一種基於多嵌段共聚物的載藥膠束系統的製備方法與流程
2023-10-09 08:23:24 2
本發明屬於化工及新材料技術領域，具體涉及一種基於多嵌段共聚物P(tBA)-b-P(DMAEMA-co-PEGMA)的載藥膠束系統的製備方法。
背景技術：
隨著近年來生物醫學的不斷發展，加之對疾病原理的深入認識，人們不斷開發出新的藥物來治療對應的疾病。但目前已開發藥物中，大多數藥物的活性成分為難溶性物質，在水中的溶解度很低。這部分藥物在人體中的，生物利用度低，藥物治療效果無法達到理想水平。正是如此，目前新藥開發的瓶頸問題正是難溶性藥物的生物利用度低，使得該藥物無法發揮應有療效。因此，提高難溶性藥物的溶解度，使藥物在體液和組織中的濃度保持在較高水平，從而提高藥物的生物利用度。而對於口服藥物的吸收過程而言，藥物的溶出速率是藥物吸收的瓶頸，通常溶出速率是吸收速率的限制條件。綜上所述，使用不同的製劑手段提高難溶性藥物的溶解度和溶出速率便成了目前藥物控釋研究的熱點和難點。
傳統的藥劑學增溶方法有超細粉碎、添加增溶劑或助溶劑、有效成分成鹽、遴選合適的晶型、改變難溶性藥物的分子結構等。但是這些方法存在著種種不足，例如有的方法成本過高，有的影響藥物療效，有的加入大量助劑或對人體存在毒副作用。針對這些問題，本發明提出了一種多嵌段共聚物膠束載藥系統。多嵌段共聚物P(tBA)-b-P(DMAEMA-co-PEGMA)具有兩親性，在水溶液中濃度達到臨界膠束濃度時，很容易發生自組裝行為，且自組裝後的膠束具有良好的組織滲透性、增容效果好等優點，並且該聚合物具有pH和溫度雙重響應性，因此本發明利用該聚合物自組裝後所得膠束的這些特點，採用物理包埋的方法將多嵌段共聚物P(tBA)-b-P(DMAEMA-co-PEGMA)膠束攜帶難溶性藥物，來達到提高難溶性藥物的溶解度和溶出速率，實現藥物靶向釋放等目的。
技術實現要素：
本發明的目的在於克服現有技術存在的不足，提供一種基於多嵌段共聚物P(tBA)-b-P(DMAEMA-co-PEGMA)的載藥膠束系統的製備方法。
本發明提出了一種基於多嵌段共聚物P(tBA)-b-P(DMAEMA-co-PEGMA)的負載難溶性藥物的載藥膠束系統的製備方法，該方法首先採用RAFT聚合法合成一種多嵌段共聚物P(tBA)-b-P(DMAEMA-co-PEGMA)，然後將P(tBA)-b-P(DMAEMA-co-PEGMA)與難溶性藥物喜樹鹼溶解於有機溶劑中，配置成一定濃度的膠束溶液，對膠束溶液進行透析，透析結束後冷凍乾燥即可得到P(tBA)-b-P(DMAEMA-co-PEGMA)載藥膠束，再將該載藥膠束溶於磷酸鹽緩衝液(PBS)中，即可實現藥物的可控釋放。
本發明提出了一種基於多嵌段共聚物的載藥膠束系統的製備方法，所述多嵌段共聚物為P(tBA)-b-P(DMAEMA-co-PEGMA)，其化學結構式如下所示：
這裡，m=80~2000, n=80~2000
具體步驟如下：
(1) 多嵌段共聚物P(tBA)-b-P(DMAEMA-co-PEGMA)的合成
稱量1~5 g丙烯酸叔丁酯(tBA)置於50 mL單口圓底燒瓶中，取5~50 mg 4-氰基-4-(硫代苯甲醯)戊酸和1~8 mg偶氮二異丁腈於50 mL燒杯中，加入5~15 mL二氧六環溶解。然後將兩者混合，通過「T型」三通，對單口燒瓶在0 ℃下抽真空，並通入氮氣。在氮氣保護下置於60~90 ℃油浴下反應6~24 h，均勻磁力攪拌。反應結束後將燒瓶於冰水浴中冷卻後通大氣，將冷卻後的溶液滴加到100~400 mL甲醇/水(v : v = 2 : 1)混合溶液中，靜置2~6 h，除去上層液體，得到底部淡粉色沉澱。重複以上沉澱步驟2~3次，最後將樣品在30~50 ℃下真空乾燥12~72 h，得到淡粉色聚丙烯酸叔丁酯(P(tBA))。
