生長因子複合物的製作方法
2023-10-09 14:22:44 2
專利名稱：生長因子複合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種分離的蛋白質複合物，其包含生長因子結合蛋白和玻連蛋白。特別地，本發明涉及一種分離的蛋白質複合物，其包含一種胰島素樣生長因子、胰島素樣生長因子結合蛋白和玻連蛋白。本發明還提供了生長因子複合物，其包含促進或增強生長因子複合物形成的不同生長因子和/或生長因子結合蛋白。本發明還提供了調節細胞增殖和/或遷移的方法，以進行創傷修復，皮膚修復，化妝用皮膚護理和組織修復治療。相反，通過破壞蛋白質複合物在體內形成，可抑制生長因子驅動的細胞增殖和/或遷移，以例如治療癌症，牛皮癬，動脈硬化和有疤痕過度生長傾向的創傷。這些治療也許具有醫學和獸醫學應用價值。
背景技術：
皮膚的生長，修復和癒合是一個複雜的生物控制機制，其通過陽性和陰性信號起作用。這種信號在控制細胞增殖，分化和遷移水平起作用，並典型地由生長因子多肽介導。在此方面，重要的生長因子包括表皮生長因子(EGF)和胰島素樣生長因子(IGF-I和-II)。
已經報導人IGF-I發揮廣泛的生物學活性，包括刺激細胞增殖，分化和遷移，保護蛋白質免於降解和細胞程序死亡，以及調節內分泌因子如生長激素。IGF-II與IGF-I具有相似性質，但表現為與癌發生及胎兒與胚胎發育更相關，IGF-I在出生以後的發育中具有更大的作用。
IGF-I和IGF-II均通過與I型IGF受體(IGFR)結合而發揮作用。這種相互作用所需的IGF的可利用性由胰島素樣生長因子結合蛋白(IGFBP 1-6)調節。IGFBP已知可陽性和陰性調節IGF功能，以及呈現IGF-非依賴性活性。
IGF途徑的另一種功能成分是II型IGFR，其還已知是陽離子非依賴性6-磷酸甘露糖受體(CI-MPR)。II型IGFR是一種多功能蛋白質，其結合攜帶6-磷酸甘露糖組分的溶酶體酶，以及IGF-II，但還不清楚與IGF-II結合的功能意義(O′Dell Day，1998，國際生物化學細胞生物學雜誌30 767；Braulke，1999，Horm.Metab.Res.31 242；Nykjaer等，1998，細胞生物學雜誌141 815)。
也已經報導IGF結合另一組蛋白質，稱為「IGFBP-相關蛋白質」，這一組蛋白質呈現結構相似性並包括結締組織生長因子(CTGF)及由mac25，nov和cyr61基因編碼的產物。與IGFBP相比，這些物質結合IGF的親和性較低。
最近，鑑別出玻連蛋白(VN)是一種胞外基質蛋白，結構與IGFBP和IGFBP-相關蛋白不相關，其結合IGF-II但不結合IGF-I(Upton等，1999，內分泌學140 2928)。
玻連蛋白是一種75kD糖基化胞外基質蛋白，其也在血液中發現，並與癌症，骨疾病和病理失調包括血管發生相關聯(參見Schvartz等，1999，生物化學細胞生物學雜誌31 539)。玻連蛋白在如血管發生和致瘤發生等病症中的作用，至少部分源於玻連蛋白結合整聯蛋白及與尿激酶纖溶酶原激活物系統成分(例如PAI-1，uPAR，纖溶酶原)相互作用的能力，從而促進細胞增殖，粘著，擴散和遷移。玻連蛋白更特異性參與應答藥物治療而防止致瘤細胞程序死亡(Uhm等，1999，癌症臨床研究5 1587)。玻連蛋白表現為在循環中是IGF-II的載體(McMurtry等，1996，內分泌學雜誌150 149)。
發明目的本發明人令人驚奇地揭示了IGFBP能結合玻連蛋白，而且當IGF-I與IGFBP結合時，其可以結合玻連蛋白。
因此本發明的一個目的是提供一種分離的含有IGFBP和玻連蛋白的複合物。
發明概述第一方面，本發明提供了一種分離的多肽複合物，其包含一種生長因子結合蛋白和玻連蛋白。
優選地，所述分離的多肽複合物還包含一種生長因子。
一種優選的生長因子是胰島素樣生長因子-I(IGF-I)。
其它生長因子包括表皮生長因子(EGF)，成纖維細胞生長因子(FGF)，鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)，骨橋蛋白，血小板反應蛋白-1，腱生蛋白-C，PAI-1，纖溶酶原，纖維蛋白原，纖維蛋白和運鐵蛋白。
一種優選的生長因子結合蛋白是選自IGFBP1，IGFBP2，IGFBP3，IGFBP4，IGFBP5和IGFBP6的一種胰島素樣生長因子結合蛋白。
一種更優選的胰島素樣生長因子結合蛋白是IGFBP2，IGFBP3，IGFBP4或IGFBP5。
一種最優選的胰島素樣生長因子結合蛋白是IGFBP3或IGFBP5。
第二方面，本發明提供了一種分離的蛋白質複合物，其包含一種IGFBP-相關蛋白和玻連蛋白。
優選地，所述分離的蛋白質複合物還包含一種生長因子，優選IGF-I。
在一個實施方案中，IGFBP-相關蛋白選自結締組織生長因子(CTGF)，由mac25基因編碼的多肽，由nov基因編碼的多肽和由cyr61基因編碼的多肽。
第三方面，本發明提供了一種分離的蛋白質複合物，其包含玻連蛋白，一種變體生長因子(a variant growth factor)和/或一種變體生長因子結合蛋白。
在一個實施方案中，這方面的分離的蛋白質複合物包含玻連蛋白和一種工程化包含肝素結合結構域(HBD)的變體生長因子。
在另一個實施方案中，這方面的分離的蛋白質複合物包含玻連蛋白和一種非糖基化生長因子結合蛋白。
在另一個實施方案中，這方面的分離的蛋白質複合物包含玻連蛋白和選自des(1-6)IGF-II和des(1-3)IGF-I的一種變體生長因子。
第一、第二和第三方面還涵蓋了本發明的分離的蛋白質複合物另外可以包括一種酸不穩定亞單位，這是能與IGFBP複合的一種多肽，後文稱為ALS。
根據第一，第二和第三方面，本發明還涵蓋了分離的蛋白質複合物，其包含變體生長因子和其生物活性片段，生長因子結合蛋白，IGFBP-相關的蛋白質和玻連蛋白，本發明還涵蓋了這種複合物的應用。生物活性片段和變異體包括所述生長因子的類似物，突變體，興奮劑和拮抗劑，生長因子結合蛋白，IGFBP-相關的蛋白質和玻連蛋白。
第四方面，本發明提供了一種藥物組合物，其包含本發明第一，第二和第三方面的一或多種分離的蛋白質複合物，和一種藥物適當的載體或稀釋劑。
第五方面，本發明提供了一種藥物組合物，其包含一種表達構建體和一種可藥用載體或稀釋劑，所述表達構建體包含編碼本發明第一，第二和第三方面的分離的蛋白質複合物的一或多種核酸。
第六方面，本發明提供了一種能表達重組的本發明第一，第二和第三方面的蛋白質複合物或能形成所述複合物的重組蛋白的轉化細胞。
第七方面，本發明提供了一種調節細胞增殖和/或遷移的方法，包括給予動物或其分離的細胞本發明第一，第二和第三方面的一種分離的蛋白質複合物的步驟。
優選地，所述分離的蛋白質複合物包含一種IGFBP和玻連蛋白。
優選地，所述分離的蛋白質複合物還包含IGF-I。
第八方面，本發明提供了一種調節細胞增殖和/或遷移的方法，包括給予動物或其分離的細胞一種製劑，其防止或破壞本發明第一，第二和第三方面的一種分離的蛋白質複合物的形成的步驟。
優選地，所述製劑防止或破壞IGFBP和玻連蛋白之間的相互作用。
更優選地，所述製劑防止或破壞IGFBP和玻連蛋白之間的相互作用，其中所述蛋白質複合物包含IGF-I。
所述製劑例如可以是IGFBP和玻連蛋白之間或IGFBP相關蛋白和玻連蛋白之間的相互作用的拮抗劑。
抑制IGFBP和玻連蛋白複合物形成的製劑例如是IGF-II。
如下文更詳細的闡述，IGFBP和玻連蛋白之間的相互作用的破壞不僅抑制致瘤細胞增殖，還抑制腫瘤轉移，這兩種情況是腫瘤病理學的關鍵問題。
本發明的另一方面提供了前述各方面的分離的蛋白質複合物和方法在治療或預防性處理上皮細胞疾病如牛皮癬，動脈硬化，胃腸道上皮惡化和上皮乳癌疾病，和/或在促進創傷癒合，皮膚修復，潰瘍和燒傷康復，體外皮膚再生如針對移植自體皮膚，骨再生和修復損傷的神經組織中的應用。
因此，本發明還提供了包含本發明分離的蛋白質複合物一種外科植入物或修復物。所述外科植入物或修復物可以用所述分離的蛋白質複合物包被、浸漬或以其它方式預處理。
