一種肌苷片質量的測定方法
2023-10-09 19:09:54 1
專利名稱：：一種肌苷片質量的測定方法專利說明一種肌苷片質量的測定方法所屬領域本發明涉及一種藥物的分析測定方法。具體來說，本發明涉及一種對肌苷片主要有效成分的測定方法。
背景技術：
：肌苷是人體中的正常成分，參與人體內核酸代謝、能量代謝和蛋白質合成，活化丙酮酸氧化酶系，提高輔酶A的活性，可使處於低能缺氧狀態下的組織細胞繼續進行代謝。還可改善肝臟功能，有助於受損肝細胞功能的恢復，可刺激體內產生抗體，並提高腸道對鐵的吸收。肌苷片是輔酶類藥物，有改善肌體代謝作用。用於各種類型肝臟疾患、心臟疾患、白細胞減少症、血小板減少症、中心視網膜炎、視神經萎縮等屬於國家基本藥物。藥用肌苷是由產肌苷的微生物發酵生成的代謝產物，肌苷產生菌在發酵過程中除產生肌苷(化學名稱次黃嘌呤核苷)外還產生次黃嘌呤等肌苷分子的類似物，由於它們結構相似在肌苷片的生產過程中這些類似物很難被除去，因此在肌苷片中含有少量的次黃嘌呤等雜質。而次黃嘌呤與肌苷有共同的紫外吸收結構，因此我國藥品部頒標準中所採用的紫外分光光度法測定肌苷片中肌苷含量就難以排除次黃嘌呤等肌苷類似物的幹擾。有報導用高壓液相色譜法測定肌苷片中肌苷含量，雖分離效果較好但所需設備昂貴、測試成本高難以推廣應用。
發明內容為克服現有分析方法的不足，本發明提供一種肌苷片質量的測定方法，具體是採用酶電極型生物傳感器法定量測定肌苷片中肌苷含量，用雙酶共固定技術將核苷磷酸化酶(EC2.4.2.1)與黃嘌呤脫氫酶(EC1.2.3.2)製成固定化複合酶膜，結合過氧化氫型電極構成肌苷酶電極生物傳感器，用於肌苷片中肌苷的含量測定，從而方便、準確、快速地對肌苷片的質量進行測定。技術方案本發明提供的肌苷片質量的測定方法，包括下述順序的步驟1固定化核苷磷酸化酶、黃嘌呤脫氫酶複合酶膜的製備1.1載體膜圈製備取直徑10mm的核微孔膜片用環氧樹脂粘貼在內徑9.5mm的橡膠密封圈上，放置過夜使固化完全即得。1.2載體膜圈表面處理將載體膜圈置20％甲醇溶液中浸泡15min，取出用蒸餾水衝淨、晾乾。1.3固定化複合酶膜製備取核苷磷酸化酶0.1單位、黃嘌呤脫氫酶0.03單位、20％牛血清白蛋白5μl、2％戊二醛2μl、均勻噴塗在載體膜圈表面，靜置固化15min，用蒸餾水洗去多餘反應物，冷凍乾燥即得。將此固定化複合酶膜裝在過氧化氫電極頭部便構成酶電極。2固定化肌苷酶膜參數基礎活性＞50，線性1～270mg/L；各點偏差小於1mg，響應30s測定值大於60s測定值的90％，膜完整性亞鐵氫化鉀測定值-2～6範圍內，工作壽命＞25d。3過氧化氫電極製備兩電極均為長20mm的圓柱體，鉑電極表面積4mm2，銀電極表面積60mm2，用專用模具置備。兩電極之間填充環氧樹脂，電極套頭端與酶膜圈應嵌合良好，鉑電極與酶膜須緊密接觸(見圖1)，鉑電極為正極；銀電極為負極。兩電極之間極化電壓0.65V，酶電極輸出電流0～500nA。4肌苷酶電極生物傳感器結構肌苷酶電極生物傳感器由生化反應系統(一次儀表)和電信號處理系統(二次儀表)組成(見圖2)。5測定方法儀器定標採用0.1mmol/LpH7.2的磷酸鹽緩衝液，標準液含肌苷268mg/L，取標準液25μl注入反應池60s後儀器自動顯示酶膜基礎活性，按動定標鍵(Calibrate)定標268，自動清洗後即可測定樣品。