2n花粉培育彩色馬蹄蓮有性三倍體的方法
2023-10-31 04:46:22 1
專利名稱：2n花粉培育彩色馬蹄蓮有性三倍體的方法
技術領域：
本發明屬植物倍性育種技術領域，具體涉及通過植物2η花粉的誘導雜交培育三倍體的方法。
背景技術：
彩色馬蹄蓮(Coloured Zaflteife1ScAia spp)是天南星科(Araceae)、馬蹄蓮屬 iZantedeschia) Aestivae組中6個原種、及其雜交種(Ζ. antedeschia如必乃·^)的總稱。6 個原禾中分另lJ為Z 了< 力膽《 ， Ζ. jucunda, Ζ. elliotiana, Ζ. pentlndii, Ζ. albomaculata, 和Ζ. Valida0 栽培種主要從黃花馬蹄蓮(Ζ elliottiana\H^^liZ.albomaculata) 和紅花馬蹄蓮(Z.rdffla/wii)培育而來。彩色馬蹄蓮色彩豔麗，形態高雅，除用作切花、盆花外，還可紮成花束、花籃，也是春秋兩季花壇或花徑的特有素材。目前世界各地彩色馬蹄蓮的發展迅速，荷蘭拍賣市場以每年50%的速度遞增。彩色馬蹄蓮在我國發展勢頭良好，產銷量持續上升，逐漸成為節日不可缺少的高檔花卉，被譽為「21世紀的花卉之星和彩色百合」。此外，彩色馬蹄蓮切花重量輕、體積小，遠距離運輸成本相對月季、百合等低很多，在利用我國的氣候及勞動力優勢、出口創匯方面具有極大的潛力。但我國沒有自主智慧財產權的品種，大量購買專利品種，成本高，因此，研究有效的育種方法，培育具有自主智慧財產權的彩色馬蹄蓮新品種是急待解決的課題。2n配子，即具有體細胞染色體數的配子，又稱作未減數配子，是自然界植物多倍體產生的主要途徑。2η配子有2η雌配子和2η雄配子(即2η花粉)兩種。2η花粉具有數量多， 易於誘導處理、收集、鑑定等優點，相反2η雌配子數量少、不能從母株上分離、鑑定困難，因此在有性多倍體的培育中主要應用2η花粉。彩色馬蹄蓮作為一種新興花卉，目前的育種工作主要集中在新花色和盆栽型品種的培育，有關多倍體育種的研究很少，無性多倍體方面的研究報導有2篇，分別利用秋水仙素和除草劑安磺靈處理體細胞獲得了無性多倍體後代。體細胞染色體加倍獲得的無性多倍體，只是一個親本基因量的簡單加倍；細胞減數分裂時由於同源染色體優先配對的原因， 不同基因組間不能進行交換、重組，沒有產生新型變異的機會，因此，彩色馬蹄蓮的無性多倍體的培育存在不能體現雜種優勢、培育三倍體時間長(一般7-8年)，產生新型變異的機會少，不利於優良種質的創新等缺陷和不足。而目前，彩色馬蹄蓮有性多倍體及其相關研究尚未見任何報導。
發明內容
本發明要解決的技術問題是克服現有技術中彩色馬蹄蓮三倍體育種時間長，不能體現雜種優勢，進一步創造優良種質機會少的缺陷和不足，其目的是提供一種2η花粉培育彩色馬蹄蓮有性三倍體的方法。為解決上述技術問題和實現本發明目的，本發明的技術方案如下 一種2η花粉培育彩色馬蹄蓮有性三倍體的方法，按以下步驟進行(1)確定2η花粉誘導的適宜發育階段
取彩色馬蹄蓮不同發育階段植株的花苞，用顯微鏡觀察其小孢子母細胞減數分裂進度，50%以上的小孢子母細胞進入前期I時為2η花粉誘導的適宜階段，並記載此時該植株的形態學特徵，所述的形態學特徵是該植株的佛焰苞的顏色，肉穗花序的顏色，佛焰苞與肉穗花序包裹的緊實度和花莖挺出的長度；
(2)待處理花柱的準備
對具有步驟(1)記載的所述的形態學特徵的植株，用手揉包裹在肉穗花序柱外的佛焰苞，直至佛焰苞散開，露出肉穗花序柱；