根據本發明處理的動物可以是哺乳動物，優選是人，或可以是非哺乳動物脊椎動物，如魚類，爬行動物或鳥，或分離自其中的細胞。
在本說明書中，除非特別指出，所用術語「包含」的含義是包含而不排除其它，所以所指出的整體或整體組可以包括一或多個其它非未指出的整體或整體組。
附圖和表的簡述表1揭示編碼生長因子和生長因子結合蛋白的核酸的參考文獻列表。
表2與玻連蛋白結合的IGF-I和IGFBP-5在HaCAT人角質形成細胞中刺激蛋白質合成。數據得自單次實驗的3H-亮氨酸摻入測定值，並以相對於對照組(沒有IGF-I，IGFBP-5或玻連蛋白)在24小時後的刺激百分率表示，每種處理均以一式三份進行。將IGF-I在存在(+)玻連蛋白(300ng/孔)或不存在(一)玻連蛋白的情況下加入IGFBP-5中(5ng/孔)。
圖1使用增加濃度的胰島素(▲)或IGF-II(◆)與[125I]-IGF-II競爭結合300ng玻連蛋白(VN)/孔的競爭結合分析。將放射標記的IGF-II(10,000cpm)加入VN包被的孔中，並在溫育過夜及幾次洗滌後確定結合的計數。所述結合用相對於在沒有IGF-II或胰島素加入的對照孔中觀測的結合的百分率表示。所述結果以得自三個實驗中的一個代表實驗的三次重複的平均值±標準偏差示出。
圖2使用增加濃度的IGF-I或IGF-II與[125I]-IGF-II競爭結合300ng玻連蛋白(VN)/孔的競爭結合分析。將放射標記的IGF-II(10,000cpm)加入VN(■)或IGFBP2(◆)包被的孔中，並在溫育過夜及幾次洗滌後確定結合的計數。所述結合用相對於在沒有IGF加入的對照孔中觀測的結合的百分率表示。
圖3使用增加濃度的proIGF-II(■)或IGF-II(◆)與[125I]-IGF-II競爭結合300ng玻連蛋白(VN)/孔的競爭結合分析。將放射標記的IGF-II(10,000cpm)加入VN包被的孔中，並在溫育過夜及幾次洗滌後確定結合的計數。所述結合用相對於在沒有IGF-II或proIGF-II加入的對照孔中觀測的結合的百分率表示。所述結果以得自兩個獨立實驗的三份重複的平均值±SEM示出。
圖4使用增加濃度的PAI-1(■)或IGF-II(◆)與[125I]-IGF-II競爭結合300ng玻連蛋白(VN)/孔的競爭結合分析。將放射標記的IGF-II(10,000cpm)加入VN包被的孔中，並在溫育過夜及幾次洗滌後確定結合的計數。所述結合用相對於在沒有IGF-II或PAI-1加入的對照孔中觀測的結合的百分率表示。所述結果以得自三個獨立實驗的一個代表性實驗的三份重複的平均值±標準偏差示出。
圖5對比(A)IGF-II和IGFBP3預溫育及(B)IGF-I和IGFBP3預溫育對結合玻連蛋白的作用的競爭結合分析。IGFBP3是非糖基化的並在大腸桿菌中產生。將增加濃度的IGFBP3與10,000cpm[125I]-IGF-II(A)或[125I]-IGF-I(B)預溫育4小時，之後加入玻連蛋白包被的孔中。或者，不用預溫育將IGFBP3和10,000cpm[125I]-IGF-II(A)或[125I]-IGF-I(B)加入玻連蛋白包被的孔中。所述結合以在沒有非特異性結合的情況中獲得的cpm表示。結果以得自三個獨立實驗的一個代表性實驗的三份重複的平均值示出。
圖6標記的IGF-I與VN包被的孔在存在(A)IGFBP1，(B)IGFBP2，(C)IGFBP3，(D)IGFBP4，(E)IGFBP5和(F)IGFBP6情況下的結合。這些重組的IGFBP在哺乳動物細胞中產生。以在存在指定的IGFBP情況中結合的標記IGF-I的平均cpm/VN包被的孔(300ng/孔)表示的數據，得自6個單獨測定。在每個孔中加入10000cpm放射標記的IGF-I。
圖7標記的IGF-I與VN在存在「Gly IGFBP-3」(糖基化IGFBP-3)，「IGFBP-3 HBD突變體」(具有突變的推定的肝素結合結構域的IGFBP-3)和「non-gly IGFBP-3」(非糖基化IGFBP-3)情況下的結合。
圖8使用增加濃度的IGF和desIGF與用[125I]-IGF-I或[125I]-IGF-II溫育的非糖基化IGFBP3競爭的競爭結合分析。將30ng(A)或10ng(B)的IGFBP3加上10,000cpm[I]-IGF-II(A)或IGF-I(B)加入VN-包被的孔中。加入增加濃度的IGF-I，IGF-II，des(1-3)IGF-I(未示出)和des(1-6)IGF-II，以與放射標記物競爭結合VN。經10ng(A)or 30ng(B)IGFBP3處理的VN包被的對照孔與只用VN包被的對照孔一起示出。結合以在沒有非特異性結合中獲得的cpm表示。結果以在三個單獨實驗的三份重複的平均值±標準偏差表示。
圖9在人角質形成細胞中刺激蛋白質合成。以24小時之後高於對照(-VN，-IGF-II)的刺激％表示的數據，得自三個重複實驗，其中每種處理均以一式三份進行測試。由空心杆(只有VN的作用)組合灰色杆(只有IGF-II的作用)表示的理論相加作用與實際觀測的預結合的IGF-II對VN的作用(黑色杆)相對比。在除了所測試的最低濃度IGF-II之外的所有情況中，實際觀測的作用明顯高於計算的相加作用(p＜0.05)。
圖10標記的IGF-II與VN包被的孔在存在(A)IGFBP1，(B)IGFBP2，(C)IGFBP3，(D)IGFBP4，(E)IGFBP5和(F)IGFBP6的情況下的結合。這些重組IGFBP在哺乳動物細胞中產生。以在存在指定IGFBP情況下結合的標記IGF-II的平均cpm/VN包被的孔(300ng/孔)表示的數據，得自六個單獨的測定。將10000cpm放射標記的IGF-II加入每個孔中。
發明詳述本發明至少部分得自本發明人的發現，即IGF-I通過IGFBP與玻連蛋白之間的結合相互作用而結合玻連蛋白。另外，本發明闡述了變體IGF和IGFBP，其可以用於增加或減少IGF，IGFBP和玻連蛋白之間的結合。這些發現使本發明人得以在體外運用這些結合相互作用以操縱與細胞生長，增殖和遷移相關的偶然體內生物學事件。本發明因此在醫學和獸醫學領域中的醫學治療如創傷癒合，皮膚修復和保養，骨再生，動脈硬化和癌症治療中具有用途。
本發明中，「分離的」是指從其天然環境中分離，或以其它方式進行人工操縱。分離的物質可以完全或基本沒有在其天然狀態中通常伴隨的成分，或者可以操縱為加上其天然環境中通常伴隨其的成分的人工狀態。
「多肽」也意味著「蛋白質」，是指胺基酸聚合物。
包括生長因子，生長因子結合蛋白和玻連蛋白的蛋白質和肽，可以以天然的，化學合成的或重組合成形式分離。
「肽」是指具有不超過50個胺基酸的蛋白質。
「生物活性片段」是指蛋白質的片段、部分或區段，其呈現所述蛋白質的至少1％，優選至少10％，更優選至少25％，及最優選至少50％的生物學活性。
肽可以易於通過重組或化學合成方法合成。例如，可參考溶液合成或固相合成方法，例如Blaclcwell科學出版社出版的Nicholson編輯的題目為「合成疫苗」的出版物中由Atherton和Shephard所著第九章「肽合成」中所述方法。肽合成方法也見於Coligan等編輯的《蛋白質科學通用方法》第18章所述(John Wiley Sons NY，1997)，在此併入參考。
或者，肽可以通過用蛋白酶如endoLys-C，endoArg-C，endoGlu-C和葡萄球菌V8-蛋白酶消化本發明多肽而產生。消化的片段可以通過例如高效液相層析(HPLC)技術純化。
在一個優選的形式中，本發明提供了一種分離的蛋白質複合物，其包含玻連蛋白，生長因子和生長因子結合蛋白。
「生長因子」是指一種分子，其刺激或促進機體或所述機體細胞生長。優選的生長因子是刺激細胞分化，尤其哺乳動物細胞分化的一種蛋白質或肽。
優選地，本發明分離的蛋白質複合物包含生長因子IGF-I。
分離的IGF和IGFBP多肽可從如GroPep(Adelaide，澳大利亞)商購，而VN多肽可從Promega公司(Madison WI，美國)商購。重組的IGF，IGFBP和VN易於由本領域技術人員生產，在下文詳加闡述。
本領域技術人員還會意識到本發明還包括IGF的前體。pro-IGF-I蛋白的例子是已經除去信號肽但未由切割E-結構域而完全加工的IGF-I。IGF-I具有得自不同的mRNA剪接的三個不同E結構域，而且這些前體蛋白可以存在於本發明分離的蛋白質複合物中。
