重組人成纖維細胞生長因子21融合蛋白及其在製備治療代謝疾病藥物中的應用的製作方法

2023-10-29 14:06:23

本發明涉及重組蛋白領域，尤其涉及一種重組人成纖維細胞生長因子21融合蛋白及其製備方法，本發明還涉及該重組人成纖維細胞生長因子21融合蛋白在製備治療代謝疾病藥物中的用途，屬於成纖維細胞生長因子技術領域。

背景技術：

糖尿病（diabetes mellitus，DM），是一類由胰腺功能病變的慢性代謝類疾病，以高血糖為主要特徵，是一種終身疾病。其發病機理是胰島素抵抗或胰島素分泌減少，導致機體糖脂代謝紊亂所致。隨著世界人口的老齡化，糖尿病已成為一種常見病、多發病，現已成為繼癌症和心腦血管病之後，第三大威脅人類生命的疾病（Nathan DM, et al. Medical management of hyperglycaemia in type 2 diabetes: a consensus algorithm for the initiation and adjustment of therapy. Diabetes Care 2009; 32: 193–203. Culy CR, Jarvis B. Repaglinide: a review of its therapeutic use in type 2 diabetes mellitus [J]. Drugs, 2001, 61(11): 1625）。

隨著經濟的日益發展，我國的糖尿病患者數量也呈上升趨勢，據調查結果估計，現中國大約有1億糖尿病患者。目前治療糖尿病的藥物大多數是以胰島素為核心發揮作用，如胰島素類製劑或其增敏劑類藥物等，但這些藥物對有些糖尿病患者特別是II型糖尿病的晚期患者效果仍然不夠理想。由於沒有可替代胰島素的藥物和更先進的治療手段，儘管病人對胰島素產生抵抗作用，導致上述藥物無法奏效，胰島素仍然是治療II型糖尿病的首選藥物。隨著胰島素抵抗作用的不斷加劇，胰島素的療效逐漸減弱，血糖無法控制在正常水平。由於血糖長期維持在較高水平，從而導致很多嚴重的併發症，如失明、腎衰、心腦血管疾病和神經系統疾病等。因此II型糖尿病的臨床治療中一直迫切需要一種能取代胰島素，解決胰島素抵抗的新型藥物。

成纖維細胞生長因子（FGF）21屬於FGF家族中一名新成員，FGF21基因主要在肝臟和脂肪中表達，FGF21在體外能夠促進HepG2細胞和3T3-L1脂肪細胞消耗葡萄糖，在動物體內具有降低血糖和甘油三酯等功能，並且不會產生低血糖和引起腫瘤發生等副作用（Kharitonenkov A, et al. FGF-21 as a novel metabolic regulator. J Clin Invest 2005; 115:1627–35. Kharitonenkov A, et al. The metabolic state of diabetic monkeys is regulated by fibroblast growth factor-21. Endocrinology 2007;148:774–81）。FGF21安全、有效以及不依賴胰島素調節生物體內血糖水平的特點，使其有望成為治療II型糖尿病的新型藥物。然而，隨著對FGF21的深入了解，我們發現野生型FGF21的生物學功能及臨床應用受到了體內穩定性和自身免疫原性的制約（Huang Z, et al. A better anti-diabetic recombinant human fibroblast growth factor 21 (rhFGF21) modified with polyethylene glycol. PLoS One 2011;6:e20669. Ye X, et al. Enhancement of the pharmacological efficacy of FGF-21 by genetic modification and PEGylation. Curr Pharm Biotechnol 2014;14:1287–98.），故對FGF21進行改造和修飾將逐漸成為近年來研究的熱點。

