一種快速有效獲得臍帶間充質幹細胞(msc)的方法

2023-10-10 00:12:49 1

專利名稱：一種快速有效獲得臍帶間充質幹細胞(msc)的方法
技術領域：
本發明是一種快速有效獲得臍帶MSC的方法，具體地說是利用細胞培養技術和合理的組織處理技術提高獲得臍帶MSC得率和速度，並快速鑑定的方法。
背景技術：
間充質幹細胞是屬於中胚層的一類多能幹細胞，主要存在於結締組織和器官間質中。MSC具有強大的增殖能力和多向分化潛能，在適宜的體內或體外環境下可分化為造血細胞、肌細胞、肝細胞、成骨細胞、軟骨細胞、基質細胞等多種細胞。同時MSC除了具有幹細胞的一般生物學特點外，還具有免疫調節功能。此外該細胞還具有來源相對方便，易於分離、 培養、擴增和純化，多次傳代擴增後仍具有幹細胞特性，不存在免疫排斥的特性。因此近年來MSC已成為幹細胞研究中的熱點，在免疫疾病治療、造血幹細胞移植、組織工程、基因工程等領域具有較好的應用前景。MSCs可以抑制淋巴細胞的增殖，具有很強的免疫調節功能。體內實驗證實，MSC移植能夠明顯延長移植皮膚的存活時間和減少異基因造血幹細胞移植GVHD，我們也成功利用 MSC移植治療了數十例系統性紅斑狼瘡患者。目前認為這個MSC分泌各種免疫調節分子，與免疫細胞的接觸，低免疫原性、誘導嵌合體形成從而誘導免疫耐受調控機體免疫有關。目前的研究表明MSC還可以治療缺血性疾病。MSC和外周血幹細胞聯合移植可以促進乳腺癌患者和高危急性髓性白血病患者的造血恢復，並沒有相關的負作用，顯示了良好的促造血恢復的能力。MSC細胞的這種治療效果與MSC分泌各種造血因子及生成骨髓基質且有利於造血幹細胞的體外擴增、造血幹細胞移植後的歸巢及植入、可縮短移植後骨髓造血功能恢復的時間有關。同時在大鼠大腦動脈阻塞和心肌梗死模型的研究中均發現，MSC 細胞具有改善病症的作用。同時MSC作為一種幹細胞，也具有幹細胞多向分化潛能，MSC可以治療先天性骨形成不良、異染性腦白質營養不良(MLD)和赫爾利症候群，在帕金森症，老年痴呆症，脊椎損傷，燒傷的治療也有報導。此外MSC可以作為攜帶外源基因的良好載體，已經有人把細胞因子，如IL23、EPO 等導入MSC細胞內，進入體內後獲得長時間穩定表達。有人把IFNii的基因導入MSC內，發現腫瘤的微環境容易使MSC植入，進入腫瘤內的MSC通過分泌IFNii細胞因子抑制腫瘤生長，顯示了 MSC具有可能的腫瘤生物治療功能。這些結果都提示了 MSC廣泛的治療功能，目前世界各國均投入大量的人力物力財力進行廣泛和深入的研究。但上述的治療方案都需要大量的MSC進行移植，因此建立穩定有效快速的MSC資源庫具有極為重要的意義。—般認為MSCs在骨髓組織中的含量最豐富，但是隨著年齡的老化，自體骨髓中 MSCs數目顯著降低、增殖分化能力大幅度衰退，並存在病毒感染的潛在危險，同時供體MSC 的採集困難，使得尋找骨髓以外其它可替代的MSCs 「資源庫」的研究被提上日程。目前，已經從脂肪、胚胎、羊膜液、胎盤、臍帶血以及臍帶等骨髓以外的組織中分離出MSC。而在這些組織中，臍帶屬於醫療廢棄物，最容易獲得，且對其研究及應用不涉及倫理學問題，並且具有穩定大量的來源，因此具有研究的價值。目前的研究表明，臍帶間充質幹細胞存在於臍帶沃頓膠和血管周圍組織中，在該部位培養獲取的成纖維細胞樣，表達α-平滑肌肌動蛋白及多種MSCs標記物(⑶四、CD44、CD51、CD105、SH2、SH3)，但不表達內皮或白細胞特殊抗原 ⑶34、⑶45。同時在臍帶間充質幹細胞培養基中加入5-氮胞苷，MSCs向心肌細胞分化，改變培養條件還可向脂肪細胞和骨細胞分化，提示了臍帶MSC細胞和骨髓MSC細胞具有相同的表型和分化潛能。目前用於分離間充質幹細胞的方法主要有4種，即流式細胞分選法、磁珠分離法、 密度梯度離心法和貼壁篩選法。