用於預防反芻動物捻轉血矛線蟲病的dna疫苗的製作方法

2024-01-21 11:23:15 3

專利名稱：用於預防反芻動物捻轉血矛線蟲病的dna疫苗的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物製品領域，涉及一種具有預防和治療反芻動物捻轉血矛線蟲病作用的DNA疫苗。具體而言，本發明涉及一種包含其中插入了捻轉血矛線蟲(Haemonchus contortus)保護性隱蔽抗原基因H11部分編碼區的重組真核質粒載體的DNA疫苗。
背景技術：
捻轉血矛線蟲病是由圓線目毛圓科血矛屬的捻轉血矛線蟲(Haemonchus contortus)引起的一種寄生蟲病。病原寄生於宿主第四胃，偶見小腸中，以宿主血液為其營養來源。感染牛、羊、鹿、犛牛、駱駝等反芻動物，引起貧血及貧血症候群，嚴重的可致動物，特別是羔羊大批死亡，死亡率高達30％以上。該病呈世界性分布，國內各地均有報導，尤其在一些牧區此病在羊群中流行嚴重，感染率可達70-80％以上。
捻轉血矛線蟲(Haemonchus contortus)是反芻動物的一種重要消化道寄生蟲。目前主要採用化學藥物治療，雖取得了一定的效果，但藥物殘留和環境汙染嚴重。抗藥性蟲株的出現和蔓延，使得傳統的化學治療受到了嚴重挑戰，這給畜牧業生產帶來了極大的經濟損失，應用免疫學方法防治該病十分迫切和必要。捻轉血矛線蟲病呈界性分布，我國許多地方均有發生，隨著我國農業產業結構的調整，許多地方將反芻動物飼養作為支柱產業來發展，因此，研製有效的疫苗預防該病已經成為重要課題。
目前，研究相繼發現了多種具有較好的免疫保護作用的捻轉血矛線蟲天然抗原，例如，H11、H-gal-GP、H45(P1)、P52/46、15/24Kd ES和Hc-sL3。其中H11是寄生階段捻轉血矛線蟲小腸微絨毛上皮細胞中的一種跨膜糖蛋白，分子量為110kDa，該抗原對不同年齡段動物均有保護作用，而且對抗藥性蟲株、不同地理分離株具有交叉保護作用。
但是包括H11在內的這些抗原在蟲體內的含量極低，分離純化過程複雜而煩瑣，難以商品化生產。研究又發現該抗原的重組表達產物無論是原核表達產物還是真核表達產物，其免疫效果均不理想。Munn等使用十二烷基磺酸鈉(SDS)、SDS和二硫蘇糖醇(DTT)處理H11，改變H11的天然構象，再分別免疫綿羊，發現蟲卵減少率均明顯低於天然構象的H11。其中原因尚不完全明了。
核酸疫苗是近幾年發展起來的一種新型疫苗，因其操作簡便，既具有重組亞單位疫苗的安全性，又具有減毒活疫苗誘導全方位免疫應答的高效、持續性的優點，成為當今疫苗研究的熱點之一。DNA疫苗在體內可模擬天然抗原的構象，以MHCI和MHCII途徑進行抗原遞呈，不但引起體液免疫應答反應，而且可引起機體細胞免疫應答反應。因此，開發出具有預防和治療作用的DNA疫苗具有重要的意義。

發明內容
本發明提供了一種具有預防或治療反芻動物捻轉血矛線蟲病作用的免疫調節型的DNA疫苗。
本發明提供了一種製備具有預防或治療反芻動物捻轉血矛線蟲病作用的免疫調節型DNA疫苗的方法。
另外，本發明還提供了所述DNA疫苗的用途。
本發明是部分地建立在本發明人的下列發現之上含有捻轉血矛線蟲(Haemonchus contortus)保護性隱蔽抗原基因H11部分編碼區的重組真核質粒載體能夠為反芻動物提供針對捻轉血矛線蟲的有效免疫保護；將3段不同位置的捻轉血矛線蟲保護性隱蔽抗原基因H11部分編碼區分別插入真核質粒載體，然後將3種重組真核質粒的混合物免疫接種動物，能夠提供更好的免疫保護。
本發明使用的是具有免疫原性的H11基因，該基因編碼的蛋白抗原H11是寄生階段捻轉血矛線蟲小腸微絨毛上皮細胞中的一種跨膜糖蛋白，分子量為110kDa。研究發現蛋白抗原H11對不同年齡動物均有一定的保護作用，將母羊血清抗體和初乳抗體轉移至新生羔羊(5周齡)體內，結果發現5周齡羔羊獲得保護力，可以抵抗3000隻第3期幼蟲的攻擊。H11對7～9周齡的羔羊同樣具有保護作用。其次，H11對不同地理分離株具有交叉保護性。
