一種載有基因的磷酸鈣複合納米粒及其製法與用途的製作方法

2023-10-31 05:28:42

專利名稱：一種載有基因的磷酸鈣複合納米粒及其製法與用途的製作方法
技術領域：
本發明屬一非病毒基因傳遞系統的製備方法與應用，涉及載基因的磷酸鈣複合納米粒的製備、分離及其在骨髓間質幹細胞中的傳遞。
背景技術：
基因治療是以基因轉移為基礎，將外源基因導入體內達到治療目的的一種治 療方法。目前基因治療的首要問題是如何選擇合適的基因傳遞系統(gene delivery system，⑶S)。一般，⑶S可以分為病毒和非病毒兩大類。病毒型⑶S所用的病毒主要 有慢病毒(參見Hyun-Joo Lee, Yong-Soo Lee, Hye-Sun Kim, et al Retronectin enhanceslentivirus-mediated gene delivery into hematopoietic progenitor cells [J]· Biologicals，2009，203-209)、腺病毒(參見=Wei-Wen Hu, Michael W. Lang, Paul H.Krebsbach. Digoxigeninmodification of adenovirus to spatially control gene delivery from chitosan surfaces[J]. Journal of Controlled Release,2009,135(3) 250-258)等。雖然病毒型GDS轉染效率高，但由於該系統存在的自身局限性，如能誘導 宿主免疫反應、具有潛在的致瘤性、裝載容量有限、代價高等，特別是1999年基因治療臨床 試驗中，出現首例運用腺病毒載體致人死亡的嚴重後果(參見Roy I, Ohulchanskyy TY, Bharali DJ, et al. Optical tracking oforganically modified silica nanoparticles as DNA carriers -.a nonviral, nanomedicine approachfor gene delivery. Proc Natl Acad Sci USA, 2005,102 (2) :279_284)，其安全問題迫使人們對病毒型的⑶S的選擇持更為 謹慎的態度，目前，在嚴格控制病毒型GDS臨床應用的同時，人們把注意力和希望逐步轉向 非病毒⑶S的研究和應用。非病毒載體目前常用的如脂質體及多聚陽離子聚合物，多聚陽離子聚合物有多 聚胺基酸，殼聚糖(參見Ximing Xu, Capito RM, Spector Μ. Plasmid size influences chitosannanoparticle mediated gene transfer to chondrocytes[J]. J Biomed Mater Res A. 2008,84(4) 1038-48),陽離子明膠[5](參見Ximing Xu, Capito RM, Spector Μ. Delivery ofplasmid IGF-I to chondrocytes via cationized gelatin nanoparticles [J], J Biomed Mater Res A. 2008,84(1) :73_83)等。但脂質體和多聚陽離 子聚合物在體內外的不穩定性及高濃度時存在明顯的細胞毒性作用限制了其進一步的應 用，開發具有安全高效的基因載體具有非常重要的意義。磷酸鈣是機體的天然成分，具有良好的組織相容性和吸收性，易被細胞胞飲，無毒 副作用等特點，因此是一種優良的基因載體。磷酸鈣基因載體通常採用共沉澱法製備，這種 方法使得DNA大部分包裹在磷酸鈣內能夠得到比較好的保護而不被降解。但採用上述共沉 澱法製備的納米粒粒徑一般大於IOOnm(參見Savita Bisht, Gajadhar Bhakta, Susmita Mitra, et al. pDNA loaded calcium phosphate nanoparticles :highly efficient non-viralvector for gene delivery[J]. International Journal of Pharmaceutics, 2005，288 (6) : 157-168)，不利於轉染效率的提高。