對流式細胞分選法和磁珠分離法來說，因迄今尚未發現間充質幹細胞特異性很強的表面標記物，研究者需要選用多個表面標誌進行檢測；此外，這兩種方法對細胞活性的影響較大、實驗條件要求較高，並不利於細胞的分離分選，故目前尚未廣泛應用。密度梯度離心法由於需要較精密的儀器和合適的分離液，對細胞也有一定的影響，並不適合用於大規模的生產應用。而貼壁篩選法，所獲的細胞形態均一，增殖速度快，生長狀態穩定，且操作簡便，成本低，有望成為較實用的生產方法。相關文獻報導了臍帶MSC 細胞的獲取方法，獲取效率相對較低，速度較慢。我們改進了傳統的內皮細胞消化方法和消化酶的配方，採用半組織貼壁方法可以大量快速的獲取臍帶MSC細胞。並有很高的獲得效率和得率。本方法簡單易行，更有利於用於生產實踐。

發明內容
本發明的目的是提供一種通過優化臍帶組織消化酶配方和消化細胞貼壁的方式， 快速有效利用新生胎兒的臍帶為資源獲取臍帶MSC以及快速MSC鑑定的方法，具體如下1.剪取剖宮產健康產婦近胎盤端臍帶20-30cm，置於無菌預冷的PBS中保存。臍帶經過嚴格的病原體檢測確認安全後使用。 2.超淨工作檯中，將臍帶取出放入玻璃培養皿中，剝離臍動脈和臍靜脈，將剝離血管的臍帶組織放於DMEM/F12培養基中剪成2mm3左右的組織塊。3.常規臍帶組織消化使用的酶為膠原酶或者膠原酶與胰酶的混合液，如果想將組織完全消化往往需要比較長的時間，影響原代細胞狀態。而如果消化時間較短，不能將組織完全消化，則會影響分離效率。並且這種消化方式對組織塊的粉碎或者剪碎的要求比較高， 大塊未剪碎的組織常常不能完全消化。同時，使用膠原酶或者膠原酶與胰酶的混合液消化的組織多成粘稠狀，需要大量的緩衝液稀釋，多次衝洗才能獲取相應的細胞，更加大了 MSC 細胞獲取的難度。因此，我們配置了一種專門用於臍帶組織消化的酶CDH消化酶，該酶在較短的時間內可以充分的將臍帶組織消化，對組織塊粉碎的要求較低，且消化液不粘稠，更容易衝洗離心獲取MSC細胞。4.常規臍帶組織消化後，會通過100目篩網過濾，獲取單細胞懸液，然後接種於細胞培養瓶貼壁，這種方法MSC獲取較快，但獲取的MSC細胞一般較少，且由於中間處理過程太多，細胞狀態受到影響。也有文獻報導通過組織塊貼壁的方法獲取MSC，但這種方法對組織塊處理要求過高，大部分組織塊不能貼緊細胞瓶壁，且一般需要3周才能獲取MSC細胞。 通過我們的觀察發現，組織通過消化酶消化後，MSC細胞一般成團或者粘附在未完全消化組織上，將消化液通過100目篩網過濾後大部分消化出來的MSC細胞因成團不能通過篩網， 影響獲取效率。對此我們發明了如下的方法CDH消化酶消化後的組織液無需通過篩網，大部分單個細胞或者MSC細胞團均可貼壁，即使有未消化完全的小塊組織，在通過CDH消化酶後，也變得極易貼緊細胞瓶壁，能快速的獲取MSC細胞。該方法結合了臍帶組織消化獲取單細胞和組織貼壁方法的雙重優點，有效提高了 MSC的得率和速度。5.具體的操作過程如下剪碎的組織與⑶H混合酶溶液按1 1的比例混合加入 50ml離心管中，置於37°C搖床中，200rpm振蕩，消化池左右。消化後的組織PBS洗滌三次後，重懸於含有12%胎牛血清的DMEM/F12培養基中，鋪入T-25培養瓶。6.培養2天後，棄去未貼壁的細胞與組織，加入新鮮的含有10%胎牛血清的DMEM/ F12培養基，隔天換液。細胞長至80%豐度時(約8天)，細胞消化前三代將細胞按1 1 的比例接種於新的T-25培養瓶中。以後細胞消化均按1 3傳代。第8天即可獲得第一代MSC，約2 X IO6個細胞，並可流式檢測MSC相應表型。