在本申請的一個具體實施方案中，設計出覆蓋保護性抗原基因H11的開放閱讀框的3對引物(P15』ATACCGCGGATGACGTCGCAGGGGAG-3』和P1』5』-CGCTCTAGAAGAGCATATTGTGTCA-3』；P25』ATACCGCGGCCAGAGGCAAAGAAGA-3』和P2』5』-TTCTCTAGACCGTTCACCACAAAGGGA-3』；以及P35』-ATACCGCGGACATGGTTGAGAAGAGA-3』和P3』5』-GGCTCTAGAAAGGTGGCTTTCTTGA-3』)用這三個引物對擴增出保護性抗原基因H11的三段部分編碼區H11-1、H11-2和H11-3，分別具有如SEQ ID NO1、SEQ ID NO2和SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。
因此，一個方面，本發明提供了3段不同位置的保護性隱蔽抗原基因H11部分編碼區，即H11-1、H11-2和H11-3，分別具有如SEQ ID NO1、SEQ IDNO2和SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。
另一個方面，本發明提供了一種具有預防和治療反芻動物捻轉血矛線蟲病作用的免疫調節型的DNA疫苗，該疫苗包含其中插入了捻轉血矛線蟲(Haemonchus contortus)保護性隱蔽抗原基因H11部分編碼區的重組真核質粒載體。
在一個具體實施方案中，提供了一種重組DNA疫苗，其中包含其中插入了H11-1(SEQ ID NO1)的重組真核質粒載體。
在一個具體實施方案中，提供了一種重組DNA疫苗，其中包含其中插入了H11-2(SEQ ID NO2)的重組真核質粒載體。
在一個具體實施方案中，提供了一種重組DNA疫苗，其中包含其中插入了H11-3(SEQ ID NO3)的重組真核質粒載體。
在一個優選實施方案中，提供了一種一種具有預防和治療反芻動物捻轉血矛線蟲病作用的DNA疫苗，其中包括上述3種重組真核質粒載體的混合物，即含H11-1的重組真核質粒載體、含H11-2的重組真核質粒載體和含H11-3的重組真核質粒載體，簡稱為pcDNA-H11-1+2+3。
在一個特別優選的實施方案中，3種重組真核質粒載體的混合比例為111。
本發明所述DNA疫苗使用真核質粒表達載體作為結構框架，所述真核質粒載體除具有表達載體基本元件，在限制性酶切位點處插入了目的基因。本領域已知的任一種真核質粒載體都可用於本發明，例如，包括但不限於pcDNA3.0、pcDNA3.1、pVAX1.0和pcDNA4/His Max。在本發明的一個具體優選的實施方案中，所述的真核質粒載體為pcDNA4/His Max(購自美國Invitrogen公司)。
在本發明的第二個方面，提供了一種生產捻轉血矛線蟲(Eimeria tenella)免疫調節型DNA疫苗的方法，簡而言之，包括下列步驟1)PCR擴增捻轉血矛線蟲保護性抗原基因H11的部分編碼區設計覆蓋H11基因完整開放閱讀框的三個引物對，通過PCR擴增手段，克隆得到H11基因的3段部分編碼區，即，H11-1、H11-2和H11-3；DNA疫苗重組真核質粒及相應基因工程菌的構建2)利用分子生物學常規的重組方法，製備出含含H11-1、H11-2或H11-3的重組真核質粒，然後用其轉化宿主菌(例如，大腸桿菌JM109株)，篩選後獲得重組基因工程菌；3)基因工程菌的發酵及DNA疫苗重組真核質粒的大規模分離純化，獲得3種含H11-1、H11-2或H11-3的3種重組真核質粒，即為含H11-1、H11-2或H11-3的DNA疫苗；以及任選地還包括4)將步驟3)獲得的含H11-1、H11-2或H11-3的3種重組真核質粒按一定比例混合得到一種疫苗，即pCDA-H11-1+2+3，例如混合比例為1∶1∶1。
在本發明的第三個方面是本發明所述的捻轉血矛線蟲(Eimeria tenella)免疫調節型DNA疫苗的用途。用純化後的包含插入了H11-1、H11-2或H11-3的重組真核質粒的DNA疫苗，或者用包含所述3種重組真核質粒混合物的DNA疫苗直接免疫動物後，通過每克糞便指數、卵囊減少率、盲腸病變記分和抗線蟲指數等多項試驗指標發現，3種包含單一所述重組真核質粒的DNA疫苗以及包含所述三種重組真核質粒混合物的DNA疫苗都具有很好的免疫保護效果(其中後者保護效果更為顯著)。因此，本發明所述的DNA疫苗可用於製備預防或治療反芻動物捻轉血矛線蟲病的藥物製劑。
本發明所述的DNA疫苗可以與藥物學上常用的載體和/或佐劑配製用於預防和治療反芻動物線蟲病的藥物組合物。


