含氮基團的轉化方法

2023-10-19 14:41:17

專利名稱：含氮基團的轉化方法
本案系96198605.0號申請的分案申請，原發明名稱「定向細胞毒性蒽環型類似物」，PCT國際申請號PCT/EP96/05029，國際申請日1996年11月14日，進入中國國家階段日1998年5月26日。
本發明部分得到政府支助而完成。政府對本申請中有一定的權利。
本發明屬於靶向抗癌蒽環型(omthracycline)衍生物化學領域。更具體地說，它涉及與肽激素，如LH-RH、鈴蟾肽和促生長素抑制素類似物共價連接的阿黴素(DOX)或其道諾糖胺(daunosamine)修飾的衍生物(DM-DOX)。這些共價結合物定向於具有肽激素類似物受體的各種腫瘤。
在Schally、Janaky和Bajusz的於1995年9月6授權公開的EP0450461B1中揭示了在第六位上具有細胞毒部分的LH-RH類似物。
在Nett和Glode的於1990年9月7日公開的WO 90/09799中描述了用於損傷促性腺激素的GnRH(LH-RH)類似物。該申請描述了用於損傷促性腺激素的與LH-RH類似物相連的毒素，如蓖麻毒蛋白，並且因而治療依賴於性激素的癌症。在沒有說明連接化學的情況下也提到了LH-RH阿黴素衍生物。
在Schally等於1990年4月6日提出的美國專利申請和於1993年7月15日再次提出的系列申請08/076,846中描述了細胞毒性促生長素抑制素類似物。
A.V.Schally在《抗癌藥物》(Anti-Cancer Drugs)5，115-130(1994)的綜述中詳細說明了許多種腫癌的細胞膜上的LH-RH、鈴蟾肽或促生長素抑制素類似物的受體的存在。
G.Weckbecker在他在《Farmac.Ther.》60，245-264(1993)中的綜述中列出了一些表明在一些正常和腫癌組織中促生長素抑制素類似物的受體和受體亞型存在的依據。
在N.Bunnett《腸肽生物化學和生理學》423-445(1994)編者J.Walsh和G.J.Dockray，Raven Press，紐約和E.Spindell在《激素研究的最新進展》48，(1993)(Academic Press)的綜述中討論了鈴蟾肽樣肽和在各種正常和腫癌組織中鈴蟾肽/GRP受體的存在。
阿黴素(DOX)是目前使用最廣且非常有效的抗癌劑。然而，一些腫瘤根本不對它發生反應，且它的應用還受多重抗藥性(MDR)和心臟毒性以及嗜中性細胞減少症的限制，這是由於慢性治療的結果。為了克服這些缺陷並進一步開發蒽環型抗生素結構中存在的巨大的殺腫瘤潛力，已描述了數千種合成衍生物，包括它們與各種載體大分子相連的靶向類似物。
DOX和其類似物的大部分情況描述在《阿黴素》中，David W.Henry，ACS Symposium Series，NO.30，《腫瘤化學治療》，美國化學協會，pp.15-57(1976)和《阿黴素》，Federico Arcamone，AcademicPress(1981)中。
Mosber等美國專利4,464,529(1984年8月7日)中描述了具有抗腫瘤活性的具有高度活性、烷基化、非交叉抗性的3′-脫氨基-3′-(3″-氰基-4″-嗎啉基)-DOX和其衍生物。在《藥物化學雜誌》1984，27，638-645中還描述了這些「高度有效的嗎啉基蒽環型」的合成和生物學評價。
在Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88卷，pp.4845-4849，1991年6月中，Gao等描述了通過道諾紅菌素衍生物的DNA序列的甲醛介導的烷基化作用。
在《藥物化學雜誌》35，3208-3214(1992)中描述了具有潛在烷基化取代基的蒽環型類似物。
在1989年12月12日由Pharmacia Carlo Erba提出的歐洲專利434960中描述了用於DOX的道諾糖胺氮烷基化的α，ω-二碘化合物的應用及新的嗎啉基DOX衍生物的形成。
在Israel等的美國專利4,299,822(1981年11月10日)中N-三氟乙醯基阿黴素-14O-半戊二酸酯和-半己二酸酯被公開，作為具有改善水溶性的N-三氟乙醯基阿黴素-14O-戊酸酯(AD-32)的類似物。
Horton和Priebe(抗生素雜誌，XXXVI，1211-1215)描述了一些與14-OH母體類似物相比，在抗癌活性上沒有很大變化的不同蒽環型類似物的14-O-酯。
在設計靶向化學治療劑技術中，尋求下面的目標1.載體分子和化學治療劑之間穩定的連接，直至達到靶。
2.在結合物中載體分子保留生物特性，例如保留結合特性。
3.在結合物中化學治療劑保留藥物學活性，例如保留細胞毒活性。
4.作為結合的結果，產生相對於未結合部分更強活性和/或較低外周毒性的類似物。
在Sela等的美國專利4,263,279(1981年4月21日)中描述了通過道諾糖胺部分的NaIO4氧化作用及隨後的包括載體分子的伯胺的還原性烷基化而進行的DOX的結合作用。
如在《生物化學生物物理研究通訊》1981，102，1048-1054中所描述的，順烏頭酸間隔區被用來藉助於pH敏感鍵將道諾糖胺的氮與大分子載體相連。
Zunino等(1981)《Tumori》67，521-524和《歐洲癌症臨床研究》20，421-425中描述了14-溴道諾紅菌素和蛋白或多聚-L-胺基酸之間酯鍵和C-N連接的形成。
