一種菸草表皮毛髮育相關基因NtTTG2及其重組表達載體和應用的製作方法

2023-10-19 13:25:07

專利名稱：一種菸草表皮毛髮育相關基因NtTTG2及其重組表達載體和應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於分子生物學領域，涉及一種菸草表皮毛髮育相關基因NtTTG2及其重組表達載體和應用。
背景技術：
在植物體表面的表皮毛在不同種類的植物上表現出不同的形態特徵。一般來說， 表皮毛是由表皮細胞分化出的毛狀單細胞或者多細胞結構，這種結構可以作為植物最外層的天然屏障，有著不可替代的保護功能，如可以減弱植物在紫外線、乾旱、輻射和毒性物質等非生物脅迫下所受到的傷害[1]。另外，植物表皮毛在植物抗擊蟲害和抵禦病原物侵染過程中也起著非常重要的作用。在植物中，表皮毛髮育的控制是一個相當複雜的過程。有許多證據顯示，表皮毛的起始和發育是受正向調控因子和負向調控因子調控的。目前，對於擬南芥的表皮毛髮育模型已經研究的比較透徹，這也成為了研究植物細胞分化分子基礎的最好的模型之一。擬南芥的表皮毛是無腺體的單細胞表皮毛，一般有3個分支，在整個植株中均有分布。它的發育是一個由時空控制的過程，已經分離到的表皮毛突變體70多個，可歸以下幾種類型無表皮毛型、表皮毛簇生型、表皮毛減少型、表皮毛扭曲型和玻璃狀表皮毛型， 涉及二十多個基因的參與 。為了闡釋表皮毛髮育起始的控制機制，克隆調控基因和研究這些調控基因的功能是非常必要的。目前認為，在這些基因中，有三個最為重要，分別是編碼myb的GL1，編碼bHLH的GL3和編碼WD-40的TTG1，這三個基因表達的產物在矮牽牛中形成三元複合體，控制著花青苷的生物合成 ]。在擬南芥中，GLl (GLABR0US1)和 TTGl (TRANSPARENTTESTA GLABRA 1)兩個基因發生功能缺失的突變體，葉片的表皮毛完全消失。GL3(GLABROUS;3)基因突變的突變體數量和表皮毛的分支明顯減少或消失。表皮毛包括分泌型和非分泌型兩種，是由表皮細胞層分化出來的單細胞或多細胞的結構。分泌型表皮毛具有腺體，可以分泌多種化合物，如多糖、機酸、萜烯類或者鹽等。擬南芥的表皮毛是非分泌型的單細胞表皮毛，是表皮細胞分化成的三叉結構，一般認為起物理防衛的功能，表皮毛密度的增加可以減少被天敵選擇的機率M。這種以表皮毛作為物理屏障的功能是一種直接的抗蟲機制，可以避免植食性昆蟲的傷害。另外，有些植物的表皮毛可以分泌化學物質來抵禦外敵侵害，如分泌與防衛相關的酶類等等。菸草(Nicotiana repanda)表皮毛中含有去甲基尼古丁，這種生物鹼可以抗擊植食性昆蟲，比尼古丁毒性更大。研究表明，去甲基尼古丁的產生是受茉莉酸甲酯或傷誘導的，而且被誘導後積累非常迅速，在抗蟲中具有重要作用。表皮毛的分泌物含有大量的對天敵具有毒性或防禦作用的物質，可以佔到葉片乾重的17% [5]0 Wagner等2004年實驗證明，菸草表皮毛的分泌物在抗擊蚜蟲傷害起著重要的作用。表皮毛的分泌物可以流到葉片的表皮細胞上，當蚜蟲爬過時，這些分泌物就會粘附於蚜蟲身體上，從而被蚜蟲帶到植物的其他部位，啟動其他部位的抗蟲防衛反應。
以往研究證明，擬南芥表皮毛有利於真菌孢子和菌絲的吸附，無毛突變體gll 增強了對真菌侵染耐受能力。但進一步研究發現，表皮毛中可以高水平表達α-1， 3-glucanase，具有這種特性的表皮毛可以明顯提高對真菌侵染的抗性。這種特性是不依賴於水楊酸或者茉莉酸防衛信號通路，只依賴於表皮毛內表達的α -l，3-glUCanaSe[6]。表皮毛在減輕植株對重金屬的毒害也有重要作用。如擬南芥葉片表皮毛中可以積累十倍於表皮細胞的有毒金屬量，還檢測到高水平的穀胱甘肽的生物合成，表皮毛這種充當毒性分子存儲庫的功能可以降低植物中的養分值，從而防止植食性動物的襲擊[7]。