中國專利申請(申請號200710034376. 4)公開了 「一種基因傳輸載體磷酸鈣納米的製備方法」，該發明公開的實際上是一種磷酸鈣 納米粒而非DNA-磷酸鈣納米粒的製備方法，其基因攜帶是製備好的納米粒表面靜電吸附 基因來實現的，形態為針形，轉染效率往往有限。另外，目前磷酸鈣納米粒作為基因載體 所轉染的細胞多為鼻咽癌CNE-2、人宮頸癌Hela(參見E. H. Chowdhury，Megumi Kunou, MasatoNagaoka, et al. High-efficiency gene delivery for expression in mammalian cells bynanoprecipitates of Ca-Mg phosphate [J] · Gene, 2004，341 :77_82)等腫瘤細 胞。如何製備粒徑小(< lOOnm)，形態為球形，並能實現幹細胞高效轉染的磷酸鈣-DNA納 米粒一直是人們研究的熱點方向。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種載基因的複合納米粒，及其製法。本發明的技術方案如下—種載有基因的磷酸鈣複合納米粒，它是載有治療基因的磷酸鈣納米粒，該複合 納米粒為球形，粒徑小於50nm。上述的載有基因的磷酸鈣複合納米粒，所述的質粒DNA為轉化生長 因子 (TGF- β 1)質粒。一種上述的載有基因的磷酸鈣複合納米粒的製備方法，它是將0. IM Igepal C0-520溶於25ml環己烷，加入1. 0472 μ g氯化鈣，攪拌混勻形成微乳1 ；將0. IM Igepal C0-520, 50 μ ITis-HCL (ρΗ 7. 4)溶於25ml環己烷，加入3. 4785 μ g磷酸氫二鈉，磷酸氫二鈉 與質粒的質量比為0.1 1 10 1，攪拌形成微乳2，將微乳2緩慢滴加到微乳1中，攪 拌lOmin，形成載基因的磷酸鈣複合納米粒的乳液。一種上述載有基因的磷酸鈣複合納米粒的分離方法，它由如下步驟組成(1)層析柱的預處理取90g矽球加入含有0. 336mL氨基丙基三乙氧基矽烷 (aminopropyltriethoxysilane, APS)，1. 5mL ^jCZi SI, 7. 5μ L雙胃 ^K 白勺 150mL ZiIIiiit^, 攪拌過夜，70°C烘乾備用；(2)載有基因的磷酸鈣複合納米粒的分離將上述製得的載有基因的磷酸鈣複合納米粒乳液過矽膠層析柱，先用無水乙醇洗 脫環己烷及游離的質粒和鹽，然後用濃度為5X 10_4mol/L的NaCl的70%乙醇溶液500ml洗 脫載基因的磷酸鈣複合納米粒；(3)載有基因的磷酸鈣複合納米粒乙醇液的濃縮將步驟2所得的含有載有基因的磷酸鈣複合納米粒的乙醇液在37°C旋轉減壓蒸 發6h除去乙醇，濃縮液置於12KD的透析袋中，置於磷酸鹽緩衝液中，4°C透析過夜，即得到 載有基因的磷酸鈣複合納米粒。實驗證明本發明的載有基因的磷酸鈣複合納米粒轉染效果與市售轉染試劑相當 (P > 0. 05)，顯著高於游離質粒組(P < 0. 01)，這說明本發明的載有基因的磷酸鈣複合納米 粒作為一種非病毒載體可有效實現DNA的幹細胞傳遞。因此，本發明的載有基因的磷酸鈣複合納米粒可以在幹細胞傳遞中應用。本發明的有益之處是本發明的載有基因的磷酸鈣複合納米粒質粒包裹到磷酸鈣納米粒中，形成包裹質粒DNA的磷酸鈣「複合納米粒」並用於骨髓間質幹細胞的傳遞。該載 有基因的磷酸鈣複合納米粒粒徑小於50nm，形態為球形，具有轉染效率高，毒性低的特點， 為開發高效安全的非病毒基因傳遞系統提供了新的思路。


圖1為載有基因的磷酸鈣複合納米粒的透射電鏡圖。
圖2為分離獲取得的骨髓間質幹細胞。圖3為ELISA法測定游離質粒、載有基因的磷酸鈣複合納米粒及市售轉染劑 lipfectamine 2000轉染3天和6天細胞表達的TGF-β 1結果圖，(* =P > 0. 05)。圖4為不同濃度載有基因的磷酸鈣複合納米粒與市售轉染試劑 lipfectamine 2000 細胞毒性的試驗結果(MTT 法)(*P > 0. 05，< 0. 05，*#P < 0· 01)。