如《生物結合物化學》1990 1(5)，325-330所描述的，嗎啉代-DOX(高活性的DOX的道諾糖胺修飾類似物)藉助於可水解(溶菌體(lysosomotrop)，pH敏感)腙連接與抗體結合，涉及細胞毒試劑的C-13氧代官能團。
如《Proc.Natl.Acad.Sci.USA》1982 79，626-629中所描述，亮氨酸殘基的羧醯胺鍵對酶降解的敏感性被成功地用於包含「間隔臂」肽的DOX結合物中，該「間隔臂」肽優選Ala-Leu-Ala-Leu，其中羧基末端Leu醯化DOX中的道諾糖胺的氮，氨基末端Ala通過二羧酸間隔區與載體相連。
如《Proc.Natl.Acad.Sci.USA》1992 89，927-976所描述的，DOX的道諾糖胺氮通過戊二酸間隔區被醯化，並伴隨著嚴重的細胞毒活性的喪失而與LH-RH類似物相連。
與根據本發明的化合物在治療各種人類腫瘤中的應用相關的其它參考文獻1.Schally等(1996)，用GnRH類似物治療矛盾和前景，編者，Filicori，M.和Flamigni，C.(Parthenon，Carnforth，U.K.)pp.33-44。
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所有提到的引用文獻被本文引作參考。
本發明化合物為新的靶向細胞毒性肽激素，其包含與肽激素，如LH-RH、鈴蟾肽和促生長素抑制素類似物結合的蒽環型細胞毒性劑，如DOX或DM-DOX。這些細胞毒肽激素結合物被設計用來治療具有結合物特異性受體的腫瘤，如乳腺癌，卵巢症，子宮癌，前列腺癌，胰腺癌，結腸癌，胃癌和肺癌。本文使用的一些這種(未結合)蒽環型細胞毒性劑本質上是新的，並且是高效的，然而對於它們被以未結合物形式使用時，它們的毒性水平太高。
在尋找新的高活性的非交叉抗性的適宜於與肽載體形成共價結合物的DOX類似物中開發出了本發明提出的道諾糖胺修飾的DOX類似物。
通過使用二羧酸間隔區如戊二酸實現了穩定的以共價連接的其組成成員生物活性充分保留的結合物的形成。間隔區的一個羧基與DOX或DM-DOX的14-OH基形成一個酯鍵，間隔區的另一個羧基與肽載體的精心選擇的游離氨基形成一個羧醯胺鍵。
本發明化合物用下面通式表示Q14-O-R-P(I)其中Q為通式 Q14表示在14位上具有側鏈的Q殘基，R為H或-C(O)-(CH2)n-C(O)-和n＝0-7，R′為NH2或芳香、飽和或部分飽和的5或6元雜環化合物，其具有至少一個環氮原子，並任選具有與所述環的相鄰碳原子結合以形成二環體系的丁二烯殘基，P為H或肽部分，適宜地為LHRH、鈴蟾肽或促生長素抑制素類似物，但不排除其它生理活性肽。特別希望的是對腫瘤細胞受體具有親和性的LHRH類似物，尤其是在6位具有D-Lys殘基的那些類似物，以及縮短的促生長素抑制素和鈴蟾肽類似物。然而當R′為NH2時，R和P不為H。當R和P為H時，那麼R′不為NH2。
在本工作的過程中發現了一種新的合成反應。不僅發現阿黴素及其衍生物可藉助於二羧酸殘基在14位上偶聯以產生新的藥物學有效的結合物，而且提供了一種新的途徑來從相鄰和分離，即α，β-或α，γ-羥基伯胺形成部分飽和的雜環殘基。本發明特殊的應用在於在糖諾糖胺糖上形成2″-吡咯啉基和1″，3″-四氫吡啶基。然而，此反應還具有更廣的應用。當相鄰或分離的羥基胺與滷素取代的醛反應時，可形成5和6元部分飽和的雜環殘基，其中滷素取代的醛在醛碳和具有滷素基團的碳原子之間具有2或3個殘基。這些殘基可均為亞甲基，或可包括雜原子如氧。此反應在三個階段發生。合適地在極性惰性無水有機溶劑中，非常大量過量的滷代醛與羥基胺的酸加成鹽反應，由此通過醛基與羥基和氨基縮合形成了五元噁唑烷環(或六元1，3-四氫噁嗪環)。將該產物與有機鹼反應，適宜地為叔胺，其中在前面滷代醛的滷素部分與噁唑烷或1，3-四氫噁嗪環的仲胺基之間消除氫滷酸以通過5或6元環的加入形成稠合環結構。接著用弱酸(適宜的有機酸)如冰醋酸中和鹼。用酸的水溶液(適宜地為有機酸)處理打開稠合環的噁唑烷或1，3-四氫噁嗪部分。本領域普通技術人員應理解，根據起始的醛，含有氮的最終環可包含至少一個上述另外的雜原子。反應通式可說明如下 其中X′為滷素，適宜地為溴或碘，優選碘，Y為CH2、OCH2、CH2-CH2，Z不存在或為CH2。
當Z不存在時，作為反應的第一個步驟，醛部分形成5元惡唑烷環。當Z為CH2時，醛部分形成6元1，3-四氫噁嗪環。雖然這些環的形成是熟知的，但與通過滷代烷烴側鏈在鹼性介質如叔胺的無水介質中進行的閉環結合，該反應是新的出人意外的。
圖2為對於不同劑量水平的本發明的某化合物、現有技術中的化合物DOX和對照物，雌激素依賴性MXT小鼠乳腺癌的體積變化。
圖3為一些細胞毒LHRH類似物對患有雌激素依賴性MXT小鼠乳腺癌的小鼠存活的影響。
圖4為在用現有技術中的激動劑和本發明的某化合物治療期間，帶有大鼠Dunning R-3327-H前列腺癌移植物的雄性哥本哈根大鼠的腫瘤體積圖。
圖5為用某種本發明的化合物和相應的細胞毒性LH-RH類似物治療，對患有Dunning R-3327-H前列腺癌的大鼠的腫瘤體積的影響。
圖6為用本發明的某化合物和相應的細胞毒性LH-RH類似物治療，對患有Dunning R-3327-H前列腺癌的哥本哈根大鼠的體重的影響。
圖7為通過用本發明的某化合物和DOX治療所獲得的對腫瘤生長的抑制。