人血清白蛋白（HSA）是由585個胺基酸殘基組成的單鏈無糖基化的球形蛋白質，是人體血清內含量最高的蛋白，分子量為66kDa，第356位的蘇氨酸是可能存在O-糖基化位點（He, X.M. and D.C. Carter, Atomic structure and chemistry of human serum albumin. Nature, 1992. 358(6383): p. 209-15.），其在調節血液滲透壓和促進傷口癒合等方面起著重要的作用，並且具有人體相容性好、分子量大、半衰期長及無酶活性和免疫原性等優點，這使得白蛋白融合技術在研製長效重組蛋白藥物領域倍受關注（Nel, M.R., Human albumin administration in critically ill patients. Critical analysis of original studies has to take place. BMJ, 1998. 317(7162): p. 882.）。很多具有治療功能的蛋白質，如幹擾素、人生長激素和IL-2等，經過白蛋白融合技術的改造後，都可以開發成為具有藥效更佳和注射次數減少等優點的重組蛋白藥物。白蛋白融合技術的優勢在於其不需要額外的化學修飾，生產工藝簡單，產物均一，且質量控制相對容易，延長藥物半衰期的效果可能要比化學修飾（如PEG修飾和乙醯化等）更有效（Muller, N., et al., Superior serum half life of albumin tagged TNF ligands. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2010. 396(4): p. 793-799.）。但在白蛋融合蛋白的表達和儲存過程中伴有降解和聚合現象，增加了純化的難度和臨床用藥時出現免疫反應的風險（Yao, X.Q., et al., Degradation of HSA-AX15(R13K) when expressed in Pichia pastoris can be reduced via the disruption of YPS1 gene in this yeast. J Biotechnol, 2009. 139(2): p. 131-6. Cordes, A.A., et al., Selective domain stabilization as a strategy to reduce fusion protein aggregation. J Pharm Sci, 2012. 101(4): p. 1400-9. Cordes, A.A., J.F. Carpenter, and T.W. Randolph, Selective domain stabilization as a strategy to reduce human serum albumin-human granulocyte colony stimulating factor aggregation rate. J Pharm Sci, 2012. 101(6): p. 2009-2016.）。近來研究發現，HSA 第 381-585位胺基酸殘基構成的第3結構域（3DHSA）是HSA與新生兒Fc受體（FcRn）結合的關鍵部位，在受體介導的胞吞保護作用下耐受蛋白酶的降解，從而保證HSA具有較長的半衰期（Andersen, J.T., J.D. Qian, and I. Sandlie, The conserved histidine 166 residue of the human neonatal Fc receptor heavy chain is critical for the pH-dependent binding to albumin. Eur J Immunol, 2006. 36(11): p. 3044-3051.）。基於對白蛋白長效機制的深入認識，Kenanova 等（Kenanova, V.E., et al., Tuning the serum persistence of human serum albumin domain III:diabody fusion proteins. Protein Eng Des Sel, 2010. 23(10): p. 789-98.）將3DHSA 作為融合伴侶，構建了一系列抗癌胚抗原雙抗體與3DHSA的融合蛋白，證明了3DHSA作為融合伴侶延長蛋白藥物半衰期的可行性。

蛋白穩定性的高低直接影響其在宿主細胞中的表達量，為了提高蛋白產量及穩定性，並在不影響蛋白原有活性的基礎上，需要將FGF21進行適當的改造。本發明通過將FGF21與HSA或3DHSA連接成融合蛋白的形式來提高FGF21的穩定性，為以後FGF21的產業化提供了重要的技術幫助。

技術實現要素：

本發明解決的技術問題是提供了一種重組人成纖維細胞生長因子21融合蛋白及其製備方法，該重組人成纖維細胞生長因子21融合蛋白能夠用於製備治療糖尿病或肥胖症的藥物或藥物組合物。

本發明為解決上述技術問題採用如下技術方案，重組人成纖維細胞生長因子21融合蛋白，其特徵在於是將人成纖維細胞生長因子21重組蛋白hFGF21與HSA或3DHSA連接而成的重組融合蛋白hFGF21-HSA、HSA-hFGF21、hFGF21-3DHSA和3DHSA-hFGF21，其中重組融合蛋白hFGF21-HSA的胺基酸序列如序列表中SEQ ID NO:5所示，重組融合蛋白HSA-hFGF21的胺基酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示，重組融合蛋白hFGF21-3DHSA的胺基酸序列如序列表中SEQ ID NO:7所示，重組融合蛋白3DHSA-hFGF21的胺基酸序列如序列表中SEQ ID NO:8所示。

本發明所述的重組人成纖維細胞生長因子21融合蛋白編碼基因，其特徵在於：所述的重組融合蛋白hFGF21-HSA編碼基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，重組融合蛋白HSA-hFGF21編碼基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，重組融合蛋白hFGF21-3DHSA編碼基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示，重組融合蛋白3DHSA-hFGF21編碼基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:4所示。

本發明所述的重組人成纖維細胞生長因子21融合蛋白編碼基因的表達載體及含有該表達載體的宿主細胞，其特徵在於：所用的表達載體優選為pET30a（+），宿主細胞優選為Rossetta（DE3）。