另外，植物的表皮毛具有較高的反射率，能夠有效的反射大量的紫外線，減少紫外線直接照射與表皮細胞上，減輕植物所受的UV-B輻射破壞。總之，在植物的發育和防衛中，表皮毛起著非常重要的作用，而模式植物擬南芥表皮毛的發育調控機制的解析也帶動了許多其他植物如菸草表皮毛的相關研究。這些研究將能更好的闡明表皮毛髮育機制以及為抗病、高產基因工程育種提供優秀的基因資源。參考文獻[l]Traw Μ. B and Feeny P (2008). Glucosinolates and trichomes track tissue value in two sympatric mustards. Ecology 89 :763-772.[2]Kirik V, Simon M, Huelskamp M, Schiefelbein J(2004). The ENHANCER OF TRY AND CPC lgene acts redundantly with TRIPTYCH0N and CAPRICE in trichome and root hair cell patterning in Arabidopsis. Dev. Biol. 268 :506-513.[3]Walker A. R,Davison P. A,Bolognesi-ffinfield A. C, James C. M,Srinivasan N, Blundell T. L, Esch J. J, David Marks M，Gray J. C(1999). The TRANSPARENT TESTA GLABRAllocus, which regulates trichome differentiation and anthocyanin biosynthesis in Arabidopsis, encodes a WD40repeat protein. Plant Cell 11 1337-1349.[4]Agrawal A. A and Fishbein M(2006). Plant defense syndromes. Ecology 87 :S132-S149.[5] Ambrosio S. R, Oki Y, Heleno V. C, Chaves J. S, Nascimento P. G, Lichston J. E, Constantino M. G, Varanda Ε. M, Da Costa F B (2008). Constituents of glandular trichomes of Tithonia diversifolia !relationships to herbivory and antifeedant activity. Phytochemistry. 69 :2052-2060.[6]Calo L, Garcia I, Gotor C, Romero L. C(2006). Leaf hairs influence phytopathogenic fungus infection and confer an increased resistance when expressing a Trichoderma a~l,3-glucanase. J. Experimental Botany. 57 :3911-3920.[7]Davidian J. C, Grill D, De Kok L. J, Stulen I，Hawkesford M. J, Schnug E, Rennenberg H(2003) · Sulfur transport and assimilation in plants !regulation, interaction, signaling. Leiden :Backhuys Publishers,pp :91-99.