R′具有產生如下列括號中的所示的Qx殘基的含義NH2(Q1)，吡咯烷-1-基(Q2)，異二氫氮雜茚-2-基(Q3)，3-吡咯啉-1-基(Q4)，3-吡咯烷酮-1-基(Q5)，2-吡咯啉-1-基(Q6)，3-哌啶酮-1-基(Q7)或1，3-四氫吡啶-1-基(Q8)。
因此，如果R-P為H，-R′為-NH2，則Q1為DOX，如果R-P為H，-R′為吡咯烷-1-基，則Q2為3′-脫氨基-3′-(吡咯烷-1″-基)-阿黴素(Q2)；如R-P為H，-R′為異二氫氮雜茚-2-基，則Q3為3′-脫氨基-3′-(異二氫氮雜茚-2″-基)-阿黴素(Q3)，如果R-P為H，-R′為3-吡咯啉-1-基，則Q4為3′-脫氨基-3′-(3″-吡咯啉-1″-基)-阿黴素(Q4)；如果R-P為H，-R′為3-吡咯烷酮-1-基，則Q5為3′-脫氨基-3′-(3″-吡咯烷酮-1″-基)-阿黴素(Q5)；如果R-P為H，-R′為2-吡咯啉-1-基，則Q6為3′-脫氨基-3′-(2″-吡咯啉-1″-基)-阿黴素(Q6)，如果R-P為H，-R′為3-哌啶酮-1-基，則Q7為3′-脫氨基-3′-(3″-哌啶酮-1″-基)-阿黴素(Q7)；如果R-P為H，-R′為1，3-四氫吡啶-1-基，則Q8為3′-脫氨基-3′-(1″，3″-四氫吡啶-1″-基)-阿黴素(Q8)。
利用烷基化作用在5元環中摻入道諾糖胺氮原子的化合物體外活性比在6元環摻入道諾糖胺氮原子的它們的對應物高10-50倍(這些對比物為Q5和Q7以及Q6和Q8)。
在本發明優選的具體實施方案中，在式Q14-O-R-P物質中，R和P不為氫。在P不為氫時，為P1、P2和P3，適宜地P1為LH-RH激動劑載體、LH-RH拮抗劑載體或縮短的LH-RH類似物載體，P2為縮短的促生長素抑制素類似物，P3為鈴蟾肽拮抗劑。
適宜地，P1為Aaa-Bbb-Ccc-Ser-Tyr-D-Lys(Xxx)-Leu-Arg-Pro-Ddd，其中Xxx為氫或二氨基取代基，如A2Bu或A2Pr，其中Aaa為Glp，那麼Bbb為His，Ccc為Trp，和Ddd為Gly-NH2，Aaa為Ac-D-Nal(2)，Ac-D-Phe或AcD-Phe(4Cl)，那麼Bbb為D-Phe(4Cl)或D-Phe，Ccc為D-Pal(3)和D-Trp，Ddd為D-Ala-NH2；並且當Aaa-Bbb-Ccc為Ac，那麼Ddd為-NH 其中當Aaa為D-Phe，那麼Bbb為Tyr，Ccc為Val，Ddd為Thr或Trp；當Aaa為D-Trp，那麼Bbb為Phe，Ccc和Ddd為Thr，和P3為Aaa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-LeuBbb-NH2其中Aaa為不存在，D-Tpi或D-Phe，Bbb為(CH2-NH)Leu，(CH2-NH)Phe，(CH2-NH)Trp，(CH2-N)Tac或(CH2-N)DM-Tac。
在本發明LH-RH結合類似物的新化合物中，通過如式VII所列的二羧酸間隔區，細胞毒基團Q與LH-RH類似物上的D-Lys側鏈或與其上的Xxx基團相連Aaa-Bbb-Ccc-Ser-Tyr-D-Lys(Xxx)m(Q14-O-R)n-Leu-Arg-Pro-Ddd (VII)其中m為1或0，n為1或2，前提是當m為1，即(Xxx)為A2Bu或A2Pr時，n為1或2，當m為0，即(Xxx)為H時，n為1。
在本發明促生長素抑制素結合類似物的新化合物中，通過如下式VIII所列的二羧酸間隔區，細胞毒基團Q與促生長素抑制素類似物的氨基末端相連 在本發明鈴蟾肽拮抗劑結合類似物的新化合物中，通過如式IX所列的間隔區，細胞毒基團Q與鈴蟾肽拮抗劑的氨基末端相連。
Q14-D-R-Aaa-Gln-Trp-Ala-VaL-Gly-His-LeuBbb-NH2(IX)本發明尤其優選的具體實例為含有Q1和Q6作為細胞毒基團，戊二酸(n＝3)作為與Q1(阿黴素)或Q6(2-吡咯啉並阿黴素)形成14-O-酯鍵並與肽載體形成羧酸胺鍵的二羧酸間隔區的那些肽結合物。
本發明的最優選的具體實例為下式的細胞毒LH-RH類似物1.Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys(Q114-O-glt)-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2；2.Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys(Q614-O-glt)-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2；下式的細胞毒性促生長素抑制素類似物 和 和下式的細胞毒性鈴蟾肽拮抗劑類似物9.Q114-O-glt-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu(CH2-NH)Leu-NH2；10.Q614-O-glt-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu(CH2-NH)Leu-NH211.Q114-O-glt-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu(CH2-NH)Leu-NH2；和12.Q614-O-glt-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu(CH2-NH)Leu-NH2.