(3)秋水仙素處理誘導2η花粉
在室外溫度為10°C 20°C時，用脫脂棉將步驟2所述的彩色馬蹄蓮植株的肉穗花序柱緊貼包裹，將質量分數為0. 1% 0. 15%的秋水仙素(分子式為=C22H25NO6 ·1. 5Η20)滴加到包裹花柱的脫脂棉上進行為期三天的誘導，在誘導期間內補充所述的秋水仙素使包裹的棉花保持溼潤，三天後，用蒸餾水衝洗3 5次去除秋水仙素殘留；
(4)2η花粉的鑑定
當步驟C3)處理植株花蕾中花粉溢出時，取該花粉經乳酚酸性品紅溶液染色後製片， 在顯微鏡下觀察花粉粒大小並照相，以未處理的父本植株花粉作對照，在同一視野下觀察花粉粒大小，處理植株的花粉粒直徑比對照植株的花粉粒直徑大30% 70%的花粉粒為2η 花粉；
(5)2η花粉的收集
於秋水仙素處理後5 7天，當處理過的彩色馬蹄蓮肉穗花序的雄蕊成熟但未出花粉之前，將其雄蕊切割下來，放入培養皿中置於乾燥器中待花粉成熟溢出；不同品種雄蕊成熟的標誌差異很大，主要是由其顏色變化來判斷，如黃花和紅花馬蹄蓮雄蕊由乳白色變為深黃色時表示其成熟，而紫黑色馬蹄蓮的雄蕊成熟的標誌則是由白色變為紫黑色； (6)有性多倍化雜交
當雄蕊成熟且未出花粉時用消毒刀片將母本植株花柱的雄花部分切除，並對母本植株的花柱柱頭套袋，當母本植株的柱頭突起並分泌黏液時，將步驟(5)收集的處理花粉授與母本植株的柱頭上，授粉後繼續套袋7 10天後解除套袋，待種子成熟時採收雜交種子，採收的種子置於4°C 6°C條件下低溫貯藏2 3個月天以打破休眠後，將該種子採用大田播種和或無菌萌發的方法培育雜交後代供多倍體鑑定；
(7)有性三倍體後代鑑定
所述的有性三倍體後代鑑定是染色體鑑定，所述的染色體鑑定是取步驟(6)培育的雜交後代的莖尖或根尖採用改良苯酚品紅染色法製片，然後在顯微鏡下觀察並攝像，以染色體數目的多少來判斷其倍性，染色體數目為48 (2n=3x=48)的植株為本發明方法所獲得的彩色馬蹄蓮三倍體雜交後代。 為節約成本，在步驟(7)所述的有性三倍體後代鑑定的染色體鑑定之前還可以先進行氣孔鑑定後，取經氣孔鑑定顯示氣孔直徑大小增大30% 70%的材料再進行所述的染色體鑑定，所述的氣孔鑑定是取在相同生長條件下種植的對照植株和步驟(6)種植的彩色馬蹄蓮育雜交後進行氣孔鑑定，撕取對照植株的葉片下表皮和步驟(6)種植的彩色馬蹄蓮育雜交後的葉片下表皮分別製片，然後於顯微鏡下觀察測量氣孔直徑大小，步驟(6)種植的
5彩色馬蹄蓮育雜交後代的氣孔直徑比對照大增大30% 70%作為多倍體變異的初步鑑定指標。上述方法中所述的母本是紫花彩色馬蹄蓮(coloured Zantedechia 『Pink persuasion，),父本是黃花彩色馬蹄蓮(coloured ZaflieofecAia 'Black magic，)。本發明方法與現有技術相比有如下有益效果
1、本發明方法所確定的2η花粉誘導的適宜發育階段，能使彩色馬蹄蓮2η花粉的誘導針對其發生敏感期，有效提高2η花粉誘導率。2、本發明方法的秋水仙素處理誘導2η花粉，建立了 2η花粉培育彩色馬
