTTTTGTTCAGCAGTATGCTGATACAGTGAAATATCTGTCCGAGAAAAAAGGTGATGAAGATGAAGATGAAGATAGCATGTATCCGCGTGGATCCAGCTTCTCCAATCTGTCTGAAATTACATCACAAACCACCACCATACTAGCTTCAACAACACCAGGAGTCAAGTCAAACCTGCAACCCACAACAGTCAAGACTAAAAACACAACAACAACCCAAACACAACCCAGCAAGCCCACTACAAAACAACGCCAAAACAAACCACCAAACAAACCCAATAATGATTTTCACTTCGAAGTGTTTAACTTTGTACCCTGCAGCATATGCAGCAACAATCCAACCTGCTGGGCTATCTGCAAAAGAATACCAAACAAAAAACCAGGAAAGAAAACCACCACCAAGCCTACAAAAAAACCAACCTTCAAGACAACCAAAAAAGATCATAAACCTCAAACCACTAAACCGAAGGAAGTADsbA-G126的胺基酸序列(343aa)MGSSHHHHHHSSGAQYEDGKQYTTLEKPVAGAPQVLEFFSFFSPHSYQFEEVLHISDNVKKKLPEGVKMTKYHVNFMGGDLGKDLTQAWAVAMALGVEDKVTVPLFEGVQKTQTIRSASDIRDVFINAGIKGEEYDAAWNSFVVKSLVAQQEKAAADVQLRGVPAMFVNGKYQLNPQGMDTSNMDVFVQQYADTVKYLSEKKGDEDEDEDSMYPRGSSFSNLSEITSQTTTILASTTPGVKSNLQPTTVKTKNTTTTQTQPSKPTTKQRQNKPPNKPNNDFHFEVFNFVPCSICSNNPTCWAICKRIPNKKPGKKTTTKPTKKPTFKTTKKDHKPQTTKPKEVDsbA-G151的核苷酸序列(1104bp)ATGGGCAGCTCTCATCATCATCATCATCACTCTAGCGGTGCTCAGTACGAAGATGGTAAACAGTACACTACCCTGGAAAAACCGGTAGCTGGCGCGCCGCAAGTGCTGGAGTTTTTCTCCTTCTTCAGCCCGCATTCCTATCAGTTTGAAGAAGTTCTGCATATTTCTGATAATGTGAAGAAAAAACTGCCGGAAGGCGTGAAGATGAC
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STTPGVKSNLQPTTVKTKNTTTTQTQPSKPTTKQRQNKPPNKPNNDFHFEVFNFVPCSICSNNPTCWAICKRIPNKKPGKKTTTKPTKKPTFKTTKKDHKPQTTKPKEVCKS-G101的核苷酸序列(1071bp)ATGAGTTTTGTGGTCATTATTCCCGCGCGCTACGCGTCCACGCGTCTGCCCGGTAAACCATTGGTTGATATTAACGGCAAACCCATGATTGTTCATGTTCTTGAACGCGCGCGTGAATCAGGTGCCGAGCGCATCATCGTGGCAACCGATCATGAGGATGTTGCCCGCGCCGTTGAAGCCGCTGGCGGTGAAGTATGTATGACGCGCGCCGATCATCAGTCAGGAACAGAACGTCTGGCGGAAGTTGTCGAAAAATGCGCATTCAGCGACGACACGGTGATCGTTAATGTGCAGGGTGATGAACCGATGATCCCTGCGACAATCATCCGTCAGGTTGCTGATAACCTCGCTCAGCGTCAGGTGGGTATGGCGACTCTGGCGGTGCCAATCCACAATGCGGAAGAAGCGTTTAACCCGAATGCGGTGAAAGTGGTTCTCGACGCTGAAGGGTATGCACTGTACTTCTCTCGCGCCACCATTCCTTGGGATCGTGATCGTTTTGCAGAAGGCCTTGAAACCGTTGGCGATAACTTCCTGCGTCATCTTGGTATTTATGGCTACCGTGCAGGCTTTATCCGTCGTTACGTCAACTGGCAGCCAAGTCCGTTAGAACACATCGAAACGTTAGAGCAGCTTCGTGTTCTGTGGTACGGCGAAAAAATCCATGTTGCTGTTGCTCAGGAAGTTCCTGGCACAGGTGTGGATACCCCTGAGGACGGTAGCATGCCAGACTCTCTCGAAGTTCTGTTTCAGGGTCCAGCAGGATCCAACCTGCAACCCACAACAGTCAAGACTAAAAACACAACAACAACCCAAACACAACCCAGCAAGCCCACTACAAAACAACGCCAAAACAAACCACCAAACAAACCCAATAATGATTTTCACTTCGAAGTGTTTAACTTTGTACCCTGCAGCATATGCAGCAACAATCCAACCTGCTGGGCTATCTGCAAAAGAATACCAAACAAAAAACCAGGAAAGAAAACCACCACCAAGCCT