然而，本發明還涵蓋了分離的蛋白質複合物，其包含生長因子如表皮生長因子(EGF；(Heldin等，1981，科學4 1122-1123)，成纖維細胞生長因子(FGF；Nurcombe等，2000，生物化學雜誌275 30009-30018)，鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF；Taraboletti等，1997，細胞生長差異8 471-479)，骨橋蛋白(Nam等，2000，內分泌學141 1100)，血小板反應蛋白-1(Nam等，2000，如前)，腱生蛋白-C(Arai等，1996，生物化學雜誌271 6099)，PAI-1(Nam等，1997，內分泌學138 2972)，纖溶酶原(Campbell等，1998，Am.J.Physiol.275 E321)，纖維蛋白原(Campbell等，1999，生物化學雜誌274 30215)，纖維蛋白(Campbell等，1999，如前)或運鐵蛋白(Weinzimer等，2001，臨床內分泌代謝雜誌86 1806)。
優選地，包含骨橋蛋白，血小板反應蛋白-1，腱生蛋白-C或PAI-1的分離的蛋白質複合物還包含IGFBP-5。
優選地，包含纖溶酶原，纖維蛋白原，纖維蛋白或運鐵蛋白的分離的蛋白質複合物還包含IGFBP-3。
本發明涵蓋了分離的蛋白質複合物，其包含單體的和多聚體玻連蛋白，因為玻連蛋白可以以單體或多聚體狀態存在。特別地，多聚體VN積聚在血管損傷區域，並在組織中也是VN的主要形式。因此多聚體形式的VN提供了形成一種VN複合物的機會，其中可同時輸送一種以上類型的生長因子或生長因子結合蛋白。
本領域技術人員還會意識到本發明分離的蛋白質複合物可以包括本領域熟知的「天然」，「變性」或「延伸」狀態的玻連蛋白。
本發明還涵蓋了包含nectinepsin的分離的生長因子複合物，nectinepsin是一種胞外基質蛋白，與VN在胺基酸水平示出60％同源性(Blanchert等，1996，生物化學雜誌271 26220-26226)。
也應理解生長因子，生長因子結合蛋白和/或玻連蛋白的變體可以用於形成本發明分離的蛋白質複合物，並可以用於本發明方法中。
如本文所用，本發明的「變體」蛋白質，多肽和肽包括其中一或多個胺基酸由不同胺基酸置換的那些物質。
本領域熟知一些胺基酸可以用具有廣泛相似性質的其它胺基酸置換，而不改變所述多肽的活性性質(保守取代)。
功能上的實質變化可以通過選擇保守性較低的取代產生。其它置換是非保守取代而且相對較少可以被耐受。通常地，可能產生多肽性質最大變化的取代是那些其中(a)親水性殘基(例如Ser或Thr)由疏水性殘基(例如Ala，Leu，Ile，Phe或Val)取代；(b)半胱氨酸或脯氨酸由任何其它殘基取代；(c)具有陽電側鏈的殘基(例如Arg，His或Lys)由陰電殘基(例如Glu或Asp)取代；或(d)具有大側鏈的殘基(例如Phe或Trp)由具有較小側鏈的殘基(例如Ala，Ser)或無側鏈殘基(例如Gly)取代。
變體還包括已經例如通過綴合或複合其它化學組分或通過本領域已知的翻譯後修飾方法改變的蛋白質，多肽和肽。這種衍生物包括胺基酸缺失和/或添加。
本發明涵蓋的其它多肽和肽變體包括但非限於側鏈修飾，在肽，多肽或蛋白質合成期間摻入非天然胺基酸和/或其衍生物，及使用交聯劑和對本發明多肽和肽變體具有構象限制的其它化合物。本發明涵蓋的側鏈修飾例如包括修飾氨基基團，如用乙酐醯化；用琥珀酐和四氫鄰苯二甲酸酐醯化氨基基團；用甲基醯亞胺化物醯胺化；用氰酸鹽氨甲醯化氨基基團；用5-磷酸吡哆醛吡哆化賴氨酸隨後用NaBH4還原；通過與醛反應隨後用NaBH4還原進行還原烷化；及用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)三硝基苄基化氨基基團。
羧基可以經過O-醯異脲形成隨後衍生化而通過碳二亞胺活化而修飾，例如修飾為相應醯胺。
精氨酸殘基的胍基可以通過與如2，3-丁二酮，苯甲醯甲醛和乙二醛等試劑形成雜環縮合產物而修飾。
修飾巰基可以通過如過甲酸氧化為胱氨酸；使用4-氯高汞苯磺酸，4-氯高汞苯甲酸，2-氯高汞-4-硝基酚，氯化苯汞和其它汞劑形成汞衍生物；與其它硫醇化合物形成混合的二硫化物；與馬來醯亞胺，馬來酐或其它取代的馬來醯亞胺反應；用碘乙酸或碘乙醯胺進行羧甲基化；及用氰酸鹽在鹼性pH進行氨甲醯化。
修飾色氨酸殘基可以例如通過用2-羥基-5-硝基苄基溴化物或磺醯滷化物烷化吲哚環，或用N-溴琥珀醯亞胺氧化進行。
修飾酪氨酸殘基可以通過用四硝基甲烷硝化形成3-硝基酪氨酸衍生物而進行。
修飾組氨酸殘基的咪唑環可以用焦碳酸二乙酯進行N末端carbethoxylation或用碘乙酸衍生物烷化進行。
在肽合成期間摻入非天然胺基酸和衍生物的實例包括但非限於使用4-氨基丁酸，6-氨基己酸，4-氨基-3-羥基-5-苯戊酸，4-氨基-3-羥基-6-甲基庚酸，叔丁基甘氨酸，正亮氨酸，正纈氨酸，苯基甘氨酸，鳥氨酸，肌氨酸，2-噻吩基丙氨酸和/或胺基酸的D-異構體。
修飾還包括O-和N-連接的糖基化變體和天然發生狀態為糖基化的蛋白質的非糖基化形式。
關於這些變體，可以通過誘變多肽或誘變編碼核酸而產生，如通過隨機誘變或定點誘變。核酸誘變方法例如見於Ausubel等，分子生物學通用方法，第9章所述，在此併入參考。
本領域技術人員意識到，當有助於生物學活性的胺基酸殘基的知識可以獲得時，進行定點誘變是最佳的。在許多情況中，這個信息不能獲得，或只能例如通過分子模擬近似值推斷。
在這種情況中，進行隨機誘變。隨機誘變方法包括通過羥胺化學修飾蛋白質(Ruan等，1997，基因188 35)，在核酸中摻入dNTP類似物(Zaccolo等，1996，分子生物學雜誌255 589)，及基於PCR的隨機誘變如Stemmer，1994，美國科學院院報91 10747或Shafikhani等1997，生物技術23 304所述，在此均併入參考。也注意到基於PCR的隨機誘變試劑盒可商購，如DiversifyTM試劑盒(Clontech)。
本發明還涵蓋了生長因子變體如des(1-6)IGF-II和des(1-3)IGF-I形成本發明分離的蛋白質複合物的應用。
用作興奮劑或拮抗劑的其它變體IGF和IGFBP在下文進一步闡述。
重組生長因子複合物可以意識到分離的蛋白質複合物可以通過在本領域熟知的適當宿主細胞或無細胞表達系統中表達核酸而用重組生長因子，生長因子結合蛋白和/或玻連蛋白產生。
術語「核酸」是指單鏈或雙鏈的mRNA，RNA，cRNA和DNA，所述DNA包含cDNA和基因組DNA。
「多核苷酸」是具有80或更多個連續核苷酸的核酸，而「寡核苷酸」是少於80個核苷酸的核酸。
「探針」可以是適當標記的單鏈或雙鏈寡核苷酸或多核苷酸，以例如在Northern或Southern印跡中檢測互補序列。
「引物」通常是單鏈的寡核苷酸，優選具有15-50個連續核苷酸，其能與互補核酸「模板」退火，並以模板依賴性方式通過DNA聚合酶(如Taq聚合酶)的作用而延伸。
本領域熟知編碼IGF，EGF，IGFBP，ALS和VN的核酸，並且已供使用多年。然而，本領域技術人員可參考表1，其中列出了提供這些核酸序列的參考文獻。表1中的所有參考文獻均併入參考。
本發明的核酸可以根據以下程序製備(i)產生任選是簡併的引物，其中每種引物均包含靶核酸的各自部分；及(ii)使用所述引物組合核酸擴增技術以從核酸提取物中擴增一或多個產物。
本領域技術人員熟知適當的核酸擴增技術，包括聚合酶鏈反應(PCR)，例如Ausubel等，如前，第15章所述，在此併入參考；鏈置換擴增(SDA)，例如美國專利No 5,422,252所述，在此併入參考；滾環複製(RCR)，例如Liu等，1996，J.Am.Chem.Soc.118 1587，國際出版物WO 92/01813和國際出版物WO 97/19193所述，在此併入參考；基於核酸序列的擴增(NASBA)，例如Sooknanan等，1994，生物技術17 1077所述，在此併入參考；連接酶鏈反應(LCR)，例如國際申請WO89/09385所述，在此併入參考；及Q-β複製酶擴增，例如Tyagi等，1996，美國科學院院報93 5395所述，在此併入參考。
