一株對柑橘木蝨具強致病力的淡紫擬青黴菌株的製作方法

2023-10-31 04:06:12

專利名稱：一株對柑橘木蝨具強致病力的淡紫擬青黴菌株的製作方法
技術領域：
本發明涉及一株對柑橘木風具強致病力的淡紫擬青黴iPaeci1myceslilacinus')菌株,屬於微生物技術領域。
背景技術：
柑橘木風citri )屬同翅目(Homoptera )、木風科(Chermidae),是柑橘、檸檬、黃皮、九裡香、枸杞等芸香科植物新梢期的主要害蟲，也是傳播柑橘黃龍病的唯一自然蟲媒。柑橘黃龍病作為當前柑橘生產上防治最難、威脅最大的一種毀滅性病害，對柑橘產業的穩定和發展帶來了嚴重的威脅。但目前對該病害尚未獲得有效的防治藥劑，以防治柑橘木蝨為主的綜合防治是當前該病害防控的主要辦法。因此，加強對柑橘木蝨的防治，無論對於控制柑橘黃龍病的流行還是降低蟲體本身對柑橘的危害都具有重要的意義。目前對於柑橘木蝨的防治多採用化學防治措施，然而化學農藥的頻繁使用造成了農藥殘留、環境汙染、生物多樣性破壞和柑橘木蝨產生 抗藥性等諸多問題，而生物農藥以其高效、低毒、低殘留、無汙染、不易產生抗藥性和原料易得等特性被人們認為是未來化學農藥的理想替代藥劑。因此，利用生物農藥防治柑橘木蝨也逐漸引起人們的重視。目前，國內外研究者在利用植物提取物、昆蟲天敵等防治柑橘木蝨方面進行了諸多有益的嘗試，在柑橘木蝨蟲生真菌方面也開展了一定的研究，如目前已報導的對柑橘木蝨具有致病效果的真菌有檬形被毛孢citriformis、、氣氏敬著黴 ipaeci lomyces varioti )、玫煙色擬青黴 iPaecilomyces fumosoroseus )、球抱白僵菌 QBeauveria bassiana )、蟲牙笑頂抱黴(Acros talagmus aphit/ia )、黃色鍵刀菌iFusarium cuImorum )和臘階輪枝菌{Lecanicillium 7eca/ ii)等。目前對於柑橘木風生防菌的研究多處於實驗室階段,在農業生產中利用生防菌製劑成功防治柑橘木蝨的實例尚未有見報導。因此，目前對於柑橘木蝨蟲生真菌進一步的分離篩選和生物潛能的深入研究，對於促進將來柑橘木蝨生物防治的順利開展具有重要的意義。淡紫擬青黴iPaecilomyces 7i7aci/W5.)是一種重要的生防真菌,研究發現該菌除對多種植物線蟲具有較強的致病性外，還可寄生荔枝蝽象、葉蟬、褐飛蝨、白蟻、象鼻蟲和茶蠶等多種昆蟲，另外，該菌對小麥赤黴病菌、黃瓜炭疽病菌和棉花枯萎病菌等多種植物病原菌具有一定的拮抗作用，且其代謝產物還可促進種子萌發、促進植物根系和植株生長等，其產生的多種功能酶還具有一定的農藥降解效應。目前，已有市場化的針對防治根結線蟲等的淡紫擬青黴生防菌製劑。然而，對於淡紫擬青黴可寄生於柑橘木蝨的現象及利用淡紫擬青黴防治柑橘木蝨的研究在國內外尚未有見報導。本發明所提供的對柑橘木蝨具有強致病力的淡紫擬青黴菌株，是對目前柑橘木蝨蟲生真菌資源的有益補充，具有被開發為柑橘木風生防菌製劑的潛能。

發明內容
本發明的目的在於提供一株對柑橘木蝨具強致病力的淡紫擬青黴菌株，該菌株具有被開發為生物農藥的潛能，具有良好的市場應用前景。本發明的目的是通過以下技術方案實現的:
本發明所提供的淡紫擬青黴菌株為淡紫擬青黴Iilacinus)ZJPL08,已於2013年3月15日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保藏，保藏編號為 CGMCC N0.7318。本發明還提供了所述淡紫擬青黴菌株在防控柑橘黃龍病中的應用，以及在製備用於防治柑橘木蝨的生物農藥中的應用，菌株ZJPL08的分生孢子懸浮液對柑橘木蝨具有強致病力。所述淡紫擬青黴QPaecilomyces Iilacinus.)舊取ZJPL08是從浙江省台州市黃巖區的橘園中採集的柑橘木蝨蟲體上分離獲得的，該菌株的形態特徵、培養特性、ITS1-5.8SrDNA-1TS2序列和菌種分類結果如下:
1、菌株ZJPL08的形態特徵:菌株ZJPL08在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基生長良好，在PDA平板上菌落呈圓形、隆起，菌絲較緻密，表面無分泌物；培養初期菌落顏色為白色，產生孢子後菌落顏色顯示為淡紫色，分生孢子呈粉質狀。隨著產孢量的增多，菌落顏色逐漸加深，至培養後期，菌落顏色變為深紫色。在光學顯微鏡下觀察，菌株ZJPL08分生孢子梗單生或輪生，瓶梗基部柱狀或瓶狀，向上變為細長管狀，7.5、X 1.8 3 μ mo分生孢子為單細胞，卵形或紡錘形，無色至黃色，1.5^2.8X1.3^2.5 μ m,在孢子梗上呈鏈狀排列。2、菌株ZJPL08的生物學特性:菌株ZJPL08在PDA培養基上於15°C 35°C的溫度條件下均可生長，但不同溫度對菌株的生長有顯著影響。25°C 30°C時菌絲生長速率明顯高於其他溫度，為菌株ZJPL08的適宜生長溫度。而15°C及以下低溫或35°C及以上高溫下菌株ZJPL08的菌絲生長緩慢，產孢量減少。在全光照、全黑暗和12 h光照/12 h黑暗條件下，菌株ZJPL08在PDA培養基上均生長良好，光照時間的長短對菌株ZJPL08的生長影響不明顯。接種後I d菌 株ZJPL08在馬鈴薯蔗糖(PS)液體培養基中的分生孢子產量明顯高於馬鈴薯葡萄糖(PD)液體培養基、薩氏葡萄糖酵母浸膏(SDY)液體培養基、察氏(CD)液體培養基和麥芽浸膏(ME)液體培養基。在接種後7 d，菌株ZJPL08在H)液體培養基中的菌絲產量最高，而在PS培養基中的菌絲產量較低。菌株ZJPL08的分生孢子在15°C 35°C的溫度條件下均能萌發，其適宜萌發溫度為25°C 30°C，15°C以下的低溫和35°C以上的高溫孢子均難以萌發。孢子萌發率隨時間的延長而升高，至培養9 h後，30°C下菌株ZJPL08的分生孢子萌發率達99.5%。3、菌株 ZJPL08 的 ITS1-5.8S rDNA_ITS2 序列:測序所得菌株 ZJPL08 的 ITS1-5.8SrDNA-1TS2序列SEQ ID N0.1所示，利用NCBI Blast比對分析發現，該序列與GenBank中淡紫擬青黴lilacinus)的多個分離物(如 JN650588、FR751342、HM439952、HM032028.EU553316等)的對應序列相似性高達100%，與購自中國農業微生物菌種資源庫的淡紫擬青黴的3個對照菌株(ACCC30640、ACCC32480和ACCC31532)的相似性也高達99.8%。根據以上關於菌株ZJPL08的形態特徵、生物學特性及ITS1-5.8S rDNA_ITS2序列特徵，將菌株ZJPL08鑑定為絲孢目(Hyphomycetales)擬青黴屬的淡紫擬青黴(.Paecilomyces IiIacinus )。與現有技術相比，本發明的優點和有益效果為:(1)目前國內外尚無關於淡紫擬青黴侵染柑橘木蝨的報導，而本發明的菌株ZJPL08是從浙江省台州市黃巖區柑橘園中被侵染的柑橘木蝨蟲體上分離獲得的，與分離自其它基物的淡紫擬青黴菌株相比，本發明所述的淡紫擬青黴ZJPL08對柑橘木蝨具有更強的致病力；(2)本發明所述的淡紫擬青黴ZJPL08是一種昆蟲病原真菌，可被開發為生防菌製劑用於對柑橘木蝨的生物防治，較目前防治柑橘木蝨的化學藥劑相比，具有高效、低毒、低殘留、無汙染、不易產生抗藥性的特徵；(3)本發明所述的淡紫擬青黴ZJPL08的分生孢子懸浮液對柑橘木蝨具有強致病力，接種柑橘木風后第3 d的LC5tl為5.77 X IO9 spores/mL,濃度為LOX IO8 spores/mL的孢子懸浮液的LT5tl僅為3.1 d。菌株ZJPL08較其他淡紫擬青黴菌株對柑橘木蝨有更強的作用效果，具有良好的市場應用前景。(4)菌株ZJPL08培養快，產孢量大，孢子萌發率高，易於製備。