ACAAAAAAACCAACCTTCAAGACAACCAAAAAAGATCATAAACCTCAAACCACTAAACCGAAGGAAGTACKS-G101的胺基酸序列(357aa)MSFVVIIPARYASTRLPGKPLVDINGKPMIVHVLERARESGAERIIVATDHEDVARAVEAAGGEVCMTRADHQSGTERLAEVVEKCAFSDDTVIVNVQGDEPMIPATIIRQVADNLAQRQVGMATLAVPIHNAEEAFNPNAVKVVLDAEGYALYFSRATIPWDRDRFAEGLETVGDNFLRHLGIYGYRAGFIRRYVNWQPSPLEHIETLEQLRVLWYGEKIHVAVAQEVPGTGVDTPEDGSMPDSLEVLFQGPAGSNLQPTTVKTKNTTTTQTQPSKPTTKQRQNKPPNKPNNDFHFEVFNFVPCSICSNNPTCWAICKRIPNKKPGKKTTTKPTKKPTFKTTKKDHKPQTTKPKEVCKS-G126的核苷酸序列(1146bp)ATGAGTTTTGTGGTCATTATTCCCGCGCGCTACGCGTCCACGCGTCTGCCCGGTAAACCATTGGTTGATATTAACGGCAAACCCATGATTGTTCATGTTCTTGAACGCGCGCGTGAATCAGGTGCCGAGCGCATCATCGTGGCAACCGATCATGAGGATGTTGCCCGCGCCGTTGAAGCCGCTGGCGGTGAAGTATGTATGACGCGCGCCGATCATCAGTCAGGAACAGAACGTCTGGCGGAAGTTGTCGAAAAATGCGCATTCAGCGACGACACGGTGATCGTTAATGTGCAGGGTGATGAACCGATGATCCCTGCGACAATCATCCGTCAGGTTGCTGATAACCTCGCTCAGCGTCAGGTGGGTATGGCGACTCTGGCGGTGCCAATCCACAATGCGGAAGAAGCGTTTAACCCGAATGCGGTGAAAGTGGTTCTCGACGCTGAAGGGTATGCACTGTACTTCTCTCGCGCCACCATTCCTTGGGATCGTGATCGTTTTGCAGAAGGCCTTGAAACCGTTGGCGATAACTTCCTGCGTCATCTTGGTATTTATGGCTACCGTGCAGGCTTTATCCGTCGTTACGTCAACTGGCAGCCAAGTCCGTTAGAACACATCGAAACGT
TAGAGCAGCTTCGTGTTCTGTGGTACGGCGAAAAAATCCATGTTGCTGTTGCTCAGGAAGTTCCTGGCACAGGTGTGGATACCCCTGAGGACGGTAGCATGCCAGACTCTCTCGAAGTTCTGTTTCAGGGTCCAGCAGGATCCAGCTTCTCCAATCTGTCTGAAATTACATCACAAACCACCACCATACTAGCTTCAACAACACCAGGAGTCAAGTCAAACCTGCAACCCACAACAGTCAAGACTAAAAACACAACAACAACCCAAACACAACCCAGCAAGCCCACTACAAAACAACGCCAAAACAAACCACCAAACAAACCCAATAATGATTTTCACTTCGAAGTGTTTAACTTTGTACCCTGCAGCATATGCAGCAACAATCCAACCTGCTGGGCTATCTGCAAAAGAATACCAAACAAAAAACCAGGAAAGAAAACCACCACCAAGCCTACAAAAAAACCAACCTTCAAGACAACCAAAAAAGATCATAAACCTCAAACCACTAAACCGAAGGAAGTACKS-G126的胺基酸序列(382aa)MSFVVIIPARYASTRLPGKPLVDINGKPMIVHVLERARESGAERIIVATDHEDVARAVEAAGGEVCMTRADHQSGTERLAEVVEKCAFSDDTVIVNVQGDEPMIPATIIRQVADNLAQRQVGMATLAVPIHNAEEAFNPNAVKVVLDAEGYALYFSRATIPWDRDRFAEGLETVGDNFLRHLGIYGYRAGFIRRYVNWQPSPLEHIETLEQLRVLWYGEKIHVAVAQEVPGTGVDTPEDGSMPDSLEVLFQGPAGSSFSNLSEITSQTTTILASTTPGVKSNLQPTTVKTKNTTTTQTQPSKPTTKQRQNKPPNKPNNDFHFEVFNFVPCSICSNNPTCWAICKRIPNKKPGKKTTTKPTKKPTFKTTKKDHKPQTTKPKEVCKS-G151的核苷酸序列(1221bp)ATGAGTTTTGTGGTCATTATTCCCGCGCGCTACGCGTCCACGCGTCTGCCCGGTAAACCATTGGTTGATATTAACGGCAAACCCATGATTGTTCATGTTCTTGAACGCGCGCGTGAATCAGGTGCCGAGCGCATCATCGTGGCAACCGATCATGAGGATGTTGCCCG
CGCCGTTGAAGCCGCTGGCGGTGAAGTATGTATGACGCGCGCCGATCATCAGTCAGGAACAGAACGTCTGGCGGAAGTTGTCGAAAAATGCGCATTCAGCGACGACACGGTGATCGTTAATGTGCAGGGTGATGAACCGATGATCCCTGCGACAATCATCCGTCAGGTTGCTGATAACCTCGCTCAGCGTCAGGTGGGTATGGCGACTCTGGCGGTGCCAATCCACAATGCGGAAGAAGCGTTTAACCCGAATGCGGTGAAAGTGGTTCTCGACGCTGAAGGGTATGCACTGTACTTCTCTCGCGCCACCATTCCTTGGGATCGTGATCGTTTTGCAGAAGGCCTTGAAACCGTTGGCGATAACTTCCTGCGTCATCTTGGTATTTATGGCTACCGTGCAGGCTTTATCCGTCGTTACGTCAACTGGCAGCCAAGTCCGTTAGAACACATCGAAACGTTAGAGCAGCTTCGTGTTCTGTGGTACGGCGAAAAAATCCATGTTGCTGTTGCTCAGGAAGTTCCTGGCACAGGTGTGGATACCCCTGAGGACGGTAGCATGCCAGACTCTCTCGAAGTTCTGTTTCAGGGTCCAGCAGGATCCATCATACAAGATGCAACAAGCCAGATCGAGAACACAACCCCAACATACCTCACTCAGGATCCTCAGCTTGGAATCAGCTTCTCCAATCTGTCTGAAATTACATCACAAACCACCACCATACTAGCTTCAACAACACCAGGAGTCAAGTCAAACCTGCAACCCACAACAGTCAAGACTAAAAACACAACAACAACCCAAACACAACCCAGCAAGCCCACTACAAAACAACGCCAAAACAAACCACCAAACAAACCCAATAATGATTTTCACTTCGAAGTGTTTAACTTTGTACCCTGCAGCATATGCAGCAACAATCCAACCTGCTGGGCTATCTGCAAAAGAATACCAAACAAAAAACCAGGAAAGAAAACCACCACCAAGCCTACAAAAAAACCAACCTTCAAGACAACCAAAAAAGATCATAAACCTCAAACCACTAAACCGAAGGAAGTACKS-G151的胺基酸序列(407aa)MSFVVIIPARYASTRLPGKPLVDINGKPMIVHVLERARESGAERIIVATDHEDVARAVEAAGGEVCMTRADHQSGTERLAEVVEKCAF
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AAACAAAAAGTTTGAATTGGGTTTGGAGTTTCCCAATCTTCCTTATTATATTGATGGTGATGTTAAATTAACACAGTCTATGGCCATCATACGTTATATAGCTGACAAGCACAACATGTTGGGTGGTTGTCCAAAAGAGCGTGCAGAGATTTCAATGCTTGAAGGAGCGGTTTTGGATATTAGATACGGTGTTTCGAGAATTGCATATAGTAAAGACTTTGAAACTCTCAAAGTTGATTTTCTTAGCAAGCTACCTGAAATGCTGAAAATGTTCGAAGATCGTTTATGTCATAAAACATATTTAAATGGTGATCATGTAACCCATCCTGACTTCATGTTGTATGACGCTCTTGATGTTGTTTTATACATGGACCCAATGTGCCTGGATGCGTTCCCAAAATTAGTTTGTTTTAAAAAACGTATTGAAGCTATCCCACAAATTGATAAGTACTTGAAATCCAGCAAGTATATAGCATGGCCTTTGCAGGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTGGTGGCGACCATCCTCCAAAATCGGACAGCATGCCAGACTCTCTCGAAGTTCTGTTTCAGGGTCCAGCAGGATCCATCATACAAGATGCAACAAGCCAGATCGAGAACACAACCCCAACATACCTCACTCAGGATCCTCAGCTTGGAATCAGCTTCTCCAATCTGTCTGAAATTACATCACAAACCACCACCATACTAGCTTCAACAACACCAGGAGTCAAGTCAAACCTGCAACCCACAACAGTCAAGACTAAAAACACAACAACAACCCAAACACAACCCAGCAAGCCCACTACAAAACAACGCCAAAACAAACCACCAAACAAACCCAATAATGATTTTCACTTCGAAGTGTTTAACTTTGTACCCTGCAGCATATGCAGCAACAATCCAACCTGCTGGGCTATCTGCAAAAGAATACCAAACAAAAAACCAGGAAAGAAAACCACCACCAAGCCTACAAAAAAACCAACCTTCAAGACAACCAAAAAAGATCATAAACCTCAAACCACTAAACCGAAGGAAGTAGST-G151的胺基酸序列(387aa)MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLK
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CTTTTTAACGGTGGCGGTCGGCATGGTTCTGGCGTGTCTGGTGCAGTGGGAAGCGTTGCGCGGCAAAGCGGTCTATCGCGTCCTGCTGATTCTGCCCTACGCGGTGCCATCGTTCATTTCAATCTTGATTTTCAAAGGGTTGTTTAACCAGAGCTTCGGTGAAATCAACATGATGTTGAGCGCGCTGTTTGGCGTGAAGCCCGCCTGGTTCAGCGATCCGACCACCGCCCGCACGATGCTAATTATCGTCAATACCTGGCTGGGTTATAACCTGCAACCCACAACAGTCAAGACTAAAAACACAACAACAACCCAAACACAACCCAGCAAGCCCACTACAAAACAACGCCAAAACAAACCACCAAACAAACCCAATAATGATTTTCACTTCGAAGTGTTTAACTTTGTACCCTGCAGCATATGCAGCAACAATCCAACCTGCTGGGCTATCTGCAAAAGAATACCAAACAAAAAACCAGGAAAGAAAACCACCACCAAGCCTACAAAAAAACCAACCTTCAAGACAACCAAAAAAGATCATAAACCTCAAACCACTAAACCGAAGGAAGTAMBP-G101的胺基酸序列(482aa)MDVIKKKHWWQSDALKWSVLGLLGLLVGYLVVLMYAQGEYLFAITTLILSSAGLYIFANRKAYAWRYVYPGMAGMGLFVLFPLVCTIAIAFTNYSSTNQLTFERAQEVLLDRSWQAGKTYNFGLYPAGDEWQLALSDGETGKNYLSDAFKFGGEQKLQLKETTAQPEGERANLRVITQNRQALSDITAILPDGNKVMMSSLRQFSGTQPLYTLDGDGTLTNNQSGVKYRPNNQIGFYQSITADGNWGDEKLSPGYTVTTGWKNFTRVFTDEGIQKPFLAIFVWTVVFSLITVFLTVAVGMVLACLVQWEALRGKAVYRVLLILPYAVPSFISILIFKGLFNQSFGEINMMLSALFGVKPAWFSDPTTARTMLIIVNTWLGYNLQPTTVKTKNTTTTQTQPSKPTTKQRQNKPPNKPNNDFHFEVFNFVPCSICSNNPTCWAICKRIPNKKPGKKTTTKPTKKPTFKTTKKDHKPQTTKPKEVMBP-G126的DNA序列(1521bp)
