通過利用遞歸算法校正dna測序數據中的異相誤差的系統和方法

2023-10-17 03:20:44

專利名稱：通過利用遞歸算法校正dna測序數據中的異相誤差的系統和方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學領域。更具體而言，本發明涉及一種遞歸方法，用於校正通過一般所謂的「合成測序」(SBS)技術產生的核酸序列數據中的相位同步誤差。
背景技術：
合成測序(SBS) —般是指用於確定核酸樣本中一個或多個核苷酸的身份或序列構成的方法，其中所述方法包括分步合成與要被確定其核苷酸序列構成的模板核酸分子互補的單鏈多核苷酸分子。例如，SBS技術通常通過在對應序列位置向與模板分子的核酸種類互補的新生多核苷酸分子添加單個核酸(也稱為核甘酸)種類而工作。一般利用本領域 中已知的多種方法來檢測向新生分子添加核酸種類，這些方法包括，但不限於，所謂的焦磷酸測序，所述焦磷酸測序可以包括酶促或電子(即利用ISFET或其他相關技術的pH檢測)檢測策略或螢光檢測方法，在一些實施例中，其可以採用可逆的終止子。典型地，該過程迭代，直到合成了完全(即，所有序列位置被表示)或期望的與模板互補的序列長度為止。在美國專利 No. 6274320 ；No. 7211390 ；No. 7244559 ；No. 7264929 和 No. 7335762 中描述了 SBS技術的一些實例，在此出於所有目的通過引用將所述專利的每一個整體地併入本文。在SBS的一些實施例中，寡核苷酸引物被設計成對樣品模板分子的預定互補位置退火。在存在核酸聚合酶的情況下，為引物/模板複合物提供核甘酸種類。如果核甘酸種類與對應於樣本模板分子上直接與寡核苷酸引物的3』末端相鄰的序列位置的核酸種類互補，那麼聚合酶將利用所述核甘酸種類延伸所述引物。或者，在一些實施例中，同時為引物/模板複合物提供多個感興趣的核甘酸種類(典型地為A、G、C和T)，並且在樣本模板分子上直接與寡核苷酸引物的3』末端相鄰的對應序列位置處互補的核甘酸種類被摻入。在所述實施例的任一個中，可以用化學方式阻斷核甘酸種類(例如在3』 -O位置處)以防止進一步延伸，並且需要在下一輪合成之前解除阻斷核甘酸種類。如上所述，可以通過本領域中已知的多種方法檢測核甘酸種類的摻入，例如，通過以酶促或電子方式檢測焦磷酸鹽(PPi)的釋放(美國專利No. 6210891 ；No. 6258568和No. 6828100中描述的實例，在此出於所有目的通過引用將所述專利的每一個整體地併入本文)，或通過結合到核苷酸的可檢測標記。可檢測標記的一些實例包括，但不限於，質量標籤和螢光或化學發光標記。在典型的實施例中，例如，通過洗滌去除未摻入的核苷酸。在使用可檢測標記的實施例中，通常必須在隨後合成循環之前將它們滅活(例如，通過化學裂解或光漂白)。如上所述，然後可以利用另一核甘酸種類或多個感興趣的核甘酸種類來查詢模板/聚合酶複合物中的下一個序列位置。核甘酸添加、引物延伸、信號採集和洗滌的重複循環導致模板鏈的核苷酸序列的確定。在SBS的典型實施例中,在任何一個測序反應中同時分析大量的基本相同的模板分子或基本相同的模板分子的群體(例如103、104、105、IO6或IO7個分子)，以便獲得對於可靠檢測而言足夠強的信號。對於低信噪比需要在給定反應的群體中與基本所有模板分子相關聯的新生分子的所謂的「均勻延伸」。如這裡使用的，術語「均勻延伸」一般是指延伸反應的關係或相位，其中上述基本相同的模板分子的群體的每個成員均勻地執行反應中的相同步驟。例如，當模板分子在針對每個相關聯的模板分子的相同序列位置執行相同的反應步驟時，可以將與模板分子的群體相關聯的每個延伸反應描述為彼此同相(有時也稱為相位同步或相位同步性)。不過，相關領域的普通技術人員將認識到，每個群體中的一小部分模板分子與該群體中的其餘模板分子失去或脫離相位同步性(即，與該部分模板分子相關聯的反應在於該群體上進行的測序反應中超前於或落後於其他模板分子)(在Ronaghi，Μ.的^Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing」，Genome Res. 11,3-11 (2001)中描述了一些實例，在此出於所有目的通過引用將其整體地併入本文)。例如，將一個或多個核甘酸種類適當地摻入一個或多個新生分子中以將序列延伸了一個位置的反應的失敗導致每個後續反應處於在群體的其餘部分的序列位置之後並且與其異相的序列位置。這裡將該效應稱為「不完全延伸」(IE)。或者，在這裡將通過在位於群體的其餘部分的序列位置之前並且與其異相的序列位置中摻入一個或多個核甘酸種類而不適當地延伸新生分子稱為「推進 (carry forward) 」 (CF)。這裡將CF和IE的組合效應稱為CAFIE。