圖1為DNA疫苗pcDNA-H11-1(或pcDNA-H11-2或pcDNA-H11-3)的結構示意圖。
圖2為H11基因設計引物的策略圖。
圖3為重組質粒pMD18T-H11-1(或pMD18T-H11-2或pMD18T-H11-3)構建流程圖。
圖4為重組質粒pET-H11-1(或pET-H11-2或pET-H11-3)的構建流程圖。
圖5圖示的為重組質粒pET-H11-1、pET-H11-2和pET-H11-3誘導表達後SDS-PAGE電泳結果。在圖7的A和B中M均為蛋白質標準分子量，第1泳道均為pET28b(+)；A中的第2-9泳道依次分別為pET28-H11-1誘導後第0、1、2、3、4、5、6和7小時的取樣；B中的第2-9泳道依次分別為pET28-H11-2誘導後第0、1、2、3、4、5、6和7小時的取樣。在圖7的C中M為蛋白質標準分子量，第1和2泳道分別為pET28-H11-1的上清和包含體，第3和4泳道分別為pET28-H11-2的上清和包含體，第5和6泳道分別為pET28-H11-3的上清和包含體。
圖6為重組質粒pPICZaB-H11-1、2或3的構建流程圖。
圖7為DNA疫苗pcDNA-H11-1、2或3的構建流程圖。
圖8為RT-PCR檢測DNA疫苗pcDNA-H11-1、2或3在肌肉中的轉錄。
M為DNA標準分子量；1、3、5分別為PBS免疫組注射部位肌肉；2、4、6分別為pcDNA-H11-3、2、1免疫組注射部位肌肉。
圖9為Western-印跡檢測pcDNA-H11-1、2、3DNA疫苗在肌肉中的表達圖。
A1、A2分別以PBS、pcDNA-H11-1+2+3免疫山羊的肌肉為抗原，大鼠抗H11抗體為一抗。
B1、B2分別以pET28-H11-1和pET28-H11-2重組蛋白為抗原，pcDNA-H11-1+2+3免疫山羊的血清為一抗。
C1、C2分別以pET28-H11-1和pET28-H11-2重組蛋白為抗原，PBS免疫山羊的血清為一抗。
圖10為DNA疫苗免疫後山羊體內抗H11抗體水平曲線圖。
圖11攻蟲後山羊排出捻轉血矛線蟲卵曲線圖。
圖12為DNA疫苗免疫組和PBS對照組山羊被毛、眼結膜等部位健康狀況比較圖。
實施例基礎材料真核表達載體pcDNA4/His Max，pPICZαB(美國Invitrogen公司產品)；pMD18-T(大連寶生物(TaKaRa)工程有限公司)；pET-28a，b，c(+)(美國Novagen公司產品)。
實施例1.H11基因的製備1.引物的設計和合成根據GenBank中公開的捻轉血矛線蟲H11基因的核苷酸序列，應用Primer Premier5軟體設計3對引物，如下所示P1 5』-ATACCGCGGATGACGTCGCAGGGG AG-3，P1』5』-CGCTCTAGAAGAGCATATTGTGTCA-3』；P2 5』-ATACCGCGGCCAGAGGCAAAGAAG A-3』，P2』5』-TTCTCTAGACCGTTCACCACAAAGGG A-3』；P3 5』-ATACCGCGGACATGGTTGAGAAGAGA-3』，P3』5』-GGCTCTAGAAAGGTGGCTTTCTTGA-3』。
設計策略如圖2所示，3對引物覆蓋H11的開放閱讀框。這三對引物中均為在上遊引物5』端引入酶切位點SacII，下遊引物的5』端引入酶切位點XbaI(如下劃線部分所示)，用於構建表達載體。
2.捻轉血矛線蟲蟲體總RNA的提取挑取40條捻轉血矛線蟲成蟲放入經DEPC處理過的勻漿器中，加Trizol試劑1ml，勻漿3分鐘。將勻漿液轉移至Eppendorf管中，室溫放置5分鐘，加200μl氯仿，渦懸振蕩15秒。4℃，12000r/min離心15分鐘，吸取上層水相轉至新的Eppendorf管中，加入500μl異丙醇後於25℃沉澱30分鐘。12000r/min離心10分鐘，沉澱用75％乙醇洗滌2次，晾乾RNA沉澱，用50μl無RNA酶的水溶解沉澱。紫外分光光度計測定RNA的含量及純度，-20℃保存備用。