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權利要求
1.一種重組蛋白抗原，其中包含G蛋白片段，CTL表位和載體蛋白中的至少兩種，所述G蛋白片段來源於RSV A或B亞型。
2.根據權利要求1的抗原，其特徵在於G蛋白片段具有G蛋白的胺基酸序列中第m-n位胺基酸所示的序列，或其保留功能的變體，其中m是10-150之間的任何整數，n是180-300之間的任何整數；m優選是25-140，更優選是50-130，最優選是75-125，n優選是190-275，更優選是200-250，最優選是220-230，尤其是225；最優選G蛋白片段(FG)具有G蛋白的胺基酸序列中第75-225位、第100-225位或第125-225位胺基酸殘基間的肽序列，或其保留功能的變體；或者具有與上述序列至少80％同源、優選至少90％同源、最優選至少95％同源的胺基酸序列。
3.根據權利要求1的抗原，其特徵在於CTL表位來自RSV A或B亞型的M2蛋白。
4.權利要求1的抗原，其特徵在於載體蛋白選自熱休克蛋白(HSPs)，牛血清白蛋白BSA、匙孔血藍蛋白KLH、霍亂毒素亞單位CTB和TT蛋白，DsbA，CKS，GST或MBP，或其功能性片段。
5.權利要求1的抗原，其特徵在於組成抗原的方式可以是由N端到C端為CP+FG+CTL，CP+CTL+FG，FG+CTL+CP，CTL+FG+CP，FG+CP+CTL，或CTL+CP+FG。
6.根據權利要求1的抗原，其特徵在於組成抗原的方式可以是由N端到C端為CTL+FG，或者FG+CTL。
7.根據權利要求1的抗原，其特徵在於組成抗原的方式可以是由N端到C端為CP+FG，或者FG+CP。
8.根據權利要求1的抗原，其特徵在於組成抗原的方式可以是由N端到C端為CP+CTL，或者CTL+CP。
9.根據權利要求1和5-8中任一項的抗原，其特徵在於載體蛋白、CTL表位和G蛋白片段間的連接是通過共價鍵方式偶聯的。
10.根據權利要求1和5-8中任一項的抗原，其特徵在於載體蛋白與G蛋白片段，載體蛋白和CTL，G蛋白片段和CTL之間的連接是通過化學偶聯實現的。
11.根據權利要求1和5-8中任一項的抗原，其中載體蛋白和G蛋白片段之間、G蛋白片段和CTL表位之間，以及載體蛋白和CTL表位之間可以通過稱為連接蛋白的短肽或者蛋白連接，連接蛋白優先選自存在於黏膜細胞表面的受體。
12.根據權利要求1的抗原，其選自下組DsbA-G101、DsbA-G126、DsbA-G101-F/M2和DsbA-G101-L-F/M2、CKS-G101、CKS-G126、CKS-G151、GST-G101、GST-G126、GST-G151、MBP-G101、MBP-G126和MBP-G151。
13.編碼權利要求1-12中任一項所述抗原的核酸。
14.根據權利要求13的核酸，其特徵在於它是RNA分子。
15.特異於權利要求1-12中任一項的抗原的抗體。
16.一種藥物組合物，其特徵在於含有權利要求1-12中任一項的抗原、權利要求13或14的核酸或者權利要求15的抗體。
17.一種診斷試劑盒，其特徵在於至少含有權利要求1-12中任一項的抗原、權利要求13或14的核酸或者權利要求15的抗體。
18.權利要求1-12中任一項的抗原、權利要求13或14的核酸或者權利要求15的抗體在預防、診斷和治療RSV感染中的用途。
19.含有權利要求13的核酸的重組表達載體。
20.轉化了權利要求19所述的重組表達載體的宿主細胞。
21.根據權利要求20的宿主細胞，其特徵在於它是原核細胞或者真核細胞。
22.獲得權利要求1-12中任一項的抗原的方法，其特徵在於培養權利要求20或21所述的宿主細胞，使其表達所述抗原，和從培養物中回收該抗原。
23.根據權利要求22的方法，其特徵在於抗原被表達、錨定並暴露在宿主細胞膜表面。
24.獲得權利要求1-12中任一項的抗原的方法，其特徵在於是通過DNA在體外表達獲得的。
25.根據權利要求24的方法，其中所述體外表達方式可以是麥胚提取物翻譯體系、網織細胞裂解物翻譯體系或其它人工翻譯體系。
全文摘要
本發明涉及可用於預防和診斷呼吸道合胞病毒(RSV)感染的重組蛋白抗原，及其特異性抗體。本發明所述抗原包含G蛋白片段，CTL表位和載體蛋白中的至少兩種，所述G蛋白片段來源於RSV A或B亞型。
文檔編號G01N33/563GK1814619SQ200510009119
公開日2006年8月9日 申請日期2005年2月3日 優先權日2004年2月3日
發明者梅興國, 範昌發, 龔偉, 曾瑞紅 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院毒物藥物研究所