發明內容
本發明的目的是提供一種菸草表皮毛髮育相關基因NtTTG2。本發明的另一個目的是提供一種含有NtTTG2基因的重組表達載體。
本發明的又一目的是提供該基因的應用。一種含WD-40結構域的基因NtTTG2，該基因來源於普通菸草(Nicotiana tabacum)，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示的。所述的含WD-40結構域的菸草表皮毛髮育相關基因NtTTG2編碼的蛋白質，其胺基酸序列如SEQ ID NO. 2所示的。一種重組表達載體，包括所述的菸草表皮毛髮育相關基因NtTTG2和植物表達載體。所述的植物表達載體選自PBI121，PBI221或pCAMBIA1301中的一種。所述的植物表達載體選自pCAMBIA1301。所述的重組表達載體是通過將基因NtTTG2插入到載體pCAMBIA1301酶切位點Sac I/KpnI 間得到的載體 pCAMBIA1301: :NtTTG2。所述的重組表達載體是通過將基因NtTTG2插入到載體pCAMBIA1301酶切位點 Sac I/Kpnl間，並通過BamH I/Xba I酶切位點在NtTTG2後插入RFP基因得到的雙元載體 PCAMBIA1301::NtTTG2-RFP。一種轉化體，由所述的重組表達載體導入宿主細胞所得，所述的宿主細胞優選大腸桿菌細胞或農桿菌細胞。所述的菸草表皮毛髮育相關基因NtTTG2在導入植物獲得促進生長和/或增加產量的品種中的應用，優選導入菸草或小麥獲得促進生長和/或增加產量的品種中的應用。所述的含菸草表皮毛髮育相關基因NtTTG2的重組表達載體在導入植物獲得促進生長和/或增加產量的品種中的應用，優選導入菸草或小麥獲得促進生長和/或增加產量的品種中的應用。有益效果本發明提供了一種新的菸草表皮毛髮育相關基因NtTTG2，該基因來源於普通菸草，含WD-40結構域，具有促進植物生長發育及種子飽滿、種子數量的功能。利用該基因構建的重組表達載體，過量表達NtTTG2基因，將其轉入農桿菌並進一步轉化菸草，所獲得的 NtTTG2過表達植株明顯表現為促進生長及增加產量。


圖 lpCAMBIA1301: :NtTTG23-UTK-intron-NtTTG23-υτκ 和 pCAMBIA1301: :NtTTG2_RFP 載體圖譜。圖 2pCAMBIA1301 :NtTTG2_RFP 載體酶切驗證圖，A. pCAMBIAl301 NtTTG2載體酶切驗證圖。M為Marker，泳道1為載體酶切驗證圖， 用SacI和KpnI進行酶切；B. pCAMBIA1301 :NtTTG2-RFP載體酶切驗證圖。M為Marker，泳道1為用Mc I和KpnI進行酶切，泳道2為用BamH I和)(ba I進行酶切，泳道3為用Sac I和Xba I進行酶切。圖3潮黴素抗性平板篩選，A為非轉基因菸草，B和C為轉基因菸草種子。圖 4pCAMBIA1301: :NtTTG2-intron-NtTTG2 轉基因菸草基因表達檢測，A. Northern雜交檢測NtTTG2基因表達量，其中TCNC為野生型，TTG2iNCl，2，3為不同轉基因株系；B.實時螢光定量PCR檢測NtTTG2基因表達量，其中TCNC為野生型， TTG2iNCl，2，3為不同轉基因株系。圖5pCAMBIA1301: :NtTTG2-RFP轉基因菸草基因表達檢測，A. Northern雜交檢測NtTTG2基因表達量，其中TCNC為野生型，T0TNC1，2，3為不同轉基因株系；B.實時螢光定量PCR檢測NtTTG2基因表達量，其中TCNC為野生型，TOTNC 1，2，3分別為不同轉基因株系。圖 6pCAMBIA1301: :NtTTG23 UTK-intron-NtTTG23 UTK(沉默植株)生長產量表型， A.野生型(TCNC)和沉默植株(TTG2iNC4)菸草在花盆中生長45天和115天表型；B.