3.RT-PCR擴增以上述提取的捻轉血矛線蟲總RNA為模板，用oligo(dT)15引物進行反轉錄，合成cDNA第一鏈，採用20μl反應體系總RNA約1.0μg，oligo(dT)150.50μg，70℃變性10分鐘後立即置冰水中冷卻2分鐘，然後加入5×RT反應緩衝液4.0μl，MgCl2(25mmol/L)2.0μl，dNTP(10mmol/L)1.5μl，M-MLV反轉錄酶(200U/μl)1.0μl，RNasin(40U/μl)0.5μl，無RNase水補至20μl。將上述所有成分輕彈混勻，短暫離心後，42℃反應60分鐘，然後95℃5分鐘滅活反轉錄酶。反轉錄產物立即進行PCR或-20℃保存備用。
以反轉錄產物為模板，採用50μl體系進行PCR擴增，各反應成分如下cDNA模板2.0μl，10×PCR反應緩衝液5.0μl，MgCl2(25mmol/L)3.0μl，成對的上、下遊引物(50pmol/μl)各2.0μl(即相應地分別加入P1和P1』、P2和P2』或者P3和P3』各2.0μl)，dNTP(2.5mmol/L)4.0μl，Taq酶(5U/μl)0.5μl，補加滅菌ddH2O至50μl。將上述成分離心混合均勻後，於PCR儀上進行擴增，反應條件為94℃預變性3分鐘；94℃變性1分鐘，58℃退火1分鐘，72℃延伸1.5分鐘，共30個循環；然後72℃延伸15分鐘。
使用引物對P1和P1』、P2和P2』或者P3和P3』擴增得到的基因分別命名為H11-1、H11-2和H11-3。經測序表明，擴增得到的H11-1、H11-2和H11-3基因分別具有如SEQ ID NO1中第484-1409位、SEQ ID NO2中第484-1457位和SEQ ID NO3中第484-1607位所示的核苷酸序列。
實施例2.DNA疫苗的製備1.重組質粒pMD18-T-H11-1、pMD18-T-H11-2和pMD18-T-H11-3的構建(見圖3)取實施例1中獲得的PCR產物50μl，1％瓊脂糖凝膠上電泳，在紫外燈下切下目的條帶處瓊脂糖凝膠，用大連寶生物公司的膠回收試劑盒回收純化目的片段，方法參照說明書。取純化的PCR產物與經SacII和XbaI酶切線性化的pMD18-T載體連接，反應體系如下PCR回收產物4.0μlpMD18-T載體1.0μlLigation solution I5.0μl總體積 10.0μl將上述成分在薄壁eppendorf管中混合均勻後4℃連接過夜。連接產物轉化感受態大腸桿菌JM109，提取質粒，用SacII和XbaI雙酶切及測序等鑑定，確定為pMD18-T-H11-1、pMD18-T-H11-2和pMD18-T-H11-3。
2.重組質粒pET-H11-1、pET-H11-2和pET-H11-3的構建(見圖4)分別用BamHI和HindIII雙酶切克隆質粒pMD18-T-H11-1、pMD18-T-H11-2、pMD18-T-H11-3和原核表達載體pET28b(+)，分別回收純化H11-1、H11-2、H11-3和pET28b(+)酶切片段，T4連接酶連接，反應體系如下H11-1H H11-2H H11-3雙酶切回收的目的片段 7μl l8μl 10μlpET28b(+)載體回收片段 10μl9μl7μl10×連接緩衝液 2μl 2μl2μlT4DNA連接酶 1μl 1μl1μl20μl20μl 20μl先將目的片段與載體片段加入後，混合均勻，45℃作用5分鐘，然後在冰上加入其他成分，短暫離心混勻，置16℃連接12h。連接產物轉化感受態大腸桿菌BL21，提取質粒，用BamHI和HindIII雙酶切鑑定，確定為pET-H11-1、pET-H11-2和pET-H11-3重組載體。
3.重組質粒pET-H11-1、pET-H11-2和pET-H11-3的誘導表達將轉化有pET-H11-1、pET-H11-2和pET-H11-3質粒的陽性克隆28℃振蕩培養過夜，菌液再以1∶50稀釋至含Kna+的LB培養液中，37℃繼續培養至OD600＝0.4-0.6，然後將終濃度1mMol/L IPTG進行誘導表達，分別收集0hr、1hr、2hr、3hr、4hr、5hr、6hr的菌液，菌體蛋白進行SDS-PAGE鑑定(見圖5)。