將0.5~2.5 g甲基丙烯酸二甲氨乙酯(DMAEMA)和0.1~0.4 g乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯(PEGMA)置於50 mL單口圓底燒瓶中。稱量0.5~2.5 g上述製備的聚丙烯酸叔丁酯(P(tBA))和0.5~2.5 mg 偶氮二異丁腈於50 mL燒杯中, 加入5~15 mL二氧六環溶解。然後將兩者混合，通過「T型」三通，對單口燒瓶在0 ℃下抽真空，並通入氮氣。在氮氣保護下置於60~90 ℃油浴下反應6~48 h，均勻磁力攪拌。反應結束後將燒瓶於冰水浴中冷卻後通大氣，將冷卻後的溶液滴加到100~300 mL冰石油醚中，靜置2~6 h，除去上層液體，得到底部粘稠樣品。重複以上沉澱步驟2~3次，最後將樣品在30~50 ℃下真空乾燥12~72 h。得到淡黃色多嵌段共聚物P(tBA)-b-P(DMAEMA-co-PEGMA)。
(2) P(tBA)-b-P(DMAEMA-co-PEGMA)載藥膠束的製備
將2~6 mg喜樹鹼(CPT)與10~40 mg P(tBA)-b-P(DMAEMA-co-PEGMA)溶解在5 mL的N,N-二甲基甲醯胺中，將溶液裝入截留分子量為2500~4500 Da的透析袋中，在25 ℃條件下，於500~2000 mL去離子水中透析12~72 h。透析結束後得到負載有喜樹鹼的膠束水溶液，將其進行冷凍乾燥12~72 h後得到P(tBA)-b-P(DMAEMA-co-PEGMA)載藥膠束。
(3) P(tBA)-b-P(DMAEMA-co-PEGMA)載藥膠束的藥物釋放
將步驟(2)中製得的P(tBA)-b-P(DMAEMA-co-PEGMA)載藥膠束溶解於磷酸鹽緩衝液(PBS)中，將該溶液置於截留分子量為2500~4500 Da的透析袋中，用紫外-可見光譜儀測試釋放液中喜樹鹼的紫外吸收強度，再計算累計釋放量。
與現有技術相比，本發明的優點主要有以下三點：①本發明使用多嵌段共聚物P(tBA)-b-P(DMAEMA-co-PEGMA)作為難溶性藥物載體，該物質產率高，成本低，製備方法簡單，吸附速度快，釋放可控性好；②親水段材料為梳形的聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯(PEGMA)，該材料具有生物相容性好、無生理毒性、廉價以及能夠避免人體內網狀內皮系統識別吸收而使其能在血液循環中長效穩定等優點。
附圖說明
圖1 P(tBA300)-b-P(DMAEMA300-co-PEGMA10)膠束的自組裝及其藥物的負載/釋放示意圖。
圖2 P(tBA300)-b-P(DMAEMA300-co-PEGMA10)膠束的流體力學直徑-溫度曲線。
圖3 不同溫度下P(tBA300)-b-P(DMAEMA300-co-PEGMA10)載藥膠束的藥物釋放曲線。
圖4 不同pH值下P(tBA300)-b-P(DMAEMA300-co-PEGMA10)載藥膠束的藥物釋放曲線。
具體實施方式
下面通過實施例進一步說明本發明。
實施例1
(1) 多嵌段共聚物P(tBA300)-b-P(DMAEMA300-co-PEGMA10)的合成
稱量2.75 g丙烯酸叔丁酯(tBA)置於50 mL單口圓底燒瓶中，取20 mg 4-氰基-4-(硫代苯甲醯)戊酸和3.52 mg偶氮二異丁腈於50 mL燒杯中，加入10 mL二氧六環溶解。然後將兩者混合，通過「T型」三通，對單口燒瓶在0 ℃下抽真空，並通入氮氣。在氮氣保護下置於70 ℃油浴下反應12 h，均勻磁力攪拌。反應結束後將燒瓶於冰水浴中冷卻後通大氣，將冷卻後的溶液滴加到200 mL甲醇/水(v : v = 2 : 1)混合溶液中，靜置4 h，除去上層液體，得到底部淡粉色沉澱。重複以上沉澱步驟兩次，最後將樣品在40 ℃下真空乾燥48 h，得到淡粉色聚丙烯酸叔丁酯(P(tBA))。