具體實施例方式本發明通過實施例作進一步的說明。實施例1 載有TGF- β 1質粒的磷酸鈣複合納米粒的製備0. IM Igepal C0-520溶於25ml環己烷，1. 0472 μ g氯化鈣攪拌混勻形成微乳1 ； 0. IMIgepal C0-520 溶於 25ml 環己燒，50 μ lTis_HCL(pH 7. 4)，加入 3. 4785 μ g 磷酸氫二 鈉，兩者的質量比為磷酸氫二鈉質粒=10 1，攪拌形成微乳2。將微乳2緩慢滴加到 微乳1中，攪拌lOmin，形成複合納米粒的乳液。實施例2 載有TGF β 1質粒的磷酸鈣複合納米粒的製備方法同實施例1，只是加入的磷酸氫二鈉分別為17. 3925 μ g，6. 9570 μ g， 3. 4785mg、l. 7393μ g 和 0. 3479μ g，磷酸氫二鈉TGF-βΙ 質粒=5 1、2 1、1 1、 0.5 1和0. 1 1，得到磷酸二氫鈉與TGF- β 1質粒不同比例的載有TGF- β 1質粒的磷酸 鈣複合納米粒乳液。實施例3 載有TGF- β 1質粒的磷酸鈣複合納米粒的分離純化(1)層析柱的預處理取90g矽球加入含有0. 336mLAPS, 1. 5mL冰乙酸，7. 5 μ L雙蒸水的150mL乙醇溶液 中，攪拌過夜，70°C烘乾備用。(2)複合納米粒的分離將上述製得的不同比例的載有TGF-β 1質粒的磷酸鈣複合納米粒乳液過矽膠層 析柱，先用無水乙醇洗脫環己烷及游離的部分，然後用濃度為5X 10_4mOl/L的NaCl的70% 乙醇溶液洗脫載有TGF-β 1質粒的磷酸鈣複合納米粒。(3)複合納米粒的濃縮含有載有TGF-β 1質粒的磷酸鈣複合納米粒的乙醇溶液在37°C旋轉蒸發6h除去 乙醇，濃縮液置於12KD的透析袋中，置於磷酸鹽緩衝液中，4°C透析過夜，即得到不同比例 的載有TGF-β 1質粒的磷酸鈣複合納米粒。實施例4 載有TGF-β 1質粒的磷酸鈣複合納米粒瓊脂糖電泳將所製備的不同比例(質量比)的載有TGF-β 1質粒的磷酸鈣複合納米粒1 %瓊 脂糖凝膠80V電泳1. 5h，DNA經溴化乙錠(EB)染色顯示，紫外透射儀觀察並凝膠照相鑑定，其結果見圖2，其中1.裸DNA ；2.磷酸鈣質粒為10 1 ；3.磷酸鈣質粒為5 1 ；4.磷 酸鈣質粒為2 1 ;5.磷酸鈣質粒為1 1 ;6.磷酸鈣質粒為0. 5 1 ；7.磷酸鈣 質粒為0.1 1。電泳結果可知，在磷酸鈣質粒質量比大於等於2 1時，實現了很好的 滯留，在小於2 1時仍有部分質粒未被包埋而呈游離狀態。實施例5 大鼠幹細胞(MSC)的培養將SD大鼠拉頸處死，體積分數為75%乙醇浸泡3 5min，無菌條件下取出脛骨 和股骨；將其兩端幹骺端切除，顯露骨髓腔，用無菌注射器吸取適量PBS徹底衝洗骨髓腔； 反覆吹打衝出的骨髓，使骨髓細胞充分分散；所獲骨髓單細胞懸液沿管壁緩慢滴加於預加 的Percoll分離液(相對體積質量1. 073)的離心管中，骨髓單細胞懸液與分離液的比例為 1 1 ;2000rpm，離心20min，吸取中間雲霧狀細胞層，用PBS洗滌3次；重新懸起細胞，加入 完全培養基(含體積分數為10%胎牛血清的DMEM)，置於培養瓶中，37°C體積分數為5%的 CO2培養箱中培養。實施例6 載有TGF- β 1質粒的磷酸鈣複合納米粒的體外轉染
轉染前24h內將MSC按2X104/mL(2X104有單位嗎？)接種於96孔培養板中，置 370C 5% CO2培養箱中培養至80% -90%融合。轉染時，吸棄前一天鋪板的培養液，用PBS 洗滌後，加入載有TGF- β 1質粒的磷酸鈣複合納米粒以及DMEM培養液至100 μ L，繼續培養 6h ；換用完全培養基繼續培養。對照組用lipfeCtamineTM2000。實施例7 體外轉染細胞的轉染效率測定收集實施例5的細胞培養物上清，離心，加到酶標板中。分別設空白孔、標準孔、待 測樣品孔。除空白孔外，餘孔分別加標準溶液或待測樣品lOOul，注意不要有氣泡，輕輕混 勻，酶標板加上蓋，37°C應120分鐘。棄去液體，甩幹，不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作 液IOOul，37°C，60分鐘。洗板3次，350ul/每孔，甩幹。每孔加檢測溶液B工作液IOOul, 37°C，60分鐘，洗板5次，甩幹。