關於不完全延伸的問題，可能存在幾種可能的機制，其有助於可能單獨地或以某種組合發生的IE。有助於IE的可能的機制的一個實例可以包括缺少被提供給模板/聚合酶複合物的子集的核甘酸種類。有助於IE的可能的機制的另一實例可以包括聚合酶分子的子集未能摻入被適當地提供用於摻入新生分子中的核甘酸種類。有助於IE的可能的機制的另一實例可以包括在模板/聚合酶複合物處沒有聚合酶活動。至少部分地說明SBS方法中的IE誤差的又一機制的實例可以包括由Metzger評論的所謂的循環可逆終止(CRT) (Genome Res. 2005Dec ；15(12) :1767_76，在此出於所有目的通過引用將其整體地併入本文)。在CRT中，核甘酸種類具有改性的3』-0基團(通常稱為帽、保護基團或終止子)，其防止在摻入單個核甘酸種類之後新生分子的進一步延伸。這些保護基團被設計成可以通過包括化學處理或光處理的多種方法之一除去。在解除3』 -O位置的保護(並生成3' -OH基團)時，可以用另一核甘酸種類延伸新生分子。不過，在由於解除保護效率不佳(解除保護不完全)導致新生分子的一部分保持被保護時，將發生相位異步。在後續循環中，保持被保護的這部分新生分子將不會得到延伸，從而將落後於群體的其餘部分的序列位置並與其異相。不過，後續解除保護步驟可以成功除去至少一些先前被不適當地保持的保護基團，導致重新開始延伸，從新生分子生成信號並繼續與群體的其餘部分異相。本領域的普通技術人員將認識到可能存在其他有助於IE的因素，並且由此其不限於上文提供的實例。本發明目前描述的實施例的系統和方法針對的是校正可能因為任何這種單個或組合的原因或機製造成的IE誤差。例如，校正由於耦合不完全解除保護和後續成功解除保護導致的IE誤差是本發明的一個目的。對於CF的問題，可能存在幾種可能的機制，其有助於可能單獨地或以某種組合發生的CF。例如，一種可能的機制可以包括從先前循環剩餘的過多核甘酸種類。可能發生這種情況，因為在循環結束時執行的洗滌過程將從該循環除去非常大多數的，但未必是全部的核甘酸種類。在本實例中，結果可能包括「G」核甘酸種類循環中存在的一小部分的「A」核甘酸種類，如果在模板分子中的對應序列位置存在互補的「T」核甘酸種類，則導致新生分子的一小部分的延伸。導致推進效應的可能的機制的另一實例可以包括聚合酶誤差，例如向不與模板分子上的核甘酸種類互補的新生分子中不適當地摻入核甘酸種類。至少部分地說明SBS方法中的CF的又一機制的實例可以包括由Metzger評論的所謂的循環可逆終止(CRT) (Genome Res。2005 Dec ；15(12) : 1767-76，在上面通過引用被併入)。在本實例中，如上文相對於IE所描述的，可以採用3』-0受保護的核苷酸種類的製備，其中某一部分的核甘酸分子將缺少保護基團，或已經丟失了保護基團。也可能在預期的解除保護步驟之前在測序過程期間發生保護基團的丟失。解除保護基團的任何這種缺少都將導致一些新生分子一次被延伸了超過一個核甘酸種類。一部分新生分子的這種不適當的多延伸導致它們在序列位置中向前移動並與群體的其餘部分的序列位置異相。由此，未被保護的核苷酸和/或過早解除保護的核苷酸，可以至少部分地有助於涉及CRT的SBS方法中的CF。本發明目前描述的實施例的系統和方法針對的是校正可能因為任何這種單個或組合的原因或機製造成的CF誤差。例如，校正由於缺少保護基團而出現的CF誤差是本發明的一個目的。 此外，目前描述的本發明實施例的系統和方法針對的是IE誤差和CF誤差兩者的校正，其中對於相同測序反應中的群體，兩個類型的誤差可能以某種組合發生。例如，IE和CF均可能由於如上所述的單個或組合的原因或機制而產生。普通技術人員將認識到，IE和CF誤差的潛在可能在延伸反應期間在每個序列位置發生，並由此可能在所得到的序列數據中具有明顯的累積效應。例如，在朝向「序列讀取」結束時，該效應可能變得尤其引人注目。這裡使用的術語「讀取」或「序列讀取」 一般是指從單個核酸模板分子或模板核酸分子的多個基本相同的副本的群體獲得的整個序列數據。此外，IE和CF效應可以為利用SBS方法可靠測序的模板分子的長度(有時稱為「讀取長度」)強加上限，因為序列數據的質量隨著讀取長度增加而降低。例如，一種SBS方法可以在稱為「Phred」質量分數為20或更好的典型運行中產生包括超過2500萬個序列位置的序列數據(Phred質量分數為20意味著預測序列數據為具有99%或更高的精確度)。儘管對於SBS方法而言，Phred質量為20的總體測序處理量顯著高於由本領域的技術人員所稱的Sanger測序方法產生的序列數據，該方法採用了毛細管電泳技術，當前SBS方法的代價是讀取長度顯著更短(Margulies等人,2005, Nature437 :376-80,在此出於所有目的通過引用將其整體地併入本文)。由此，通過避免或校正IE和CF誤差產生的序列數據退化來提高讀取長度的上限會導致SBS方法總體測序處理量的增加。因此，希望提供一種系統和方法，旨在校正通過核酸測序的合成測序法產生的序列數據中的IE和/或CF誤差。這裡引用了多個參考文獻，在此出於所有目的通過引用將其全部公開整體地併入本文。此外，不論上文如何表述，這些參考文獻中的任一個都不被視為這裡主張的主題的發明的現有技術。