本文所用「擴增產物」是指通過核酸擴增方法產生的核酸產物。
重組蛋白可以通過本領域技術人員已知的任何適當方法製備。
例如，重組蛋白可以通過包括以下步驟的方法製備(i)製備一種表達構建體，其包含可操縱地連接於一或多個調節核苷酸序列的一種核酸；(ii)用所述表達構建體轉染或轉化一種適當的宿主細胞；及(iii)在所述宿主細胞中表達所述多肽。
為進行宿主細胞表達，所述重組核酸可操縱地連接於表達載體中的一或多個調節序列。
「表達載體」可以是自身複製染色體外載體如質粒，或整合入宿主基因組的載體。
「可操縱地連接」是指所述調節核苷酸序列相對於本發明重組核酸的定位能起始、調節或以其它方式控制轉錄。
調節核苷酸序列一般適於用於表達的宿主細胞。針對不同的宿主細胞，本領域已知多種類型的適當表達載體和適當調節序列。
典型地，所述一或多個調節核苷酸序列可以包括但非限於啟動子序列，前導或信號序列，核糖體結合位點，轉錄起始和終止序列，翻譯起始和終止序列，及增強子或激活子序列。
本發明涵蓋本領域已知的組成型或可誘導啟動子。所述啟動子可以是天然發生的啟動子，或組合一個以上啟動子的雜合啟動子。
在一個優選的實施方案中，所述表達載體包含一個選擇標記基因，以選擇轉化的宿主細胞。本領域熟知選擇標記基因並可根據所用宿主細胞而變化。
所述表達載體還可以包含一個融合配偶體(典型由所述表達載體提供)，以便本發明的重組多肽與所述融合配偶體形成融合多肽而表達。融合配偶體的主要優點是其有助於鑑別和/或純化所述融合多肽，並還增強蛋白質表達水平和整體產量。
為表達所述融合多肽，必需將本發明的核酸序列與所述表達載體連接，以便融合配偶體的翻譯讀框與本發明核苷酸序列一致。
融合配偶體的熟知實例包括但非限於穀胱甘肽S-轉移酶(GST)，人IgG的Fc部分，麥芽糖結合蛋白(MBP)和六組氨酸(HIS6)，這些物質特別用於通過親和層析分離所述融合多肽。為通過親和層析純化融合多肽，親和層析的相關基質分別是穀胱甘肽，直鏈澱粉和鎳或鈷綴合的樹脂。許多這種基質可以以試劑盒形式獲得，如具有(HIS6)融合配偶體的QIA表達系統(Qiagen)和Pharmacia GST純化系統。
本領域熟知的另一種融合配偶體是綠螢光蛋白(GFP)。這種融合配偶體作為螢光「標記」，可以使本發明的融合多肽通過螢光顯微鏡或流式細胞儀鑑別。所述GFP標記可用於評估本發明融合多肽的亞細胞定位，或分離表達本發明融合多肽的細胞。流式細胞術如螢光激活細胞分選(FACS)在後一應用中特別有用。
在一些情況中，所述融合配偶體還具有蛋白酶切割位點，如因子Xa或凝血酶，其使相關的蛋白酶部分消化本發明融合多肽，並從而從中釋放本發明重組多肽。釋放的多肽然後通過隨後的層析分離可以自融合配偶體中分離。
本發明融合配偶體還包含「附加表位」，其通常是短肽序列，由此可獲得特異抗體。可易於獲得特異的單克隆抗體的附加表位的熟知實例包括c-myc，流感病毒血凝素和FLAG標記。
所述重組蛋白可以由本領域技術人員使用標準方法常規製備，例如Sambrook等，分子克隆實驗室指南(冷泉港出版社，1989)，特別是在第16和17章所述，在此併入參考；分子生物學通用方法，特別在第10和16章所述，Ausubel等編輯(John Wiley Sons，Inc.1995-1999)，在此併入參考；及蛋白質科學通用方法，Coligan等編輯(John Wiley Sons，Inc.1995-1999)，特別在第1，5和6章所述，在此併入參考。
在一個實施方案中，可以分別進行生長因子，生長因子結合蛋白和玻連蛋白的重組表達，並從中形成複合物。
在另一個實施方案中，可以在相同細胞中進行生長因子，生長因子結合蛋白和玻連蛋白的重組表達，並從中形成複合物。
在這裡，本發明多肽可以通過培養用所述表達構建體轉化的宿主細胞產生，所述表達構建體包含編碼本發明多肽或其類似物的核酸。
適於蛋白質表達的條件隨著選擇的表達載體和宿主細胞而變化。這易於由本領域技術人員通過常規試驗而確定。
適於重組表達的宿主細胞包括細菌如大腸桿菌，梭菌，假單胞菌，酵母，植物細胞，昆蟲細胞(如Sf9)和哺乳動物細胞如成纖維細胞和角質形成細胞。
優選的宿主細胞是人角質形成細胞。
本發明涵蓋了誘導型和非誘導型表達載體。在適當轉染的哺乳動物細胞中，已經設計了許多誘導和阻遏系統，包括金屬硫蛋白(MT)誘導的及四環素抑制(tetR)系統，本發明涵蓋每種系統。
適當的表達載體和重組IGFBP表達方法的特殊實例可見於美國專利5,973,115所述，在此併入參考。
模擬物，興奮劑和拮抗劑本發明涵蓋了可以促進，阻止或破壞蛋白質複合物形成的製劑，所述蛋白質複合物包含生長因子，生長因子結合蛋白和玻連蛋白。這種製劑可以是一種模擬物。術語「模擬物」是指這樣的分子，其被設計為模擬蛋白質或肽的特定功能區域，本領域熟知的術語「興奮劑」，「類似物」和「拮抗劑」包括在其範圍內。
關於負責IGF-IGFBP結合的IGF和IGFBP部分的闡述見於國際出版物WO00/23469所述。另外，已經產生選擇性結合IGFBP-1或IGFBP-3的IGF-I的興奮劑變體，如國際出版物WO00/40612所述。
因此本發明涵蓋了可以被工程化以破壞或阻止IGFBP與VN之間形成多肽複合物的製劑。一個實例是一種肽，其通過模擬VN或IGFBP上的結合位點而競爭IGFBP與VN的結合。
如後文的更詳細闡述，IGF-II是一種能抑制IGFBP與玻連蛋白之間結合的製劑。也提議IGF-II的C結構域中第34-40位RVSRRSR序列的V35或S36殘基連同S39，可以突變為鹼性殘基，從而模擬IGFBP3的HBD(BXBBB，其中B是一個鹼性胺基酸殘基)。這樣可以產生更能抑制IGFBP與玻連蛋白之間複合物的形成的製劑。
本發明涵蓋的興奮劑的一個實例是被工程化而包含一個IGFBP的肝素結合結構域(HBD)從而直接結合玻連蛋白的IGF-I。例如，IGF-I的C結構域中SSSRRAPQT序列可以工程化為具有BXBBB基序。一個優選的BXBBB基序是IGFBP-3的KGRKR序列(第228-232位殘基)。
或者，可以將推定的IGF-II的玻連蛋白結合結構域RVSRRSR(第34-40位殘基)導入IGF-I中。
本發明拮抗劑的一個實例是被工程化而突變HBD中的鹼性殘基(如前文所述)以降低或阻止IGFBP與玻連蛋白的結合的IGFBP，。
適當地，工程IGFBP能結合IGF-I。
優選地，工程IGFBP是IGFBP-3或IGFBP-5。
本發明還涵蓋了IGFBP的類似物，其可以被工程化使所述類似物與VN之間形成複合物。適當地，所述類似物還可以結合IGF。這種類似物的潛在優點是其比IGFBP更易於合成或分離，具有特別需要的生物學半衰期並或許已被工程化而特異性結合IGF-I。
上述模擬物可以是具有所需生物學活性和半衰期的肽，多肽或其它有機分子，優選小有機分子。
計算機輔助結構資料庫檢索日益用作鑑別模擬物的程序。資料庫檢索方法原則上可以適用於鑑別模擬物，見於國際出版物WO94/18232(涉及產生HIV抗原模擬物)，美國專利No.5,752,019和國際出版物WO 97/41526(涉及鑑別EPO模擬物)所述，在此均併入參考。
其它方法包括鑑別分子相互作用的各種生物學方法。這些方法可以根據所述候選分子是否影響IGF-IGFBP-VN複合物的形成而篩選候選分子。適當的方法如競爭性放射性配體結合分析(見Upton等，1999，前述相關方法)，分析超速離心，微量量熱法，表面等離子體共振和基於光學生物傳感器的方法，由Coligan等編輯的《蛋白質科學》第20章所提供(John Wiley Sons，1997)，在此併入參考。
藥物組合物本發明包括以藥物組合物形式的本發明蛋白質複合物的施用。本發明的藥物組合物可以包括分離的蛋白質複合物，其包含變體IGF和/或IGFBP或如前述破壞或阻止所述複合物形成的製劑。
適當地，所述藥物組合物包含一種可藥用載體。藥物組合物還可以包含如前述多肽變體，片段或模擬物。
