反義miRNA－210的用途的製作方法
2023-10-19 23:37:52 4
專利名稱：反義miRNA－210的用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種RNA小分子的用途，尤其是涉及反義miRNA-210的應用，屬於生物醫學材料技術領域。
背景技術：
近幾年來，從植物、線蟲到人的細胞中廣泛存在一種非編碼的單鏈RNA小分子(microRNA，miRNA)，它們能以不完全互補的方式與其靶mRNA的3』非翻譯端特定區域相互作用，抑制蛋白質的合成。1993年Lee等採用經典克隆方法在線蟲中首次克隆了lin-4基因，通過點突變的方法證實小分子RNA的存在。2000年Reinhart等在人和果蠅中發現了let-7基因的存在，於是推測這類小分子可能是一類進化上保守，在生命過程中起重要作用的調節分子。隨後人們在植物、線蟲、果蠅和哺乳動物中已發現了一千多個miRNA基因。小RNA的研究給我們帶來重要的啟迪是基因組非組蛋白編碼區蘊含著重要的生命功能活動信息。現有研究表明生命的一些重要活動如幼蟲的生長發育、細胞的發生和分化、神經系統的分化等都被一些非蛋白編碼小RNA的調控；而除miRNA、siRNA以外的小RNA我們更是知之甚少。長期以來，有關基因的研究重點都在蛋白編碼基因上，而小RNA的發現和研究對揭示基因的表達調控機制，讓我們更為深入的了解生命之奧秘無疑具有重大的科學價值。
據統計，miRNA在人類基因組中約佔1％的數量，在不同的時空發育階段表達量存在顯著差異。Bartel等(Ambros V，Bartel B，Bartel DP，Burge CB，Carrington JC，Chen X，Dreyfuss G，Eddy SR，Griffiths-Jones S，Marshall M，Matzke M，Ruvkun G，Tuschl T.)提出，由於miRNA與靶mRNA互補程度不同，起著切割或微弱抑制作用。由於其作用靶點的多寡，miRNA表達量亦不同，通過基因晶片技術，可以同時檢測所有miRNA時空表達的狀況。在此基礎上，尋找miRNA靶基因，揭示其作用機制是目前研究的重點，也是後基因組時代需要解決的問題之一。全部miRNA基因功能的揭示可能會給人們對生命現象的理解帶來一場深刻的革命。
近幾年有關miRNA在機體生長發育和腫瘤發生發展過程中的作用研究已積累了大量的資料。研究表明，miRNA在細胞生長和調亡，血細胞分化，神經元的極性，胰島素分泌，大腦形態形成，心臟發生，胚胎後期發育等過程中發揮重大作用。而miRNA突變或者異位表達又與多種人類癌症相關，具有腫瘤抑制基因或者癌基因的作用。一個起腫瘤抑制基因作用的miRNA表達下降或者缺失會導致腫瘤形成。成熟miRNA水平下降導致不適當的靶蛋白的表達可能導致細胞過度增殖、侵入、凋亡的減少、不能正常分化或去分化，引起腫瘤的形成。具有癌基因功能的miRNA的過表達也將導致腫瘤的形成，如miRNA-21在膠質母細胞瘤中表達增加表達量比正常組織高5-100倍，miRNA-155前體，miRNA-15，miRNA-16在惡性淋巴瘤中亦異常表達。
腦膠質瘤源自神經上皮，也稱膠質細胞瘤，佔顱腦腫瘤的40-50％，是最常見的顱內惡性腫瘤。膠質瘤最主要的生物學特性是腦組織的終位性增殖和不斷增殖，根據病理又可分為星形細胞瘤、髓母細胞瘤、多形膠母細胞瘤、室管膜瘤、少枝膠母細胞瘤等。目前，腦腫瘤的流行病學和病因學尚不完全清楚，但有證據表明膠質瘤的形成可能與一定的內環境改變和基因變異有關，是一個多因素、多步驟的多種癌基因和/或抑癌基因參與的協同積累過程。發病男性多於女性，大多在20-50歲發病，以30-40歲多見，10歲左右兒童為另一高發期。