圖1為淡紫擬青黴lilacinus、H ZJPL08在PDA培養基上的培養特徵。圖2為淡紫擬青黴Iilacinus.)舊取ZJPL08對柑橘木風的侵染情況。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明做進一步描述，但本發明的保護範圍並不僅限於此。一種對柑橘木蝨具強致病力的淡紫擬青黴菌，菌種命名為ZJPL08，分類命名:淡紫擬青黴 7i7aci/W5.),其保藏編號:CGMCC N0.7318,保藏日期:2013 年 3月15日，保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號。實施例1:昆蟲病原菌的分離和篩選 1、病菌的分離純化:從浙江省台州市黃巖區柑橘園內採集柑橘木蝨蟲屍，帶回實驗室將其放於70%乙醇中浸泡30 S,再經過0.1%升萊浸泡3 min,最後用無菌水衝洗3次,用無菌濾紙吸乾蟲體上的水分，然後將其放於馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基(配製方法為:稱取200 g馬鈴薯，洗淨去皮切碎，加水1000 mL煮沸半個小時，紗布過濾，再加20 g葡萄糖和20 g瓊脂，充分溶解後趁熱紗布過濾，分裝至錐形瓶或玻璃試管中，121°C，高壓滅菌20 min)中，置於微生物培養箱中28°C恆溫培養，至蟲體周圍長出菌絲後，挑取菌絲轉至新的PDA平板上培養(重複此操作2 3次)，持續培養5 d左右，待菌落上產生分生孢子，用無菌水洗脫分生孢子製備成分生孢子懸浮液，然後參照《植病研究方法》中所述的稀釋純化法(方中達.植病研究方法(第三版)[M].北京:中國農業出版社，1998: 122-140)對病菌進行單孢分離。最後將分離純化獲得的菌株保存於PDA斜面培養基中，培養31 d後，置於4 °C冰箱保存。2、致病菌的篩選:將上述分離純化保存的菌株接種到PDA平板上，於28°C恆溫培養10 d左右後，以無菌水洗脫菌落上產生的分生孢子，製備獲得分生孢子懸浮液，向其中加入適量的吐溫-80至終濃度為0.1%。取於溫室飼養的30頭健康柑橘木蝨成蟲(本說明書實施例均以柑橘木蝨成蟲為測試對象)浸沒於含0.1%吐溫-80的分生孢子懸浮液中1(T15 s，挑取處理後仍能自由活動的柑橘木蝨置於培養皿中的九裡香葉片上(培養皿底部鋪有2層用無菌水溼潤過的濾紙，其上放置一個帶10個左右葉片的九裡香嫩枝，枝條底端以無菌水溼潤的脫脂棉包裹)，然後放於28°c光照培養箱中(每天14 h光照/10 h黑暗，溼度95%以上)培養，同時設立含0.1%吐溫-80的無菌水處理柑橘木蝨為對照，培養7 d後觀察病菌對柑橘木蝨的侵染和致死情況。之後再按步驟I中的方法從處理後的柑橘木蝨蟲體中分離病菌，比較再分尚的病菌與初始接種的病菌的形態特徵和培養特徵。通過以上操作，篩選出符合科赫氏法則的對柑橘木蝨具致病性的菌株，排除從柑橘木蝨蟲體上分離到的腐生菌等非致病菌。通過篩選，獲得I株對柑橘木蝨具有致病力的菌株，將其命名ZJPL08。3、菌株的復壯:製備上述篩選到的對柑橘木蝨具致病力的菌株ZJPL08的分生孢子懸浮液，接種到健康柑橘木蝨蟲體上，然後再從發病的柑橘木蝨蟲體上分離純化病菌，具體操作方法同上。最後獲得分離純化的菌株ZJPL08。實施例2:菌株ZJPL08的鑑定
1、菌株ZJPL08的形態特徵:將上述分離純化的菌株ZJPL08接種到PDA培養基平板中央，置於28°C恆溫培養，每天觀察菌落生長情況並記錄菌落顏色和形態。將菌株ZJPL08接種到另一 PDA培養基平板中央，同時將滅菌後的蓋玻片(I cmXl cm)斜插入距接種點約Icm左右處的培養基內，置於28 1:恆溫培養5 d左右待菌絲爬到蓋玻片上後，取出蓋玻片置於光學顯微鏡下觀察菌株ZJPL08的菌絲和孢子形態。圖1示菌株ZJPL08在PDA培養基上培養7 d後的形態特徵，可見菌株ZJPL08菌落呈圓形、隆起，菌絲較緻密，表面無分泌物；培養初期菌落顏色為白色，產生孢子後菌落顏色顯示為淡紫色，分生孢子呈粉質狀。隨著產孢量的增多，菌落顏色逐漸加深，至培養後期，菌落顏色變為深紫色。在光學顯微鏡可觀察到菌株ZJPL08分生孢子梗單生或輪生，瓶梗基部柱狀或瓶狀，向上變為細長管狀，7.5^9 X 1.8^3 μ mo分生孢子為單細胞，卵形或紡錘形，無色至黃色，1.5^2.8 X 1.3^2.5 μ m,在孢子梗上呈鏈狀排列。