「可藥用載體」是指一種固體或液體充填劑，稀釋劑或形成膠囊的物質，其可以安全用於全身施用。根據施用的特殊途徑，可以使用本領域熟知的各種載體。這些載體可以選自糖，澱粉，纖維素及其衍生物，麥芽，明膠，滑石，硫酸鈣，植物油，調和油，多元醇，藻酸，磷酸鹽緩衝溶液，乳化劑，等滲鹽水，和無熱源水。
可以使用任何適當途徑為患者提供本發明組合物。例如可以應用經口服，直腸，非腸道，舌下，口腔，靜脈內，關節內，肌內，皮內，皮下，吸入，眼內，腹膜內，腦室內，經皮等方法。例如為施用免疫原性組合物、疫苗和DNA疫苗合適的是肌內和皮下注射。
劑型包括片劑，分散液，懸浮液，注射液，溶液，糖漿，藥片，膠囊，栓劑，氣霧劑，經皮貼片等。這些劑型還可以包括特別為此設計的注射或植入控制釋放裝置，或經修改以此方式起作用的其它形式植入體。所述治療劑的控制釋放可以例如用疏水性聚合物包衣而實現，所述聚合物包括丙烯酸樹脂，蠟，高級脂肪醇，聚乳酸和聚乙醇酸和某些纖維素衍生物如羥丙甲基纖維素。另外，所述控制釋放可以通過使用其它聚合物基質，脂質體和/或微球實現。
適於口服或非腸道施用的本發明的藥物組合物可以以分立單位存在，如膠囊，小袋或片劑，每劑均含有預定數量的一或多種本發明治療劑，可以以粉末或顆粒或溶液或在水溶液中的懸浮液，非水溶液液體，水包油乳狀液或油包水液態乳狀液形式存在。
關於包含IGF和IGFBP的藥物組合物，特別參考美國專利5,936,064和國際出版物WO99/62536和WO99/54359所述，在此併入參考。
本發明的藥物組合物還可以包含表達載體，如病毒載體如痘苗，及在基因治療中有用的病毒載體。後者包括腺病毒和腺病毒伴隨病毒(AAV)，如Braun-Falco等，1999，基因治療6 432所述，逆轉錄病毒和慢病毒載體，如Buchshacher等，2000，血液95 2499所述，及得自單純皰疹病毒和巨細胞病毒的載體。用於內分泌基因治療的病毒載體的綜述見於Stone等，2000，內分泌學雜誌164 103所述。
本發明還可利用基因表達定向於表皮細胞的特殊表達載體，如美國專利5,958,764所述，及針對體內創傷癒合應用，如美國專利5,962,427所述。
上述出版物在此均併入參考。
治療用途本發明提供了使用本發明多肽複合物的治療方法。這些方法特別針對於治療性處理哺乳動物，尤其是人。
這種方法包括施用上述藥物組合物，而且可以通過顯微針注射入特異組織部位，如美國專利6,090,790所述，用於創傷，燒傷或潰瘍的局部乳液，洗劑或密封敷料，如美國專利6,054,122所述，或釋放所述組合物的植入體，如國際出版物WO99/47070所述。
在這方面也可以應用基因治療，如美國專利5,929,040和美國專利5,962,427所述方法。
還有可以遺傳修飾皮膚細胞以產生皮膚替代品的方法，如通過遺傳工程化所需生長因子的表達(Supp等，2000，J.Invest.Dermatol.1145)。關於這個領域的一個實例見於Bevan等，Biotechnol.Gent.Eng.Rev.16 231所述。
本發明還涵蓋了將轉染的或轉化的細胞「種植」給一種受體的方法，如國際出版物WO99/11789所述。
這些方法可用於刺激細胞增殖，並從而促進或加速創傷和燒傷癒合，修復皮膚損害如潰瘍，組織置換和移植如通過體外培養自體皮膚進行，內部器官如腎和肺的再上皮化，及修復損傷的神經組織。
皮膚置換治療已為本領域所熟知，並可以利用共同培養的上皮/角質形成細胞系，如Kehe等，1999，Arch.Dermatol.Res.291 600所述，或體外培養原代(通常是自體的)表皮、真皮和/或角質形成細胞。這些技術也可以利用工程生物材料及合成的聚合物「支架」。
關於這個領域的實例見於Terskikh Vasiliev，1999，Int.Rev.Cytol.188 41和Eaglestein Falanga，1998，Cutis 621提供。
更特別地，在顱面手術中所用的置換口腔黏膜的產生見於Izumi等，2000，J.Dent.Res.79 798所述。胎兒角質形成細胞和真皮成纖維細胞可以在體外擴展，以產生用於移植的皮膚，治療皮膚損傷，如Fauza等，J.Pediatr.Surg.33 357所述，同時得自在透明質酸衍生的生物材料上體外培養的真皮和表皮的皮膚替代品示出具有治療燒傷的潛力(Zacchi等，1998，J.Biomed.Mater.Res.40 187)。
上皮細胞療法的另一方面涉及胃腸道上皮內膜的修復，以治療或防止腸道功能衰退。
本發明還涵蓋了聚合物支架，其促進置換皮膚工程，例如Sheridan等，2000，控制釋放雜誌14 91和Fauza等，1998，如前所述，本發明還包括作為將皮膚細胞輸送至創傷和燒傷部位的製劑的微球(LaFrance Armstrong，1999，Tissue Eng.5 153)。
根據本發明可容易地利用上述方法，使用本發明分離的蛋白質複合物促進皮膚細胞增殖以進行組織置換和美容性皮膚處理。
關於骨再生，本發明提供了用本發明分離的蛋白質複合物包被、浸漬或以其它方式預處理的外科或修復植入體。
相反，通過阻止或破壞IGF-IGFBP-VN複合物形成而阻止或抑制細胞遷移，可以進行預防性或治療性處理牛皮癬或惡性病如上皮細胞癌如乳癌。
本發明還涵蓋了通過將本發明分離的蛋白質複合物給予幹細胞或祖細胞而分化幹細胞或祖細胞的方法。在此方法中也可以使用包含變體生長因子和IGFBP的分離的蛋白質複合物。
根據這種方法產生的分化的細胞可以用於如前述治療方法中。
例如，據信平滑肌細胞是「間充質幹細胞」，而且可以被驅動分化為成纖維細胞，基質細胞，內皮細胞，骨細胞或脂肪細胞。
為使本發明易於理解並實際應用，現在通過以下非限制性實施例闡述特別優選的實施方案。
在此所述的所有放射性配體競爭結合分析均基本如Upton等，1999，如前所述進行。
實施例1確定胰島素、pro-IGF-II和IGF-I與IGF-II競爭結合玻連蛋白的能力的競爭結合分析由於IGF和胰島素之間結構相似，因此檢測胰島素與玻連蛋白的結合。通過Upton等，1999(如前)所述進行交聯試驗表明胰島素不太可能與IGF-II競爭結合玻連蛋白，用IGF-I出現相同情況。因此，檢測高濃度的胰島素以確定胰島素是否能與放射標記的IGF-II競爭結合玻連蛋白。示於圖1的結果表明與最初用IGF-I觀測到的情況相同(Upton等，1999，如前)，胰島素幾乎不與[125I]-IGF-II競爭結合玻連蛋白。
IGF-I作為IGF-II結合玻連蛋白的競爭劑的研究表明IGF-I可以競爭[125I]-IGF-II與玻連蛋白的結合(圖2)。然而，在與放射標記的IGF-II競爭結合玻連蛋白中，IGF-I的效力明顯低於IGF-II，要達到同樣效力，需要IGF-I的濃度高於IGF-II的大約3000倍。
相似研究表明proIGF-II可以與[125I]-IGF-II競爭結合玻連蛋白(圖3)。ProIGF-II在與[125I]-IGF-II競爭結合玻連蛋白中沒有IGF-II那樣的效力，IC50值分別為65.6nM和9.6nM。因此，在proIGF-II內E結構域的存在代表了改變與玻連蛋白結合的結構修飾。這可以是由於與IGF-II相比proIGF-II中額外的結構域的位阻現象，或者可以是由於proIGF-II分子結構改變從而改變了proIGF-II與玻連蛋白的親和性。
實施例2PAI-1和uPAR作為IGF-II與玻連蛋白結合的競爭劑的研究對PAI-1和suPAR可能是與IGF-II競爭結合玻連蛋白的分子進行研究，因為已經報導這些蛋白質結合玻連蛋白(Declerck等，1988，生物化學雜誌263 15454；Wei等，1994，生物化學雜誌269 32380；Kanse等，1996，Exp.Cell Res.224 344)。在高達2000nM濃度，觀測到PAI-1與[125I]-IGF-II競爭結合玻連蛋白IC50值為大約524nM(圖4)。儘管從IC50值看這個濃度相對較高，但是發現這類濃度可與體內腫瘤相關(Grondahl-Hansen等，1993，癌症研究53 2513)。事實上，Kjoller等，1997，Exp.Cell Res.232 420，發現需要370nM的PAI-1才能在確定PAI-1抑制WISH細胞遷移能力的分析中達到半數最大效應。推測這種抑制通過PAI-1與整聯蛋白和uPAR競爭結合玻連蛋白而產生。因此，在PAI-1，IGF-II和玻連蛋白之間觀測到的相互作用確實可能具有一些體內功能結果，特別當有時在腫瘤中發現IGF-II和PAI-1水平是高度表達的時候。