膠質細胞瘤的生長特點為浸潤性生長，與正常腦組織無明顯界限，多數不限於一個腦葉，向腦組織外呈指狀深入破壞腦組織，偏良性者生長緩慢，病程較長，自出現症狀至就診時間平均兩年，惡性者瘤體生長快，病程短，自出現症狀到就診時多數在3個月之內，70-80％多在半年之內。Chan等(Chan JA，Krichevsky AM and Kosik KS.MicroRNA-21 Is anAntiapoptotic Factor in Human Glioblastoma Cells.Cancer Res 2005；656029-6033)的研究顯示，膠質母細胞瘤強烈表達miRNA-21。與非腫瘤胚胎、成人腦組織以及培養的非腫瘤細胞相比，miRNA-21在人類膠質母細胞瘤組織以及六個膠質細胞瘤細胞系(A172，U87，U373，LN229，LN428以及LN308)的表達顯著升高。研究表明miRNA-2 1在培養的膠質母細胞瘤細胞系的抑制性表達導致了caspases的激活，進而凋亡性細胞死亡增加。這些結果顯示，通過抑制關鍵的與凋亡相關的基因表達，異常表達的miRNA-21可能與導致惡性腫瘤表型有關。Ciafre(Ciafre SA，Galardi etal，Extensive modulation of a set of microRNAs in primary glioblastoma，BBRC，2005，1351-1358)等採用miRNA晶片(含245個人和鼠miRNA探針)對9例膠質母細胞瘤和10種膠質母細胞瘤細胞株進行分析表明miRNA-221在膠質母細胞瘤中顯著上調，而一組腦中富有的miRNAs，如miRNA-128，miRNA-181a，miRNA-181b，miRNA-181c則在膠質母細胞瘤中表達量顯著下調。
由於miRNA序列在不同的生物中具有一定的保守性，目前普遍認為miRNA的功能是參與生命的一些基本過程，如發育過程中的細胞增殖、細胞死亡、應激反應和脂肪代謝等。腫瘤是一種遺傳物質改變導致的惡性疾病，它嚴重地威脅人類的健康。為了研究參與腫瘤的miRNA分子，首先就要確定miRNA究竟在那些腫瘤細胞或組織中表達及其表達水平。在此基礎上進一步揭示異常表達的miRNA在腫瘤細胞中所起的生物學功能。但是到目前為止還沒有文獻報導關於反義miRNA-210作為製備治療人腦膠質瘤細胞株侵襲的藥物的用途。
發明內容
本發明的目的在於通過miRNA晶片技術提供反義miRNA-210的新用途。
本發明提供反義miRNA-210作為製備治療人腦膠質瘤細胞株侵襲的藥物的用途。
雖然miRNA在膠質母細胞瘤中的表達研究已有報導，但本發明所採用的miRNA晶片整合了476個人和鼠的miRNA探針，遠比2005年Ciafre等採用的254個miRNA晶片數量多。本發明採用同樣的方法對大量恆河猴腦組織及人神經幹細胞進行對照研究，有助於探尋年齡相關表達miRNA基因在腦腫瘤發生發展過程中的特點與規律，為蛋白組學研究提供更為深層次的研究資料。本發明採用miRNA晶片研究了三例腦膠質瘤miRNA表達情況，並用Northern和q-PCR等方法對晶片結果對9例腦膠質瘤樣品和四株腦膠質瘤細胞進行驗證。本發明還從Ambion公司購買有人正常腦RNA(成人腦總RNA混合樣品)作為對照。本發明研究結果表明，miRNA-210不僅在腦膠質瘤中高表達，也在人神經幹細胞中高表達。為了驗證晶片檢測結果，本發明採用Northern和q-PCR方法對上述結果進行了驗證。本發明在Northern分析的基礎上，採用q-PCR方法進一步確證miRNA-210在人腦膠質瘤組織細胞中呈高表達。其次探討了是否miRNA-210像miRNA-21一樣具有促進人腦膠質瘤細胞凋亡的作用，遺憾的是該項研究結果顯示，反義miRNA-210在這方面的作用不顯著。再次，本發明採用Invasion Assay kit(細胞侵襲檢測試劑盒)對U251和TJ905兩種細胞系進行試驗，結果發現反義miRNA-210能顯著降低人腦膠質瘤細胞株的侵襲能力。轉染後各組細胞的miRNA定量PCR和Northern驗證。在此基礎上，本發明採用傳統的wound assay，進一步驗證了反義miRNA-210具有顯著降低人腦膠質瘤細胞侵襲的作用。
