一種通過bmp15基因高效快速檢測綿羊高繁殖性狀的方法
2023-10-10 00:07:39 1
專利名稱：一種通過bmp15基因高效快速檢測綿羊高繁殖性狀的方法
技術領域：
本發明涉及策勒黑羊BMP15基因編碼序列上的一個單核苷酸多態性(簡稱SNP) 位點，可作為綿羊高繁殖性狀的一個分子標記，建立了判定該SNP位點基因型的檢測方法。
背景技術：
綿羊屬單胎哺乳類動物，但某些綿羊品種卻具有穩定的多胎性能。研究認為， BMPR-IB基因，⑶F9基因和BMP15基因對控制綿羊多胎性能有重要價值，尤其發現在以上 三個基因序列中的鹼基改變，可以顯著影響綿羊的繁殖性狀。！^ecB基因是在綿羊上發現的 第一個多胎主效基因，該基因是BMPR-IB基因上的一個鹼基發生突變產生，同樣在⑶F9和 BMP15上也發現能夠影響綿羊產羔性能的基因。在我國的多胎綿羊中，均發現了 !^ecB基因存在並顯著影響產羔數，該基因已經作 為分子標記在生產實踐中廣泛應用；但其他多胎主效基因研究還沒有明確的結論。本發明 研究綿羊多胎主效基因，有助於了解哺乳動物繁殖性狀的作用機制，同時可以把多胎主效 基因作為分子標記，迅速提高綿羊的繁殖性能。
發明內容
本發明的目的在於提供的通過BMP15基因高效快速檢測綿羊高繁殖性狀的方 法，對甄別綿羊的繁殖率具有著重要的科學價值，並已得到實踐的驗證。本發明的目的是這樣實現的一種通過BMP15基因高效快速檢測綿羊高繁殖 性狀的方法，包括1)在策勒黑羊BMP15基因編碼序列中新發現的一個SNP位點，其位 點位於Genebank序列(序列號為NM_001114767. 1)從BMP15基因序列的起始密碼子 ATG開始+755位點，發生了 T —C突變(簡稱T755C) ；2)人工合成一對核苷酸序列作為 檢測T755C位點的引物，其正向引物5' -gaagaccaaacctctccctaagg-3 『；反向引物 5' -tactttcaggcccatcatgctcc-3『；上下遊引物長度均為23bp，將其結合到綿羊BMP15基 因相應的模板鏈上，並擴增到含有E+755位點的核酸序列；3)提取DNA，利用引物擴增PCR， 將產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用溴化乙錠染色，以凝膠成像確定已擴增的目的條帶； 4)利用限制性內切酶Apa I對PCR產物進行消化，消化後用8%丙烯醯胺凝膠電泳，硝酸銀 染色，以凝膠成像鑑別該綿羊個體在T755C位點的基因型，將其不同的基因型作為綿羊高 繁殖性狀的分子標記，用於輔助選擇育種；上步的T755C位點突變後，造成BMP15蛋白的結構和功能發生改變，顯著改變了母 羊的產羔數；上步酶切消化產物大小為140bp時，表示該個體沒有高繁殖性能；酶切消化產物 大小為120bp和140bp兩條帶時，表示該個體具有高繁殖性能。所述檢測綿羊高繁殖性狀的方法，利用限制性內切酶Apa I識別T755C位點，此序 列為C時能切開，序列為T時不能被切開。所述檢測綿羊高繁殖性狀的方法，獲取的BMP15基因T755C位點，因不同基因型個體間具有不同的繁殖性狀，其不同的基因型可以作為綿羊高繁殖性狀的分子標記。所述檢測綿羊高繁殖性狀的方法，實驗選用的試劑與藥劑均為市售產品。本發明構思及作用機理利用DNA序列分析技術對策勒黑羊BMP15基因編碼區序 列進行了分析，在E+755位點(Genebank序列Access number :NM_001114767. 1起始密碼子 ATG開始+755個鹼基)首次發現了鹼基T — C的突變(簡稱T755C)；該核苷酸突變後，造 成三聯密碼子由CTG突變為CCG，從而導致編碼亮氨酸的密碼子轉變為脯氨酸，引起BMP15 蛋白結構和功能的改變，並顯著影響了母羊的產羔數。該方法由於E+755位點不同的基因型，可以作為判斷綿羊個體是否具有高繁殖性 狀的一個分子標記；建立的檢測該位點的高效快速檢測方法，對提高畜牧業種群的繁育及 優選有著重要的實用價值，彰顯技術進步。
本發明對照說明書附圖作進一步闡述。附圖1為本方法擴增的PCR產物的電泳圖；如圖所示泳道1為150bp Marker, 2-8為PCR產物，大小為140bp附圖2為本方法的內酶切消化後的電泳圖；如圖所示泳道13 為 IOObp Marker，1，2，3，4，5，7，9，10，11，12 泳道為 140bp，6 和 8泳道為120bp和140bp