儘管已知PAI-1結合玻連蛋白N末端生長調節素B結構域，仍需要高濃度PAI-1才能有效與IGF-II競爭結合玻連蛋白，提示這些研究未提供關於玻連蛋白上IGF-II結合位點的位置的明確信息。然而，所述結果可以以兩種方式解釋。第一種可能是在IGF-II和PAI-1之間觀測到的競爭是由於在玻連蛋白生長調節素B結構域內一級高親和性位點由於位阻現象的部分競爭所致。或者，所述競爭可以是由於IGF-II和PAI-1之間的直接競爭，結合玻連蛋白上PAI-1結合親和性降低的位點。需要進一步的實驗研究以闡明這個問題。
儘管本發明人不能示出可溶的suPAR與IGF-II競爭結合VN，但這可能是由於在國際運輸後使用凍幹的suPAR所致。沒有跡象表明復水的suPAR是生物學活性的，儘管觀測到[125Il-suPAR不結合VN(數據未示出)也許支持用於這些研究的suPAR是失活的這種解釋。
使用與鑑別玻連蛋白上PAI-1結合位點位於含有44個N末端胺基酸的一玻連蛋白片段內的相似方法(Deng等，1995，Thromb.Haemost.74 66)，可以確定在PAI-1和IGF-II之間結合玻連蛋白的競爭是否是任一這些可能性的結果。
以前已經示出可溶形式的尿激酶受體(suPAR)]以結合固定的玻連蛋白(Wei等，1994，sUP7-a)。然而，在此報導的研究中，甚至濃度高達300nM，在suPAR和[125I]-IGF-II之間也未觀測到競爭結合玻連蛋白。
實施例3在存在非糖基化重組IGFBP-3情況下，IGF-I和IGF-II與玻連蛋白的結合為研究IGFBP是否能介導IGF與玻連蛋白結合，評定增加濃度的IGFBP-3在存在[125I]-IGF-I或[125I]-IGF-II的情況下的作用。結果示於圖5。
在所測試濃度，10ng/孔的IGFBP-3導致最大量的[125I]-IGF-I與玻連蛋白包被孔結合，而30ng/孔的IGFBP-3導致最大量的[125I]-IGF-II與玻連蛋白包被孔結合。所述作用在[125I]-IGF-I的情況中最顯而易見，因為低計數的[125I]-IGF-I結合玻連蛋白，甚至在最低濃度的IGFBP-3(3.7ng)，這種結合也增加(圖5A)。相反，[125I]-IGF-II未示出在玻連蛋白包被孔上獲得的結合增加，直至濃度為11ng/100μL-33ng/100μL也未達到(圖5B)。
用[125I]-IGF-I或[125I]-IGF-II預溫育IGFBP-3，與未預溫育的IGFBP-3和[125I]-IGF-I或[125I]-IGF-II相比，不改變與玻連蛋白的結合。
實施例4在存在在哺乳動物細胞中產生的重組IGFBP的情況下，IGF-I與玻連蛋白的結合如Upton等，1999所述(如前)進行結合分析，所述分析檢測在存在IGFBP的情況下，[125I]-IGF-I結合VN包被平皿的能力，所述IGFBP與放射標記同時加入。數據示於圖6。IGFBP-2，-4和-5的數量增加導致標記IGF-II與玻連蛋白包被孔結合增加。在測試的IGFBP最高量(5ng)，針對IGFBP-2，4和5，標記的IGF-I的結合與對照孔相比提高大約2.8，3.8和8倍，所述對照孔中存在VN而不存在IGFBP。
存在0.05、0.2和0.5ng/孔的IGFBP-3也增加標記IGF-I與VN的結合，而2和5ng/孔的IGFBP-3表現為抑制放射標記的IGF-I的結合。測試的所有濃度的IGFBP-1和IGFBP-6也均是抑制性的。
這些結果表明與IGF-II情況不同，觀測到IGF-I與VN的最小直接結合。然而，IGFBP、尤其IGFBP-2，-3，-4和-5的存在，增強IGF結合VN包被孔，提示在這種情況中IGFBP介導IGF-I與VN的結合。另外，數據提示IGFBP具有既增強又抑制IGF-I與VN結合的潛力，這取決於a)存在何種IGFBP及b)IGFBP存在量。
實施例5在存在IGFBP-3變體的情況下，標記IGF-II與VN的結合如上所述進行結合分析，所述分析檢測在存在IGFBP-3變體的情況下，[125I]-IGF-I結合VN包被平皿的能力，所述變體中推定的「肝素結合結構域」被突變(IGFBP-3 HBD)及其中糖基化位點被突變(Non-gly IGFBP-3，即非糖基化IGFBP-3)。數據示於圖7。
這些結合分析中使用的IGFBP-3糖基化突變體中的三個潛在的O-糖基化位點Asn89，Asn109，Asn172突變為Ala。
IGFBP-3 HBD突變體不增強[125I]-IGF-I與VN包被平皿的結合，提示IGFBP-3的肝素結合結構域參與IGFBP-3與VN的結合。其它研究已經鑑別推定的「肝素結合結構域」之外的胺基酸殘基與IGF-I結合IGFBP-3相關，因此很可能這個結果表示IGFBP-3與VN結合降低，而不是標記的IGF-II與IGFBP-3結合降低(Imai等，2000，生物化學雜誌27518188-18194)。
令人感興趣地，非糖基化IGFBP-3突變體明顯增強[125I]-IGF-I與VN包被平皿的結合。在存在2ng突變體IGFBP-3的情況下，標記的IGF-I與VN包被孔的結合驚人地提高20倍，這是令人感興趣的並提示IGFBP-3的糖基化抑制a)IGF-I與IGFBP-3或b)IGFBP-3與VN的相互作用。或者，這兩個相互作用均可以通過存在碳水化合物而阻礙。
非糖基化IGFBP-3在體內是否功能相關還未確定。然而，這個發現提示結合VN的非糖基化IGFBP-3可以是將IGF-I輸送至需要IGF-I以加強細胞功能之處的一種有效方式，如在刺激細胞增殖中。或者，結合VN的非糖基化IGFBP-3可以提供一種機制，在不需要細胞增殖的情況下隔絕過量IGF-I，如在過表達IGF的腫瘤中。
實施例6確定在存在非糖基化重組IGFBP-3的情況下，IGF變體與標記的IGF競爭結合VN的能力的競爭結合分析在競爭分析中使用圖5所述產生放射標記的IGF最大結合的IGFBP3濃度，以確定在存在IGFBP3情況下，濃度增加的IGF和desIGF是否可以與放射標記的IGF競爭結合玻連蛋白。結果表明高濃度的IGF-I，IGF-II，des(1-6)IGF-II及或許des(1-3)IGF-I(未示出)，在存在10ng的IGFBP3情況下，可以與[125I]-IGF-II競爭結合玻連蛋白(圖8)。這些實驗結果表明在存在30ng的IGFBP3情況下，只有IGF-I、IGF-1I和des(1-6)IGF-II可以與IGF-II競爭結合玻連蛋白包被孔。
實施例7包含IGF-II和玻連蛋白的分離的蛋白質複合物對細胞增殖的刺激在這個研究中使用將IGF-II與VN預先結合的策略，以嘗試更真實反映體內胞外環境。大多數細胞培養方法均在溶液相中加入外源底物；從而所述細胞持續暴露於處理之下。組織中細胞不會遇到體內這種「持續溶液相」環境。因此適於這個研究的方法是將IGF與VN預先結合，更真實反映體內條件。
在IGF與VN在培養皿中預先結合之後，將細胞種植於孔中，並通過制定的方法檢測與VN複合的IGF刺激蛋白質合成的能力(Francis等，1986，生物化學雜誌233207-213)。蛋白質合成增加與細胞數增加相關，因此是細胞增殖的反映。應答以相對於對照孔(無VN或IGF)的百分比表示，通過測定在48小時後[3H]-亮氨酸摻入新合成的蛋白質的情況表示。
參考圖9中數據，當3、10、30、100、300和1000ng的IGF-II與所述孔在沒有VN情況下預先結合時，分別觀測到產生超出對照孔(-VN，-IGF)8％、12％、10％、16％、24％和43％的應答。另外，這些相同劑量的預先結合VN包被孔的IGF-II刺激[3H]-亮氨酸摻入蛋白質的作用分別為19％、29％、39％、51％、70％和101％。針對3、10、30、100、300和1000ng的IGF-II，組合只用VN(12％)獲得的應答和只用IGF-II獲得的應答(參考上文)，分別產生20％、24％、22％、28％、36％和55％的預計加合作用。這些數值明顯不同於當IGF-II以除了兩個最低測試量IGF-II(3和10ng)之外所有劑量與VN預先結合時觀測到的實際作用(p＜0.05)。因此，預先結合VN的IGF-II在蛋白質合成中刺激協同作用，比計算的加合作用高5-46％。這些應答可能是IGF-II與VN直接結合的結果，也可能是IGF-II與VN通過IGFBP間接結合產生的。HaCAT角質形成細胞產生大量IGFBP-3(Wraight等，1994，J.Invest.Dermatol 103627-631)。