發明內容
本發明的實施例涉及核酸序列的確定。更具體而言，本發明的實施例涉及遞歸方法和系統，用於校正通過SBS對核酸測序期間獲得的數據中的相位同步誤差。描述了一種用於校正與從模板分子群體產生的序列數據的相位同步相關聯的誤差的方法的實施例，該方法包括以下步驟檢測響應於測序反應期間引入的核甘酸種類而產生的信號；針對從每個核甘 酸種類檢測的信號產生觀測的值；利用推進值(carryforward value)和不完全延伸值從觀測的值定義正摻入值和負摻入值；利用從與負摻入值相關聯的觀測的值導出的噪聲值修訂推進值和不完全延伸值；利用修訂的推進值和修訂的不完全延伸值重新定義正摻入值和負摻入值；以及重複修訂和重新定義的步驟，直到正摻入值和負摻入值收斂為止。在一些實施方式中，該方法重複，直到推進值和不完全延伸值收斂為止。而且，描述了一種用於校正與從模板分子群體產生的序列數據的相位同步相關聯的誤差的系統或儀器，該系統或儀器包括測序儀器，其檢測響應於測序反應期間引入的多個核甘酸種類而產生的多個信號；以及計算機，該計算機包括在其上存儲的可執行代碼，其執行包括以下步驟的方法針對從每個核甘酸種類檢測的信號產生觀測的值；利用推進值和不完全延伸值從觀測的值定義正摻入值和負摻入值；利用噪聲值修訂推進值和不完全延伸值，其中噪聲值是從與負摻入值相關聯的觀測的值導出的；利用修訂的推進值和修訂的不完全延伸值重新定義正摻入值和負摻入值；以及重複修訂和重新定義的步驟，直到推進值和不完全延伸值收斂為止。更確切地說，本發明提供了一種用於遞歸地校正與從模板分子的基本相同的副本的群體產生的序列數據的相位同步相關聯的誤差的方法，該方法包括(a)檢測響應於測序反應期間引入的多個核甘酸種類而產生的多個信號；(b)針對從每個核甘酸種類檢測的信號產生觀測的值；(C)利用推進值和不完全延伸值從觀測的值定義多個正摻入值和多個負摻入值；(d)利用噪聲值修訂推進值和不完全延伸值，其中噪聲值是從與負摻入值相關聯的多個觀測的值導出的；(e)利用修訂的推進值和修訂的不完全延伸值重新定義該多個正摻入值和該多個負摻入值；以及(f)重複步驟(d)-(e)，直到該多個正摻入值和該多個負摻入值收斂為止。在本發明的範圍之內，並行執行多個測序反應，其中針對測序反應中的每一個執行步驟(a)-(f)。優選地，所述正摻入值和所述負摻入值是整數，最優選地，所述正摻入值是I，所述負摻入值是O。可以利用參數估計模型確定步驟(C)中採用的推進值和不完全延伸值。在步驟(c)之前，可以利用閾值值分配所述正摻入值和所述負摻入值，其中在所述觀測的值高於閾值值時分配正摻入值，在所述觀測的值低於閾值值時分配負摻入值。所述閾值值優選包括在O和I之間的範圍內的值，最優選地，所述閾值值包括約為O. 2的值。也可以通過利用參考序列定義閾值值，以預測沒有核甘酸種類存在的多個位置。噪聲值可以是與來自引入的多個核甘酸種類的負摻入值相關聯的觀測的值的平均值。優選地，所述引入的多個核甘酸種類包括前48個引入的核甘酸種類。在一個實施例中，本發明還提供了一種用於遞歸地校正與從模板分子的基本相同的副本的群體產生的序列數據的相位同步相關聯的誤差的方法，該方法包括以下步驟(a)檢測響應於測序反應期間引入的多個核甘酸種類而產生的多個信號；(b)針對從每個核甘酸種類檢測的信號產生觀測的值；(C)利用推進值和不完全延伸值從觀測的值定義多個正摻入值和多個負摻入值；(d)利用噪聲值修訂推進值和不完全延伸值，其中噪聲值是從與負摻入值相關聯的多個觀測的值導出的；(e)利用修訂的推進值和修訂的不完全延伸值重新定義該多個正摻入值和該多個負摻入值；以及(f)重複步驟(d)-(e)，直到所述推進值和所述不完全延伸值收斂為止。 本發明還提供了用於遞歸地校正與從模板分子的基本相同的副本的群體產生的序列數據的相位同步相關聯的誤差的系統或儀器，該系統或儀器包括(a)測序儀器部件，其檢測響應於測序反應期間引入的多個核甘酸種類而產生的多個信號；(b)計算機，該計算機包括在其上存儲的可執行代碼，其執行包括以下步驟的方法i.針對從每個核甘酸種類檢測的信號產生觀測的值；ii.利用推進值和不完全延伸值從觀測的值定義多個正摻入值和多個負摻入值；iii.利用噪聲值修訂推進值和不完全延伸值，其中噪聲值是從與負摻入值相關聯的多個觀測的值導出的；iv.