蹄蓮有性三倍體的適宜溫度，有效操處理方式和適宜的秋水仙素，誘導時間等，使得採用本發明方法能獲得彩色馬蹄蓮有性三倍體。3、上述1和2的優點以及本發明方法的各步鑑定措施，使得採用本發明方法能再現，可重複地獲得彩色馬蹄蓮有性三倍體。4、採用本發明方法能一步獲得有性三倍體，即體現了雜種多倍體優勢，又縮短了育種進程至少4年以上，還為創造新的彩色馬蹄蓮優良種質資源奠定了良好的基礎。染色體製片具體操作步驟如下 取材在上午8 00—10 00取幼嫩根尖。預處理將根尖浸入0.002 mol/L 8—輕基喹啉溶液中，處理6小時，並用蒸餾水衝洗。固定採用卡諾氏固定液(95%乙醇醋酸=3 :1)處理根尖3小時，並用蒸餾水衝洗。酸解根尖放入1 mol/L HCl室溫處理8-12分鐘。壓片取根尖放在載玻片上，滴一滴改良苯酚品紅染色液，蓋上蓋玻片，用鉛筆的橡皮頭敲打，使細胞分散。鏡檢觀察彩色馬蹄蓮根尖細胞並對處於有絲分裂中期的染色體進行計數。
具體實施例方式
以下結合實施例，對本發明作進一步的說明，但不構成對本發明保護範圍的限制。實施例採用的化學試劑均為市售產品，顯微鏡是放大倍數可以達到100倍的光學
顯微鏡。乳酚酸性品紅溶液配方屬現有的常規配方，乳酚酸性品紅溶液配方是20g苯酚 + 20ml 90%乳酸+ 40ml 98%甘油+ 20ml水+ 80mg酸性品紅。改良苯酚品紅染色液配方是原液A 取3g鹼性品紅溶於100ml 70%的酒精中(可長期保存)；原液B 取A液IOml加入90ml 5%苯酚(即石炭酸)水溶液(2周內使用)；原液 C 取B液55ml加入6ml冰醋酸和6ml 38%的甲醛(可長期保存);染色液取C液10_20ml， 加入80 90ml 45%的醋酸和1. 5g山梨醇，放置兩周後使用。(1)供試材料
父本是黃花馬蹄蓮(coloured Zantedechia 『Black magic，)、母本是紅花馬蹄蓮 (coloured Zantedechia 『Pink persuasion，)，均為商業栽培的二倍體品種，供試驗用的開花植株購自雲南丹輝彩色馬蹄蓮公司，即雜交組合為Pink persuasionXBlack magic。
黃花馬蹄蓮『Black magic』的特徵特性葉片戟形，亮綠色，全緣，葉片有半透明的白色斑點；肉穗花序鮮黃色，直立於佛焰中央；佛焰苞黃色，邊緣平滑，其花苞的喉部有黑色斑塊。紅花馬蹄蓮『Pink persuasion'的特徵特性葉片戟形，亮綠色，全緣，葉片有半透明的白色斑點；肉穗花序乳白色、成熟時變為黃色且有紅色斑點；佛焰苞上部玫紅色，基部乳白色，邊緣呈波浪形。(2)確定2η花粉誘導的適宜發育階段
取作父本黃花馬蹄蓮『Black magic'從花苞剛從葉杆中抽出、花苞緊閉、呈翠綠色至花苞抽出20cm 25cm、花苞略微散開、花苞從下至上一半以上的部位轉變為黃綠色不同發育階段的植株的花苞，用顯微鏡觀察其小孢子母細胞減數分裂進度，50%以上的小孢子母細胞進入前期I時為2η花粉誘導的適宜階段，並記載此時該植株的形態學特徵，所述的形態學特徵是該植株的佛焰苞的顏色，肉穗花序的顏色，佛焰苞與肉穗花序包裹的緊實度和花莖挺出的長度。黃花馬蹄蓮『Black magic' 50%以上的當小孢子母細胞進入前期I時的形態學特徵是佛焰苞呈翠綠色、肉穗花序白色、花莖挺出5cm 8cm，以表現出的此形態學特徵的階段在田間對其植株進行2η花粉誘導；
在通過顯微鏡觀察確定了其植株的花蕾小孢母細胞進入前期I的時期時，還要記載其植株的形態學特徵是為田間實驗提供依據，在田間通過所記載的小孢子母細胞進入前期I 的形態學特徵，即可方便地在所述的前期I對該植株進行2η花粉的誘導，因為在田間是不可能邊顯微鏡觀察邊進行2η花粉誘導處理。(3)待處理花柱的準備