野生型(TCNC)和沉默植株(TTG2iNC4)菸草在種植10、20、30、40和50天後生長高度測定；C.野生型(TCNC)和沉默植株(TTG2iNC4)菸草在種植10、20、30、40和50天後鮮重測定。圖7pCAMBIA1301: :NtTTG2-RFP (過表達植株)生長表型，A.野生型(TCNC)和過表達植株(T0TNC1，2，3)在生長45天後表型；B.野生型(TCNC)和過表達植株(T0TNC1,2, 3)花及角果表型；C.野生型(TCNC)和沉默植株(T0TNC1，2，3)菸草在種植10、20、30、40和 50天後鮮重測定；D.野生型(TCNC)和沉默植株(T0TNC1，2，;3)菸草角果內種子數統計。
具體實施例方式實施例1. NtTTG2基因的克隆與序列結構分析菸草(Nicotiana tabacum)品種NC89的種子直接播於裝有營養土的直徑為15cm 的花盆中，溫室O3-27°C、10h光照/14h黑暗)培養，40日齡植株用於RNA的提取。總RNA提取以普通菸草為材料，總RNA的抽提採用Trizol試劑(Invitrogen， USA)按照說明操作，用分光度計檢測其RNA含量和質量。反轉錄生成第一鏈取2μ g RNA作模板，根據!Iomega公司M-MLV反轉錄酶配套試劑使用說明，分別加入下遊引物0. 5 μ g，定容至15μ L，70°C變性5min，立即在冰上放置 5min。然後分別加入 M-MLV 5 X buffer 5 μ L，dNTP (25mM) 5 μ 1，rRNasin Ribonuclease Inhibitor 25U,M-MLV 反轉錄酶 200U，DEPC 水補足 25rtL。42°C溫育 lh，95°C 5min 滅活反轉錄酶。經過優化後，取適量的反轉錄產物用於隨後的PCR。以cDNA第一鏈作為RT-PCR模板，常規方法做PCR，擴增NtTTG2基因PCR擴增引物序列上遊引物SEQID NO. 3(5，-ACACACATAATTTCCCTTCCATTTCC-3，)下遊引物SEQID Ν0· 4(5，-AGAGACCATATAAACACAGTGCCCT-3，)，25μ L 反應體系為10XEx taq buffer 2. 5 μ L, dNTP 2. 0 μ L，Mg2+L 5 μ L，上、下遊引物各 1 μ L, Ex taq 0. 2 μ L，模板 1 μ L，ddH20 15. 8 μ L。反應程序如下為 95°C 5min， 95°C 50sec，58°C 50sec，72°C lmin,72°C IOmin0 PCR 產物 NtTTG2 基因經純化回收後，連接到 pMD 19-T Simple Vector 載體(Takara，Japan)上得到 pMD 19-T Simple: :NtTTG2 質粒，轉化大腸桿菌感受態細胞DH5 α，送上海invitrogen公司測序，序列如SEQ ID N0. 1。實施例2.雙元載體 pCAMBIA1301 NtTTG23-UTE-intron-NtTTG23-UTE 的構建根據NtTTG2基因3、不翻譯區序列(3—UTR)設計引物，擴增其編碼區部分片段 337bp，用於NtTTG2基因沉默載體的構建。上遊引物SEQID N0. 5(5' -TGTAGCGGAGTTGGAAAGGCATCAGG-3 『)
下遊引物SEQID NO. 6(5，-TCCCACCGCTGAGCAAAAGACATAC-3，)，以 pMD 19-T Simple :NtTTG2 質粒為模板，利用 SEQ ID NO. 5 和 SEQ ID NO. 6 進行PCR擴增長度為337bp的部分NtTTG23 UTK基因序列，條件如下95°C預變性5min ；95°C變性45sec、58°C復性30sec、72°C延伸30sec, 30個循環；最後72°C延伸5min。PCR產物用1 % 的瓊脂糖膠電泳，溴化乙錠(EB)染色，用Agarose Gel DNA Purification Kit(TaKaRa)對電泳條帶進行回收。