圖1、臍帶來源的MSC細胞形態(A)採用本方法獲取的MSC培養3天後的細胞形態，組織塊處生發出的貼壁細胞，呈發散型梭狀。也有部分單個貼壁細胞並開始分裂增值。 (B)採用傳統消化處理方式培養3天後只有少數細胞貼壁，部分樣本無法獲取細胞。(C)採用本方法獲取的第一代MSC培養8天後的形態，細胞豐度達到80%，成為形態相對均一的梭型成纖維樣細胞，漩渦狀生長。(D)採用傳統消化處理方式培養8天後少數細胞開始增值， 但並不能達到80%的細胞豐度達到(E，F)用本方法獲取的MSC與採用傳統消化處理方式培養的第15代MSC形態未發生改變。圖2、獲取的MSC細胞流式快速表型檢測將在T-25塑料培養瓶中培養的第三代 MSC細胞消化獲得單細胞懸液，採用單克隆螢光抗體分別標記上機檢測，用CellQuest軟體進行數據分析MSC細胞的判定標準為陽性表型⑶105、⑶73、⑶90、⑶44、⑶四、HLA-ABC陽性率不低於 95% Jj^§CD34、CD14、CDllb、CD19、HLA-DR、CD31 陽性率不高於 2%。圖3、將貼壁細胞用細胞消化液(0. 25%胰酶+0. 02% EDTA)消化成單細胞懸液， 按1 X IO4細胞/孔接種在M孔板內，每隔M小時消化3個孔，收集細胞，並用0. 4%的胎盼蘭計數活細胞，繪製生長曲線。第三代細胞增值較快，在對數生長期，細胞倍增時間均約為36小時。細胞每傳一代，細胞數約增長2倍。與相關文獻和專利的報導基本一致。第8 天獲得第一代MSC，約2 X IO6個細胞，預計每隻20cm臍帶一個月後可獲得7 X IOiciMSC細胞產量。
具體實施例方式本發明的目的是利用細胞培養技術和合理的組織處理技術提高獲得臍帶MSC得率和速度，並快速鑑定的方法。發明人公布了一種優化的臍帶組織消化酶配方和消化細胞貼壁方式，以及快速MSC鑑定方法。下面就具體實施例來說明本發明的具體運用。實例1臍帶MSC細胞快速獲取1.剪取剖宮產產婦手術中近胎盤端臍帶20-30cm，置於無菌預冷的PBS中保存。2.臍帶經過嚴格的病原體檢測(梅毒螺旋體、愛滋病病毒(HIV)、巨細胞病毒 (CMV)、B肝病毒(HBV)、C肝病毒(HCV)、梅毒、支原體等微生物病原體檢測)，確認安全後使用。同時排除早產、胎膜早破、絨毛羊膜炎、系統性紅斑狼瘡、腎炎、糖尿病等因素的臍帶樣本，確保獲取的MSC正常。3.超淨工作檯中，將臍帶取出放入玻璃培養皿中，剪成約5cm長的小段，用PBS洗淨。將臍帶血完全洗淨後，剝離臍動脈和臍靜脈，並將剝離血管的臍帶組織放於DMEM/F12 培養基中用手術剪刀剪成2mm3左右的組織塊。4.配置CDH消化酶(II型膠原酶250U/ml，中性蛋白酶100U/ml，透明質酸酶IOU/ ml)，37度溶解於DMEM/F12培養基，過濾0. 22 μ m的濾器除菌備用。消化酶最好現配現用， 在4度保存時間勿超過1周。5.剪碎的組織與⑶H混合酶溶液按1 1的體積比例混合與50ml離心管中，置於37°C搖床中，200rpm振蕩，消化池左右(待組織塊基本消化即可，少數較小的組織塊的殘留並不影響MSC獲取效率)。6.將消化後的組織液4°C，300g離心5min，棄上清，棄上清，將沉澱用PBS重懸於 50ml新鮮培養基中，4°C，300g離心5min，棄清，PBS洗兩次，注意不要將細胞和組織沉澱棄去。最後一遍離心後，棄上清，將沉澱重懸於含有12%胎牛血清的DMEM/F12培養基中，鋪入 T-25培養瓶。鋪入細胞培養瓶培養瓶前不能用100目篩網過濾，過濾會影響MSC細胞的獲得效率。(約5cm的臍帶消化所得的沉澱鋪於1個T-25培養瓶中)7.培養2天後，棄去未貼壁的細胞與組織，加入新鮮的含有10%胎牛血清的DMEM/ F12培養基，隔天換液。MSC細胞會在沿著貼壁的組織塊或者貼壁的細胞長出。細胞長至 80%豐度時(約8天)，細胞消化液(0. 25%胰酶+0. 02% EDTA)，前三代將細胞按1 1的比例接種於新的T-25培養瓶中，以保證生長速率。以後細胞消化均按1 3傳代。8.每隻20cm臍帶，第8天獲得第一代MSC，約2X IO6個細胞，一個月後可獲得 7 X IOiciMSC細胞產量。實例2臍帶MSC細胞快速鑑定細胞形態學觀察通過本方法獲得的原代細胞和組織塊多在2天內貼壁，培養4-6 天即可觀察到從組織塊處生發出的貼壁細胞，呈發散型梭狀。