一種高效製備綿羊克隆胚胎的方法
2023-10-09 23:50:19
專利名稱：一種高效製備綿羊克隆胚胎的方法
技術領域：
本發明涉及一種高效製備綿羊克隆胚胎的方法，屬於胚胎移植的方法領域。
背景技術：
目前，生產哺乳動物克隆的方法主要有胚胎分割和細胞核移植兩種。克隆羊「多莉」，以及其後各國科學家培育的各種克隆動物，採用的都是細胞核移植技術。所謂細胞核移植，是指將不同發育時期的胚胎或成體動物的細胞核，經顯微注射和細胞融合方法移植到卵母細胞中，重新組成胚胎並使之發育成熟的過程。與胚胎分割技術不同，細胞核移植技術，特別是細胞核連續移植技術可以產生無限個遺傳相同的個體。由於細胞核移植是產生克隆動物的有效方法，故人們往往把它稱為動物克隆技術。目前細胞核移植過程中，操作人員大都僅憑主觀判斷來挑選用作成熟的卵母細胞，所有關於豬，山羊，綿羊、牛(Keefer，CL, H. , Baldassarre, R. , Keyston. 2001. Generation of dwarf goat (Capra hircus) clones following nuclear transfer with transfected and nontransfected fetal fibroblasts and in vitro—matured oocytes. Biology of Reproduction, vol. 64 no. 3 849-856;翁凡，鄭小亮，劉哲.哺乳動物卵母細胞去核方法的研究進展[J]，安徽農學通報.2007年21期；桑國俊，牛卵母細胞及體外胚培養技術研究D)].甘肅農業大學.2008年；吳志南，山羊卵泡卵體外成熟、體外受精及冷凍保存方法的研究[D].揚州大學.2005年)的卵母細胞篩選的報導和論文都是採取在體視顯微鏡下挑選有2-3層顆粒細胞的卵丘-卵母細胞複合體的方法，並不進行初步的篩選。且胚胎融合率較低，導致大量胚胎浪費及高昂成本，因此急需開發一套高效製備綿羊克隆胚胎的方法，包括優質核供體細胞的製備方法、通過攪拌法初步篩選綿羊卵母細胞以提高綿羊卵母細胞的成熟效率，提高核移植操作的效率，提高融合效率。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種高效製備綿羊克隆胚胎的方法，以提高綿羊克隆胚胎製作效率。為解決上述技術問題，本發明通過攪拌篩選提高綿羊卵母細胞的體外成熟效率； 選取長勢良好的生長匯合的成纖維細胞作為核供體；採取擠壓去核同時注核的方法提高核移植效率；通過優化融合液配方提高胚胎融合效率。具體實施步驟為
成熟綿羊卵母細胞的製備將採集的卵巢置於30°C-35°C的滅菌生理鹽水中，lh-池內運回實驗室。用預溫的生理鹽水清洗卵巢，用帶8#針頭的IOml注射器，內有吸卵液(含青黴素(100IU/ml)、鏈黴素(100IU/ml)，0· 5%FBS，25mg/ml 肝素 TCM199 (Tissue Culture Medium 199 ，吸取卵巢表面2mm-6mm大小的卵泡，卵泡液收集於燒杯中，靜置5min後卵泡液凝集為絮狀，用細棒輕柔攪拌凝集物，待凝集物聚集成團後將凝集團扯碎並繼續攪拌。將攪拌後卵泡液放在體視顯微鏡下收集有兩層以上卵丘細胞包裹的綿羊卵母細胞用於成熟，將收集的卵丘-卵母細胞複合體(Cumulus Oocyte Complexes, COCs)在成熟液中洗3遍， 置於ΙΟΟμΙ成熟培養液微滴中，每滴放15個COCs，置於38. 5°C、5%C02、飽和溼度的培養箱
