一種柑桔黃單胞菌的快速檢測膠體金試紙條的製作方法

2023-10-29 03:24:07

專利名稱：一種柑桔黃單胞菌的快速檢測膠體金試紙條的製作方法
技術領域：
本發明屬於免疫檢測技術領域及納米金示蹤技術領域，具體涉及一種用於快速檢測柑桔黃單胞菌的膠體金免疫層析試紙條。
背景技術：
柑桔潰蕩病(Citrus bacterial canker disease, CBCD)是一種由柑桔黃單胞菌 iXanthomonas citri subsp.ciiri, Icc)所引起的，危害全世界柑桔種植業最嚴重的檢疫性細菌病害[1]。該病能侵染絕大多數多種芸香科植物，包括柑桔屬的絕大多數商品化栽培品種[2]。該病主要隨帶病種苗等繁殖材料遠距離傳播，發病嚴重時往往導致樹勢衰退，枯枝落葉、布滿病斑、果實品質惡劣甚至未熟先落，嚴重影響柑桔的產量和質量[3]。由於抗病品種和特效藥劑的匱乏，針對發病的植株仍然採用挖除病樹集中燒毀的剷除方式M[5]。目前對該病的防控措施主要依靠加強植物檢疫檢測，早期診斷病害，切斷傳播源頭。隨著我國經濟快速發展，柑桔產品的調運和交易更加頻繁，人為傳播的危險性急劇加大，在這樣的形勢下迫切需要更多更好的檢測技術手段，特別是快速簡便、可用於現場診斷的方法。膠體金溶液分散相中的金原子直徑在廣150nm之間，隨著顆粒的大小不同溶膠顏色呈現由紅到紫的變化。膠體金免疫技術(ICG)是以膠體金顆粒作為顯色物質或示蹤標記物[8]，標記於抗原或抗體上，直觀反映抗原抗體之間相互作用的新型免疫標記技術·1(1]。膠體金顆粒本身無毒，能夠迅速而穩定地吸附於所有生物大分子上，但不改變大分子的生物活性，因此作為一種安全的探針它可以進行切片定位及日常診斷技術[11]。其優點是快速、 靈敏、特異性強、穩定性好，且操作簡便、無需任何儀器設備，結果判斷直觀可靠、易被基層人員掌握。

發明內容
本發明的目的是為了彌補當前檢測技術的不足，提供一種快速、簡便、靈敏、特異、 經濟的柑桔黃單胞菌快速診斷膠體金試紙條。本發明提篩選高靈敏度抗體(ELISA效價達到1 :256，000倍)，研發出的單抗介導膠體金速測卡易於攜帶、使用方便，結果直觀、保存簡單，從制樣到結果全過程僅需要10分鐘，檢測下限為lX103~4c/i//mL。目前為止螢光定量qPCR方法最為靈敏(IXlOlYfizAiL), 速測卡與qPCR法的結果符合率能達到95. 15%以上。在基層現場檢疫時能夠提供一定的幫助，僅需要對個別疑似樣品進一步診斷，避免了大規模的送樣檢測，節省人力物力。研製的膠體金速測卡用於檢測柑桔潰瘍病，節約耗材，操作簡單，靈敏度高，穩定性好，對基層實地檢測起到極大幫助，具有極大的推廣和實用價值。有益效果本發明具有的突出優點和實用性①特異性強；②穩定性好，批間/批內差異小，易於質量控制；③無毒無害，使用安全；④操作簡便，無需儀器設備；⑤符號顯示結果，自帶質控對照，結果易於判斷；⑥易於運輸儲藏。發明內容包括(1)篩選優質的單克隆抗體1、2。(2)製備大小為5 40nm納米金顆粒。(3)各類緩衝液、層析材料的預處理液的配方。具體製作過程如下 (1)單克隆抗體的製備
用柑桔黃單胞菌Cfcc)全菌懸液免疫小白鼠，通過ELISA方法測定小鼠抗血清效價達到規定要求後，取免疫小鼠的淋巴組織(脾細胞)分離抗體分泌細胞在培養液中混懸加入96 孔板，在CO2培養箱中培養，將提前復甦的骨髓瘤細胞與脾細胞按1 :10或1 :5的比例混合在一起，在離心管中用不完全培養液洗滌，30s內緩慢滴加預熱的PEG，靜置90-120S後補加完全培養液，將融合後的細胞懸液加入含有飼養細胞的96孔板，CO2培養箱中培養，數天後鏡下觀察克隆細胞。ELISA方法檢測篩選出能夠穩定分泌Zcc單克隆抗體的陽性克隆細胞株1、2並進行擴大培養，方法是對小鼠腹腔接種降植烷或液體石蠟，7-10天後腹腔接種用 PBS或無血清培養基稀釋的雜交瘤細胞，數天後無菌注射器吸取腹水，對腹水進行純化既得到單克隆抗體1、2。單克隆抗體1、2是針對抗原上不同的抗原決定簇，因此不會彼此結合， 並測定單抗的效價、特異性、穩定性。(2)膠體金標記單克隆抗體1的製備方法