本發明所述的重組人成纖維細胞生長因子21融合蛋白的製備方法，其特徵在於具體步驟為：將重組人成纖維細胞生長因子21融合蛋白編碼基因的核苷酸序列與表達載體相連接得到重組表達載體；再將該重組表達載體轉化宿主細胞，然後篩選高表達陽性宿主細胞，培養細胞並誘導表達重組人成纖維細胞生長因子21融合蛋白，收集菌體、破碎、離心、澄清、純化，得到目標產物重組人成纖維細胞生長因子21融合蛋白。

本發明所述的重組人成纖維細胞生長因子21融合蛋白在製備治療代謝疾病藥物中的應用，其中代謝疾病包括糖尿病、肥胖症和代謝綜合症。

本發明所述的用於治療糖尿病或肥胖症的藥物組合物，其特徵在於包括治療上有效劑量的重組人成纖維細胞生長因子21融合蛋白和藥學上可接受的載體或輔料。

本發明的細胞試驗和動物學試驗結果表明，重組人成纖維細胞生長因子21融合蛋白能夠較好的控制血糖波動，穩定維持24小時血糖處於正常水平。特別是hFGF21與3DHSA連接的重組融合蛋白，其降糖效果更佳。本發明的重組融合蛋白可作為藥物治療糖尿病、肥胖症或代謝綜合症等代謝疾病。

附圖說明

圖1是重組融合蛋白hFGF21-HSA、HSA-hFGF21、hFGF21-3DHSA和3DHSA-hFGF21在大腸桿菌中表達量的SDS-PAGE電泳分析圖；

圖2是純化後重組融合蛋白hFGF21-HSA、HSA-hFGF21、hFGF21-3DHSA和3DHSA-hFGF21的SDS-PAGE電泳分析圖；

圖3是5種蛋白的體內半衰期比較圖；

圖4是5種蛋白的體外細胞活性檢測圖；

圖5是STZ誘導的I型糖尿病小鼠長期注射5種蛋白後每周血糖水平的變化曲線；

圖6是STZ誘導的I型糖尿病小鼠注射不同蛋白8周後血糖、糖化血紅蛋白及甘油三脂水平的變化曲線；

圖7是II型糖尿病db/db小鼠長期注射5種蛋白後每周血糖水平的變化曲線；

圖8是II型糖尿病db/db小鼠注射不同蛋白8周後血糖、糖化血紅蛋白及甘油三脂水平的變化曲線。

具體實施方式

下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是範例性的，並不對本發明的範圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和範圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護範圍內。

說明：本發明中涉及的基因的設計、合成和克隆、表達載體的構建、核酸提取、測序和鑑定，以及表達產物的分離和純化等操作步驟，可按照本領域已知的技術進行（參見CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY）。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。

實施例1

hFGF21-HSA、HSA-hFGF21、hFGF21-3DHSA和3DHSA-hFGF21表達載體的構建

根據大腸桿菌密碼子偏好性，設計出4種基因，其核苷酸序列分別如序列表中SEQ ID NO:1（hFGF21-HSA）、SEQ ID NO:2（HSA-hFGF21）、SEQ ID NO:3（hFGF21-3DHSA）和SEQ ID NO:4（3DHSA-hFGF21）所示。將這4種基因送至上海捷瑞生物公司合成，同時在各基因兩端設計NdeI與BamHI兩酶切位點。

將4種合成的含有各自目的基因片段的載體和pET30a（+）分別用NdeI與Bam HI雙酶切，酶切完畢後，膠回收各自需要的目標片段。使用T4 DNA連接酶將4種目的片段分別與原核表達載體pET30a（+）連接，連接反應體系為10µL，混勻，4℃連接過夜，然後各自轉化至大腸桿菌DH5α中。挑取陽性克隆，經過酶切鑑定後，即分別構建得到4種重組質粒pET30a-hFGF21-HSA、pET30a-HSA-hFGF21、pET30a-hFGF21-3DHSA和pET30a-3DHSA-hFGF21。