將通過PCR方法獲得的337bp部分NtTTG23 UTK基因序列，用T4連接酶連接至pUCm-T載體上得到pUCm-T NtTTG23、■載體，轉化至大腸桿菌DH5 α。塗LB (含Amp 100 μ g/mL)平板，37°C培養16_20h後挑取若干克隆提取質粒，BamH I和I^st I雙酶切驗證後送公司測序。測序驗證正確後，用I3St I/BamH I和I^st I/Xho I兩種不同的雙酶切方式分別切pUCm-T: :NtTTG23 UTK載體，酶切得到兩端具有不同酶切位點的兩種NtTTG23 UTK基因片段 NtTTG23 UTK(Pst I/BamH I)和 NtTTG23 UTK(Pst I/Xho I)，以進行下一步操作。利用存在於pBSSK-in載體(Invitrogen，上海)中的內含子構建髮夾結構，該內 ^TX^i 600bp, g T Phaseolus vulgaris nitrite reductase (NIR)(JftiHT^ 花)，利用該內含子兩側的多克隆位點將已獲得的NtTTG23 UTK基因片段反向重複地連在內含子兩側。具體步驟如下將NtTTG23 UTK(Pst I/BamH I)連入用BamH I與I^st I雙酶切的 pBSSK-in ；該產物再用Nsi I與Xho I (或Sal I)雙酶切，然後將NtTTG23 UTE(Pst I和Xho I)連接其上(Pst I和Nsi I是同尾酶，可發生連接，但連接後無法切開)，即構成RNAi載體。最後用Me I/Kpn I 將整個 RNAi 片段切下，得到 NtTTG23 UTK-intron-NtTTG23 UTK(S ac I/Kpn I)，連入穿梭載體pCAMBIA1301的組成型表達啟動子35S之後的&ic I和Kpn I 酶切位點之間，構成轉化單元 PCAMBIA1301: :NtTTG23 UTK-intron-NtTTG23 UTK(圖 1)。將 pCA MBIAl3Ol NtTTG23-UTE-intron-NtTTG23-UTE 轉入到農桿菌 EHAlO5 (Invitrogen,上海)中，為
轉基因奠定基礎。實施例3.雙元載體 pCAMBIA1301 :NtTTG2_RFP 的構建提取菸草總RNA，利用RT-PCR反轉錄合成cDNA。採用上遊引物SEQ ID NO. 7 (5，-GAGCTCATGGAAAATTCAAGTCAAGAAT-3，)，下遊引物SEQ ID NO. 8(5，-GGTACCTACTTTAA GCAGTTGCAACTTGT-3，)，以菸草 cDNA 為模板，擴增 NtTTG2，在 NtTTG2 兩端引入 Sac I/Kpn I酶切位點，將擴增得到的NtTTG2基因連接到pMD 19-T SimpleVector載體(Takara, Japan)上轉入大腸桿菌DH5 α中，測序正確後，用Me Ι/Κρη I對連接有NtTTG2基因的 pMD 19-T Simple Vector載體進行雙酶切，得到測序正確的NtTTG2片段，然後將載體 PCAMBIA1301 (購自 CAMBIA 公司)也用 Sac I/Kpn I 酶切，將 NtTTG2 片段與 pCAMBIA1301 線性載體連接，NtTTG2被插入pCAMBIA1301載體中花椰菜花葉病毒35S啟動子下遊得到 PCAMBIA1301: :NtTTG2 載體。同樣原理，用 BamH I/Xba I 將 pBIlM (Invitrogen，上海)上的RFP (紅色螢光蛋白)切下，插入到用同樣的酶切pCAMBIA1301 :NtTTG2載體下遊的BamH I/Xba I酶切位點間，得到雙元載體pCAMBIA1301 :NtTTG2-RFP,並進行酶切驗證，結果見圖 2。將pCAMBIA1301: :NtTTG2-RFP轉入到農桿菌EHA105anvitrogen，上海)中，為轉基因奠定基石出。實施例4.葉盤法轉化菸草及其抗性篩選