4.重組質粒pPICZαB-H11-1、pPICZαB-H11-2和pPICZαB-H11-3的構建(見圖6)將pMD18-T-H11-1、pMD18-T-H11-2或pMD18-T-H11-3與表達載體pPICZαB分別用SacII和XbaI雙酶切，經瓊脂糖凝膠電泳後分別回收目的片段和載體片段，以合適的比例進行粘端連接(構建策略如圖4-1)，反應體系如下H11-1H H11-2H H11-3雙酶切回收的目的片段7μl 8μl10μl回收的pPICZαB載體片段 10μl9μl7μl10×連接緩衝液 2μl 2μl2μlT4DNA連接酶1μl 1μl1μl20μl20μl 20μl16℃連接12小時。將連接產物分別轉化新鮮製備的E.coli JM109感受態細胞，取經過冰浴、熱休克及抗性復甦的菌液塗布於含ZeocinTM(25μg/ml)的低鹽LB固體培養基平板上，於37℃溫箱中倒置培養18～24h，提取質粒，用SacII和XbaI雙酶切等鑑定，確定為pPICZαB-H11-1、pPICZαB-H11-2和pPICZαB-H11-3。
5.重組質粒pcDNA-H11-1、pcDNA-H11-2和pcDNA-H11-3的構建(見圖7)將pPICZαB-H11-1、pPICZαB-H11-2或pPICZαB-H11-3質粒與pcDNA4/HisMax質粒分別用XhoI和XbaI雙酶切，經瓊脂糖凝膠電泳後分別回收目的片段和載體片段，以合適的比例進行粘端連接，反應體系如下H11-1H H11-2H H11-3雙酶切回收的目的片段 7μl 8μl 10μlpcDNA4/HisMax C片段 10μl 9μl 7μl10×連接緩衝液 2μl 2μl 2μlT4DNA連接酶 1μl 1μl 1μl20μl 20μl 20μl連接產物轉化感受態大腸桿菌JM109，提取質粒，用Xho I和XbaI雙酶切確定獲得即為pcDNA4/HisMax-H11-1、pcDNA4/HisMax-H11-2和pcDNA4/HisMax-H11-3DNA疫苗。
6.含三種重組真核質粒混合物的DNA疫苗的製備將上述操作得到的pcDNA4/HisMax-H11-1、pcDNA4/HisMax-H11-2和pcDNA4/HisMax-H11-3按1∶1∶1的比例混合，得到含這三種重組真核質粒混合物的DNA疫苗。
實施例3.DNA疫苗的動物保護性試驗1.試驗動物接種選擇體重相當、無捻轉血矛線蟲感染、5』-7月齡健康山羊15隻，隨機分成3組，每組5隻。第1組肌肉注射PBS。第2組肌肉注射3種重組真核質粒載體的混合物(pcDNA4/HisMax-H11-1+2+3)。首次免疫後2周加強免疫一次。每次每隻山羊注射1ml pcDNA4/HisMax-H11-1+2+3(其中H11-1、2和3各100μg/ml)。在第2次免疫後14天，每隻山羊感染10,000隻捻轉血矛線蟲第三期幼蟲。第3組山羊不免疫，也不攻擊三期幼蟲。
2.RT-PCR檢測核酸疫苗的表達情況第1次免疫後7天，局部麻醉山羊，取疫苗注射肌肉細胞提取RNA，最後用20μl經DEPC處理過的水溶解RNA沉澱。為防止質粒DNA汙染，反轉錄前用無RNase的DNase處理肌肉RNA，進行RT-PCR。具體方法同實施例1所述。結果表明DNA疫苗在山羊肌肉細胞內獲得了轉錄(見圖8)。
3.Western印跡檢測核酸疫苗的表達情況於第2次免疫後7天，採取血清和疫苗注射部肌肉(局部麻醉)，制樣、SDS-PAGE、電轉移至硝酸纖維膜。PBS洗膜2次，0.2％麗春紅染色，鉛筆標記蛋白質標準分子量所在位置；PBS洗膜數次，至麗春紅全部褪去，3％BSA(PBS)4℃過夜或37℃1小時；PBS洗膜數次，加大鼠抗H11抗體(3％BSA稀釋)，37℃作用1小時；生理鹽水洗膜數次，加羊抗大鼠IgG-HRP(3％BSA稀釋)，37℃作用1小時；生理鹽水洗膜，加底物顯色，生理鹽水漂洗，PBS終止反應，乾燥NC膜，照相。
pET28-H11-1、pET28-H11-2或pET28-H11-3(實施例3第3步中構建)原核表達重組蛋白制樣、SDS-PAGE、電轉移至硝酸纖維膜後，以核酸疫苗第二次免疫2周後血清為一抗、兔抗山羊IgG-HRP為標記二抗進行Western印跡檢測。結果發現DNA疫苗在肌肉細胞內獲得了很好的表達，並刺激山羊產生抗H11抗體(見圖9)。
4.ELISA檢測抗體水平於免疫前、首次免疫後14天、第二次免疫後10、16、24、29、38、47天採取血清。用矩陣法確定包被抗原和抗體(血清)稀釋度。