採用檸檬酸三鈉還原法製備膠體金顆粒並測定金顆粒大小約為5 40nm，15000rpm離心，製備儲液。用K2CO3調節膠體金溶液至最適合pH8-10，攪拌並滴加Zcc單抗1 ；加入 5-15% BSA溶液封閉；加入0. 5 2 % PEG20000穩定；金標抗體4°C 15000rpm離心30min ；收集管底可流動的暗紅色沉澱於保存液中(pH9. 8PBS+0. 5 1%PVA + 3 5%蔗糖+2 5%甘油+ Γ2% Tween20)[21]，4°C保存。(3)金標結合墊的製備
用預處理液(pH9. 8PBS+廣2. 5%Tween20+0. θΓθ. 2%PVA+廣2%casein)對金標墊進行預處理。將金標抗體噴塗於40mm X 5mm金標墊上。
(4)硝酸纖維素膜的處理
硝酸纖維素膜AE99用pH9. 8PBS浸泡後晾乾，在距NC膜下端廣1. 2cm處固定Zcc單抗 2作為檢測線，距NC膜上端0. 5^0. 7cm處固定羊抗鼠抗體作為質控線，晾乾後採用封閉液 (1 2%Tween20+l 2%Casein+l 2%BSA)封閉。
(5)膠體金試紙條的裝配
試紙條由樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊和PVC背襯組成。分為4個部分加樣區、標記物結合區、對比檢測區、吸水區。用膠體金標記^fcc單抗1包被於標記物結合區， Ic單抗2包被於對比檢測區的檢測帶上，羊抗鼠多抗平行包被於檢測帶後端作為質控線。 該試紙條利用免疫層析技術和雙抗夾心法原理，通過對比檢測區上檢測線和質控線的顏色深淺，判斷待測樣品中濃度的高低，濃度越高檢測線顏色比質控線越深。PVC塑料板便於檢測時使用者握取，保持試紙條的潔淨，整個過程要求避免其他汙染物沾染。試紙條用鋁箔袋密封，加入矽膠顆粒乾燥劑，4°C可長期保持備用。(6)速測卡特異性測定
選擇抗原菌以及其他11種植物致病菌、柑桔葉圍附生菌及常見菌種作為供試菌種蠟質芽孢桿菌UaciB^s cerem)、大腸埃希氏菌(fecAericAia co/i)、水稻白葉枯病袁、Xanthomonas oryzae pv. oryzae)^^M'MM'MM ( Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis)、蘇雲金芽抱桿菌{Bacillus thuringiensis)、枯草芽抱桿菌 {Bacillus subtil islif iXanthomonas campestris pv. campes tris Wtt
病菌solanacearum) 4種柑桔組織中分離的伴生菌(鑑定為黃單胞屬其他種)， 均稀釋成約為IXlO8個菌)的菌懸液，分別滴加70μ 到速測卡加樣區，5min內觀察結果。僅有測試Ic的速測卡C線和T線均出現呈陽性，其餘11張速測卡僅出現C線呈陰性。說明速測卡對有很好的特異性，對其他11種供試菌種無明顯交叉反應。如圖3 所示圖3中速測卡測試Zcc以及其他11種常見菌種。(7)速測卡靈敏度測定
將Ic菌懸液從1 X IQsCfufmL稀釋到1 X Wcfu/mL,分別滴加70μ 到速測卡加樣區， 5min內觀察結果。根據結果，免疫金層析速測卡能夠檢測1X103~4濃度的Ic菌懸液。如圖4所示
從右到左依次是Icc菌懸液1 X IQ9Cfu/mL到1 X IQ1CfufmL0


圖1為本發明的結構示意圖； 圖2為圖1的右視圖3為柑桔黃單胞菌膠體金免疫層析速測卡測試Zcc和11種常見細菌菌株測定圖； 圖4為柑桔黃單胞菌膠體金免疫層析速測卡檢測靈敏度測定圖； 圖5為本發明陰性結果檢測圖； 圖6為本發明陽性結果檢測圖； 圖7為本發明有待進一步檢查的檢測圖； 圖8為本發明無效結果的檢測圖。
具體實施例方式如圖1、2所示，一種柑桔黃單胞菌的快速檢測膠體金試紙條，PVC底板1表面上由下到上依次貼有加樣墊2、結合墊3、硝酸纖維素膜4和吸水墊5，所述加樣墊2上端搭接在結合墊3上；該結合墊3上端搭接在硝酸纖維素膜4上；所述吸水墊5下端也搭接在硝酸纖維素膜4上。其中所述結合墊3上包被柑桔黃單胞菌單克隆抗體1，所述硝酸纖維素膜4 上設置有檢測線7和質控線6，所述檢測線7包被柑桔黃單胞菌單克隆抗體2，所述質控線6 包被羊抗鼠抗體。柑桔黃單胞菌單克隆抗體1、2是用柑桔黃單胞菌免疫小白鼠，取免疫小鼠的脾細胞與小白鼠骨髓瘤細胞雜交融合，製備雜交瘤細胞，篩選能夠穩定分泌柑桔黃單胞菌單克隆抗體的細胞株製得。實施例1 無病斑柑桔樣品檢測 (1)樣品製備