依序每孔加底物溶液90ul，37°C避光顯色30分鐘(此時肉 眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，後3-4孔梯度不明顯)。依序每孔加終止溶 液50ul，終止反應(此時蘭色立轉黃色)。用酶聯免疫檢測儀在450nm波長測量各孔的光 密度(0D值)，計算各孔的蛋白表達濃度，結果見圖3。載有TGF-β 1質粒的磷酸鈣複合納米粒轉染效果與市售轉染試劑相當(P > 0. 05)，顯著高於游離質粒組(P < 0. 01)，說明所發明的載有TGF-β 1質粒的磷酸鈣複合納 米粒作為一種非病毒載體可有效實現DNA的幹細胞傳遞。實施例8 細胞毒性實驗採用MTT比色法考察載有TGF- β 1質粒的磷酸鈣複合納米粒的細胞毒性。2 X IO4 個/孔的MSC接種96孔板，37°C，CO2中繼續孵育24h，待細胞貼壁後，每孔加入不同濃度 (4，6，8，10，16，20yg/ml)的載有TGF-β 1質粒的磷酸鈣複合納米粒及對市售轉染試劑 lipfectamine 2000,分別作用48h後，每孔加MTT溶液100 μ L(5mg/ml)，繼續培養4h，棄上 清，每孔加入二甲亞碸(DMSO) 100 μ L，酶聯免疫檢測儀測定570nm處各孔吸光度㈧，以培 養基為空白對照，並與脂質體lipfeCtamineTM2000相比較，取平均值，並計算細胞存活分數 (細胞存活率(%) =A57ck樣品)/A57Q(對照)X100%)。其中A57tl(樣品)為加入載體後的細胞吸光 度，A57ckwm)為空白對照的細胞吸光度，結果見圖5。實驗結果表明，隨著非病毒載體用量的增加，所發明的載有TGFiil質粒的磷酸鈣複合納米粒細胞毒性明顯小於市售轉染試劑lipfectamine 2000(P < 0. 01)..,
權利要求
一種載有基因的磷酸鈣複合納米粒，其特徵是它是載有治療基因的磷酸鈣納米粒，該複合納米粒為球形，粒徑小於50nm。
2.根據權利要求1所述的載有基因的磷酸鈣複合納米粒，其特徵是所述的基因質粒 是 TGF-3 1。
3.—種權利要求1所述的載有基因的磷酸鈣複合納米粒的製備方法，其特徵是它是 將0. 1M Igepal C0-520溶於25ml環己烷，加入1. 36M氯化鈣，攪拌混勻形成微乳1 ；將0. 1M Igepal C0-520,50u lTis-HCL(pH 7.4)溶於25ml環己烷，加入磷酸氫二鈉和基因質粒，加 入磷酸氫二鈉的質量0.35M，磷酸氫二鈉與質粒的質量比為0. 1 1 10 1，攪拌形成微 乳2，將微乳2緩慢滴加到微乳1中，攪拌lOmin，形成載有基因的磷酸鈣複合納米粒的乳 液。
4.一種權利要求1所述的載有基因的磷酸鈣複合納米粒的分離方法，它由如下步驟組成(1)層析柱的預處理取90g矽球加入含有0. 336mL氨基丙基三乙氧基矽烷(aminopropyltriethoxysilane， 八卩5)，1.51^冰乙酸，7.51^雙蒸水的150mL乙醇溶液中，攪拌過夜，70°C烘乾備用；(2)載有基因的磷酸鈣複合納米粒的分離將權利要求2製得的載有基因的磷酸鈣複合納米粒乳液過步驟(1)預處理的矽膠層析 柱，先用無水乙醇洗脫環己烷及游離的質粒和鹽，然後用含有5X10_4mol/LNaCl的70%乙 醇溶液洗脫載基因的磷酸鈣複合納米粒；(3)載基因的磷酸鈣複合納米粒乙醇液的濃縮將步驟(2)所得的含有載基因的磷酸鈣複合納米粒的乙醇液在37°C旋轉減壓蒸發6h 除去乙醇，濃縮液置於12KD的透析袋中，置於磷酸鹽緩衝液中，4°C透析過夜，即得到載基 因的磷酸鈣複合納米粒。
5.根據權利要求1所述的載基因的磷酸鈣複合納米粒在幹細胞傳遞中應用。
全文摘要
一種載有基因的磷酸鈣複合納米粒，它是載有治療基因的磷酸鈣納米粒，該複合納米粒為球形，粒徑小於50nm。本發明的載有基因的磷酸鈣複合納米粒轉染效果與市售轉染試劑相當(P＞0.05)，顯著高於游離質粒組(P＜0.01)，這說明本發明的載有基因的磷酸鈣複合納米粒作為一種非病毒載體可有效實現DNA的幹細胞傳遞。因此，本發明的載基因的磷酸鈣複合納米粒可以在幹細胞傳遞中應用。本發明公開了其製法。
文檔編號A61K47/32GK101829330SQ20091026411
公開日2010年9月15日 申請日期2009年12月30日 優先權日2009年12月30日
發明者餘江南, 徐希明, 曹霞, 蘇偉燕 申請人:江蘇大學