圖1.miRNA晶片雜交2.miRNA晶片分析聚類結果。A顯示miRNA聚類總體情況。B顯示在腦膠質瘤中顯著高表達的miRNA。C顯示在腦膠質瘤中顯著下調的miRNA。
圖3.採用Northern和miRNA定量PCR方法檢測miR-210在腦膠質瘤中的表達情況。定量PCR發現miR-210的拷貝數在腦膠質瘤中(glioma樣品1-3)較正常對照組(NHB1-3)顯著增高(A)。與癌旁組織的平均值比較，miR-210在腦膠質瘤中的拷貝數增高2.00±0.10倍，表達顯著上調(B)。對更多的glioma樣品及癌旁組織進行Northern分析結果進一步確認晶片結果的可靠性(C)。
圖4.細胞侵襲實驗表明反義miRNA-210能顯著降低人腦膠質瘤細胞株的侵襲能力。與正常對照組(U251NC和TJ905NC)及鹼基錯配序列組(U251SC和TJ905SC)比較，反義miRNA-210能顯著抑制腦膠質瘤細胞的侵襲作用(A)。定量PCR和Northern檢定細胞轉染合成的miRNA核苷酸結果。
具體實施例方式
1.RNA抽提每100mg組織加入1ml Trizol，用液氮研磨充分研碎組織塊。加入約1/5體積的氯仿，上下顛倒充分混勻1分鐘左右，室溫下靜置5分鐘。4℃，12,000rpm離心15分鐘後小心轉移上清液入新的1.5ml離心管，加入等體積的異丙醇，輕輕顛倒混勻，室溫靜置10分鐘。4℃，12000rpm離心10分鐘後，去上清，向沉澱中加入2/5體積的70％乙醇，4℃，12000rpm離心洗滌沉澱5分鐘。去上清，將沉澱室溫晾乾後加入適量無RNA酶的水充分溶解，測定OD260和OD280值。採用無RNA酶的DNA酶I處理，QIAGEN RNeasy試劑盒純化總RNA，詳細操作原理和方法見試劑盒說明書。瓊脂糖膠電泳評價總RNA質量，在凝膠成像儀上觀測、拍照，保存圖像，一般認為28S∶18S≥2可以初步判定總RNA質量較好。
2.MicroRNA晶片的製備首先從miRNA信息登錄網站http://microrna.sanger.ac.uk(2005.09)上獲取製備miRNA探針的序列，其中包括313條人的及34條小鼠的miRNA序列對應的探針序列。同時，我們也將XIE發表在2005年Nature上的文章(Xie X，Lu J，Kulbokas EJ，et al.Systematic discovery of regulatory motifs in humanpromoters and 3 UTRs by comparison of several mammals[J].Nature，2005，434(7031)338)中所提及的122條預測中的miRNA對應的探針也整合到其中，最終在我們的miRNA晶片上集中了469種不同的miRNA對應的探針。為了實現對晶片實驗過程的質量控制，本發明在晶片上設置了陰性及陽性對照。陰性對照我們設計了兩種，一種是空白點樣液體；另外一種就是沒有摻入Y2對應的RNA，因此Y2就是一個最合適的陰性對照。陰性對照預期的雜交信號是很弱的，它們的信號值不足以進入到後續的數據分析當中。陽性對照分為三種(1)固定化陽性對照5』-GTCACATGCGATGGATCGAGCTCCTTTATCATC-3』。在晶片實驗最後檢測雜交結果時，此序列應該在cy3的激發波長下有較強的螢光信號，掃描信號值在8000以上，表明晶片上的核酸固定是沒有問題的。