實施例2

hFGF21-HSA、HSA-hFGF21、hFGF21-3DHSA和3DHSA-hFGF21四種融合蛋白的表達及純化

（1）轉化、培養並誘導表達

將含有正確序列的4種重組質粒pET30a-hFGF21-HSA、pET30a-HSA-hFGF21、pET30a-hFGF21-3DHSA和pET30a-3DHSA-hFGF21分別轉化至表達菌株Rosseta（DE3）（北京全式金生物技術有限公司，目錄號：CD801）。轉化後的單菌落分別接種至20mL含Kan（50µg/mL）的LB培養基中，37℃培養8h，以體積比為1:100接種於另一20mL含Kan（50µg/mL）的LB培養基中，37℃培養，當A600在0.35左右時，加入IPTG至終濃度為0.25mmol/L進行誘導，誘導溫度為30℃，5h後收穫菌體，用Binding buffer（20mmol/L Na3PO4，pH 7.0）重懸菌體，破碎菌體後離心，分別取上清和沉澱進行12wt% SDS-PAGE電泳分析。結果顯示hFGF21與HSA或3DHSA連接後的融合蛋白大部分以可溶性形式表達，如圖1所示，A圖泳道1：蛋白標準分子量Marker；2、3、4：hFGF21-HSA全菌蛋白、菌體上清、菌體沉澱；5、6、7：HSA-hFGF21全菌蛋白、菌體上清、菌體沉澱；B圖泳道1：蛋白標準分子量Marker；2：未誘導菌體；3、4、5：3DHSA-hFGF21全菌蛋白、菌體上清、菌體沉澱；6、7、8：hFGF21-3DHSA全菌蛋白、菌體上清、菌體沉澱。

（2）蛋白純化

向菌體中加入一定濃度溶菌酶（1mg/mL），冰上放置30min，超聲破碎菌體細胞（工作1s，間隔1s，4min/次，共3次循環）。破碎徹底後，12000rpm，4℃離心15min，收集上清。上清液過0.22μm濾膜澄清後，通過泵進入AKTA purifier 100系統，與2-3倍柱體積Binding buffer平衡好的Blue Sepharose 6FF柱（裝於XK16/20空柱，柱高10cm，流速100cm/h）完全結合後，用4-5倍柱體積的binding buffer衝洗雜蛋白，當紫外曲線達到穩定的基線時，再用2-3倍柱體積Elution buffer（20mmol/L Na3PO4，2 mol/L NaCl，pH 7.0）洗脫目的蛋白，把結合在填料上的融合蛋白洗脫下來並收集到試管中。

把Superdex 75凝膠過濾柱（裝於Column XK26/70空柱中，柱體積340mL，流速2mL/min）接到AKTA purifier 100系統中，先用2倍柱體積的蒸餾水替換其保護液（體積分數為20%乙醇），再用2倍柱體積的Desalting buffer（20mmol/L Na3PO4、150mmol/L NaCl，pH7.0）平衡柱子，然後將親和層析洗脫液通過Superloop進樣。收集各洗脫峰，並進行15wt% SDS-PAGE電泳分析，結果顯示經純化過後，四種融合蛋白純度在95%以上，如圖2所示，A圖泳道1：蛋白標準分子量Marker；2：純化後的hFGF21-HSA融合蛋白；3：純化後的HSA-hFGF21融合蛋白；B圖泳道1：蛋白標準分子量Marker；2：純化後的hFGF21-3DHSA融合蛋白；3：純化後的3DHSA-hFGF21融合蛋白。

實施例3

4種蛋白hFGF21-HSA、HSA-hFGF21、hFGF21-3DHSA和3DHSA-hFGF21的體內半衰期檢測

選取體重約2kg的家兔18隻，隨機分為6組。每組分別皮下注射6種蛋白hFGF21、hFGF21-HSA、HSA-hFGF21、hFGF21-3DHSA和3DHSA-hFGF21，劑量30nmol/kg，在給藥後的0h、1h、3h、5h、7h、24 h，於耳緣靜脈採血800μL左右。12000r/m離心10min，取上清保存於-20℃備用。

ELISA間接法測定6種蛋白的體內半衰期：用稀釋好不同濃度的hFGF21、hFGF21-HSA、HSA-hFGF21、hFGF21-3DHSA和3DHSA-hFGF21蛋白（2μg/mL、0.2μg/mL、200ng/mL、20ng/mL和2ng/mL）分別建立蛋白濃度含量的標準曲線，將稀釋後的標準蛋白和血清包被酶標板，應用ELISA間接法測定各血清中目標蛋白的含量，統計學分析並計算出6種蛋白的體內半衰期。體內半衰期t1/2=0.301*（t2-t1）/log（OD1/OD2），其中OD1和OD2分別表示t1和t2時取出血清所對應酶標板上的平均光吸收值。