具體步驟簡述如下1農桿菌培養1)分別從平板上挑取轉染 pCAMBIA1301: :NtTTG23 UTK-intron-NtTTG23、■載體 (NtTTG2基因沉默載體)的農桿菌EHA105單菌落以及含有pCAMBIA1301 :NtTTG2_RFP載體(NtTTG2基因過表達載體)的農桿菌EHA105單菌落，分別接種到3mL YEB液體培養基中 (Str 25 μ g/mL、Rif50 μ g/mL、Kan 80 μ g/mL)於恆溫搖床上 27°C，180rpm 搖培過夜至 OD 600 為 0. 6-0. 8。2)搖培過夜的菌液按1 100的比例，轉入新配置的含上述抗生素的YEB培養基中，在與上述相同的條件下培養Mi左右，0D600為0. 2-0. 5時即可用於轉化。2侵染於超淨工作檯上，將菌液倒入無菌的小培養皿中。取不具潮黴素(Hm)抗性的菸草無菌苗的幼嫩、健壯葉片，去主脈，將葉片剪成0. 5cmX0. 5cm的小塊，放入菌液中， 浸泡適當時間(一般5-lOmin)。取出葉片置於無菌濾紙上吸去附著的菌液。 同時設未經農桿菌侵染的葉盤作為陰性對照，以下步驟同。3共培養將侵染後的菸草葉片接種在不含任何激素和抗生素的MS基本培養基上，用封口膜封好培養皿，28°C黑暗中培養2-4d。4選擇培養將黑暗中共培養2-4d的菸草葉片轉移到帶抗性的分化培養基 (MS+1 μ g/mL 6-苄氨基嘌呤+50 μ g/mL潮黴素+500 μ g/mL羧苄青黴素)中，用封口膜封好培養皿，在光照為2，000-10, 0001uX、25j8°C、16/ i光照/光暗條件下選擇培養，結果見圖 3。5生根培養約2-3周後，待不定芽長到Icm左右時，切下不定芽並轉移到生根培養基(1/2MS+200 μ g/L ΙΑΑ+50 μ g/mL潮黴素+500 μ g/mL羧苄青黴素)上進行生根培養， 5-10d後長出不定根。根長好後，移入盆缽中培養。待菸草種子成熟後進行單株收種(Tl代，具有RR，Rr，rr型)，T1代種子繼續在Hm 抗性平板上篩選，根據孟德爾遺傳第一定律統計分析，將篩選獲得T2代純合品系，分別得到轉入 pCAMBIA1301: :NtTTG23~UTR-intron-NtTTG23~UTR 的 NtTTG2 基因沉默植株純合品系以及轉入pCAMBIA1301: :NtTTG2-RFP的NtTTG2基因過表達植株純合品系。實施例5轉基因菸草中NtTTG2基因表達檢測l.Northern 雜交，方法參考 Wu et al. 2007 :ffu X,ffu Τ, Long J, Yin Q, Zhang Y, Chen L,Liu R, Gao T and Dong H(2007). Productivity and biochemical properties of green tea in response to full-length and functional fragments of HpaG Xooc, a harpin protein from the bacterial rice leaf streak pathogen Xanthomonas oryzae pv. Oryzicola. J. Biosci. 32 :1119-1131.)1. IRNA甲醛凝膠變性電泳分別提取並純化pCAMBIA1301 :NtTTG2-intron_NtTTG2轉基因菸草以及 PCAMBIA1301: :NtTTG2-RFP轉基因菸草的RNA。去純化的RNA樣品進行甲醛變性電泳。 首先用0. lmol/L NaOH浸泡電泳槽及梳子5min，然後用0. 1 % DEPC水仔細衝洗；在滅菌印pendorf管中建立變性反應；然後，55 °C水浴60min，冰水中放置IOmin，離心；加入2 μ 110 X甲醛凝膠加樣緩衝液並將印pendorf管重新放置於冰上；製備1 OOmL含有 2. 