樣品製備取肌苷片5片，精密稱定，研細，精密稱取適量(約相當於肌苷0.10g)，置100ml量瓶中加水適量使溶解，用水稀釋至刻度，搖勻，濾過，棄去初濾液，精密取續濾液10ml，置50ml量瓶中加水稀釋至刻度，搖勻，即得，進樣量25μl。有益效果用共固定化核苷磷酸化酶-次黃嘌呤脫氫酶複合H2O2電極測定肌苷片中肌苷含量是目前該分析領域最先進的測試手段，其先進性表現為(1)與紫外分光光度法相比具有方法簡單、分析專一性好的優點，能測出單個肌苷組分，而不是具有紫外吸收的多個組分；(2)與常規酶法分析相比較，因為採用固定化技術將可溶性酶固定在電極頭部反覆使用，在測定過程中不會造成酶的流失，從而減低了酶法測定的成本；(3)採用H2O2電極為基礎電極，較之pH電極和氧電極其基線電流更加穩定，分析精度高於其它方法。(4)肌苷化學穩定性較差在外界條件改變時易分解產生次黃嘌呤幹擾肌苷測定，使測得的結果偏高。採用酶電極法測定肌苷片中的肌苷含量，由於酶促反應專一性高、樣品不需分離直接稀釋500倍即可進樣分析、處理條件溫和、反應時間短暫結果較為可靠。圖1是肌苷酶電極結構示意圖；其中1鉑電極；反應(2)，2銀電極；反應(3)，3內膜，4固定化核苷磷酸化酶-次黃嘌呤脫氫酶；反應(1)，5核微孔膜，6密封圈，7底物圖2是肌苷酶電極生物傳感器結構示意圖；其中1進樣器，2光電開關，3信號處理器，4酶電極，5攪拌子，6電磁攪拌器，7泵1，8緩衝液，9泵2，10廢液具體實施例方式1儀器與試藥核苷磷酸化酶(EC2.4.2.1)、黃嘌呤脫氫酶(EC1.2.3.2)、肌苷對照品美國Sigma公司；牛血清白蛋白、戊二醛上海化學試劑採購供應站進口分裝；核微孔膜(0.2μm)美國Nucleopore公司；鉑、銀純度為99.999％，中國人民銀行濟南分行；其它試劑均為分析純。SBA-40型肌苷生物傳感分析儀。2測定原理固定化雙酶複合酶膜結合過氧化氫電極測定肌苷依據下述反應3肌苷對照品溶液製備精密稱取肌苷對照品268mg置1000ml容量瓶中，加蒸餾水溶解、定容，作為對照品溶液。4酶電極專一性試驗取可能的幹擾物配成濃度268mg/L的溶液，以268mg/L的肌苷標準液在肌苷酶電極上的響應為268，測定幹擾物溶液在同一酶電極上的相對響應。結果見表1表1酶電極專一性試驗Tab1Specificityofenzymeelectrode5酶電極最適pH不同pH磷酸鹽緩衝液對肌苷酶電極響應的影響見表2所示，在pH6.8時酶電極響應值最高，所以本研究採用pH6.8的磷酸鹽緩衝液。表2不同pH磷酸鹽緩衝液對肌苷酶電極響應的影響Tab2EffectsofenzymeelectrodefordifferentpHbuffer6精密度試驗對含有肌苷的同一標準液連續測定20次，方法同「儀器定標」結果為n＝20，X＝200.3(mg/L)，s＝2.4(mg/L)，RSD＝1.18％。7線性關係試驗用肌苷酶電極測定50、100、150、200、250mg/L肌苷標準液，以濃度為X，響應值為Y進行回歸分析。