5將疑似植物組織放入離心管中，加入無菌水，浸泡30min，為縮短浸泡時間可加以震蕩， 靜置數分鐘吸取上清液離心，留管底少量殘液滴加到速測卡加樣區，5min內觀察顯色結果。(2)樣品檢測
在檢測前將試紙條包裝拿出，室溫放置5分鐘左右。取出試紙水平放置，將各待測樣液用簡易滴管分別吸取並滴加4滴於加樣區圓形孔槽。5分鐘內即可肉眼觀察結果。(3)結果判定
如果檢測線沒有看到紅色條帶而質控線出現紅色條帶，說明檢測結果呈陰性，待測樣液不含1c，試紙條質量完好(如附圖5所示)；如檢測線和質控線都出現紅色條帶，或檢測線顏色較質控線更深，則待測液中含有Ic且濃度高於lX103_4cfu/ml (如附圖6所示);如果檢測線顏色明顯淺於質控線顏色，則待測液中可能存在濃度低近lX103_4cfu/ml的1c， 應作進一步檢測驗證(如附圖7所示)；如果檢測線出現紅色條帶而質控線沒有條帶出現說明試紙條效果失效，結果不可靠(如附圖8所示)。實施例2
帶疑似病斑的柑桔樣品檢測 (1)樣品製備
將帶有病斑的疑似植物組織選取少量放入小離心管中加無菌水浸泡並研磨。(2)樣品檢測
靜置數分鐘後吸取上清直接滴加到速測卡加樣區，5min內觀察顯色結果。(3)結果判定
如果檢測線沒有看到紅色條帶而質控線出現紅色條帶，說明檢測結果呈陰性，待測樣液不含1c，試紙條質量完好(如附圖5所示)；如檢測線和質控線都出現紅色條帶，或檢測線顏色較質控線更深，則待測液中含有Ic且濃度高於lX103_4cfu/ml (如附圖6所示);如果檢測線顏色明顯淺於質控線顏色，則待測液中可能存在濃度低近lX103_4cfu/ml的1c， 應作進一步檢測驗證(如附圖7所示)；如果檢測線出現紅色條帶而質控線沒有條帶出現說明試紙條效果失效，結果不可靠(如附圖8所示)。
權利要求
1.一種柑桔黃單胞菌的快速檢測膠體金試紙條，包括PVC底板(1)，其特徵在於所述 PVC底板(1)表面由下至上依次貼有加樣墊(2)、結合墊(3)、硝酸纖維素膜(4)和吸水墊(5)，其中所述結合墊(3)上包被柑桔黃單胞菌單克隆抗體1，所述硝酸纖維素膜(4)上設置有檢測線(7)和質控線(6)，所述檢測線(7)包被柑桔黃單胞菌單克隆抗體2，所述質控線(6)包被羊抗鼠抗體。
2.根據權利要求1所述一種柑桔黃單胞菌的快速檢測膠體金試紙條，其特徵在於所述柑桔黃單胞菌單克隆抗體1、2是用柑桔黃單胞菌全菌免疫小白鼠，取免疫小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞雜交融合，製備雜交瘤細胞，篩選能夠穩定分泌柑桔黃單胞菌單克隆抗體的細胞株製得。
3.根據權利要求1所述一種柑桔黃單胞菌的快速檢測膠體金試紙條，其特徵在於所述加樣墊(2)上端搭接在結合墊(3)上；該結合墊(3)上端搭接在硝酸纖維素膜(4)上；所述吸水墊(5)下端也搭接在硝酸纖維素膜(4)上。
全文摘要
本發明公開了一種柑桔黃單胞菌的快速檢測膠體金試紙條，包括PVC底板(1)，其特徵在於所述PVC底板(1)表面上由下到上依次貼有加樣墊(2)、結合墊(3)、硝酸纖維素膜(4)和吸水墊(5)，其中所述結合墊(3)上包被柑桔黃單胞菌單克隆抗體1，所述硝酸纖維素膜(4)上設置有檢測線(7)和質控線(6)，所述檢測線(7)包被柑桔黃單胞菌單克隆抗體2，所述質控線(6)包被羊抗鼠抗體。本發明具有的突出優點和實用性①特異性強；②穩定性好，批間∕批內差異小，易於質量控制；③無毒無害，使用安全；④操作簡便，無需儀器設備；⑤符號顯示結果，自帶質控對照，結果易於判斷；⑥易於運輸儲藏。
文檔編號C07K16/12GK102243239SQ20111010367
公開日2011年11月16日 申請日期2011年4月25日 優先權日2011年4月25日
發明者吳渝佳, 殷幼平, 王中康 申請人:重慶大學