利用修訂的推進值和修訂的不完全延伸值重新定義該多個正摻入值和該多個負摻入值；以及V.重複步驟iii-iv，直到所述推進值和所述不完全延伸值收斂為止。在本發明的範圍之內，該系統或儀器並行執行多個測序反應，其中針對測序反應的每個執行步驟(i)-(v)。優選地，所述正摻入值和所述負摻入值是整數，最優選地，所述正摻入值是I，所述負摻入值是O。可以利用參數估計模型確定步驟(C)中採用的推進值和不完全延伸值。在步驟(c)之前，可以利用閾值值分配所述正摻入值和所述負摻入值，其中在所述觀測的值高於閾值值時分配正摻入值，在所述觀測的值低於閾值值時分配負摻入值。所述閾值值優選包括在O和I之間的範圍內的值，最優選地，所述閾值值包括約為O. 2的值。也可以通過利用參考序列定義閾值值，以預測沒有核甘酸種類存在的多個位置。噪聲值可以是與來自引入的多個核甘酸種類的負摻入值相關聯的觀測的值的平均值。優選地，所述引入的多個核甘酸種類包括前48個引入的核甘酸種類。以上實施例和實施方式未必彼此包含或排除，並且可以以不衝突的以及其他可能的任何方式被組合，無論它們與相同的還是與不同的實施例或實施方式關聯地呈現。一個實施例或實施方式的描述並不打算相對於其他實施例和/或實施方式是限制性的。而且，在本說明書中別處描述的任何一個或多個功能、步驟、操作或技術可以在替代實施方式中與發明內容中描述的任何一個或多個功能、步驟、操作或技術組合。由此，以上實施例和實施方式是說明性的而非限制性的。


從以下結合附圖進行的詳細描述將更清楚地理解以上和其他特徵。在附圖中，類似的附圖標記表示類似的結構、元件或方法步驟，附圖標記最左邊的數字表示參考元件首先出現在其中的圖的編號(例如，元件160首先出現在圖I中)。不過，所有這些約定旨在是典型的或說明性的，而非限制性的。圖I是用於將理論流圖轉換成觀測的流圖的數學模型的一個實施例的簡化圖形表不;圖2是圖I的映射模型的反演的一個實施例的簡化圖形表示；
圖3a是包括圖I和2的映射模型的正向和逆向矩陣計算的模型的一個實施例的簡化圖形表示；圖3b是利用圖3a的正向模型的正向矩陣計算的一個實施例的簡化圖形表示；圖4a是利用圖3a的反演模型的逆向矩陣計算的一個實施例的簡化圖形表示；圖4b是利用圖3a和4a的反演模型,使用不同級的迭代校正獲得的結果的一個實施例的簡化圖形表示；圖5是目前描述的發明的CAFIE誤差校正方法的結果的一個實施例的簡化圖形表示；圖6是參數值跨越基本相同的模板分子的群體的樣本的分布的一個實施例的簡化圖形表示；圖7是僅IE校正的效果，以及CAFIE校正的效果的一個實施例的簡化圖形表示；圖8是遞歸地校正η次迭代的序列數據中的相位同步誤差的方法的一個實施例的簡化圖形表示；以及圖9是測序結果的一個實施例的簡化圖形表示，示出了利用用於校正序列數據中的相位同步誤差的遞歸算法，在鹼基位置，針對讀取長度和誤差相對於前述實施例的優點。
具體實施例方式這裡使用的術語「流圖(flowgram) 」一般是指由SBS方法，尤其是基於焦磷酸鹽的測序方法(也稱為「焦磷酸測序」)產生的序列數據的圖形表示，且可以更具體地稱作「焦磷酸測序譜圖(pyrogram) 」。當在流圖上繪製時，針對每個流的檢測到的光或其他信號(例如pH變化)的值可以大約為零(表示在下一個序列位置，流中的核甘酸種類不和模板中的核甘酸種類互補，並由此不被摻入)，或大約為一(表示檢測到摻入了恰好一個與模板中的核甘酸種類互補的核甘酸種類)，或大約是大於一的整數(表示檢測到摻入了與模板中的兩個連續核甘酸種類互補的流中存在的核甘酸種類的兩個或更多副本)。這裡使用的術語「運行」或「測序運行」 一般是指在一個或多個模板核酸分子的測序操作中執行的一系列測序反應。這裡使用的術語「流」一般是指向包括模板核酸分子的環境中添加溶液的順次或迭代循環，其中溶液可以包括用於添加到新生分子的核甘酸種類或其他試劑，例如可以在測序反應中或為了減小來自核甘酸種類的先前流循環的遺留(carryover)或噪聲效應而採用的緩衝劑或酶。這裡使用的術語「流循環」一般是指有順序的一系列流，其中在該循環期間使核甘酸種類流動一次(即，流循環可以包括按照τ、A、C、G核甘酸種類的次序順序添加，但其他序列組合也被視為該定義的一部分)。典型地，流循環是在循環之間具有相同流序列的重複循環。這裡使用的術語「讀取長度」一般是指可以被可靠測序的模板分子的長度的上限。存在很多因素有助於系統和/或過程的讀取長度，包括，但不限於模板核酸分子中的GC含