結果如圖3所示，經公式計算出融合蛋白hFGF21-HSA、HSA-hFGF21、hFGF21-3DHSA、3DHSA-hFGF21及野生型蛋白hFGF21的體內半衰期分別約為396min、402min、318min、331min和36min，說明了hFGF21蛋白經融合表達後體內半衰期顯著增加。

實施例4

4種蛋白hFGF21-HSA、HSA-hFGF21、hFGF21-3DHSA和3DHSA-hFGF21的體外糖吸收活性檢測

HepG2細胞培養：HepG2細胞（中國醫學科學院基礎所細胞庫）為人肝癌細胞株，其生長條件為高糖DMEM培養基，其中加入10wt%新生牛血清NCS（Invitrogen Corporation）、青黴素100μg/mL、鏈黴素100μg/mL，在37℃、體積分數5% CO2、飽和溼度條件下培養。當細胞生長至高密度時，應進行傳代，用0.25wt%胰蛋白酶液消化後，以體積比為1:3-1:5的比例將細胞接種於新的培養瓶內培養，取對數生長期的細胞用於實驗。

HepG2細胞接種與處理：用質量濃度為0.25%胰蛋白酶消化液消化生長狀態良好的HepG2細胞，離心收集細胞，按照2.5×104的密度將細胞接種於96孔板中繼續培養，每孔中培養液體積為200μL。當細胞生長至均勻單層時，棄去上層培養液加入新鮮的無血清培養基繼續培養12h後，即可加入待測蛋白檢測活性。

加樣HepG2細胞飢餓12h後，分別用不同濃度（10nmol/L、100nmol/L、1000nmol/L）的hFGF21、hFGF21-HSA、HSA-hFGF21、hFGF21-3DHSA和3DHSA-hFGF21 5種蛋白刺激細胞24h，用GOD-POD法檢測培養基中殘留的葡萄糖含量。取培養基上清液2μL加入到200μL葡萄糖檢測液中，每孔葡萄糖至少重複檢測3次，37℃反應5-10min後，在500nm波長下測OD值。計算葡萄糖消耗率，並運用統計學分析實驗結果。

培養液中殘留的葡萄糖濃度和細胞葡萄糖消耗率的計算公式如下：

葡萄糖濃度（mmol/L）=OD樣品/OD標準×5.55mmol/L

細胞葡萄糖消耗率（%）=[(C空白葡萄糖-C給藥葡萄糖) / C空白葡萄糖] ×100%

數據分析結果如圖4所示，結果顯示，相對於hFGF21蛋白，hFGF21-HSA、HSA-hFGF21、hFGF21-3DHSA和3DHSA-hFGF21四種融合蛋白的體外細胞糖吸收活性也顯著增加，且在低、中、高三種劑量下，差異都極顯著（##p16.65mmol/L的小鼠判定為I型糖尿病動物模型。

分組，給藥及指標檢測：選取成模的血糖值低於25mmol/L的I型糖尿病小鼠36隻，隨機分為模型對照組、hFGF21組、hFGF21-HSA組、HSA-hFGF21組、hFGF21-3DHSA組和3DHSA-hFGF21組，每組6隻。於每天早上8點半左右給予實驗組相應的受試物一次，皮下注射，劑量50nmol/kg，模型對照組注射相同體積的生理鹽水，連續給藥8周。實驗過程中自由飲食、飲水。

於每周第一天早上8點左右尾靜脈採血測定各實驗組小鼠血糖水平，給藥8周後，各實驗組小鼠處死（前夜禁食），眼球取血測定實驗小鼠血糖（BG）、糖基化血紅蛋白（GHb）和甘油三脂（TG）水平。所得實驗數據進行統計學分析。

實驗檢測數據如圖5、6所示，圖5結果表明，相對於模型對照組，5種給藥組小鼠血糖在給藥1周後下降顯著，且之後每周血糖變化趨勢一致，但與hFGF21組相比，hFGF21-HSA、HSA-hFGF21、hFGF21-3DHSA和3DHSA-hFGF21 4組小鼠血糖水平下降迅速。hFGF21-HSA、HSA-hFGF21、hFGF21-3DHSA和3DHSA-hFGF21 4種融合蛋白在 I 型糖尿病小鼠上的長效降糖效果明顯優於hFGF21，作用持續時間長，其中3DHSA-hFGF21組小鼠長期降糖效果最佳。