在與相鄰或分離的，即α，β-或α，γ-羥胺的氮形成部分飽和雜環的新方法中，使用大量過量，適宜地為過量30倍的滷代醛，在無水惰性有機極性非羥基(非質子的)溶劑，適宜地為二甲基甲醯胺中進行反應的第一個步驟，其中4-碘丁醛和5-碘戊醛為尤其有效的。然而，本發明不局限於此，溴可被用來代替碘。此反應以及後續步驟可在室溫下進行。
使用過量，適宜地為過量2-4倍的有機鹼進行鹼化反應步驟。叔胺如三烷基胺適用於此目的。
通過在水存在下，用有機酸處理將由此形成的二環打開以釋放相鄰或分離的羥基，可使用稀釋的含水三氟乙酸，適宜地為在惰性有機溶劑如乙腈中的溶液。通過減壓除去揮發物，用已烷萃取過量的滷代化合物，並在HPLC中純化殘餘物來純化產物。
縮寫為了描述本發明的肽和它們的衍生物，使用肽化學技術中普遍接受並在由IUPACIUB生物化學命名委員會推薦的常用的胺基酸縮寫(歐洲生物化學雜誌，138，9-37(1984))。
各胺基酸殘基的縮寫以胺基酸的俗名為基礎，例如Glp為焦穀氨酸，His為組氨酸，Trp為色氨酸等。除非另有說明，縮寫指的是L異構體形式的胺基酸，如Ser為L-絲氨酸，D-Lys為D-賴氨酸。
本發明非常見胺基酸的縮寫如下D-Nal(2)為D-3-(2-萘基)丙氨酸，D-Pal(3)為D-3-(3-吡啶基)丙氨酸，D-Phe(4Cl)為D-4-氯苯丙氨酸。
根據常規書寫肽序列，其中N-末端胺基酸位於左邊，C-末端胺基酸位於右邊，如Glp-His-Trp。
式Leu(CH2-NH)Leu-NH2描述位於亮氨酸和肽序列C末端的亮氨醯胺殘基之間的被還原的肽鍵。
使用的其它縮寫為A2Bu二氨基丁酸A2Pr二氨基丙酸BN鈴蟾肽BOP試劑苯並三唑-1-基氧三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸鹽DIPEAN，N-二異丙基乙胺DM-DOX道諾糖胺修飾的阿黴素DMFN，N-二甲基甲醯胺DMTac5，5-二甲基-噻唑烷-4-羧酸DOX阿黴素Fmoc9-芴基甲氧羰基glt-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-，戊二醯基Glt2O戊二酸酐HOBt1-羥基苯並三唑HO-glt-OH戊二酸HOSuN-羥基琥珀醯亞胺HPLC高效液相色譜TFA三氟乙酸Tac噻唑烷-4-羧酸Tpi2，3，4，9-四氫-1H-吡啶並[3，4-b]吲哚-3-羧酸使用裝有168型二極體陣列檢測儀的Beckman分析型HPLC系統和System Gold色譜軟體(Beckman)來監測化學反應並檢查本發明化合物的純度。使用的柱為DynamaxC-18(250×4.6mm；孔大小300；顆粒大小12μm)。溶劑體系由兩種成分組成(i)0.1％TFA水溶液，和(ii)0.1％TFA的70％含水乙腈的溶液，並以1分鐘增加1％(ii)的線性梯度形式使用以監測化學反應。用於檢查純度，該體系以等梯度形式使用。
使用Beckman 342型半製備HPLC體系來分離和純化本發明的化合物。柱為Aquapore Octyl(250×10mm；孔大小300；顆粒大小15μm)。溶劑體系為與上面分析型HPLC中的相同。分析使用Bruker ARX300 NMR分光計(300MHz 1H頻率，75MHz13C頻率)和電子噴射質譜儀Finnigan-MAT TSQ 7000來鑑定阿黴素衍生物的結構。肽載體的合成通常以藥物學可接受的非毒性鹽如酸加成鹽的形式將本發明的化合物給藥。酸加成鹽的例子為氫氯酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、富馬酸鹽、葡糖酸鹽、單寧酸鹽、馬來酸鹽、乙酸鹽、三氟乙酸鹽、檸檬酸鹽、苯甲酸鹽、琥珀酸鹽、藻酸鹽，pamoate、蘋果酸鹽、抗壞血酸鹽、酒石酸鹽等。如果以片劑形式給予活性成分，該片劑可包含藥物學可接受稀釋劑，包括粘合劑如黃蓍膠、玉米澱粉或明膠，崩解劑如藻酸及潤滑劑如硬脂酸鎂。
如果需要以液體形式給藥，甜味劑和/或增香劑可被用作藥物學可接受稀釋劑的一部分，靜脈注射可以等滲生理鹽水、磷酸緩衝液等形式完成。
藥物組合物通常包含與常規的藥物學可接受載體相結合的肽。通常，當靜脈給藥時，劑量為每千克宿主體重為約1-約100微克肽；口服劑量將更高。總之，通常以與使用其它LHRH、促生長素抑制素和鈴蟾肽類似物的臨床治療相同方式來進行使用這些肽的治療。
這些肽可被通過經靜脈、皮下、肌肉內、口服、鼻內或陰道對哺乳動物進行給藥以通過與特異受體結合而獲得生物激素作用。在LHRH類似物的情況下，這些作用包括可逆的生殖腺活動的抑制，在促生長素抑制素類似物的情況下，抑制胃腸機能。有效劑量隨給藥形式和被治療的哺乳動物的具體種類而變化。一個典型的劑型實例為含有該肽的生理鹽水溶液，施用該溶液以提供約0.1-2.5mg/kg體重範圍內的劑量。可以固體形式或液體形式進行肽的口服給藥。