量程度。這裡使用的術語「二進位編碼列表」(如下所述，有時表示為P』或q』)一般是指核甘酸種類流的列表，包括二進位值，表示與完成的測序運行相關聯的每個核甘酸種類的正或負摻入事件(即，負摻入事件表示核甘酸種類未被成功摻入)的狀態。當由在核甘酸 流動期間觀測的信號值的強度計算的值大於閾值信號值時，將每個核甘酸摻入事件定義為正摻入事件，或者當由觀測的信號值的強度計算的值小於閾值信號值時，將每個核甘酸摻入事件定義為負摻入事件。然後為每個定義的核甘酸摻入事件分配等效二進位數，從而由「O」表示負摻入，由「I」表示正摻入。例如，在測序流次序為TCAG的情況下，前4個流之內「A」和「G」的正摻入事件將導致0，0，1，I的「二進位編碼列表」。在這裡可互換地使用術語「二進位編碼列表」和「二進位列表」。這裡使用的術語「閾值」一般是指從對於給定測序運行的觀測的流圖計算的值，並且是指與從不和核甘酸種類摻入事件相關聯的源檢測的信號(有時也稱為「背景信號」)水平相關聯的數值。這裡使用的術語「新生分子」一般是指正在通過摻入與模板分子中的對應核甘酸種類互補的核甘酸種類由模板相關的DNA聚合酶延伸的DNA鏈。這裡使用的術語「核甘酸種類」 一般是指通常被摻入到新生核酸分子中的核酸單體類型的身份，所述核酸單體類型包括嘌呤(腺嘌呤，鳥嘌呤)和嘧啶(胞嘧啶，尿嘧啶，胸腺嘧啶)。這裡使用的術語「完成效率」一般是指在給定流期間適當延伸的新生分子的百分t匕。這裡使用的術語「不完全延伸率」一般是指未能適當延伸的新生分子的數目與所有新生分子的數目的比率。目前描述的發明的一些實施例校正了每個流的檢測的信號以說明上述CF和IE機制。例如，本發明的一個方面包括假定CF和IE的給定水平，計算任何已知序列的相位同步性損失的程度。測序過程的實施例可以包括Sanger型技術，一般被稱為雜交測序(SBH)、連接測序(SBL)或摻入測序(SBI)技術的技術。此外，測序技術可以包括所謂的聚合酶克隆測序(polony sequencing)技術；納米孔、波導和其他單分子檢測技術；或可逆的終止子技術。如上所述，優選的技術可以包括合成測序方法。例如，一些SBS實施例對核酸模板的基本相同的副本的群體測序，並且通常採用一個或多個寡核苷酸引物，所述寡核苷酸引物被設計成對樣品模板分子的預定互補位置或附著到模板分子的一個或多個連接物退火。在存在核酸聚合酶的情況下，為引物/模板複合物提供核甘酸種類。如果核甘酸種類與對應於樣本模板分子上直接與寡核苷酸引物的3』末端相鄰的序列位置的核酸種類互補，那麼聚合酶將利用所述核甘酸種類延伸所述引物。或者，在一些實施例中，同時為引物/模板複合物提供多個感興趣的核甘酸種類(典型地為A、G、C和T)，並且在樣本模板分子上直接與寡核苷酸引物的3』末端相鄰的對應序列位置處互補的核甘酸種類被摻入。在所述實施例的任一個中，可以用化學方式阻斷核甘酸種類(例如在3』-O位置處)以防止進一步延伸，並且需要在下一輪合成之前解除阻斷核甘酸種類。還將認識到，向新生分子的末端添加核甘酸種類的過程與上面針對向引物末端添加描述的過程基本相同。如上所述，可以通過本領域中已知的多種方法檢測核甘酸種類的摻入,例如，通過利用酶促反應過程產生光檢測焦磷酸鹽(PPi)的釋放或通過檢測pH變化(美國專利No. 6210891 ；No. 6258568和No. 6828100中描述的實例，在此出於所有目的通過引用將所述專利的每一個整體地併入本文)，或通過結合到核苷酸的可檢測標記。可檢測標記的一些實例包括，但不限於，質量標籤和螢光或化學發光標記。在典型的實施例中，例如，通過洗滌去除未摻入的核苷酸。此外，在一些實施例中，可以對未摻入的核苷酸進行酶降解，例如，舉例來說，利用腺苷三磷酸雙磷酸酶或焦磷酸酶的降解，如在2008年6月27日提交的題為 「System and Method for Adaptive Reagent Control in Nucleic Acid Sequencing，，的序號為No. 12/215455的美國專利申請和2009年I月29日提交的題為「System and Methodfor Improved Signal Detection in Nucleic Acid Sequencing」的序號為 No. 12/322284的美國專利申請中所述的；在此出於所有目的通過引用將所述美國專利申請的每一個整體地併入本文。在使用可檢測標記的實施例中，通常必須在隨後合成循環之前將它們滅活(例如，通過化學裂解或光漂白)。如上所述，然後可以利用另一核甘酸種類或多個感興趣的核甘酸種類來查詢模板/聚合酶複合物中的下一個序列位置。核甘酸添加、延伸、信號採集和洗滌的重複循環導致模板鏈的核苷酸序列的確定。繼續本實例，通常在任何一個測序反應中同時分析大量的基本相同的模板分子或基本相同的模板分子的群體(例如103、104、105、IO6或IO7個分子)，以便獲得對於可靠檢測而言足夠強的信號。而且，目前描述的本發明的實施例的系統和方法可以包括利用為在計算機系統上執行而存儲的計算機可讀介質的一些設計、分析或其他操作的實施方式。