得線性回歸方程Y＝1.582+0.974X，r＝0.9986，其中X為濃度，Y為響應值，r為相關係數。8加樣回收試驗取稀釋的肌苷片樣品溶液分為5份加已知濃度的肌苷標準液進行回收試驗。結果見表3表3肌苷回收試驗結果Tab3Recoveryresultsforinosine(n＝3)9酶電極法與紫外分光光度法對比試驗酶電極法照「儀器定標」操作，紫外分光光度法照衛生部部頒標準肌苷片含量測定項下操作。結果見表4表4肌苷片中肌苷含量測定結果％Tab4Contentsofinpsineinitstablets％(n＝3)權利要求1.一種肌苷片質量的測定方法，包括下述順序的步驟1固定化核苷磷酸化酶、黃嘌呤脫氫酶複合酶膜的製備1.1載體膜圈製備取直徑10mm的核微孔膜片用環氧樹脂粘貼在內徑9.5mm的橡膠密封圈上，放置過夜使固化完全即得。1.2載體膜圈表面處理將載體膜圈置20％甲醇溶液中浸泡15min，取出用蒸餾水衝淨、晾乾。1.3固定化複合酶膜製備取核苷磷酸化酶0.1單位、黃嘌呤脫氫酶0.03單位、20％牛血清白蛋白5μl、2％戊二醛2μl、均勻噴塗在載體膜圈表面，靜置固化15min，用蒸餾水洗去多餘反應物，冷凍乾燥即得。將此固定化複合酶膜裝在過氧化氫電極頭部便構成酶電極。2.固定化肌苷酶膜參數基礎活性＞50，線性1～270mg/L；各點偏差小於1mg，響應30s測定值大於60s測定值的90％，膜完整性亞鐵氫化鉀測定值-2～6範圍內，工作壽命＞25d。3.過氧化氫電極製備兩電極均為長20mm的圓柱體，鉑電極表面積4mm2，銀電極表面積60mm2，用專用模具置備。兩電極之間填充環氧樹脂，電極套頭端與酶膜圈應嵌合良好，鉑電極與酶膜須緊密接觸(見圖1)，鉑電極為正極；銀電極為負極。兩電極之間極化電壓0.65V，酶電極輸出電流0～500nA。4.肌苷酶電極生物傳感器結構肌苷酶電極生物傳感器由生化反應系統(一次儀表)和電信號處理系統(二次儀表)組成(見圖2)。5.測定方法儀器定標採用0.1mmol/LpH7.2的磷酸鹽緩衝液，標準液含肌苷268mg/L，取標準液25μl注入反應池60s後儀器自動顯示酶膜基礎活性，按動定標鍵(Calibrate)定標268，自動清洗後即可測定樣品。樣品製備取肌苷片5片，精密稱定，研細，精密稱取適量(約相當於肌苷0.10g)，置100ml量瓶中加水適量使溶解，用水稀釋至刻度，搖勻，濾過，棄去初濾液，精密取續濾液10ml，置50ml量瓶中加水稀釋至刻度，搖勻，即得，進樣量25μl。全文摘要本發明涉及一種肌苷片質量的測定方法，屬生物傳感器
技術領域：
。製備方法是將核苷磷酸化酶與次黃嘌呤脫氫酶共固定化後與H2O2電極結合構成肌苷酶電極生物傳感器，採用0.1mmol.L-1pH7.2的磷酸鹽緩衝液，標準液含次黃嘌呤268mg.L-1，取標準液25μl注入反應池25s後儀器自動顯示酶膜基礎活性，按動定標鍵(Calibrate)定標100，自動清洗後即可測定樣品。文檔編號G01N27/49GK101162214SQ20071011417公開日2008年4月16日申請日期2007年11月16日優先權日2007年11月16日發明者孫士青,史建國,楊俊惠,馬耀宏,李雪梅,張立群,孟慶軍,豔楊,王丙蓮申請人:山東省科學院生物研究所