同時也可觀察到部分單個貼壁細胞開始分裂增值。通過1次傳代(8天)後，細胞增值較快，成為形態相對均一的梭型成纖維樣細胞，漩渦狀生長。連續傳代15次細胞形態未發生明顯變化。按照文獻和其他專利的報導，獲取第一代MSC細胞需要2周，並且成功率不高。本方法獲得的細胞數和獲取時間以及成功率均明顯優於按照其他文獻和專利。流式檢測分離、擴增的MSCs如何進行鑑定，是目前的爭議問題。MSCs能表達多種表面抗原但不特異，但通過檢查多個表面標記可以區分MSC和其他細胞，相關文獻也有報導。同時流式細胞術檢測是一種快速精確的檢測手段，可以很有效快速的確定獲取細胞的表型。避免了傳統的通過檢測MSC細胞分化能力鑑定耗時過長的缺點。將在T-25塑料培養瓶中培養的第三代MSC細胞用細胞消化液消化獲得單細胞懸液，並細胞計數。將MSC細胞重懸至1 X 107細胞數/毫升，單細胞懸液分裝入流式管中，每管100 μ 1。在每個流式管中加入相應標記的流式螢光抗體，混勻。4度避光孵育30分鐘。 每個流式管加入500 μ 1 PBS洗去未標記上的抗體，40C，300g離心lOmin，棄上清，棄上清， 重複三次。隨後將細胞沉澱重懸與100 μ 1 PBS中。流式細胞儀檢測相應表型，並通過相應軟體分析。MSC細胞的判定標準為陽性表型⑶105、⑶73、⑶90、⑶44、⑶四、HLA-ABC陽性率不低於 95% Jj^§CD34、CD14、CDllb、CD19、HLA-DR、CD31 陽性率不高於 2%實例3臍帶MSC細胞得率及細胞生長曲線的測定。將獲得的MSC細胞在第一代第八天用細胞消化液(0. 25%胰酶+0. 02% EDTA)消化後，用0.4%的胎盼蘭計數活細胞，統計第一代細胞得率。將第三代細胞用細胞消化液 (0. 25 %胰酶+0. 02 % EDTA)消化後，按1 X 104細胞/孔接種在24孔板內，每隔24小時消化 3個孔，收集細胞，並用0.4%的胎盼蘭計數活細胞，繪製生長曲線。前三代細胞生長較慢， 因此需要以1 1的比例接種傳代，第4代開始細胞增值較快，在對數生長期，細胞倍增時間均約為36小時。細胞每傳一代，細胞數約增長2倍。與相關文獻和專利的報導基本一致。 第8天獲得第一代MSC，約2 X 106個細胞，預計每隻20cm臍帶一個月後可獲得7 X 1010MSC 細胞產量。
權利要求
1.一種專門用於臍帶組織消化的酶CDH消化酶，該酶在較短的時間內可以充分的將臍帶組織消化，對組織塊粉碎的要求較低，且消化液不粘稠，更容易衝洗離心獲取MSC細胞。這種消化液的特徵是含有II型膠原酶250U/ml，中性蛋白酶100U/ml，透明質酸酶IOU/ ml，37度溶解於DMEM/F12培養基，過濾0. 22 μ m的濾器除菌備用。消化酶最好現配現用，在 4度保存時間勿超過1周。
2.一種快速有效獲得臍帶造血幹細胞的方法，其特徵為運用要求書1所述的專用臍帶組織消化酶配方，採取臍帶組織共培的方式，快速有效利用新生胎兒的臍帶為資源獲取臍帶MSC以及快速MSC鑑定的方法。
全文摘要
本發明屬於生物醫藥領域，公開了一種快速有效獲得臍帶間充質幹細胞(MSC)方法。特徵是通過一種優化臍帶組織消化酶配方和消化細胞貼壁的方式，快速有效利用新生胎兒的臍帶為資源獲取臍帶MSC以及快速MSC鑑定的方法。本方法在現有的臍帶間充質幹細胞的基礎上改進而成，在獲得MSC的時間上縮短為原來的一半、得率提高了一倍，且不影響MSC的各種表面特徵和功能。為臍帶MSC的科研和臨床運用提供一種科學的快速有效的獲取方法。
文檔編號C12N9/48GK102191229SQ20101012523
公開日2011年9月21日 申請日期2010年3月16日 優先權日2010年3月16日
發明者侯亞義, 劉柳, 李鵬飛, 王亞平, 趙葉琳, 趙曉寅 申請人:侯亞義