用包被液稀釋H11抗原至合適濃度，加入酶標板，每孔50μl，37℃1小時後4℃過夜。棄包被液，PBS-Tween20洗滌3-5次，加100μl封閉液，4℃過夜或37℃1小時。棄封閉液，PBS-Tween20洗滌3-5次，加待檢血清(1∶1000稀釋)50μl，37℃保溫1小時。棄血清，PBS-Tween20洗滌3-5次，加酶標二抗50μl，37℃保溫1小時。棄二抗，PBS-Tween20洗滌3-5次，加顯色液100μl，避光反應5』-15分鐘，每孔加100μl2M硫酸終止反應，酶標儀測量OD490。
結果發現第二次免疫後10天抗體滴度達到較高水平，然而在二次免疫後16-29天時發現抗體滴度急劇下降到較低水平，之後又開始回升，並維持在一個較高水平(見圖10)。t檢驗表明pcDNA4/HisMax-H11-1+2+3免疫組抗體水平極顯著高於PBS對照組(P＜0.01)。
5.蟲卵計數捻轉血矛線蟲第三期幼蟲感染後，分別於感染後第21、23、25、27、29、31和33天山羊直腸採集糞便，用於蟲卵計數。
採用麥克馬斯特氏法。稱2克糞便於乳缽中，加水10ml，攪勻，再加飽和鹽水50ml。混勻後，吸取糞液，注入記數室，置顯微鏡臺上，靜置1-2分鐘。在鏡下計數，刻度中的蟲卵總數乘以200即為每克糞便中的蟲卵數。蟲卵減少率＝(1-實驗組平均每克糞便數/對照組平均每克糞便數)×100％。
蟲卵計數結果如表1。攻蟲後21天，糞便中開始能檢測到少量的捻轉血矛線蟲蟲卵，隨著時間推移，對照組和核酸疫苗免疫組每克糞便蟲卵數(EPG)逐漸增加，而不免疫不感染組均未檢測到捻轉血矛線蟲蟲卵。
表1 每克糞便蟲卵數(×200)

圖11是蟲卵排出規律曲線。pcDNA4/HisMax-H11-1+2+3免疫組山羊蟲卵排出數量明顯(t檢驗差異極顯著P＜0.01)少於PBS對照組，蟲卵減少率達58.75％。單獨用pcDNA4/HisMax-H11-1、pcDNA4/HisMax-H11-2或pcDNA4/HisMax-H11-3免疫組的山羊蟲卵減少率雖然低於pcDNA4/HisMax-H11-1+2+3免疫組，但是蟲卵排出數量也明顯(t檢驗差異極顯著P＜0.01)少於PBS對照組。
6.蟲卵孵化率於感染後第27、29、31天，直腸採集糞便，蟲卵計數後，稱重，捻磨後26℃培養4-6天，採用貝爾曼氏法[5]分離三期幼蟲，計數，計算蟲卵孵化率。蟲卵孵化率＝三期幼蟲數/蟲卵數×100％pcDNA4/HisMax-H11-1+2+3免疫組蟲卵平均孵化率為3.90％，PBS組平均孵化率為14.22％。核酸疫苗免疫後蟲卵孵化率降低72.57％，t檢驗差異極顯著(P＜0.01)。單獨用pcDNA4/HisMax-H11-1、pcDNA4/HisMax-H11-2或pcDNA4/HisMax-H11-3免疫組的山羊蟲卵排出數量雖然高於pcDNA4/HisMax-H11-1+2+3免疫組，但是也明顯(t檢驗差異極顯著P＜0.01)少於PBS對照組。
7.成蟲計數感染三期幼蟲後第35天，頸靜脈放血致死山羊，收集第四胃，分離捻轉血矛線蟲，分別計數雌雄蟲數目。成蟲減少率＝(1-實驗組平均成蟲數/對照組平均成蟲數)×100％。
結果發現PBS對照組平均每隻山羊的雌蟲、雄蟲、成蟲荷蟲數分別為266、170.5、436.5，而核酸疫苗免疫組分別為82.8、55.8、138.6(表2)。t檢驗分析表明免疫組和對照組間差異極顯著(P＜0.01)
表2 山羊第四胃內捻轉血矛線蟲成蟲計數

捻轉血矛線蟲H11基因疫苗免疫山羊後，攻擊第三期幼蟲，結果發現與對照組相比，免疫組山羊排出蟲卵減少58.75％、蟲卵孵化率降低72.57％、成蟲減少68.25％。PBS對照組攻蟲後被毛粗亂、消瘦、精神萎靡不振(12圖B)，眼結膜蒼白，表現為貧血症狀(12圖C右)；而免疫組相對健康，如圖12A和圖12C左。
序列表110南京農業大學120用於預防反芻動物捻轉血矛線蟲病的DNA疫苗130
1603170PatentIn version 3.12101211926212DNA213捻轉血矛線蟲(Haemonchus contortus)220
221免疫保護性隱蔽抗原基因H11的部分編碼區1(H11-1)222(1)..(926)223