(2)雜交的陽性對照我們選擇了組織內源的，RNA鹼基長度在100nt左右的U6和tRNA作為miRNA晶片的內源陽性對照；U6對應的探針序列是5』-ATTTGCGTGTCATCCTTGCG-3』；tRNA對應的探針序列是5』-GGGTTATGGGCCCAGCACGCTTCCGCTGCGCCACTCTGCT-3』；它們的雜交信號也應該是比較高的，一般都超過5000信號值。
(3)晶片系統的陽性對照為了避免受到實驗RNA樣品的幹擾，在晶片上還點有與實驗樣品沒有關係的核酸序列，以檢查晶片系統的有效性。本發明把這種對照稱為外標(exogenous controls)。在miRNA晶片上，本發明設計了8條與所有的RNA序列不具同源性的寡核苷酸序列作為外標，名字和序列見下表。經過blast比較，這8個核酸序列和人的全部基因序列沒有同源性。本發明用Ambion公司的miRNA Probe Construction kit(Cat#.1550)合成了此8條探針對應的長度類似miRNA的RNA序列(20-30nt)，然後在反應的時候摻入到實際檢測的RNA樣品中去，一同進行晶片反應實驗。根據摻入RNA量的不同，這些外標點可以呈現不同的雜交信號；除了Y2以外，一般信號值都在5000以上。晶片系統的陽性對照見表1。
表1.晶片系統的陽性對照
3.miRNA晶片檢測用於miRNA晶片檢測的RNA樣品製備先使用Trizol抽提方法得到總RNA，再使用Ambion公司的mirVana miRNA isolation kit(catalog#1560)試劑盒對樣品進行純化，去除佔總RNA主要成分的較大片段，留下包括miRNA在內的小片段部分。具體純化步驟詳見試劑盒使用手冊。miRNA晶片檢測按常規方法進行。
4.生物信息學分析由於microRNA也是通過基因晶片的手段進行研究，所以將兩者並列說明。首先，採用的晶片是Affymetrix U133 Plus 2.0array，這種晶片是目前同類產品中覆蓋基因數目最多的一種在一張晶片上，覆蓋了47,000個轉錄本，代表38,500個明晰的人類基因，來自下列公共資料庫GenBank，dbEST，and RefSeq.其中的6,500個更新的基因來自最新的資料庫Build 159 of the UniGene database(2003年1月25日)。U133主要適用於研究基因的表達情況並了解基因發揮功能的網絡。包括1)基因表達的組織特異性和細胞特異性；2)誘導基因表達譜研究；3)基因表達分化和4)腫瘤表達譜研究。在基因晶片的結果中，採用T-Test的方法來檢驗數據間的顯著性差異以求得其可信度，而用不同年齡階段的數據兩兩相比的方法來求得某些蛋白質的表達是否具有年齡特異性，使用cluster3.0程序來進行聚類分析。
5.Northern blotting分析使用Trizol抽提培養細胞或組織的總RNA，定量並質檢。取30-50ug總RNA進行變性聚丙烯醯胺凝膠電泳，凝膠濃度為15％。電泳結束後進行電轉膜，將樣品轉至帶正電荷的尼龍膜上。將所要檢測的miRNA對應的探針用同位素進行末端標記，並在適宜條件下與膜進行雜交。雜交完成後進行壓片掃描。再以U6基因的探針與膜進行雜交，得到U6的雜交信號，並以此作為上樣量的衡量標準。最後使用成像系統讀出雜交信號的強度，比較各組不同的樣品間的差異。