例如，幾個實施例在下面被詳細描述為處理檢測到的信號和/或分析利用SBS系統和方法產生的數據，其中可以在計算機系統上實施所述處理和分析實施例。供目前描述的發明使用的計算機系統的示範性實施例可以包括任何類型的計算機平臺，例如工作站、個人計算機、伺服器或任何其他目前或將來的計算機。然而，本領域普通技術人員應當認識到，如本文所述的前述計算機平臺被特別地配置成執行所述發明的專門操作，並且不被視為通用計算機。計算機典型地包括已知部件，例如處理器、作業系統、系統存儲器、存儲器儲存裝置、輸入-輸出控制器、輸入-輸出裝置和顯示裝置。本領域普通技術人員還要理解，存在很多可能的計算機的配置和部件，並且還可以包括高速緩衝存儲器、數據備份單元和很多其他裝置。顯示裝置可以包括提供視覺信息的顯示裝置，該信息通常可以在邏輯和/或物理上被組織成像素陣列。還可以包括界面控制器，其可以包括用於提供輸入和輸出界面的多種已知的或未來的軟體程序中的任一種。例如，界面可以包括通常被稱為「圖形用戶界面」(常稱為GUI)的界面，其向用戶提供一個或多個圖形表示。通常使界面能夠利用本領域普通技術人員已知的選擇或輸入手段接受用戶輸入。
在相同或替代實施例中，計算機上的應用可以採用包括被稱為「命令行界面」(常稱為CLI)的界面的界面。CLI典型地在應用和用戶之間提供基於文本的交互。典型地，命令行界面通過顯示裝置以文本行的形式呈現輸出並接收輸入。例如，一些實施方式可以包括所謂的「外殼」，例如相關領域中的普通技術人員已知的Unix外殼，或採用面向對象類型的編程架構的 Microsoft Windows Powershell，例如 Microsoft. NET 框架。相關領域中的普通技術人員將認識到，界面可以包括一個或多個⑶I、CLI或其組
口 O處理器可以包括市售處理器，例如Intel Corporation製造的Celeron 、Core 或 Pentium 處理器，Sun Microsystems 製造的 SPARC 處理器，AMD Corporation 製造的Athlon 、Sempron 、Phenom 或Opteron 處理器,或者其可以是可獲得的或將變成可獲得的的其他處理器之一。處理器的一些實施例可以包括所謂的多核處理器和/或被使得能夠在單核或多核配置中採用並行處理技術。例如，多核架構典型地包括兩個或更多處理器「執行核」。在本實例中，每個執行核可以作為獨立處理器運行，其使得能夠並行執行多線程。此 夕卜，相關領域中的普通技術人員將認識到，可以以一般所謂的32或64位架構、或現在已知的或將來可能開發的其他架構配置來配置處理器。處理器典型地執行作業系統，其可以是，例如來自Microsoft Corporation的Windows ⑧類型的作業系統(例如 Windows XP、Windows Vista ⑧或 Windows _7);來自 Apple Computer Corp.的 Mac OS X 作業系統(例如 Mac OS X vlO. 6 「Snow Leopard，，作業系統);從很多供應商或所謂的開放源可獲得的Unix⑧或Linux類型作業系統；另一種或未來的作業系統；或其某種組合。作業系統以眾所周知的方式與固件和硬體對接，並促進處理器協調和執行各種可以以多種程式語言寫成的電腦程式的功能。作業系統，典型地與處理器協作，協調並執行計算機的其他部件的功能。作業系統還提供調度、輸入-輸出控制、文件和數據管理、存儲器管理、以及通信控制與相關服務，全部都依據已知的技術。系統存儲器可以包括多種已知或未來存儲器儲存裝置中的任一種。實例包括任何通常可獲得的隨機存取存儲器(RAM)、磁性介質，例如駐留硬碟或帶、光學介質，例如讀寫光碟，或其他存儲器儲存裝置。存儲器儲存裝置可以包括多種已知或未來裝置中的任一種，包括光碟驅動器、帶驅動器、可移動硬碟驅動器、USB或快閃記憶體驅動器、或軟盤驅動器。這種類型的存儲器儲存裝置通常從程序存儲介質(未示出)讀取和/或向其寫入，所述程序存儲介質例如分別是光碟、磁帶、可移動硬碟、USB或快閃記憶體驅動器、或軟磁碟。可以將這些程序存儲介質或者現在使用的或可能以後會開發的其他存儲介質中的任一種視為電腦程式產品。如將要認識到的，這些程序存儲介質典型地存儲計算機軟體程序和/或數據。計算機軟體程序，也稱為計算機控制邏輯，通常存儲在結合存儲器儲存裝置使用的系統存儲器和/或程序儲存裝置中。在一些實施例中，描述了一種電腦程式產品，其包括具有存儲在其中的控制邏輯(計算機軟體程序，包括程序代碼)的計算機可用介質。控制邏輯當由處理器執行時使處理器執行這裡所描述的功能。在其他實施例中，主要在硬體中利用例如硬體狀態機實施一些功能。實施硬體狀態機以便執行這裡所述的功能對於相關領域中的技術人員而言將是顯而易見的。