具體實施例方式本發明對照實施例作進一步說明。一、體外擴增(1)採集羊外周血液1. 5ml，使用肝素納抗凝，經過凍融和離心後，收集沉澱的白 細胞，用酚氯仿抽提的方法提取基因組DNA ；(2)採用位於 Genebank 序列(Access number :NM_001114767. 1)從 ATG 開始第 +729bp到+751bp作為上遊引物，並在引物1的第22個鹼基由A改為G，增加了內切酶Apa I的一個識別位點，從ATG開始第+846bp到+848bp作為下遊引物，以上引物進行PCR擴增 可以得到長度為140bp的特異性核酸序列；(3) PCR 擴增反應體系10 X PCR buffer (Mg2+free) 2 μ L, 25mM MgCl 1. 5uL, lOmmol/L dNTP 混合物 2 μ L，10 μ mol/L 上遊引物 1 μ L，10 μ mo 1/L 下遊引物 1 μ L，Taq 酶 1. 25U, 50ng/ μ L 綿羊基因組 DNA 1 μ L, DMSOl μ L, ddH20 補足 20 μ L ；G) PCR 反應循環程序95°C 5min 1 個循環；95°C 30s，58°C退火 90s，72°C 90s 共 ；35個循環；72°C 5min 1個循環；(5)通過2%的瓊脂糖凝膠電泳，確定PCR產物擴增出目的條帶的質量(見附圖 1)。二、擴增片段的限制性內切酶片段長度多態性技術分析(1)用內切酶Apa I對PCR產物進行消化反應。反應體系為PCR產物4 μ L， IOXbuffer 1 μ L，內切酶5U，用雙蒸水補足至10yL，37°C水浴10h。(2)檢測酶切產物。酶切產物用8%聚丙烯醯胺處置上凝膠電泳，硝酸銀染色，利用凝膠成像系統觀察結果(見附圖2)。三、BMP15基因E+755位基因型的判斷標準(1)BMP15基因E+755位的鹼基為T，則酶切消化產物大小為140bp ；(2)鹼基為C，則酶切消化產物大小為120bp ；(3)鹼基是雜合子，則酶切產物有140bp和120bp兩條帶；通過觀測聚丙烯醯胺凝膠電泳後的染色結果，判定酶切消化產物的帶型，可以確 定該綿羊個體中BMP15基因+755位置的基因型。四、酶切消化產物大小為140bp時，該個體沒有高繁殖性能，酶切消化產物大小為 120bp和140bp兩條帶時，該個體具有高繁殖性能。
權利要求
1.一種通過BMP15基因高效快速檢測綿羊高繁殖性狀的方法，其特徵在於包括1)在 策勒黑羊BMP15基因編碼序列中新發現的一個SNP位點，其位點位於Genebank序列(序列 號為NM_001114767. 1)從BMP15基因序列的起始密碼子ATG開始+755位點，發生了 T — C 突變(簡稱T755C) ；2)人工合成一對核苷酸序列作為檢測T755C位點的引物，其正向引物 5『 -gaagaccaaacctctccctaagg-3『；反向弓丨物5『 _tactttcaggcccatcatgctcc_3『；上下 遊引物長度均為23bp，將其結合到綿羊BMP15基因相應的模板鏈上，並擴增到含有E+755位 點的核酸序列；3)提取DNA，利用引物擴增PCR，將產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用溴化 乙錠染色，以凝膠成像確定已擴增的目的條帶；4)利用限制性內切酶ApaI對PCR產物進行 消化，消化後用8%丙烯醯胺凝膠電泳，硝酸銀染色，以凝膠成像鑑別該綿羊個體在T755C 位點的基因型，將其不同的基因型作為綿羊高繁殖性狀的分子標記，用於輔助選擇育種；上步的T755C位點突變後，造成BMP15蛋白的結構和功能發生改變，顯著改變了母羊的 產羔數；上步酶切消化產物大小為140bp時，表示該個體沒有高繁殖性能；酶切消化產物大小 為120bp和140bp兩條帶時，表示該個體具有高繁殖性能。
2.按照權利要求1所述檢測綿羊高繁殖性狀的方法，其特徵在於利用限制性內切酶 Apa I識別T755C位點，此序列為C時能切開，序列為T時不能被切開。
3.按照權利要求1所述檢測綿羊高繁殖性狀的方法，其特徵在於獲取的BMP15基因 T755C位點，因不同基因型個體間具有不同的繁殖性狀，其不同的基因型可以作為綿羊高繁 殖性狀的分子標記。
4.按照權利要求1所述檢測綿羊高繁殖性狀的方法，其特徵在於實驗選用的試劑與 藥劑均為市售產品。
全文摘要
本發明提供的一種通過BMP15基因高效快速檢測綿羊高繁殖性狀的方法，包括1)在策勒黑羊BMP15基因編碼序列中新發現的一個SNP位點，位點位於Genebank序列，從BMP15基因序列的起始密碼子ATG開始+755位點，發生T-C突變(簡稱T755C)；2)合成一對核苷酸序列作為檢測T755C位點的引物，其正向引物5′-gaagaccaaacctctccctaagg-3′；反向引物5′-tactttcaggcccatcatgctcc-3′；上下遊引物長度均為23bp，將其結合到綿羊BMP15基因相應的模板鏈上，並擴增到含有E+755位點的核酸序列；3)提取DNA，利用引物擴增PCR，將產物用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，用溴化乙錠染色，以凝膠成像確定已擴增的目的條帶；4)利用限制性內切酶ApaI對PCR產物進行消化，酶切消化產物為120bp和140bp兩條帶時，表示個體具有高繁殖性能。
文檔編號C12Q1/68GK102051411SQ201010517378
公開日2011年5月11日 申請日期2010年10月25日 優先權日2010年10月25日
發明者馮利君, 史洪才, 楊丹, 梁慶玲, 牛志剛, 白傑 申請人:新疆維吾爾自治區畜牧科學院中國—澳大利亞綿羊育種研究中心