6.qPCR檢測方法miRNA的qPCR檢測使用invitrogen的Trizol抽提總RNA，定量並質檢。取50-100ng總RNA為模板，使用針對特定miRNA的逆轉錄引物及invitrogen的SuperScriptIII First-Strand Synthesis System試劑盒合成cDNA。以cDNA為模板，使用針對目標miRNA的PCR引物及Takara的SYBR(R)Premix Ex TaqTM螢光定量PCR體系，在stratagen MX3000P定量PCR儀上進行擴增，並測得樣品的Ct值。將所得Ct值通過代入測定標準曲線得出的公式，採用絕對定量的計算方法得出樣品中的目標miRNA的含量。U6基因作為內照對miRNA qPCR檢測結果進行標準化校正。對於預測中的目標基因的qPCR檢測使用invitrogen的Trizol抽提總RNA，定量並質檢。取3ug總RNA為模板，以隨機寡核苷酸為引物，使用invitrogen的SuperScriptIII First-Strand Synthesis System試劑盒合成cDNA。以cDNA為模板，使用針對目標基因的特異引物及Takara的SYBR(R)Premix Ex TaqTM螢光定量PCR體系，在stratagen MX3000P定量PCR儀上進行擴增，並測得樣品的Ct值。同時測定待測樣品中的看家基因(如B-actin、GAPDH)的Ct值，以此來校正各組樣品之間上樣量差別，將所得數據標準化後進行比較各組之間目的基因的變化(即相對定量法)。
7.細胞培養惡性膠質瘤細胞TJ905(由天津醫科大學總醫院神經外科饋贈)培養在含10％FBS(蘭州民海)的高糖DMEM培養基中，人膠質母細胞瘤U251MG(購自上海中科院細胞庫)培養在含10％FBS(蘭州民海)的RPMI1640培養基中，置37℃培養箱、5％CO2，2天傳代一次。人膠質母細胞瘤SHG-44(購自上海中科院細胞庫)培養在含10％FBS(蘭州民海)的RPMI1640培養基中，置37℃培養箱、5％CO2，2天傳代一次。人神經母細胞瘤SH-SY5Y(ATCC號購自上海中科院細胞庫)培養在含15％FBS(蘭州民海)的MEM-F12培養基中，置37℃培養箱、5％CO2，3-4天傳代一次。
8.細胞轉染甲氧基寡核苷酸由上海吉瑪公司化學合成，microRNA前體購自美國Ambion公司(Ambion Pre-mirTMmiRNA precursor CaU No.17100)，轉染共設正常對照組，miRNA前體組，miRNA反義鏈組(anti sense)，miRNA鹼基錯配序列組(scramble)和miRNA通用陰性對照組(EGFP)。細胞於鋪板18-24h後至70％-80％融合開始轉染，所用試劑為Lipofectamine 2000(Invitrogen)。轉染按本室常規方法並參照說明書進行。寡核苷酸的工作濃度均為50nmol/L。DDR1 siRNA組和siRNA通用陰性對照組(Negative)。細胞於鋪板18-24h後至70％-80％融合開始轉染，所用試劑為Lipofectamine 2000(Invitrogen).具體轉染方法參照說明書進行，寡核苷酸及siRNA的工作濃度均為50nmol/L。細胞轉染所用的核苷酸序列見表2。
表2.細胞轉染所用核苷酸序列表
9.細胞遷移實驗取無菌12孔板，惡性膠質瘤細胞TJ905培養在含10％FBS的高糖DMEM培養基中，人膠質母細胞瘤U251MG培養在含10％FBS的RPMI1640培養基中，置37℃培養箱、5％CO2，2天傳代一次。轉染miRNA 24h後，用200ul吸頭劃出兩條十字交叉細胞刮除帶。轉染miRNA 48h後開始觀察記錄實驗結果。
10.細胞侵襲實驗實驗所用試劑盒為QCMTMCollagen Cell Invasion Assay kit(Chemicon Cat.#ECM551)。轉染前一天接種細胞於6孔板培養至80％匯合，轉染後將細胞在無血清培養基中飢餓18-24小時。用0.25％胰酶消化細胞並用含5％BSA的DMEM終止反應。細胞離心後重懸於含5％BSA的DMEM中(0.5×106 cells/mL)。將250ul細胞懸液加入Boyden小室的上室中，下室加入500ul含10％FBS的DMEM，37C培養箱5％CO2培養。48h後將小室浸入400ul細胞染液中染色20min並漂洗，用棉籤擦去微孔膜上層的細胞，之後將膜剪下於200倍顯微鏡下成像。將聚碳酸酯微孔濾膜浸入染料提取液中反應10min，100ul細胞染液轉入酶標板在560nm處讀取吸光值。