中成熟培養。供體細胞的準備剖腹取40天胚齡的綿羊胎兒頭部皮膚，儘量撕碎，將組織塊按 5mm左右間隔，接種在50 ml卡氏培養瓶的瓶底，每個瓶接種約25塊左右，要儘量將組織塊的切面貼在瓶底上，使組織塊粘附在瓶底，放入培養箱，靜置池-處，加5ml含15%FBS(fetal calf serum)的DMEM/F12 (Dulbecco's modified Eagle's medium mixed 1:1 with Ham's F-12)培養液，放入37°C、5%C02、飽和溼度培養箱內靜置培養3d後，換5ml含15%FBS的 DMEM/F12新鮮培養液。以後每3d換培養液一次，3_4d可明顯看到組織塊周圍有細胞長出， 細胞向周圍擴展，5d-8d由組織塊長出的細胞匯合，用0. 05%TE (胰蛋白酶一 EDTA)消化傳代，篩選長勢旺盛的成纖維細胞，取5代以內的自然生長匯合的成纖維細胞作為核供體，用 0. 05%TE 37°C消化lmin，離心收集細胞後用操作液清洗3次放4°C冰箱備用。克隆胚胎的製備
1.將成熟培養22h-24h後的綿羊卵母細胞置於無血清的H-M199 (HEPES-TCM199)中， 用移液器反覆吹吸成熟綿羊卵母細胞，待成熟綿羊卵母細胞周圍的卵丘細胞部分脫落，再將成熟綿羊卵母細胞移入含0. 25%透明質酸酶的H-M199中作用5min，然後用含10%FBS的 H-M199反覆吹吸綿羊卵母細胞，直到無卵丘細胞為止。以排出第一極體為成熟標準，於顯微鏡下檢查成熟情況。2.選取5代以內的自然生長匯合的成纖維細胞作為核供體，用0. 05%TE37°C消化 lmin，終止消化後，離心收集細胞，用操作液清洗3次放4°C冰箱備用。3.挑選排放第一極體並且形態正常的綿羊卵母細胞，置於7. 5μδ/πι1細胞鬆弛素(CCB)中，作用5min，然後用含10%FBS的H-M199清洗3遍，置於覆蓋有石蠟油10μ1含 10%FBS的H-M199的微滴中，並將核供體細胞也置於微滴中，在顯微作業系統下，用持卵針吸住綿羊卵母細胞，使極體處在5點鐘的位置，用內徑為20Mm去核針扎破透明帶擠出第一極體及其附近少量胞質，從破口處將供體成纖維細胞直接注射到去核綿羊卵母細胞透明帶下，輕輕觸壓使供體細胞與細胞膜緊密接觸。重構胚胎的融和及體外培養供體細胞注射完成後立即用融合液融合，融合後放入成熟液中，培養4h後，用含5mM離子黴素5%FBS的H-M199中激活5min，移入含有2mM 6-DMAP (6-二甲基氨基)的輸卵管上皮培養液(SOFaa)中培養4h。將重構胚置於ΙΟΟμΙ的 SOFaa培養液微滴中培養，每個微滴放入15枚重構胚，置於38. 5°C、5%C02、飽和溼度培養箱中培養，4 後檢查卵裂情況，連續培養7d檢查囊胚情況。本發明通過攪拌法篩選的綿羊卵母細胞大部分處於同一時期，成熟的時間統一， 成熟過度的綿羊卵母細胞均凝集，質量差的卵丘細胞完全脫落，便於篩選，提高成熟率。採用本發明製作的成纖維細胞活力好，生長旺盛，接觸性抑制可以將細胞周期調整到GO期， 可以在卵細胞中啟動重編程，發育到囊胚。本發明提供的融合液可以使融合效率提高到95% 以上，大大提高了克隆胚胎的成功率，且不影響後續的胚胎發育。採用本發明提供的方法降低了克隆胚胎製作過程中的胚胎損失，提高了克隆胚胎的效率，是一種高效製備綿羊優質克隆胚胎的方法。
具體實施例方式實施例1綿羊卵母細胞的成熟