4001atgacgtcgc aggggagaac gcggacattg ctgaatctaa ctccaatccg tcttattgtc 60gcattatttc tagtagctgc tgcagtcggc ctctctattg gtctcaccta ttactttact 120cgcaaagcgt tcgatacctc agaaaagcca gggaaggatg atactggtgg caaggacaaa 180gacaattctc cctctgcggc ggaactactc cttccaagta atataaaacc attgtcttac 240gacttgacga tcaaaacata tctacctggt tatgtggact tcccaccgga gcaaaacctc 300acattcgatg ggcgtgtgga aatatcaatg gttgtaattg agccaacaaa gagtatcgta 360ctcaattcaa agaagatctc tgtaataccc caagaatgtg aactggtatc gggcgataaa 420aaactcgaaa ttgaaagtgt aaaggagcac ccaagactgg aaaaggttga gtttcttatc 480aaaagccaac tggaaaaaga tcaacaaatc ttgctcaagg tcggctacat cggtctcatc 540agcaacagcc ttggtggaat ctaccagacc acttatacca ccccggatgg cacccctaag 600atcgctgcag tttcacaaaa tgagcccata gatgctcgtc gaatggtacc atgcatggat 660
gaaccgaaat acaaagcaaa ctggaccgtt actgtcattc atccaaaagg cgccaaagcc 720gtctcgaatg gaatcgaagt gaacggagat ggagagatca gtggtgattg gatcacatcg 780aagttcttga ctactccacg gatgtcatcc tacttgttgg cagttatggt ttcagaattt 840gaatacatcg aaggtgaaac aaagacgggt gttcggttcc gtatatggtc acgcccagag 900gcaaagaaga tgacacaata tgctct 9262102211974212DNA213捻轉血矛線蟲(Haemonchus contortus)220
221免疫保護性隱蔽抗原基因H11的部分編碼區2(H11-2)222(1)..(974)223
4002ccgcggccag aggcaaagaa gatgacacaa tatgctctga aatccggcat caaatgcata 60gagttctacg aagatttctt tgatatcaaa tcccctctga agaaacaaga tgtgatcgcc 120cttcctgatt tctcagcagg agccatggag aactggggcc tcatcactta cagagaaaac 180tctttgttgt acgatgacag attctatgca ccgatgaata aacagcgaat tgctcgcatt 240gttgctcatg agcttgctca tcagtggttt ggcgacttgg ttacgatgaa gtggtgggac 300aacttgtggt tgaatgaagg tttcgcaaga ttcacagaat tcattggagc tggtcagata 360actcaagatg acgccagaat gcggaactac ttcctgattg atgtacttga acgcgctttg 420aaagctgatt cggtagcgtc gagccatcca ctttccttca gaattgacaa agctgcagaa 480gttgaagaag cctttgatga tatcacatac gccaaaggag cttctgttct tactatgctg 540agagccttga ttggagaaga aaaacataag cacgcagtat cgcagtacct caagaagttc 600tcgtatagca atgcagaagc gacagatcta tgggcagttt tcgatgaagt tgtcactgac 660
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221免疫保護性隱蔽抗原基因H11的部分編碼區3(H11-3)222(1)..(1124)