糖基化血紅蛋白（GHb）測試通常可以反映患者近8-12周的血糖控制情況，故本實驗檢測給藥8周後各實驗組小鼠血糖和糖基化血紅蛋白水平來比較6種蛋白控制血糖波動的能力。如圖6所示，該結果進一步說明了hFGF21-HSA、HSA-hFGF21、hFGF21-3DHSA和3DHSA-hFGF21 4種融合蛋白對 I 型糖尿病小鼠的血糖水平具有長久持續的調控作用，且效果顯著優於hFGF21。

給藥8周後，各實驗組小鼠血清甘油三脂水平結果如圖6所示，相對於生理鹽水組，5種蛋白都能顯著降低TG含量。而與hFGF21相比，hFGF21-HSA、HSA-hFGF21、hFGF21-3DHSA和3DHSA-hFGF21 四種蛋白在I型糖尿病小鼠的血脂水平上表現出更佳的改善效果。

二、本發明4種融合蛋白在 II 型糖尿病動物模型上的活性檢測

分組、給藥及指標檢測：取SPF級9-11周齡雄性db/db小鼠（購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，動物質量合格證號SCXK（滬）2012-0005）50隻，預飼養1周後稱重，次日禁食不禁水6h，尾靜脈取血測定小鼠的空腹血糖，剔除體重異常，篩選血糖值相對接近均值的成模小鼠36隻，隨機分為模型對照組、hFGF21組、hFGF21-HSA組、HSA-hFGF21組、hFGF21-3DHSA組和3DHSA-hFGF21組，每組6隻。於每天早上8點半左右給予實驗組相應的受試物一次，皮下注射，劑量50nmol/kg，模型對照組注射相同體積的生理鹽水，連續給藥8周。實驗過程中自由飲食、飲水。

實驗檢測數據如圖7、8所示，圖7結果表明，相對於模型對照組，5種給藥組小鼠血糖在給藥1周後下降顯著，且之後每周血糖變化趨勢一致，但與hFGF21組相比， hFGF21-HSA、HSA-hFGF21、hFGF21-3DHSA和3DHSA-hFGF21 4組小鼠血糖水平下降迅速。hFGF21-HSA、HSA-hFGF21、hFGF21-3DHSA和3DHSA-hFGF21 4種融合蛋白在II型糖尿病小鼠上的長效降糖效果明顯優於hFGF21，作用持續時間長，其中3DHSA-hFGF21組小鼠長期降糖效果最佳。

糖基化血紅蛋白（GHb）測試通常可以反映患者近8-12周的血糖控制情況，故本實驗檢測給藥8周後各實驗組小鼠血糖和糖基化血紅蛋白水平來比較5種蛋白控制血糖波動的能力。如圖8所示，結果進一步說明了hFGF21-HSA、HSA-hFGF21、hFGF21-3DHSA和3DHSA-hFGF21 4種融合蛋白對II型糖尿病小鼠的血糖水平具有長久持續的調控作用，且效果顯著優於hFGF21。

給藥8周後，各實驗組小鼠血清甘油三脂水平結果如圖8所示，相對於生理鹽水組，5種蛋白都能顯著降低TG含量。而與hFGF21相比，hFGF21-HSA、HSA-hFGF21、hFGF21-3DHSA和3DHSA-hFGF21 4種融合蛋白在II型糖尿病小鼠的血脂水平上表現出更佳的改善效果。