將新鮮採集的綿羊卵巢置於30°C _35°C的滅菌生理鹽水中，lh-池內運回實驗室。用預溫的生理鹽水清洗卵巢，用帶8#針頭的IOml注射器，內有吸卵液(含青黴素(100IU/ml)、 鏈黴素(100IU/ml)，0. 5%FBS, 25mg/ml肝素的TCM199)，吸取卵巢表面2mm-6mm大小的卵泡， 卵泡液收集於燒杯中，靜置5min後卵泡液凝集為絮狀，用細棒輕柔攪拌凝集物，待凝集物聚集成團後將凝集團扯碎並繼續攪拌。將攪拌後卵泡液放在體視顯微鏡下收集有兩層以上卵丘細胞包裹的綿羊卵母細胞用於成熟，將收集的COCs在成熟液中洗3遍，置於ΙΟΟμΙ成熟培養液微滴中，每滴放15個COCs，置於38. 5°C、5%C02、飽和溼度的培養箱中成熟培養。培養17h後第一極體排出率90. 9%(1504/1654)。成熟液15%PG處理後發情綿羊血清 10 μδ/πι1 FSH, 20 μδ/πι1 LH, 1. 5 Pg/ml 17-BE2 溶於 TCM199。實施例2供體細胞的準備
剖腹取40天胚齡的綿羊胎兒頭部皮膚，儘量撕碎，將組織塊按5mm左右間隔，接種在50 ml卡氏培養瓶的瓶底，每個瓶接種約25塊左右，要儘量將組織塊的切面貼在瓶底上，使組織塊粘附在瓶底，放入培養箱，靜置池-處，加5ml含15%FBS的DMEM/F12培養液，放入37°C、 5%C02、飽和溼度培養箱內靜置培養3d後，換5ml含15%FBS的DMEM/F12新鮮培養液。以後每3d換培養液一次，3d-4d可明顯看到組織塊周圍有細胞長出，細胞向周圍擴展，5d — 8d 由組織塊長出的細胞匯合，可消化傳代，篩選長勢旺盛的成纖維細胞，鑑定核型，製作生長曲線，選取5代以內的自然生長匯合的成纖維細胞作為核供體，用0. 05%TE37°C消化lmin， 離心收集細胞後用操作液清洗3次放4°C冰箱備用。實施例3克隆胚胎的製作
1.將成熟培養22h-24h後的綿羊卵母細胞置於無血清的H-M199中，用移液器反覆吹吸成熟綿羊卵母細胞，待成熟綿羊卵母細胞周圍的卵丘細胞部分脫落，再將成熟綿羊卵母細胞移入含0. 25%透明質酸酶的H-M199中作用5min，然後用含10%FBS的H-M199清洗綿羊卵母細胞，直到無卵丘細胞為止。以排出第一極體為成熟標準，於顯微鏡下檢查成熟情況。2.選取5代以內的自然生長匯合的成纖維細胞作為核供體，用0. 05%TE37°C消化 lmin,終止消化後，離心收集細胞，用操作液清洗3次放4°C冰箱備用。3.挑選排放第一極體並且形態正常的綿羊卵母細胞，置於7. 5Pg/mlCCB中，作用 5min,然後用含10%FBS的H-M199清洗3遍，置於覆蓋有石蠟油10μ1含10%FBS的H-M199的微滴中，並將核供體細胞也置於微滴中，在顯微作業系統下，用持卵針吸住綿羊卵母細胞， 使極體處在5點鐘的位置，先用內徑為20Mm的注射針吸取多個形態良好，表面粗糙的核供體細胞，用注核針扎破透明帶然後用注射針擠壓透明帶外第一極體上方位置，擠出第一極體及其附近少量胞質，從破口處將去注核針內的供體成纖維細胞直接注射到去核綿羊卵母細胞透明帶下，輕輕觸壓使供體細胞與細胞膜緊密接觸。實施例4重構胚胎的融和及體外培養