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2、菌株ZJPL08的序列分析:將菌株ZJPL08接種至PDA培養基平板，置於28 V恆溫培養至菌落長滿整個培養皿，以無菌藥匙刮取PDA平板上生長的真菌菌絲於無菌研缽中，加入液氮研磨至粉末狀，採用改良的CTAB法提取菌株ZJPL08的總DNA，以純化的DNA為模板，用真菌通用引物ITS5 (5 ; -GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3 ')和ITS4 (5 ' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 ')進行PCR擴增(具體操作方法參考:鹿連明等.柑橘黃龍病菌核糖體蛋白基因的多態性及系統發育分析.浙江大學學報，2011，37(2):125-132λΡΟ 產物經瓊脂糖凝膠電泳，利用凝膠回收試劑盒回收後送交公司測序。測序所得菌株ZJPL08的ITS1-5.8S rDNA_ITS2序列如SEQ ID N0.1所示，利用NCBI Blast比對分析發現,該序列與GenBank中淡紫擬青黴lilacinus、的多個分離物(如 JN650588、FR751342、HM439952、HM032028、EU553316 等)的序列相似性高達100%，與購自中國農業微生物菌種資源庫的淡紫擬青黴的3個對照菌株(ACCC30640、ACCC32480 和 ACCC31532)的相似性也高達 99.8%。根據以上關於菌株ZJPL08的形態特徵及ITS1-5.8S rDNA_ITS2序列特徵，可將菌株ZJPL08鑑定為絲孢目(Hyphomycetales)擬青黴屬)的淡紫擬青黴(.Paecilomyces lilacinus\實施例3:菌株ZJPL08的生物學特性1、不同溫度對菌株ZJPL08生長的影響:以無菌打孔器於在PDA培養基上培養7d左右的菌株ZJPL08的菌落周圍打取5 mm大小的菌餅，然後將菌餅分別置於數個新鮮製備的PDA平板(直徑為9 cm)中央，分別於5°C、10°C、15°C、20°C、25°C、3(TC和35°C光照培養箱中倒置培養，每個溫度下設3個重複。培養14 d，每24 h觀察菌落生長情況並採用十字交叉法記錄菌落直徑。結果見表1，可以看出，菌株ZJPL08在PDA培養基上於15°C 35°C的溫度條件下均可生長，其中25°C和30°C時菌絲生長速率明顯高於其他溫度，培養14 d菌落幾乎可長滿整個培養皿，而35°C時菌落生長速度明顯減緩，10°C和5°C低溫下菌落幾乎不生長。因此，250C 30°C為菌株ZJPL08的適宜生長溫度。表I接種後不同天數不同溫度下菌株ZJPL08的生長情況
權利要求
1.一株淡紫擬青黴菌株,其特徵在於該菌株為淡紫擬青黴lilacinus)ZJPL08,已於2013年3月15日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保藏，保藏編號為CGMCC N0.7318。
2.如權利要求1所述的淡紫擬青黴菌株在防控柑橘黃龍病中的應用。
3.如權利要求1所述的淡紫擬青黴菌株在製備用於防治柑橘木蝨的生物農藥中的應用。
全文摘要
本發明涉及一株對柑橘木蝨具強致病力的淡紫擬青黴(Paecilomyceslilacinus)菌株，屬於微生物技術領域。所述菌株為淡紫擬青黴(Paecilomyceslilacinus)ZJPL08，已於2013年3月15日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保藏，保藏編號為CGMCC No.7318。本發明所述的淡紫擬青黴ZJPL08對柑橘木蝨具有更強的致病力，可被開發為生防菌製劑用於對柑橘木蝨的生物防治，較目前防治柑橘木蝨的化學藥劑相比，具有高效、低毒、低殘留、無汙染、不易產生抗藥性的特徵。菌株ZJPL08較其他淡紫擬青黴菌株對柑橘木蝨有更強的作用效果，菌株ZJPL08培養快，產孢量大，孢子萌發率高，易於製備，具有良好的市場應用前景。
文檔編號C12N1/14GK103160442SQ20131011753
公開日2013年6月19日 申請日期2013年4月7日 優先權日2013年4月7日
發明者鹿連明, 杜丹超, 蒲佔湑, 胡秀榮, 陳國慶 申請人:浙江省柑桔研究所