對具有步驟(2)記載的所述的形態學特徵的植株，用右手母指與中指配合輕揉包裹在肉穗花序外的佛焰苞，直至佛焰苞散開，露出肉穗花序；注意不要損傷苞片和花柱。(4)秋水仙素處理誘導2η花粉
在室外溫度為10°c -25°C時，用脫脂棉將步驟(3)所述的彩色馬蹄蓮植株的肉穗花序柱緊貼包裹，將質量分數為0. 15%的秋水仙素滴加到包裹花柱的脫脂棉上進行為期三天的誘導，在誘導的時間內補充所述的秋水仙素使包裹的棉花保持溼潤，第四天，用鑷子摘去脫脂棉並用蒸餾水衝洗5次去除秋水仙素殘留。(5) 2η花粉的鑑定
當步驟(4)處理植株花蕾發育成熟溢出花粉時，按常規操作，取該花粉經乳酚酸性品紅溶液染色後製片，在顯微鏡(16X40倍)下觀察花粉粒大小並照相，以未處理的父本植株花粉作對照，在同一視野下觀察花粉粒大小，處理植株的花粉粒直徑比對照植株的花粉粒直徑大30% 70%的花粉粒為2η花粉； (6) 2η花粉的收集
於秋水仙素處理後7 10天，當處理過的彩色馬蹄蓮肉穗花序的雄蕊成熟但未出花粉之前，將其雄蕊切割下來，放入培養皿中置於乾燥器中待花粉成熟溢出。不同品種雄蕊成熟的標誌差異很大，主要是由其顏色變化來判斷，如黃花和紅花馬蹄蓮雄蕊由乳白色變為深黃色時表示其成熟，而紫黑色馬蹄蓮的雄蕊成熟的標誌則是由白色變為紫黑色。(7)有性多倍化雜當雄蕊成熟且未出花粉時用消毒刀片將母本植株花柱的雄花部分切除，並對母本植株的花柱柱頭套袋，當母本植株的柱頭突起並分泌黏液時，將步驟(6)收集的處理花粉授與母本植株的柱頭上，直至植株子房明顯膨大，且花莖下彎時解除套袋.待種子成熟時採收雜交種子。(8)種子採收
授粉15 20天後果實開始逐漸膨大。種子成熟大約需要80 90天左右，最後一個月控制水分，逐漸減少水分至停止澆水，待植株葉片枯黃、果皮發黃並略顯皺縮時雜交種子已成熟，採收的種子置於4°C條件下低溫貯藏60天打破休眠後，播於培養基進行無菌萌發，貯藏種子兩年內均可萌發，採無菌萌發幼苗的根尖進行染色體觀察，鑑定雜交後代倍性。無菌萌發的方法是，將消毒處理的雜交種子於培養基MS + 6-BA 2. Omg/L + NAAO. lmg/L + 蔗糖 30g/L + 瓊脂 7g/L 中、光照 20001x 30001x、溫度 18°C 25°C條件下培養。( 9 )有性三倍體後代鑑定
①氣孔鑑定
取在相同生長條件下種植的對照植株和步驟(8)種植的彩色馬蹄蓮育雜交後進行氣孔鑑定，撕取對照植株的葉片下表皮和步驟(8)種植的彩色馬蹄蓮育雜交後的葉片下表皮分別製片，然後於OLYMPUS顯微鏡下觀察測量氣孔大小，步驟(8)種植的彩色馬蹄蓮育雜交後的葉片氣孔大小比對照大增大30% 70%作為多倍體變異的初步鑑定指標；
②染色體鑑定
取經氣孔鑑定出氣孔大小比對照大30% 70%的植株的根尖採用改良苯酚品紅染色法製片，然後在顯微鏡下觀察並攝像，以染色體數目的多少來判斷其倍性，染色體數目增加為 48 (2n=3x=48)的植株為本發明方法所獲得的彩色馬蹄蓮三倍體雜交後代；彩色馬蹄蓮二倍體植株染色體為32(2n=2x=32)，表明上述秋水仙素處理成功誘導2η花粉產生、並與正常雌配子通過有性雜交獲得三倍體雜交後代。
權利要求