SEQUENCE LISTING

河南師範大學

重組人成纖維細胞生長因子21融合蛋白及其在製備治療代謝疾病藥物中的應用

PatentIn version 3.3

SEQ ID NO:1

2352

DNA

人工序列

SEQ ID NO:1

gactcttctc cgctgctgca gttcggtggt caggttcgtc agcgttacct gtacaccgac 60

gacgctcagc agaccgaagc tcacctggaa atccgtgaag acggtaccgt tggtggtgct 120

gctgaccagt ctccggaatc tctgctgcag ctgaaagctc tgaaaccggg tgttatccag 180

atcctgggtg ttaaaacctc tcgtttcctg tgccagcgtc cggacggtgc tctgtacggt 240

tctctgcact tcgacccgga agcttgctct ttccgtgaac tgctgctgga agacggttac 300

aacgtttacc agtctgaagc tcacggtctg ccgctgcacc tgccgggtaa caaatctccg 360

caccgtgacc cggctccgcg tggtccggct cgtttcctgc cgctgccggg tctgccgccg 420

gctctgccgg aaccgccggg tatcctggct ccgcagccgc cggacgttgg ttcttctgac 480

ccgctgtcta tggttggtcc gtctcagggt cgttctccgt cttacacctc tggtggtggt 540

ggttctggtg gtggtggttc tggtggtggt ggttctagag gtgttttcag aagagacgct 600

cacaagtctg aagttgctca cagattcaag gacttgggtg aagaaaactt caaggctttg 660

gttttgatcg ctttcgctca atacttgcaa caatgtccat tcgaagacca cgttaagttg 720

gttaacgaag ttactgaatt tgctaagact tgtgttgctg acgaatctgc tgaaaactgt 780

gacaagtctt tgcacacttt gttcggtgac aagttgtgta ctgttgctac tttgagagaa 840

acttacggtg aaatggctga ctgttgtgct aagcaagaac cagaaagaaa cgaatgtttc 900

ttgcaacaca aggacgacaa cccaaacttg ccaagattgg ttagaccaga agttgacgtt 960

atgtgtactg ctttccacga caacgaagaa actttcttga agaagtactt gtacgaaatc 1020

gctagaagac acccatactt ctacgctcca gaattgttgt tcttcgctaa gagatacaag 1080

gctgctttca ctgaatgttg tcaagctgct gacaaggctg cttgtttgtt gccaaagttg 1140

gacgaattga gagacgaagg taaggcttct tctgctaagc aaagattgaa gtgtgcttct 1200

ttgcaaaagt tcggtgaaag agctttcaag gcttgggctg ttgctagatt gtctcaaaga 1260

ttcccaaagg ctgaatttgc tgaagtttct aagttggtta ctgacttgac taaggttcac 1320

actgaatgtt gtcacggtga cttgttggaa tgtgctgacg acagagctga cttggctaag 1380

tacatctgtg aaaaccaaga ctctatctct tctaagttga aggaatgttg tgaaaagcca 1440

ttgttggaaa agtctcactg tatcgctgaa gttgaaaacg acgaaatgcc agctgacttg 1500

ccatctttgg ctgctgactt cgttgaatct aaggacgttt gtaagaacta cgctgaagct 1560

aaggacgttt tcttgggtat gttcttgtac gaatacgcta gaagacaccc agactactct 1620

gttgttttgt tgttgagatt ggctaagact tacgaaacta ctttggaaaa gtgttgtgct 1680

gctgctgacc cacacgaatg ttacgctaag gttttcgacg aatttaagcc attggttgaa 1740

gaaccacaaa acttgatcaa gcaaaactgt gaattgttcg aacaattggg tgaatacaag 1800

ttccaaaacg ctttgttggt tagatacact aagaaggttc cacaagtttc tactccaact 1860

ttggttgaag tttctagaaa cttgggtaag gttggttcta agtgttgtaa gcacccagaa 1920

gctaagagaa tgccatgtgc tgaagactac ttgtctgttg ttttgaacca attgtgtgtt 1980

ttgcacgaaa agactccagt ttctgacaga gttactaagt gttgtactga atctttggtt 2040

aacagaagac catgtttctc tgctttggaa gttgacgaaa cttacgttcc aaaggaattt 2100

aacgctgaaa ctttcacttt ccacgctgac atctgtactt tgtctgaaaa ggaaagacaa 2160

atcaagaagc aaactgcttt ggttgaattg gttaagcaca agccaaaggc tactaaggaa 2220

caattgaagg ctgttatgga cgacttcgct gctttcgttg aaaagtgttg taaggctgac 2280

gacaaggaaa cttgtttcgc tgaagaaggt aagaagttgg ttgctgcttc tcaagctgct 2340