可通過任何肽化學領域的技術人員已知的方法進行本發明肽載體的合成。適宜方法的總匯可在M.Bodanszky，《肽合成原理》，Springer-Verlag，Heidelberg，1984中找到。固相肽合成方法可在J.M.Stewart和J.D.Young的教科書，《固相肽合成》，PierceChem.CO.，Rockford，IL，1984(第二版)中以及G.Barany等的綜述《國際肽和蛋白質研究雜誌》30，705-739(1987)中查找到。
本發明所採用的LH-RH類似物載體的合成詳細描述在美國專利5,258,492(Sandor Bajusz和Andrew V.Schally，1993年11月2日)的實施例中以及Bajusz等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，1637-1641(1988)和86，6318-6322(1989)和Janaky等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，1023-1027和972-976(1992)的論文中。
本發明所採用的促生長素抑制素類似物載體的合成詳細描述在美國專利4,650,787(1987年3月17日，Andrew V.Schally和RenZ.Cai.)的實施例中。對合成的描述也可在Cai等，Proc.Natl.A-cad.Sci.USA 83，1896-1900(1986)和Proc.Natl.Sci.USA 84，2502-2506(1987)的論文中查找到。
本發明所採用的鈴蟾肽拮抗劑載體的合成詳細描述在Coy等，《生物化學雜誌》263，5056-5060(1988)和264，14691-14697(1989)和Cai等，《肽》13，267-271(1992)和Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，12664-12668(1994)的論文中。
本發明所採用的阿黴素衍生物的合成及它們與不同肽載體的結合物的形成在下面實施例中進行了詳細描述，其中這些實施例意在說明而不起限制作用。
在存在26.1μL(150μmol)DIPEA時，將該中間體與11.4mg(100μmol)Glt2O的1ml無水DMF溶液反應過夜。在Speed Vac中將溶劑蒸發掉，並藉助於與0.1％(v/v)TFA水溶液的摩擦將殘餘油狀物固化。如分析型HPLC所檢測的，由此得到的粗物質含有70％N-Fmoc-DOX 14-O-半戊二酸酯，20％未反應的N-Fmoc-DOX和10％其它不純物。此粗產物可不經進一步純化而用於製備肽DOX結合物。當此粗物質溶解於含0.1％TFA的20ml 60％乙腈水溶液中並上樣於半製備性HPLC時，獲得了45.7mg 98％純度的N-Fmoc-DOX14-O-半戊二酸酯終產物(收率64％)。
幾乎如實施例1所描述，將由此獲得的41.6mg(58μmol)3′-脫氨基-3′-(吡咯烷-1″-基)-阿黴素TFA鹽(Q2)與1.2當量Glt2O的無水DMF溶液反應。產率為35％(16.9mg)，純度為98％。
除了採用4-溴丁醯氯代替3-溴丙醯氯外，幾乎與用於1-氯-4-溴-2-戊酮相同的方法從4-溴丁醯氯製備1-氯-5-溴-2-戊酮。獲得1.6g清油，收率＝80％。
幾乎以相同方法從2-(4-氯丁基)-1，3-二氧戊環(5-氯-正戊醛乙二醇縮醛)(Fluka)獲得5-碘戊醛。獲得1.65g黃色油狀物。產率80％。
含2-吡咯啉並DOX的細胞毒性LH-RH激動劑類似物的製備和分離([D-Lys6(2-吡咯啉並DOX14-O-glt)]LH-RH，Q614gl)將11.2mg(5μmol)Q114gl(參見實施例11)溶解在200μl DMF中，並加入30mg(150μmol，30倍過量)4-碘丁醛(實施例8)，接著加入3μl(17μmol)DIPEA。1小時後，反應完畢(參見實施例9)，向反應混合物中加入10μl冰醋酸，接著將反應混合物滴加至1mL 0.1％TFA的70％乙腈水溶液。接著將該溶液用1mL 0.1％TFA水溶液稀釋，並真空除去乙腈。隨後將剩餘水溶液用1mL己烷萃取，並上樣至HPLC。獲得質量為7.6mg、99％純度的最終產物。(產率66％)。
如實施例9中所述，通過將DOX14-O-半戊二酸酯與4-碘丁醛反應來製備2-吡咯啉-1-基-DOX14-O-半戊二酸酯。
如實施例11所述，從N-Fmoc-DOX14-O-半戊二酸酯，通過裂解Fmoc保護基製備DOX14-O-半戊二酸酯。(產率40％)。