實施例8在存在在哺乳動物細胞中產生的重組IGFBP情況下，標記的IGF-II與VN的結合檢測[125I]-IGF-II在存在IGFBP的情況下結合VN包被的平皿的能力的結合分析如Upton等，1999(如前)所述進行，所述IGFBP與放射標記同時加入。這些研究中使用的是在哺乳動物中產生的糖基化IGFBP。如圖10所示，增加量的IGFBP-1，-3和-6導致標記的IGF-II與玻連蛋白包被孔的結合以劑量依賴性方式降低。IGFBP2還表現為競爭標記IGF-II與VN的結合，但效力比IGFBP-1，-3或-6低。另一方面，IGFBP-4對IGF-II與VN的結合的作用很小，而IGFBP-5表現為少量增強IGF-II結合。IGFBP-3的抑制作用可以得自IGFBP3與IGF-II競爭結合VN上相同結合區域。或者，或另外，IGFBP-3以及IGFBP-1和IGFBP-6的抑制作用，可以得自IGF-II與VN的親和性比IGF-II與這些IGFBP的親和性低，因此這些IGFBP隔絕IGF-II並且所述複合物不結合VN。
實施例9包含IGF-I，IGFBP-5和玻連蛋白的分離的蛋白質複合物對細胞增殖的刺激參考表2，IGF-I與IGFBP-5和玻連蛋白在所有測試濃度均刺激角質形成細胞增殖(通過3H-亮氨酸摻入新合成的蛋白質中測定)，在最高測試濃度觀測到協同作用。
本發明人提示分離的蛋白質複合物對細胞增殖的作用可能在比表2所述相對低量更高濃度的IGFBP-5存在下更強。
實施例10IGF和IGFBP變體的工程化IGFBP-3中在與ECM結合中重要的並已經闡明是推定的「肝素結合結構域」的胺基酸殘基是在第228-232位的KGRKR殘基。在IGFBP-5的相應區域發現相似殘基。在此報導的結合研究中使用的IGFBP-3 HBD突變體是殘基KGRKR變化為MDGEA，其基於在IGFBP-I中相應位置中發現的胺基酸。這些變化導致蛋白質這個部分的電荷逆轉。這個突變體仍然高親和性結合IGF-I和IGF-II，但很少結合酸不穩定亞單位及細胞表面(Firth等，1998，生物化學雜誌2732631-2638)。
不同類別蛋白質中肝素結合基序最初由Cardin等，1989，動脈硬化9 21-32闡述。
人IGF-II的C結構域含有許多陽性電荷的胺基酸殘基，尤其第34-40位含有胺基酸RVSRRSR。這些陽性電荷的胺基酸在介導IGFBP與細胞表面和VN結合中起重要作用，IGF-II中的這些胺基酸在IGF-II與VN的直接結合中也起重要作用。不管怎樣，通過產生缺失V35或S36及S39的一種IGF-II突變體而導入與在IGFBP-3中發現的序列相似的「肝素結合基序」是一個相對簡便的方法。介導IGF-II與VN結合的正電荷殘基的重要性，還通過本發明人揭示了雞IGF-II突變體(desR40)-IGF-II與VN的結合降低這個證據得以進一步例證。
另一方面，IGF-I的C結構域在IGF-II蛋白質上述相應區域中含有相對非極性胺基酸鏈。這可以解釋為什麼IGF-I不直接結合VN。另外，也不結合VN(或IGFBP)的胰島素不具有相應的C結構域，因為其在成熟蛋白質中被切除。
人IGF-I SSSRRAPQT人IGF-II RVSRRS--R將IGF-II序列RVSRRSR或IGFBP3序列KGRKR導入IGF-I能使IGF-I直接結合VN。
實施例11分離的蛋白質複合物，細胞增殖和存活Bcl-2轉錄是細胞存活途徑的一個關鍵因子，其在通過α-β3整聯蛋白附著於VN的細胞中增加(Matter Ruoslahti，2001，生物化學雜誌276 27757-27763)。另外，IGF-I通過以AKT依賴性方式增加bcl-2轉錄而保護細胞免於程序死亡(Pugazhenthi等，1999，生物化學雜誌274 27529-35)。IGF受體與α-β3整聯蛋白物理締合，對細胞生長具有協同作用(Schneller等，1997，EMBO雜誌16 5600-5607)。因此本發明分離的蛋白質複合物可以提供一個整合胞外點，以起始由整聯蛋白和生長因子受體介導的細胞存活信號。
已經表明IGFBP-5在前列腺癌細胞中加強IGF-I的抗細胞程序死亡和促進有絲分裂作用(Miyake等，2000，內分泌學141 2257-2265)。另外，VN在體內由神經膠質瘤細胞的合成及在結腸直腸腺癌中的合成與腫瘤等級相關(Uhm等，1999，臨床癌症研究5 1587-1594；Tomasini-Johansson等，1994，Exp Cell Res.214 303-312；Gladson等，1995，細胞科學雜誌108 947-56；Gladson Cheresh，1991，臨床研究雜誌88 1924-32)。
因此，根據本發明，提示在體內形成的IGF:IGFBP:VN複合物可以促進腫瘤細胞存活和轉移。本發明因此涵蓋了破壞體內複合物形成的治療劑。
已經報導VN的肝素結合結構域抑制纖連蛋白基質裝配(Hocking等，1999，生物化學雜誌274 2725727264)。纖連蛋白沉積降低與腫瘤細胞入侵相關，因為細胞遷移速度降低與聚合的纖連蛋白水平提高相關(Morla等，1994，自然367 193-196)。因此，結合VN的肝素結合結構域的IGF:IGFBP複合物可以阻礙纖連蛋白基質裝配並促進腫瘤侵入局部結締組織。因此本發明涵蓋了破壞這些體內複合物以降低腫瘤侵染的治療劑。
分離的蛋白質複合物與創傷癒合可以使用相反的論據支持所述複合物在需要細胞遷移如創傷修復的情況中應用。IGF系統在創傷癒合中起重要作用，而且IGF-I和IGFBP-3均以顯著濃度存在於創傷處體液中(Skottner等，1990，ActaScand.Suppl.367 63-66；Clark R(ed)1996，創傷修復的分子和細胞生物學，pp 3-50，Plenum出版社，紐約；Robertson等，1996，內分泌學137 2774-2784；Vogt等，1998，生長激素IGF研究，8 Suppl B107-9)。
已經表明IGFBP降低IGF從創傷處清除速度(Robertson等，1999，.Am J Physiol.276 E663-71)。IGFBP-3IGF-I複合物在體外結合纖維蛋白凝塊，引起這種情況也在體內發生使IGF-I在創傷部位積聚的推測(Campbell等，1999，生物化學雜誌274 30215-30221)。相似地，玻連蛋白結合纖維蛋白(Podor等，2000，生物化學雜誌27519788-19794)。還注意到玻連蛋白-裸鼠表現為創傷處纖維蛋白溶解增強及微血管發生減少(Jang等，2000，外科學127 696-704)。
根據本發明，提示結合IGFBP的IGF可以結合VN，其接著與纖維蛋白凝塊結合，因此在創傷部位提供了IGF的集聚。因此本發明分離的蛋白質複合物可以施用於創傷處以促進修復過程。
本發明涵蓋的創傷癒合的一個特殊方面涉及糖尿病足部潰瘍的癒合。創傷癒合在糖尿病患者中很慢。生長因子影響癒合過程，而且尤其IGF已經示出刺激角質形成細胞增殖。然而，對糖尿病患者皮膚和足部潰瘍組織的分析表明與非糖尿病患者組織切片相對比，在基底層和成纖維細胞中沒有IGF-I表達(Blakytny等，2000，病理學雜誌190 589-594)。本發明分離的蛋白質複合物可以用於將IGF-I輸送於這類創傷處。
分離的蛋白質複合物與骨工程
IGFBP-5通過一種非依賴於IGF受體的機制促進標記的IGF-I與骨的結合，(Mohan等，1995，生物化學雜誌270 2042420431)，並增強IGF刺激的成骨細胞功能(Andress，1995，生物化學雜誌27028289-28296)。