ttgggtttgt aa 2352

SEQ ID NO:2

2352

DNA

人工序列

SEQ ID NO:2

agaggtgttt tcagaagaga cgctcacaag tctgaagttg ctcacagatt caaggacttg 60

ggtgaagaaa acttcaaggc tttggttttg atcgctttcg ctcaatactt gcaacaatgt 120

ccattcgaag accacgttaa gttggttaac gaagttactg aatttgctaa gacttgtgtt 180

gctgacgaat ctgctgaaaa ctgtgacaag tctttgcaca ctttgttcgg tgacaagttg 240

tgtactgttg ctactttgag agaaacttac ggtgaaatgg ctgactgttg tgctaagcaa 300

gaaccagaaa gaaacgaatg tttcttgcaa cacaaggacg acaacccaaa cttgccaaga 360

ttggttagac cagaagttga cgttatgtgt actgctttcc acgacaacga agaaactttc 420

ttgaagaagt acttgtacga aatcgctaga agacacccat acttctacgc tccagaattg 480

ttgttcttcg ctaagagata caaggctgct ttcactgaat gttgtcaagc tgctgacaag 540

gctgcttgtt tgttgccaaa gttggacgaa ttgagagacg aaggtaaggc ttcttctgct 600

aagcaaagat tgaagtgtgc ttctttgcaa aagttcggtg aaagagcttt caaggcttgg 660

gctgttgcta gattgtctca aagattccca aaggctgaat ttgctgaagt ttctaagttg 720

gttactgact tgactaaggt tcacactgaa tgttgtcacg gtgacttgtt ggaatgtgct 780

gacgacagag ctgacttggc taagtacatc tgtgaaaacc aagactctat ctcttctaag 840

ttgaaggaat gttgtgaaaa gccattgttg gaaaagtctc actgtatcgc tgaagttgaa 900

aacgacgaaa tgccagctga cttgccatct ttggctgctg acttcgttga atctaaggac 960

gtttgtaaga actacgctga agctaaggac gttttcttgg gtatgttctt gtacgaatac 1020

gctagaagac acccagacta ctctgttgtt ttgttgttga gattggctaa gacttacgaa 1080

actactttgg aaaagtgttg tgctgctgct gacccacacg aatgttacgc taaggttttc 1140

gacgaattta agccattggt tgaagaacca caaaacttga tcaagcaaaa ctgtgaattg 1200

ttcgaacaat tgggtgaata caagttccaa aacgctttgt tggttagata cactaagaag 1260

gttccacaag tttctactcc aactttggtt gaagtttcta gaaacttggg taaggttggt 1320

tctaagtgtt gtaagcaccc agaagctaag agaatgccat gtgctgaaga ctacttgtct 1380

gttgttttga accaattgtg tgttttgcac gaaaagactc cagtttctga cagagttact 1440

aagtgttgta ctgaatcttt ggttaacaga agaccatgtt tctctgcttt ggaagttgac 1500

gaaacttacg ttccaaagga atttaacgct gaaactttca ctttccacgc tgacatctgt 1560

actttgtctg aaaaggaaag acaaatcaag aagcaaactg ctttggttga attggttaag 1620

cacaagccaa aggctactaa ggaacaattg aaggctgtta tggacgactt cgctgctttc 1680

gttgaaaagt gttgtaaggc tgacgacaag gaaacttgtt tcgctgaaga aggtaagaag 1740

ttggttgctg cttctcaagc tgctttgggt ttgggtggtg gtggttctgg tggtggtggt 1800

tctggtggtg gtggttctga ctcttctccg ctgctgcagt tcggtggtca ggttcgtcag 1860

cgttacctgt acaccgacga cgctcagcag accgaagctc acctggaaat ccgtgaagac 1920

ggtaccgttg gtggtgctgc tgaccagtct ccggaatctc tgctgcagct gaaagctctg 1980

aaaccgggtg ttatccagat cctgggtgtt aaaacctctc gtttcctgtg ccagcgtccg 2040

gacggtgctc tgtacggttc tctgcacttc gacccggaag cttgctcttt ccgtgaactg 2100

ctgctggaag acggttacaa cgtttaccag tctgaagctc acggtctgcc gctgcacctg 2160

ccgggtaaca aatctccgca ccgtgacccg gctccgcgtg gtccggctcg tttcctgccg 2220

ctgccgggtc tgccgccggc tctgccggaa ccgccgggta tcctggctcc gcagccgccg 2280

gacgttggtt cttctgaccc gctgtctatg gttggtccgt ctcagggtcg ttctccgtct 2340

tacacctctt aa 2352

SEQ ID NO:3

1194