為了評價類似物的活性，以通過結晶紫染色細胞來定量測定生物量為基礎，採用微滴定平板的比色細胞毒性分析，其中生物量的定量與細胞數目的確定極為相關(Reile等；分析生物化學187，262-267，1990；Bernhardt G.等，癌症研究與臨床腫瘤雜誌(1992)，118，35-43；Spruss Th.等，癌症研究與臨床腫瘤雜誌117，435-443，1991；Gillies R.J.，分析生物化學雜誌，159，109-113，1986；Kueng，W.等；分析生物化學，182 16-19，1989)。分析方法在96孔平板上接種細胞1至2天後，將培養基換成含待測試化合物的新鮮培養基和僅用作對照培養物的新鮮培養基。在培養一段不同的時間後，將細胞用戊二醛固定，並4℃下貯存在胎牛血清(FBS)中直至實驗結束。將細胞用結晶紫染色，並用70％乙醇水溶液提取結合的染料。分別用ELA Reader(Bio-Tek Instruments)或Biomek 1000(Beckman)測定590nm或600nm處的光密度。每一數據點代表八個培養孔的平均值。用T/C＝(T-C0)/(C-C0)來計算T/C值，其中T＝處理組培養物的光密度，C＝對照組(未處理)培養物的光密度，C0＝培養開始時培養物的光密度(t＝0)。
其道諾糖胺N被結合至具有反應活性功能團的五元環中的細胞毒性基團活性比它們類似的六元環對應物高5-50倍，例如3-吡咯啉-1-基-DOX(Q5)和3-哌啶-1-基-DOX(Q7)以及2-吡咯啉-1-基-DOX(Q6)和1，3-四氫-吡啶-1-基-DOX(Q8)。
表17-1在體外阿黴素和其道諾糖胺修飾的衍生物對MCF人乳腺癌細胞系的作用
在96孔平板上將細胞培養於含5％HI-DCC-FBS(熱失活葡聚糖包被活性炭處理的胎牛血清)的IMEM培養基中。通過結晶紫染色法確定處理和對照平板中的相對細胞數目，並以T/C值表示，其中T/C＝(T-C0/C-C0)×100[T＝處理組培養物的吸光率，C＝對照培養物的吸光率，C0＝培養開始時的培養物的吸光率(t＝0)。測得的吸光率與細胞數目成正比]。較低的T/C值說明由於處理而導致的癌細胞存活的減少。即75表示與對照100％相比，75％的細胞存活或25％抑制。
DOX在LH-RH激動劑肽結合物Q114gL中和超活性2-吡咯啉-1-基-DOX(Q6)在LH-RH激動劑肽結合物Q614gL中的體外細胞毒活性的充分保留。
表18-1表明在體外，分別與其與LH-RH激動劑類似物的結合物[D-Lys6]LH-RH(Q114gL和Q614gL)相比，阿黴素和其道諾糖胺修飾衍生物2-吡咯啉-1-基-阿黴素(Q6)對MCF-7人乳腺癌細胞系及MXT雌激素依賴小鼠乳腺癌細胞系生長的影響。表18-1
在96孔平板上，將MCF-7細胞培養在含5％HI-DCC-FBS的IMEM培養基中。將MXT細胞培養在含0.6g/L L-穀氨醯胺和10％FBS中的RPMI 1640培養基中。*如表17-1所示進行測定。
表19-1在體外含阿黴素的細胞毒性促生長素抑制素類似物對MIIA PaCa-2人胰癌細胞系生長的作用
在96孔平板上，將細胞培養在含10％胎牛血清的RPMI 1640培養基中。
實施例20在體外，含阿黴素的鈴蟾肽拮抗劑的細胞毒類似物對CFPAC-1人胰癌細胞系生長的影響表20-1表明本發明含DOX的鈴蟾肽拮抗劑類似物的體外細胞毒活性被充分保留。表20-1
在24孔平板上，將細胞培養在含10％胎牛血清的IMDM培養基中。
*Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-(CH2-N)-Leu-NH2
*D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-(CH2-N)-Tac-NH2激素衍生物被保留的結合特性。
**如B.Szoke等，《肽》，15(2)，359-366(1994)中所描述，在使用[125I]標記的[D-Trp6]LH-RH作為放射性配體的競爭性結合實驗中測定類似物與大鼠垂體LH-RH受體和人乳腺癌受體的結合親和性。結合親和性用IC50值表示，即抑制50％的放射性配體的特異性結合所需的未標記類似物的濃度。
分別與其細胞毒衍生物Q114gS98-1(DOX14-O-glt-S-98-1)和Q114gS121(DOX14-O-glt-S-121)相比，通過促生長素抑制素類似物S-98-1
和S-121
對人生長激素釋放激素(hGH-RH(1-29)NH2)的抑制誘導從超灌注的大鼠垂體細胞中釋放生長激素。
在大鼠垂體超灌注系統中，以1nM促生長素抑制素和同時1nMhGH-RH(1-29)NH2的劑量給藥3分鐘。再保持注入促生長素抑制素類似物6分鐘。在灌注促生長素抑制素期間(0分鐘)及給藥結束後30、60和90分鐘時測定GH對1nM hGH-RH(1-29)NH2的3分鐘給藥的反應。數據示於表22-1中。表22-1