2mol/L甲醛的1.5%瓊脂糖凝膠。加1. 5g瓊脂糖到72mL滅菌水中，加熱溶解瓊脂糖，在冷卻至55°C的溶液中同時加入IOmL 10XMOPS電泳緩衝液和18mL去離子甲醛，並在通風櫥內灌制凝膠(0. 5%的凝膠可以用來分離0. 5-8Kb的RNA，若要分離更大的RNA，則使用 1. 0% -1. 2%的瓊脂糖凝膠)；將瓊脂糖/甲醛凝膠裝入水平電泳槽中，加入足夠1XM0PS 電泳緩衝液覆蓋凝膠約1mm，預電泳5min(5V/Cm)；凝膠浸入1XM0PS電泳緩衝液中，4-5V/ cm電壓下進行電泳，直到溴酚藍移出約8cm(電泳過程中，由於電泳緩衝液的pH值會發生變化，導致在較高電壓下，條帶會模糊不清。電泳過程中可以使用蠕動泵將兩極緩衝液循環， 每電泳Ih換一次緩衝液。)；電泳結束後將膠塊置於凝膠成相系統中，觀察RNA的完整性， 記錄18S、28S條帶離加樣孔的距離，並在DEPC水中衝洗。
權利要求
1.一種含WD-40結構域的菸草表皮毛髮育相關基因NtTTG2，其特徵在於該基因來源於普通菸草(Nicotiana tabacum)，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示的。
2.權利要求1所述的含WD-40結構域的菸草表皮毛髮育相關基因NtTTG2編碼的蛋白質，其特徵在於胺基酸序列如SEQ ID NO. 2所示的。
3.一種重組表達載體，其特徵在於包括權利要求1所述的基因NtTTG2和植物表達載體。
4.根據權利要求3所述的重組表達載體，其特徵在於所述的植物表達載體選自 PBI121, PBI221 或 pCAMBIA1301 中的一種，優選 pCAMBIA1301。
5.根據權利要求4所述的重組表達載體，其特徵在於所述的重組表達載體的啟動子為組成型啟動子，優選花椰菜花葉病毒35S啟動子。。
6.根據權利要求4所述的重組表達載體，其特徵在於所述的重組表達載體是通過將NtTTG2基因插入到載體pCAMBIA1301酶切位點Mc I/Kpn I間得到的載體 PCAMBIA1301::NtTTG20
7.根據權利要求4所述的重組表達載體，其特徵在於所述的重組表達載體是通過將 NtTTG2基因插入到載體pCAMBIA1301酶切位點Me I/Kpn I間，並通過BamH I Xba I酶切位點在NtTTG2後插入RFP基因得到的雙元載體pCAMBIA1301 :NtTTG2_RFP。
8.一種轉化體，其特徵在於由權利要求3所述的重組表達載體導入宿主細胞所得，所述的宿主細胞優選大腸桿菌細胞或農桿菌細胞。
9.權利要求1所述的菸草表皮毛髮育相關基因NtTTG2在導入植物獲得促進生長和/ 或增加產量的品種中的應用，優選導入菸草或小麥獲得促進生長和/或增加產量的品種中的應用。
10.權利要求3所述的重組表達載體在導入植物獲得促進生長和/或增加產量的品種中的應用，優選導入菸草或小麥獲得促進生長和/或增加產量的品種中的應用。
全文摘要
本發明屬於分子生物學領域，涉及一種菸草表皮毛髮育相關基因NtTTG2及其重組表達載體和應用。該基因來源於普通菸草，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，其編碼的產物胺基酸序列為SEQ ID NO.2。本發明還提供一種重組表達載體，包括本發明所述的基因NtTTG2。該基因在促進植物生長發育及種子飽滿、種子數量方面有重要作用，是一種理想促生及增加產量的基因，可在導入植物獲得促進生長和/或增加產量的品種中應用，優選導入菸草或小麥獲得促進生長和/或增加產量的品種中應用。
文檔編號C12N15/82GK102304522SQ20111026467
公開日2012年1月4日 申請日期2011年9月8日 優先權日2011年9月8日
發明者崔潤芝, 徐衡, 李寶燕, 董漢松, 蔡洪生 申請人:南京農業大學