1.2n花粉培育彩色馬蹄蓮有性三倍體的方法，按以下步驟進行(1)確定2η花粉誘導的適宜發育階段取彩色馬蹄蓮不同發育階段植株的花苞，用顯微鏡觀察其小孢子母細胞減數分裂進度，50%以上的小孢子母細胞進入前期I時為2η花粉誘導的適宜階段，並記載此時該植株的形態學特徵，所述的形態學特徵是該植株的佛焰苞的顏色，肉穗花序的顏色，佛焰苞與肉穗花序包裹的緊實度和花莖挺出的長度；(2)待處理花柱的準備對具有步驟(1)記載的所述的形態學特徵的植株，用手揉包裹在肉穗花序柱外的佛焰苞，直至佛焰苞散開，露出肉穗花序柱；(3)秋水仙素處理誘導2η花粉在室外溫度為10°C 20°C時，用脫脂棉將步驟2所述的彩色馬蹄蓮植株的肉穗花序柱緊貼包裹，將質量分數為0. 1% 0. 15%的秋水仙素滴加到包裹花柱的脫脂棉上進行為期三天的誘導，在誘導期間內補充所述的秋水仙素使包裹的棉花保持溼潤，三天後，用蒸餾水衝洗3 5次去除秋水仙素殘留；(4)2n花粉的鑑定當步驟C3)處理植株花蕾中花粉溢出時，取該花粉經乳酚酸性品紅溶液染色後製片， 在顯微鏡下觀察花粉粒大小並照相，以未處理的父本植株花粉作對照，在同一視野下觀察花粉粒大小，處理植株的花粉粒直徑比對照植株的花粉粒直徑大30% 70%的花粉粒為2η 花粉；(5)2η花粉的收集於秋水仙素處理後5 7天，當處理過的彩色馬蹄蓮肉穗花序的雄蕊成熟但未出花粉之前，將其雄蕊切割下來，放入培養皿中置於乾燥器中待花粉成熟溢出； (6)有性多倍化雜交當雄蕊成熟且未出花粉時用消毒刀片將母本植株花柱的雄花部分切除，並對母本植株的花柱柱頭套袋，當母本植株的柱頭突起並分泌黏液時，將步驟(5)收集的處理花粉授與母本植株的柱頭上，授粉後繼續套袋7 10天後解除套袋，待種子成熟時採收雜交種子，採收的種子置於4°C 6°C條件下低溫貯藏2 3個月天，將該種子採用大田播種和或無菌萌發的方法培育雜交後代供多倍體鑑定；(7)有性三倍體後代鑑定所述的有性三倍體後代鑑定是染色體鑑定，所述的染色體鑑定是取步驟(6)培育的雜交後代的莖尖或根尖採用改良苯酚品紅染色法製片，然後在顯微鏡下觀察並攝像，以染色體數目的多少來判斷其倍性，染色體數目為48的植株為本發明方法所獲得的彩色馬蹄蓮三倍體雜交後代。
2.根據權利要求1所述的2η花粉培育彩色馬蹄蓮有性三倍體的方法，其特徵在於在步驟(7)所述的有性三倍體後代鑑定的染色體鑑定之前先進行氣孔鑑定後，取經氣孔鑑定顯示氣孔直徑增大30% 70%的材料再進行所述的染色體鑑定，所述的氣孔鑑定是取在相同生長條件下種植的對照植株和步驟(6)種植的彩色馬蹄蓮育雜交後進行氣孔鑑定，撕取對照植株的葉片下表皮和步驟(6)種植的彩色馬蹄蓮育雜交後的葉片下表皮分別製片，然後於顯微鏡下觀察測量氣孔直徑大小，步驟(6)種植的彩色馬蹄蓮育雜交後代的氣孔直徑比對照增大30% 70%作為多倍體變異的初步鑑定指標。
3.根據權利要求1或2所述的2η花粉培育彩色馬蹄蓮有性三倍體的方法，其特徵在於所述的母本是紫花彩色馬蹄蓮coloured『Pink persuasion』，父本是黃花彩色馬蹄蓮 coloured ZaflieofecAia 'Black magic』。
全文摘要
本發明公開了2n花粉培育彩色馬蹄蓮有性三倍體的方法，屬植物倍性育種技術領域。該方法是(1)確定2n花粉誘導的適宜發育階段，(2)待處理花柱的準備，(3)秋水仙素處理誘導2n花粉，(4)2n花粉的鑑定，(5)2n花粉的收集，(6)有性多倍化雜交，(7)有性三倍體後代鑑定。該方法能成功一步獲得彩色馬蹄蓮有性三倍體。
文檔編號A01H1/08GK102217525SQ20111012209
公開日2011年10月19日 申請日期2011年5月12日 優先權日2011年5月12日
發明者吳紅芝, 周滌, 李潔筠, 楊輝, 石景峰 申請人:雲南農業大學