**以佔在給予促生長素抑制素類似物之前，由注入3分鐘1nMhGH-RH(1-29)NH2所誘導的GH釋放的百分數來表示。
1.Halmos等，癌症通訊，85，111-118(1994)2.Cai，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9112664-12668，(1994)3.Kris，等，生物化學雜誌，26211215-11220，(1987)4.McPherson，G.A.藥物學方法雜誌，14213-228，(1985)5.Cheng和Prusoff，生物化學藥理學，223099-3108，(1973)表23-1與鈴蟾肽比較，細胞毒性鈴蟾肽拮抗劑Q614gB(2-吡咯啉-1-基-DOX14-O-glt-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-leu-ψ-(CH2-N)Leu-NH2與Swiss 3T3細胞系中的鈴蟾肽受體的特異性結合的鑑定表3
表4
表5
Q614gL處理導致5隻中2隻動物存活，並且腫瘤沒有發展。
表24-1
*從第9天至第12天，將劑量提高到2.5nmol從第9天至第12天，將劑量提高到5.0nmol*存活表24-2
**使用Duncan’s檢驗，與對照數據相比存活時間明顯較長(p＜0.01)，存活時間明顯較短(p＜0.01)或(p＜0.05)。
如表25-1和圖2所示，劑量為850nmol/20g小鼠的T-107，(即與[D-Lys6]LH-RH相連的N-戊二醯-DOX)在抑制腫瘤生長中完全無效。相反，劑量為非毒性劑量650nm/20g小鼠的Q114gL(與[D-Lys6]LH-RH相連的14-O-戊二醯-DOX)對腫瘤生長產生強烈的抑制(圖)。單劑為650nmol/20g小鼠的單獨的DOX具有很高的毒性(平均存活時間13.6天)並且功效明顯較差於Q114gL(圖2)。
表25
*存活時間明顯短於對照組(p＜0.01)**與對照組相比，存活時間明顯較長(p＜0.01)或*(p＜0.05)(在第2天意外死亡的一隻小鼠從這兩組中除去)。
將MXT(3.2)ovex腫瘤塊(1mm3)移植入雌性B6D2F1小鼠中。移植1天後通過每天腹膜內注射開始處理並持續12天。如表26-1所示，所有組接受等摩爾量的化合物。在第10、14和18天測量腫瘤並計算腫瘤體積。數據示於表26-1和圖3中。
用每日劑量為30nmol的道諾糖胺修飾的阿黴素類似物Q2(吡咯啉-1-基-DOX)劑量對腫瘤生長產生強的抑制作用(腫瘤體積在第14天時為144mm3，而對照組為1391mm3)，但在實驗結束之前，殺死了所有動物，產生嚴重的毒性(平均存活17.9天)。類似地，Q2與[D-Lys6]LH-RH混合(混合物)產生強的腫瘤抑制作用(腫瘤體積，在第14天時為80mm3)，但平均存活時間(18.5天)明顯短於未處理對照組(23.1天)。作為用Q214gL(與[D-Lys6]LH-RH共價結合的Q2)的處理結果，兩個動物死亡，一個在第16天，另一個在第26天死亡。從8個存活動物中，僅一個在第18天最後的測量中腫瘤發展，並且它們均看來很健康，但後來它們均開始長出腫瘤。該組的平均存活時間明顯較長(28.3天)於對照組。單獨用[D-Lys6]LH-RH類似物處理不影響腫瘤生長。
該實驗表明Q214gL比細胞毒性基團Q2具有更高的功效和較低的外周毒性是由於細胞毒基團與靶向載體LH-RH類似物的共價結合的結果。表26-1細胞毒LH-RH類似物對雌激素依賴性MXT小鼠乳腺癌生長及患有腫瘤的小鼠的存活時間的作用
所有的日劑量為30nmol摩爾當量明顯短於對照組(p＜0.05)*用Duncan’s檢驗測得明顯長於對照組(p＜0.01)。
實施例272-吡咯啉-1-基-DOX(Q6)和細胞毒LH-RH激動劑類似物Q614gL(與[D-Lys6]LH-RH相連的Q614-O-半戊二酸酯)對雄激素依賴性大鼠Dunning R-3327-H前列腺癌生長的作用。
將患有激素依賴性Dunning R-3327-H前列腺癌的雄性哥本哈根大鼠用Q614gL，一種由與2-吡啉啉-1-基-阿黴素相連的激動劑[D-Lys6]LH-RH組成的促黃體生成素釋放激素(LH-RH)的新細胞毒類似物進行處理。在第一個實驗中，將2-吡咯啉-1-基-阿黴素以50nmol/kg的濃度作為單一藥物(Q6)和與[D-Lys6]LH-RH的未結合混合物或與載體[D-Lys6]LH-RH結合(Q614gL)的形式給藥。第二次以50nmol/kg單獨的基團Q6或與[D-Lys6]LH-RH混合給藥後，所有大鼠死亡，表示全身毒性症狀，而用細胞毒LH-RH結合物Q614gL處理的所有動物存活。使用150nmol/kg Q614gL的總劑量處理5周後，將腫瘤從實驗開始時的8.35±1.7cm3的最初體積減至4.47±0.8cm3，而對照組的腫瘤繼續生長，並測得為17.84±2.2cm3。用Q614gL的治療還明顯降低了腫瘤的重量和腫瘤的負擔。在設計用來比較Q6和Q614gL的功效和毒性的第二個實驗中，治療方案由3次給予25nmol/kg Q6或25nmol/kg和50nmol/kg Q614gL組成。