在許多研究中已經示出植入材料羥磷灰石是高度生物學相容的，及與現有骨良好整合。近來的跡象表明羥磷灰石從血清中比其它常規使用的植入材料如鈦和不鏽鋼中吸收更多的VN。VN的吸收通過成骨細胞前體細胞的更強結合而實現(Kilpadi等，2001，J.Biomed.Mater.Res.57 258-267)。
最近檢測了VN對納米相氧化鋁/常規氧化鋁的作用，發現VN增強成骨細胞附著(Webster等，2001，Tissue Eng 7 291-301)。
本發明人提示本發明分離的蛋白質複合物可用於包被這些原料，並從而在整形外科應用如髖關節置換中促進骨細胞附著，生長及整合。
VN在兔骨細胞培養物中增強IGF-I刺激的破骨細胞再吸收和蛋白酶活性(Rousselle等，2001，組織學和組織病理學16 727-734)，IGFBP-5增強IGF刺激的成骨細胞有絲分裂(Andress Bimbaum，1992，生物化學雜誌267 22467-22472)。
本發明人提示由於骨細胞產生的主要IGFBP是IGFBP-5，因此通過VN引起的IGF作用增強很可能也涉及IGFBP-5。
分離的蛋白質複合物和治療動脈硬化IGF-I已經預先包含於試驗性動脈硬化損傷的研究中。另外，α-β3抑制劑已經表明降低動脈硬化損傷，這與IGF-I介導的信號化抑制相關(Nichols等，1999，Circ.Res.85 1040-1045)。
鑑於(i)IGFBP-5和VN由動脈平滑肌細胞合成和分泌，並存在於血管壁中；
(ii)IGF:IGFBP-5:VN複合物促進血管平滑肌細胞有絲分裂和遷移(Nam Clemmons，2000，生長激素IGF研究10A23)；本發明人提示IGF:IGFBP-5:VN複合物參與動脈硬化損傷的形成。因此破壞所述複合物形成的治療劑可以有效治療動脈硬化。
本說明書闡述了本發明優選的實施方案，這些實施方案無限制本發明之意。本領域技術人員意識到根據所揭示內容，在不偏離本發明範圍內可以對本發明例證的實施方案進行各種修改和變化。
也應意識到所有專利和科學文獻及電腦程式在此均併入參考。
表1
表權利要求
1.一種分離的蛋白質複合物，其包含生長因子結合蛋白和玻連蛋白。
2.權利要求1的分離的蛋白質複合物，還包含生長因子。
3.權利要求2的分離的蛋白質複合物，其中所述生長因子是胰島素樣生長因子I(IGF-I)。
4.權利要求2的分離的蛋白質，其中所述生長因子選自表皮生長因子(EGF)，成纖維細胞生長因子(FGF)，鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)，骨橋蛋白，血小板反應蛋白-1，腱生蛋白-C，PAI-1，纖溶酶原，纖維蛋白原，纖維蛋白和運鐵蛋白。
5.權利要求1的分離的蛋白質複合物，其中所述生長因子結合蛋白選自IGFBP1，IGFBP2，IGFBP3，IGFBP4，IGFBP5和IGFBP6。
6.權利要求5的分離的蛋白質複合物，其中胰島素樣生長因子結合蛋白是IGFBP2，IGFBP3，IGFBP4或IGFBP5。
7.權利要求6的分離的蛋白質複合物，其中胰島素樣生長因子結合蛋白是IGFBP3或IGFBP5。
8.一種分離的蛋白質複合物，其包含一種IGFBP相關蛋白和玻連蛋白。
9.權利要求8的分離的蛋白質複合物，其還包含一種生長因子。
10.權利要求9的分離的蛋白質複合物，其中所述生長因子是IGF-I或IGF-II。
11.權利要求10的分離的蛋白質複合物，其中IGFBP相關蛋白選自(i)結締組織生長因子(CTGF)；(ii)由mac25基因編碼的多肽；(iii)由nov基因編碼的多肽；及(iv)由cyr61基因編碼的多肽。
12.一種分離的蛋白質複合物，其包含玻連蛋白，一種變體生長因子和/或一種變體生長因子結合蛋白。
13.權利要求12的分離的蛋白質複合物，其包含玻連蛋白和一種經工程化而包含肝素結合結構域(HBD)的變體生長因子。
14.權利要求13的分離的蛋白質複合物，其中所述變體生長因子是經工程化而包含所述HBD的IGF-I。
15.權利要求13的分離的蛋白質複合物，其由與玻連蛋白直接結合的經工程化而包含所述HBD的IGF-I組成。
16.權利要求13的分離的蛋白質複合物，其中HBD具有胺基酸序列BXBBB，其中B是一個鹼性胺基酸殘基。
17.權利要求14的分離的蛋白質複合物，其中所述HBD具有胺基酸序列KGRKR。
18.一種具有缺失或突變的HBD的變體IGFBP，其中所述IGFBP不能形成權利要求1的分離的蛋白質複合物。
19.權利要求19的變體IGFBP，其能結合IGF-I。
20.權利要求19的變體作為拮抗劑的應用。
21.權利要求12的分離的蛋白質複合物，其包含玻連蛋白和一種非糖基化生長因子結合蛋白。
22.權利要求21的分離的蛋白質複合物，其中所述非糖基化生長因子結合蛋白是IGFBP3。
23.權利要求13的分離的蛋白質複合物，其包含玻連蛋白和選自des(1-6)IGF-II和des(1-3)IGF-I的一種變體生長因子。
24.權利要求1，8或12的分離的蛋白質複合物，其中玻連蛋白是多聚體。
25.權利要求1，8或12的分離的蛋白質複合物，其中玻連蛋白是單體。
26.權利要求24的分離的蛋白質複合物，其中每種玻連蛋白單體與選自IGFBP1，IGFBP2，IGFBP3，IGFBP4，IGFBP5和IGFBP6的相同或不同IGFBP結合。
27.權利要求26的分離的蛋白質複合物，其還包含直接與玻連蛋白結合的IGF-II。
28.一種藥物組合物，其包含權利要求1，8或12的任一種分離的蛋白質複合物和一種可藥用載體或稀釋劑。
29.一種外科植入物或修復體，其包含權利要求1，8或12的任一種分離的蛋白質複合物。
30.一種轉化的細胞，其能表達權利要求1，8或12的任一種重組蛋白質複合物，或者表達能形成所述複合物的重組多肽。
31.一種調節細胞增殖和/或遷移的方法，包括給予動物或其分離的細胞權利要求1，8或12的任一種分離的蛋白質複合物。
32.一種調節細胞增殖和/或遷移的方法，包括給予動物或其分離的細胞一種製劑，所述製劑阻止或破壞權利要求1，8或12的任一種蛋白質複合物的形成。
33.權利要求32的方法，其中所述製劑阻止或破壞IGFBP與玻連蛋白之間的相互作用。
34.權利要求32的方法，其中所述製劑是IGF-II。
35.IGF-II在抑制權利要求1的分離的蛋白質複合物形成中的應用。
36.權利要求1，8或12的任一種分離的蛋白質複合物在製備治療上皮細胞疾病的藥物中的應用。
37.權利要求36的應用，其中所述上皮細胞疾病是牛皮癬或上皮細胞乳癌。
38.權利要求36的應用，其中所述上皮細胞疾病通過破壞胃腸道上皮內膜而削弱腸道功能。
39.權利要求1，8或12的任一種分離的蛋白質複合物在製備促進創傷癒合，皮膚修復，潰瘍和燒傷康復或體外皮膚再生的藥物中的應用。
40.權利要求1，8或12的任一種分離的蛋白質複合物在製備促進骨再生的藥物中的應用。
41.權利要求1，8或12的任一種分離的蛋白質複合物在製備促進損傷的神經組織修復的藥物中的應用。
42.破壞或阻止權利要求1，8或12的任一種分離的蛋白質複合物形成的製劑在在製備治療癌症的藥物中的應用。
43.破壞或阻止權利要求1，8或12的任一種分離的蛋白質複合物形成的製劑在在製備治療動脈硬化的藥物中的應用。
全文摘要
本發明提供了一種分離的蛋白質複合物，其包含生長因子、生長因子結合蛋白和玻連蛋白。優選地，所述分離的蛋白質複合物包含胰島素樣生長因子I、胰島素樣生長因子結合蛋白3或胰島素樣生長因子結合蛋白5和玻連蛋白。本發明還提供了調節細胞增殖和/或遷移的方法，通過施用所述蛋白質複合物進行創傷修復，皮膚修復和組織置換治療。相反，通過使用破壞生長因子蛋白質複合物在體內形成的藥劑，可抑制生長因子驅動的細胞增殖和/或遷移，以例如治療癌症，牛皮癬，動脈硬化和有疤痕過度生長傾向的創傷。
文檔編號C07K14/78GK1541107SQ01819321
公開日2004年10月27日 申請日期2001年9月24日 優先權日2000年9月22日
發明者齊·厄普頓, 齊 厄普頓, 安 克裡克爾, 珍妮弗·安·克裡克爾 申請人:昆士蘭技術大學