11.Caspase-3/7酶活性檢測將細胞接種於96孔板中，培養，進行轉染實驗，培養48小時。採用Apo-ONETMHomogeneous Caspase-3/7kit(Promega Cat No.G7790)試劑盒，按說明書操作。將caspase底物和Apo-ONETMcaspase3/7 buffer混合，配成Apo-ONETM試劑。按Apo-ONETM試劑和培養基體積比為1∶1的比例加入Apo-ONETM試劑，300rpm-500rpm搖至少30秒，使Apo-ONETM試劑和培養基充分混勻。使用螢光分光光度計在激發波長485±20nm和發射波長530±25nm條件下讀取OD值。Caspase3酶活性檢測也可利用化學發光法(Calbiochem，Cat No.235400)的活性。細胞計數，收集培養細胞，PBS洗兩遍。加適量裂解緩衝液，液氮/37℃反覆凍融三次，每次5分鐘。10,000xg，4℃離心10分鐘。吸取上清備用。準備caspase3底物溶液(2mM，Calbiochem，Cat No.235400))，caspase3抑制劑溶液(500nM)，按照如下表格的量向96孔板中加入樣品，按說明書操作。、37℃預熱酶標板，加入細胞裂解液和caspase3抑制劑，置於37℃孵育10分鐘。加入10ul caspase3底物開始反應，0.5-2小時後在405nm下測OD值。
12.蛋白質印跡分析在樣品中加入裂解液，置於液氮中反覆凍融數次後，再超聲徹底破碎樣品，離心分離出蛋白質，對取得的蛋白樣品進行定量。在蛋白樣品中加入上樣緩衝液，煮沸3-5分鐘後，進行SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳，恆流20mA。待前沿指示劑恰好跑出凝膠後，停止電泳，進行轉膜。將樣品轉至膜上後，再與所要研究的蛋白的單抗共同孵育，最終進行顯色，得到印跡信號。同時以beta-actin為參照，對信號進行標準化校正，之後在成像系統中讀出信號密度，進行進一步的分析。
本發明發現miRNA-210的過度表達顯著。在晶片分析的基礎上，採用Northern，q-PCR方法進一步確證miRNA-210在人腦膠質瘤組織細胞中呈高表達。本發明採用Invasion Assay kit(細胞侵襲檢測試劑盒)對U251和TJ905兩種細胞系進行試驗，結果發現反義miRNA-210能顯著降低人腦膠質瘤細胞株的侵襲能力。採用woundassay，進一步驗證了反義miRNA-210具有顯著降低人腦膠質瘤細胞侵襲的作用。侵襲性和轉移性是癌細胞最主要的生物學特性，也是惡性腫瘤的重要標誌。上述實驗結果證明miRNA-210可作為一種癌基因促進人腦膠質瘤細胞的侵襲作用。
權利要求
1.反義miRNA-210作為製備治療人腦膠質瘤細胞株侵襲的藥物的用途。
全文摘要
本發明涉及一種RNA小分子的用途，尤其是涉及反義miRNA－210的應用，屬於生物醫學材料技術領域。本發明採用miRNA晶片研究了三例腦膠質瘤miRNA表達情況，並用Northern和q－PCR等方法對晶片結果對9例腦膠質瘤樣品和四株腦膠質瘤細胞進行驗證，結果發現反義miRNA－210能顯著降低人腦膠質瘤細胞株的侵襲能力。
文檔編號A61P35/00GK101091798SQ20071003954
公開日2007年12月26日 申請日期2007年4月17日 優先權日2007年4月17日
發明者賴立輝, 陳小娜, 戚豔婷, 李丹, 張智, 趙喻, 陳琳, 呂豔 申請人:華東師範大學, 博奧生物有限公司