當處理開始時，所有組的腫瘤體積在3.9-4.5cm3之間。處理5周後，用50nmol/kg Q614gL處理的大鼠中的腫瘤減少至2.3±0.51cm3，然而與未處理動物的15.6±2.2cm3相比，25nmol/kg Q6仍然具有毒性，並僅可將最終腫瘤體積減少至6.76±1.4cm3，類似於用25nmol/kg Q614gL獲得的結果(6.74±cm3)。樣本的組織學評價表明僅在Q614gL處理組中有顯著的有絲分裂細胞的減少。在未處理的Dunning腫瘤樣本的膜上檢測到具有高結合能力的LH-RH受體，但在用Q614gL處理後，未能發現LH-RH的結合位點，AN-201和Q614gL的腫瘤生長的抑制還與EGF受體的結合能力的顯著降低相關。如圖4-6所示，靶向的細胞毒LH-RH類似物Q614gL為一種有效的抗腫瘤劑，它導致大鼠Dunning R-3327-H前列腺癌的衰退。我們的研究還表明細胞毒LH-RH類似物Q614gL比摻入的抗腫瘤基團(Q6)的毒性更小，並且在抑制腫瘤生長中明顯更具活性。
+用Q6作為單一藥物或與[D-Lys6]LH-RH的未結合混合物處理的動物在第二周死亡。在這兩組中顯示了在第8天記錄的腫瘤的體積。
圖5實驗II用25nmol/kg 2-吡咯啉-1-基-阿黴素(Q6)、25nmol/kg和50nmol/kg細胞毒LH-RH類似物Q614gL處理，對患有Dunning R-3327-H前列腺癌的大鼠的腫瘤體積的影響。垂直線表示SEM。與對照相比*p＜0.05；**p＜0.01。由箭頭表示的處理在第1、8和29天時進行了3次。圖6，實驗II用25nmol/kg 2-吡咯啉-1-基-阿黴素(Q6)、25nmol/kg和50nmol/kg細胞毒LH-RH類似物Q614gL處理，對患有Dunning R-3327-H前列腺癌的哥本哈根大鼠的體重的影響。垂直線表示SEM。與對照相比*p＜0.05；**p＜0.01。由箭頭表示的處理在第1、8和29天時進行了3次。
將平均腫瘤大小為約15mm3的小鼠分成六個組，其中每組9隻動物，並在腫瘤移植七天後接受下面的處理組1，生理鹽水；組2，Q114gL，劑量為700nmol/20g動物；組3，Q114gL，劑量為413nmol/20g動物(對於DOX的最大耐受劑量，MTD)；組4,413nmol/20g動物(MTD)的DOX；組5,700nmol/20g DOX與700nmol/20g[D-Lys6]LH-RH的混合物；組6，載體激動劑類似物[D-Lys6]LH-RH，劑量為700nmol/20g動物。
OV-1063受體分析表明LH-RH的高親和性結合位點的存在。
結果如圖7所示，用413nmol/20g劑量的Q114gL處理(組3)獲得了對腫瘤生長的強的抑制作用。動物沒有顯示嚴重的毒性症狀。與之相比，使用413nmol/20g(12mg/kg，MTD，組4)相同劑量的DOX的處理在實驗結束後仍存活的三個動物中沒有產生明顯的腫瘤生長的抑制。由於毒性，三個動物在第5天死亡，6個動物在第9天死亡。在較高劑量時(700nmol/20g，組2)，Q114gL顯示出非常強的腫瘤生長抑制作用(圖7)。9隻動物中的兩隻死於毒性，1隻死於偶然。6隻存活動物在實驗結束時從體重減少約20％中恢復過來。在組6中，將相同的大劑量(700nmol/20g)DOX與700nmol/[D-lys6]LH-RH混合。由於嚴重毒性產生的結果，這組所有動物在第5天時死亡。
結論我們的結果清楚地表明由於在上皮卵巢癌OV-1063的細胞中存在LH-RH受體，靶向細胞毒性LH-RH結合物Q114gL比其所含的細胞毒基團阿黴素(Q1)顯示出更低的毒性和更高的抗腫瘤活性。
權利要求
1.一種將α，β或α，γ-羥伯胺的伯氨基的氮轉化為在具有5-6個原子的含氮的單不飽和雜環化合物的氮的方法，包括下面的步驟a)將所述羥胺與過量滷代醛反應，該滷代醛具有醛碳、帶有滷素的碳，並且在醛碳和帶有滷素的碳之間具有2或3個選自CH2、CH2CH2和OCH2的殘基，b)相對於羥胺，加入過量的有機鹼，c)用弱酸中和所述鹼，和d)用稀釋酸水溶液處理。
2.權利要求1的方法，其中步驟a)在非質子反應惰性有機溶劑中進行。
3.權利要求1的方法，其中步驟a)在極性非羥基反應惰性有機溶劑中進行。
4.權利要求1的方法，其中溶劑為二甲基甲醯胺。
5.權利要求1的方法，其中醛選自ω-溴-和ω-碘-丁醛和-戊醛。
全文摘要
一種將α，β或α，γ－羥伯胺的伯氨基的氮轉化為在具有5－6個原子的含氮的單不飽和雜環化合物的氮的方法，包括a)將所述羥胺與過量滷代醛反應，該滷代醛具有醛碳、帶有滷素的碳，並且在醛碳和帶有滷素的碳之間具有2或3個選自CH
文檔編號A61K31/7028GK1405127SQ02143919
公開日2003年3月26日 申請日期1996年11月14日 優先權日1995年11月27日
發明者A·V·沙利, A·A·納吉, R－Z·凱 申請人:贊塔裡斯股份公司