將1.22 g甲基丙烯酸二甲氨乙酯(DMAEMA)和237.54 mg乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯(PEGMA)置於50 mL單口圓底燒瓶中。稱量1 g上一步的聚丙烯酸叔丁酯(P(tBA))和1.27 mg 偶氮二異丁腈於50 mL燒杯中, 加入10 mL二氧六環溶解。然後將兩者混合，通過「T型」三通，對單口燒瓶在0 ℃下抽真空，並通入氮氣。在氮氣保護下置於70 ℃油浴下反應24 h，均勻磁力攪拌。反應結束後將燒瓶於冰水浴中冷卻後通大氣，將冷卻後的溶液滴加到200 mL冰石油醚中，靜置4 h，除去上層液體，得到底部粘稠樣品。重複以上沉澱步驟兩次，最後將樣品在40 ℃下真空乾燥48 h。得到淡黃色多嵌段共聚物P(tBA300)-b-P(DMAEMA300-co-PEGMA10)。
(2) P(tBA300)-b-P(DMAEMA300-co-PEGMA10)載藥膠束的製備
將3 mg喜樹鹼(CPT)與20 mg的P(tBA300)-b-P(DMAEMA300-co-PEGMA10)溶解在5 mL的N,N-二甲基甲醯胺中，將溶液裝入截留分子量為3500 Da的透析袋中，在25 ℃條件下，於1000 mL去離子水中透析48 h。透析結束後得到負載有喜樹鹼的膠束水溶液，將其進行冷凍乾燥48 h，即得P(tBA300)-b-P(DMAEMA300-co-PEGMA10)載藥膠束。
(3)不同溫度下P(tBA300)-b-P(DMAEMA300-co-PEGMA10)載藥膠束的可控釋放
取8 mg第(2)步製得的載藥膠束溶解於20 mL pH值為7.4的磷酸鹽緩衝液(PBS)，將該溶液平均分為兩份，分別置於截留分子量為3500 Da的透析袋中，在25 ℃和45 ℃條件下，分別浸入100 mL PBS(pH=7.4)緩衝溶液中。在設定的時間間隔下取5 mL釋放液，再補充5 mL新鮮的PBS溶液，即置換量為5 mL。用紫外-可見光測試釋放液中喜樹鹼的紫外吸收強度，再計算累計釋放量。由圖2的結果可知，P(tBA300)-b-P(DMAEMA300-co-PEGMA10)的低臨界溶解溫度(LCST)為36.8 ℃。因此，利用本發明分別在低於和高於膠束LCST下進行藥物釋放實驗，釋放曲線如圖3所示。從釋放曲線中可以看出，當溫度在LCST以下(25 ℃)時，P(tBA300)-b-P(DMAEMA300-co-PEGMA10)膠束結構十分穩定，只有很少量的藥物從膠束中擴散出來，藥物釋放的過程非常緩慢，在48 h以後大約仍有60 %的藥物留在膠束中。而當載藥膠束被置於溫度高於LCST(45 ℃)的環境下，較高的溫度導致穩定的膠束殼核結構遭到破壞，藥物的釋放過程也明顯加快。20 h後，就有約50 %的藥物從膠束中被釋放出來，在48 h以後，約有58 %的藥物從膠束內核中被釋放出來。由以上分析可以表明，通過改變載藥膠束所處的釋放環境的溫度，本發明可以對該膠束的藥物釋放速率進行有效調控。
(4)不同pH下P(tBA300)-b-P(DMAEMA300-co-PEGMA10)載藥膠束的可控釋放