輸入-輸出控制器可以包括多種已知裝置中的任一種，用於從用戶(無論是人還是機器，無論是本地的還是遠程的)接受和處理信息。這樣的裝置包括，例如，數據機卡、無線卡、網絡接口卡、音效卡、或用於多種已知輸入裝置中的任一種的其他類型的控制器。輸出控制器可以包括用於多種已知顯示裝置中的任一種的控制器，所述顯示裝置用於向用戶(無論是人還是機器，無論是本地的還是遠程的)呈現信息。在目前描述的實施例中，計算機的功能元件通過系統總線彼此通信。計算機的一些實施例可以利用網絡或其他類型的遠程通信與一些功能元件通信。如對於相關領域中的技術人員明顯的是，儀器控制和/或數據處理應用，如果以軟體實施，那麼可以被加載到系統存儲器和/或存儲器儲存裝置中以及從系統存儲器和/或存儲器儲存裝置被執行。儀器控制和/或數據處理應用的全部或部分也可以駐留在存儲器儲存裝置的只讀存儲器或類似裝置中，這種裝置不需要儀器控制和/或數據處理應用首先通過輸入-輸出控制器被加載。相關領域中的技術人員將理解，可以由處理器以已知的 方式向系統存儲器中、或高速緩衝存儲器中、或兩者中加載儀器控制和/或數據處理應用、或其部分，如有利於執行。而且，計算機可以包括在系統存儲器中存儲的一個或多個庫文件、實驗數據文件和網際網路客戶端。例如，實驗數據可以包括與一個或多個實驗或化驗相關的數據，例如檢測到的信號值，或與一個或多個SBS實驗或過程相關聯的其他值。此外，網際網路客戶端可以包括被使得能夠利用網絡訪問另一個計算機上的遠程服務的應用，並且可以例如包括一般所謂的「網絡瀏覽器」。在本實例中，一些通常採用的網絡瀏覽器包括可從MicrosoftCorporation 獲得的 Microsoft Internet Explorer 8,可從Mozilla Corporation 獲得的 Mozilla Firefox 3· 6,可從 Apple Computer Corp.獲得的 Safari 4,可從 Google Corporation獲得的Google Chrome,或本領域中當前已知的或將來要開發的其他類型的網絡瀏覽器。而且，在相同或其他實施例中，網際網路客戶端可以包括或可以是被使得能夠通過網絡訪問遠程信息的專用軟體應用的元件，例如用於生物學應用的數據處理應用。網絡可以包括本領域的普通技術人員公知的很多不同類型的網絡中的一個或多個。例如，網絡可以包括區域網或廣域網，其採用通常所謂的TCP/IP協議族來通信。網絡可以包括包含互連計算機網絡的全球系統的網絡，其通常被稱為網際網路，或者還可以包括各種內部網架構。相關領域中的普通技術人員還將認識到，在網絡化環境中的一些用戶可能偏好採用一般所謂的「防火牆」(有時也稱為包過濾器，或邊界保護裝置)來控制往返於硬體和/或軟體系統的信息流量。例如，防火牆可以包括硬體或軟體元件或其某種組合，並且典型地被設計成強制執行由用戶(例如，舉例來說，網絡管理員等)設置的安全策略。在上面通過引用併入的2007年2月15日提交的題為「System and Method forCorrecting Primer Extension Errors in Nucleic Acid Sequence Data，，的序號為US2007/004187的PCT專利申請中提供了前述實施例的實例，並且所述實例至少部分地基於如下發現，即可以通過IE和CF的數學模型將理論流圖轉換成真實觀測的流圖。例如，理論流圖表示從序列讀取產生的數據，其不具有來自上述CAFIE機制的誤差或其他類型的背景誤差。沿著相同的線，觀測的流圖表示從序列讀取產生的數據，其包括所述CAFIE和其他背景誤差因素的某種度量。在本實例中，誤差因素中的一些或全部可以被精確地逼近並且被應用於理論流圖模型，以提供從實際測序運行獲得的真實數據的表示。此外，這裡描述的前述實施例還至少部分地基於如下概念人們可以利用數學模型的反演由觀測的流圖逼近理論流圖。由此，繼續上文的實例，可以向在觀測的流圖中表示的實際測序數據應用誤差的近似值以產生表示除去了所有或基本所有誤差因素的目標核酸的序列構成的理論流圖。一些前述實施例校正了每個流的檢測的信號以說明上述CF和IE機制。例如，一個方面包括假定CF和IE的給定水平，計算任何已知序列的相位同步性損失的程度。下面示出的表I提供了對於IE和CF的數學建模閾值的實例，對於不同讀取長度，所述閾值提供99%或更好的精確度(例如，讀取是至少99%，表示模板分子的實際序列)。表I中呈現的預測值示出了對於各種讀取長度CF和IE效應對測序精確度的影響，以及實現大致99%的讀取精確度可以容忍的IE和CF誤差的程度。表I表明，對於未校正的讀取，可允許不大於I %的CF率(假設對於該群體IE等於零)，以便使大約100個序列位置的讀取長度為99%精確(即，99%或更高的完成效率)。而且，可允許不大於O. 25%的IE率 (假設CF率等於零)，以便使大約100個序列位置的讀取長度為99%精確。表I.在不同讀取長度導致99%精確度的預測誤差率