223
4003acatggttga gaagagatga accgctttac ttgcatgtta gtgatgctgg cgctcccttt 60gtggtgaacg cagaccgcta tggattttat cgacaaagtc atgacgctaa tggttggaaa 120aagataatca agcagctcaa ggataatcat gaggcttaca gtccccggac aagaaatgcc 180atcattagcg atgcgtttgc tgcggctgca actgacgcaa ttgagtatga gactgtattt 240gaacttctga attatgccga aaaagaaacg gaatatctac cattagaaat cgcaatgtcg 300gggatctctt cgattttgaa atacttcggt accgagccag aggcaaagcc agctcaagtg 360tacatgatga acatattgaa accgatgtat gagaaaagca gtatcgaatt cattgccaat 420aactacagaa atgacaagct gtttttccaa atcaacctcc aaaaagatgt cattgatatg 480ttctgcgccc tcggatcgca agactgcagg aagaaatata aaaaactttt cgatgacgaa 540gtcatgaaca aatgcaggga tggtcaagca gcaaccgaat gcgtaagaat cgccgctcct 600
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1.一種用於預防和治療反芻動物捻轉血矛線蟲病的DNA疫苗，其中包含插入了捻轉血矛線蟲(Haemonchus contortus)保護性隱蔽抗原基因H11部分編碼區的真核質粒載體。
2.權利要求1所述的DNA疫苗，其中所述的H11部分編碼區具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
3.權利要求1所述的DNA疫苗，其中所述的H11部分編碼區具有SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
4.權利要求1所述的DNA疫苗，其中所述的H11部分編碼區具有SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。
5.一種用於預防和治療反芻動物捻轉血矛線蟲病的DNA疫苗，其中包括3種重組真核質粒載體，其中所述3種重組真核質粒載體其中分別插入了捻轉血矛線蟲保護性隱蔽抗原基因H11的3個不同位置部分編碼區分別具有如SEQ ID NO1、SEQ ID NO2或SEQ IDNO3所示的核苷酸序列。
6.權利要求5所述的DNA疫苗，其中所述3種重組真核質粒載體的混合比例為1∶1∶1。
7.權利要求1-6所述的DNA疫苗，其中所述的真核質粒載體為pcDNA4/His Max。
8.權利要求1-7中任一項所述的DNA疫苗在製備用於預防和治療反芻動物捻轉血矛線蟲病的藥物中的用途。
9.權利要求8所述的用途，其中所述的反芻動物為山羊。
全文摘要
本發明提供了一種具有預防和治療反芻動物捻轉血矛線蟲病作用的DNA疫苗捻轉血矛線蟲(Haemonchus contortus)保護性隱蔽抗原基因H11部分編碼區的重組真核質粒載體的DNA疫苗。具體而言，本發明還提供了3種重組真核質粒，這3種重組真核質粒中分別插入了捻轉血矛線蟲(H.contortus)保護性隱蔽抗原基因H11的3段不同位置部分編碼區，即H11－1、H11－2或H11－3。本發明提供了包含所述3種重組真核質粒其中之一的DNA疫苗。另外，本發明還提供了包含這3種重組真核質粒載體混合物的DNA疫苗。本發明所述疫苗包含有多個T細胞免疫應答元件，能夠有效地預防和治療反芻動物捻轉血矛線蟲病。
文檔編號A61P33/00GK1840202SQ20051012404
公開日2006年10月4日 申請日期2005年11月23日 優先權日2005年11月23日
發明者李祥瑞, 嚴若峰, 趙光偉, 徐立新 申請人:南京農業大學