供體細胞注射完成後立即用特製融合液融合，融合後放入成熟液中，4h後，用含5mM離子黴素5%FBS的H-Ml99中激活5min，移入含有2mM 6-DMAP的SOFaa培養液中培養4h。將重構胚置於ΙΟΟμΙ的SOFaa培養液微滴中培養，每個微滴放入15枚重構胚，置於38. 5°C、5%C02、飽和溼度培養箱中培養，4 後檢查卵裂情況，連續培養7d檢查囊胚情況。結果融合率達到 96. 47% (356/369)，卵裂率達 92. 97% (331/356)，囊胚率達 24. 8% (82/331)。融合液0.05g/LBSA, 0. 20M 甘露醇，0. 08mM 醋酸鈣，0. 8 mM Hepes 用 Sigma 超純水溶解，不調PH值，調節滲透壓為253468 mOsm, 0. 22Mm濾膜過濾，分裝後4°C儲存。實施例5重構胚胎的融和及體外培養
供體細胞注射完成後立即用特製融合液融合，融合後放入成熟液中，4h後，用含5mM離子黴素5%FBS的H-Ml99中激活5min，移入含有2mM 6-DMAP的SOFaa培養液中培養4h。將重構胚置於ΙΟΟμΙ的SOFaa培養液微滴中培養，每個微滴放入15枚重構胚，置於38. 5°C、 5%C02、飽和溼度培養箱中培養，4 後檢查卵裂情況，連續培養7d檢查囊胚情況。結果融合率達到 98 % (355/362)，卵裂率達 89. 85% (319/355)，囊胚率達 23. 8% (76/319)。融合液組成為0. 15g/LBSA, 0. 35M甘露醇，0. 05mM醋酸鈣，0. 5mM Hepes,超純水溶解，不調PH值，調節滲透壓為253468 mOsm, 0. 22Mm濾膜過濾，分裝後4°C儲存。實施例6重構胚胎的融和及體外培養
供體細胞注射完成後立即用特製融合液融合，融合後放入成熟液中。將融合胚置於成熟液中培養4h後，用含5mM離子黴素5%FBS的H-M199中激活5min，移入含有2mM 6-DMAP 的SOFaa培養液中培養4h。將重構胚置於ΙΟΟμΙ的SOFaa培養液微滴中培養，每個微滴放入15枚重構胚，置於38. 5°C、5%C02、飽和溼度培養箱中培養，4 後檢查卵裂情況，連續培養7d檢查囊胚情況。結果融合率達到96. 78% (361/373)，卵裂率達90. 8% (328/361), 囊胚率達 27. 7% (91/328)0融合液0.12g/LBSA, 0. 30M 甘露醇，0. 20mM 醋酸鈣，2 mM Hepes 用 Sigma 超純水溶解，不調PH值，調節滲透壓為253468 mOsm, 0. 22Mm濾膜過濾，分裝後4°C儲存。以上所述，僅為本發明的較佳實施例，並非對本發明作任何形式上和實質上的限制，凡熟悉本專業的技術人員，在不脫離本發明技術方案範圍內，當可利用以上所揭示的技術內容，而作出的些許更動、修飾與演變的等同變化，均為本發明的等效實施例；同時，凡依據本發明的實質技術對以上實施例所作的任何等同變化的更動、修飾與演變，均仍屬於本發明的技術方案範圍內。
權利要求
1.一種高效製備綿羊克隆胚胎的方法，其特徵在於通過攪拌篩選獲得處於同一細胞周期的綿羊卵母細胞，將供體胞細胞核通過顯微注射到所述綿羊卵母細胞後立即用融合液處理，融合後的胚放入成熟液培養形成融合胚胎。
2.權利要求1所述的方法，其特徵在於所述綿羊卵母細胞的製備方法為預溫的生理鹽水清洗新鮮卵巢，收集卵巢表面2mm-6mm大小的卵泡與吸卵液中，卵泡液凝集為絮狀後， 用細棒輕柔攪拌使凝集物聚集，將凝集團撕碎並繼續攪拌；在體視顯微鏡下收集卵丘-卵母細胞複合體，成熟液中洗3遍，置於成熟培養液微滴中，38. 5°C、5%C02、飽和溼度的培養箱中成熟培養。
3.權利要求1或2所述的方法，其特徵在於所述供體細胞為成纖維細胞，來源於40天胚齡胎兒的頭部。
4.權利要求2所述的方法，其特徵在於所述吸卵液組成為100IU/ml青黴素、100IU/ml 鏈黴素，0. 5%FBS，25mg/ml 肝素 TCM199。