稱取載藥膠束8 mg，平均分成兩份，分別溶於10 mL pH = 4.0和pH = 7.4的PBS溶液中，得到負載有喜樹鹼的不同pH的載藥膠束溶液，再將兩組溶液分別置於截留分子量為3500 Da的透析袋中，分別於100 mL與透析袋內相同pH值的磷酸鹽緩衝液中透析。將燒杯分別置於37 ℃的恆溫振蕩器中恆溫振蕩，分別於1 h、2 h、3 h、4 h、8 h、10 h、12 h、16 h、20 h、24 h、36 h、48 h在兩個透析燒杯中各取5 mL釋放液，再補充5 mL 新鮮的PBS溶液，即置換量為5 mL。用紫外-可見光測試釋放液中喜樹鹼的紫外吸收強度，再計算累計釋放量。釋放曲線如圖4所示。從圖中可以看出，在pH = 4.0的條件下，喜樹鹼的釋放速率較快，在12 h時累積釋放量可達59 %左右，12 h後，釋放速率變緩；在48 h時，有約76.2 %的藥物從膠束內核中被釋放出來。而在pH = 7.4的條件下，試樣在12 h時的累積釋放量僅達到26.8 %，48 h時的累積釋放量為37.9 %。這主要是由於與pH = 7.4的正常環境相比，在pH = 4.0的酸性釋放環境下，聚合物鏈段質子化嚴重，膠束結構被破壞，藥物釋放速度加快。
上述實驗很好地證明了多嵌段聚合物P(tBA300)-b-P(DMAEMA300-co-PEGMA10)載藥膠束具有溫度和pH雙重敏感性，能夠實現可控的藥物負載和釋放，具有潛在的生物醫學價值。其在pH = 7.4的正常活體環境中藥物釋放率不高，但在pH = 4.0的酸性環境中可以有效釋放，而pH = 4.0的酸性液態環境是某些癌變的腫瘤細胞所生存的環境。因此多嵌段聚合物P(tBA300)-b-P(DMAEMA300-co-PEGMA10)載藥膠束是一種很好的藥物載體，它能達到攜載抗癌藥物、靶向殺死癌變細胞、儘量少地破壞活體正常細胞的目的，符合靶向給藥的特點。
實施例2
與實施例1相比，將第一步中丙烯酸叔丁酯(PtBA)用量變為2.29 g，其他條件保持不變，則體系中單體(丙烯酸叔丁酯)，鏈轉移劑(4-氰基-4-(硫代苯甲醯)戊酸)和引發劑(偶氮二異丁腈)的摩爾比為250 : 1 : 0.3。
實施例3
與實施例1相比，將第一步中甲基丙烯酸二甲氨乙酯(DMAEMA)用量變為1.01 g，其他條件保持不變，則體系中單體(甲基丙烯酸二甲氨乙酯)，鏈轉移劑(4-氰基-4-(硫代苯甲醯)戊酸）和引發劑(偶氮二異丁腈)的摩爾比為250 : 1 : 0.3。
實施例4
與實施例1相比，將第一步中乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯(PEGMA)用量變為0.36 g，其他條件保持不變，則體系中單體(乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯)、鏈轉移劑(4-氰基-4-(硫代苯甲醯)戊酸)和引發劑(偶氮二異丁腈)的摩爾比為15 : 1 : 0.3。
實施例5
與實施例1相比，將第二步中喜樹鹼(CPT)用量變為4 mg，其他條件保持不變，則體系中藥物(喜樹鹼)和載藥劑的質量比為1 : 5。
實施例6
與實施例1相比，將第二步中喜樹鹼(CPT)用量變為5 mg，其他條件保持不變，則體系中藥物(喜樹鹼)和載藥劑的質量比為1 : 4。
實施例7
與實施例1相比，將第二步中透析時間變為72 h，其他條件保持不變。
實施例8
與實施例1相比，將第二步中透析時間變為96 h，其他條件保持不變。
實施例9
與實施例1相比，將第三步和第四部中載藥膠束用量變為6 mg，其他條件保持不變，則載藥膠束濃度變為0.3 mg/mL
實施例10
與實施例1相比，將第三步和第四部中載藥膠束用量變為10 mg，其他條件保持不變，則載藥膠束濃度變為0.5 mg/mL
實施例2-10中獲得的多嵌段共聚物P(tBA)-b-P(DMAEMA-co-PEGMA)膠束載藥與實施例1的產品具有類似的性能。