5.權利要求2所述的方法，其特徵在於所述成熟液體組成為15%PG處理後發情綿羊血清 10 Pg/ml FSH, 20 Pg/ml LH, 1. 5 Pg/ml 17_βΕ2 溶於 TCM199。
6.權利要求1所述的方法，其特徵在於所述供體細胞的製備方法為剖腹取40天胚齡的綿羊胎兒頭部皮膚，儘量撕碎，將組織塊按5mm左右間隔，接種在50 ml卡氏培養瓶的瓶底，每個瓶接種約25塊左右，要儘量將組織塊的切面貼在瓶底上，使組織塊粘附在瓶底，放入培養箱，靜置3h-4h，加5ml含15%FBS的DMEM/F12培養液，放入37°C、5%C02、飽和溼度培養箱內靜置培養3d後，換5ml含15%FBS的DMEM/F12新鮮培養液；以後每3d換培養液一次， 3d-4d可明顯看到組織塊周圍有細胞長出，細胞向周圍擴展，5d-8d由組織塊長出的細胞匯合，可消化傳代，篩選長勢旺盛的成纖維細胞，選取5代以內的自然生長匯合的成纖維細胞作為核供體，用0. 05%TE 37°C消化lmin，離心收集細胞後用操作液清洗3次放4°C冰箱備用。
7.權利要求1或2所述的方法，其特徵在於所述顯微注射的具體步驟為顯微鏡下篩選排出第一極體綿羊卵母細胞，置於覆蓋有石蠟油10μ1含10%FBS的H-M199的微滴中，通過顯微注射將權利要求4所述供體細胞移植入去核綿羊卵母細胞透明帶下，輕輕觸壓使供體細胞與細胞膜緊密接觸，注射完成後立刻使用融合液處理。
8.一種可提高胚胎融合效率的融合液，其特徵在於組成為0.05-0. 15g/LBSA, 0. 20-0. 35M甘露醇，0. 05-0. 20mM醋酸鈣，0. 5-2 mM H印es，超純水溶解，不調pH值，調節滲透壓為253468 mOsm, 0. 22Mm濾膜過濾，分裝後4°C儲存。
9.權利要求8所述的融合液，其特徵在於組成為0.08-0. 12g/LBSA，0. 05-0. 30M甘露醇，0.08-0. 12mM醋酸鈣，0.8-1. 2 mM H印es，超純水溶解，不調pH值，調節滲透壓為253468 mOsm, 0. 22Mm濾膜過濾，分裝後4°C儲存。
10.權利要求9所述的融合液，其特徵在於組成為0.lg/LBSA，0. 28M甘露醇，0. ImM醋酸鈣，1 mM H印es，超純水溶解，不調pH值，調節滲透壓為253468 mOsm, 0. 22Mm濾膜過濾， 分裝後4°C儲存。
全文摘要
本發明公開了一種高效製備綿羊優質克隆胚胎的方法，屬於胚胎移植的方法領域。本發明通過攪拌篩選獲得處於同一細胞周期的綿羊卵母細胞，將供體胞細胞核通過顯微注射入移植入綿羊卵母細胞後，立即用融合液處理，處理後的胚胎放入成熟液培養形成融合胚胎，化學激活後啟動重構胚胎卵裂。本發明通過攪拌法獲得處於同一時期，成熟時間統一的綿羊卵母細胞，提供了新的挑選優質綿羊卵母細胞方法，提高了綿羊卵母細胞的成熟率。使用同一根注射針擠壓去核同時注核的方法提高了核移植的操作效率。通過使用本發明開發的融合液可以使融合效率提高到95%以上，大大提高了克隆胚胎的成功率，且不影響後續的胚胎發育。本發明提供的方法降低了克隆胚胎製作過程中的胚胎損失，提高了生產綿羊克隆胚胎的效率，是一種高效製備綿羊優質克隆胚胎的方法，具有廣闊的應用前景。
文檔編號C12N15/877GK102229964SQ20111013385
公開日2011年11月2日 申請日期2011年5月23日 優先權日2011年5月23日
發明者劉羿羿, 周歡敏, 張東 申請人:內蒙古農業大學