讀取長度(鹼基)100200400
不完全延伸0.0 0.0025 0.0 0.0013 0.0 0.0007
推進0.01 0.0 0.005 0.0 0.003 0.00
預測的粕·確度 99% -99% -99% -99% 99% -99%將要理解，表I中呈現的值僅僅是出於說明的目的，並且不應被視為限制性的。普通技術人員將認識到，幾個因素可能有助於值的可變性，例如基因組或參考序列和用於對預測進行公式化的其他參數。例如，SBS方法的典型實施例一般實現從I %變動到2%的CF率，而IE率從O. 1%變動到O. 4% (即，完成效率從99. 6%變動到99.9% )。如上所述，CF和IE的校正是合乎需要的，因為相位同步性的損失在讀取長度上具有累積效應，並隨著讀取長度增大而使讀取質量退化。在一些前述實施例中，假設表不CF和IE的值在基本相同的模板分子群體的整個讀取中基本恆定，例如，舉例來說，駐留在PicoTiterPlate陣列或諸如ISFET型裝置的其他類型的孔陣列的單個孔之內的模板分子群體。這允許利用兩個簡單參數「完成效率」和「推進」，而沒有對模板分子的實際序列的任何先驗了解，在整個讀取中對每個序列位置進行數值校正。已經發現前述實施例的系統和方法對於確定和校正在模板分子群體中出現的CF和IE的量非常有效。例如，已經實施了前面的校正實施例，其針對每個孔中駐留的基本相同的模板分子的每個群體應用從每個流檢測的信號值的校正以說明CF和IE。前述實施例將相位同步性的缺少建模為非線性映射方稈(I)M (ρ, ε , λ ) = q其中-M 為 CAFIE 映射
-ρ為理論流圖[作為數組]-λ是完成效率參數- ε是推進參數-q為觀測的流圖[作為數組]
可以通過利用方程(I)中給出的映射模型公式將理論流圖轉換成真實觀測的流圖以估計IE和CF。可以通過例如通過對具有已知序列的多核苷酸模板分子測序分析被引入到觀測的流圖(q)的誤差，來產生用於這樣的映射公式的模型。圖I中示出了由方程(I)給出的數學模型的實例。例如，在圖I的左手側，理論流圖101是理論流圖(P)的說明性表示，其示出在與其關聯的核甘酸種類相鄰的括號中描述的理想化信號強度值。理論流圖101的每個理想化值是整數或零。在本實例中，值「I」表示由單個核甘酸摻入推導出的100%檢測的信號強度，「O」表示0%信號(例如，在包括I百萬個新生分子和I百萬個基本相同的模板分子的群體的孔中，「 I 」表示在每個新生分子被延伸了單個核甘酸時推導出的信號，「 2 」表示在每個新生分子被延伸了兩個核苷酸時推導出的信號，等等)。在圖I的右手側，觀測的流圖103是來自觀測(或模擬)的流圖(q)的檢測的信號強度值的說明性表示。類似地，流圖103中的每個信號強度值被描述在與其關聯的核甘酸種類相鄰的括號中。在圖I的右手側還有流105，其提供表示與核苷酸和信號值相關聯的迭代流序列的代表性數目(例如，流105的每一迭代表示添加核甘酸種類、之後是洗滌過程)。例如，如圖I中所示的流I與流105的所述迭代中引入的「C 」核甘酸種類相關聯，並對應於理論流圖101和觀測的流圖103的信號值。在圖I的實例中，針對每個流105迭代，理論流圖101和觀測的流圖103之間的信號強度值之差至少部分地表示相位同步的損失。例如，在觀測的流圖103中表示的信號值不是整數，而是每個針對流105的同一迭代通常稍高於或稍低於理論流圖101中表示的理想值。可以利用參數113的已知值估計表示為「M」的映射模型110。例如，參數113包括ε (推進)參數和λ (完成效率)參數。可以採用參數113估計映射模型110並將理論流圖(P) 101的信號值轉換成觀測的值(q) 103。在本實例中，由映射模型110表示的誤差值隨著流105的每一迭代而累積，並以指數方式增長。繼續上文的實例，由誤差值表示的誤差可以在理論上隨著每個流以指數方式增長。例如，與基本相同的模板分子的每個群體相關聯的相位同步化測序反應在流迭代之後變成三個不同的相位同步化子群體。所述子群體包括相位同步化反應的第一子群體，其中在相對於模板分子的合適的序列位置處適當地摻入流中的核甘酸種類(例如沒有CAFIE效應)；相位同步化反應的第二子群體，其中已經發生來自CF機制的不適當的摻入，並且反應在相對於第一群體的序列位置前面；以及相位同步化反應的第三子群體，其中已經發生來自IE機制的不適當的摻入，並且反應在第一群體的序列位置後面。在本實例中，在下一流迭代時，三個子-子群體將由上述三個子群體的每個形成，等等。相關領域的普通技術人員將認識到，在第η個流迭代時，將存在對在流η的信號有貢獻的相位同步化反應的3n個群體。進一步繼續上文的實例，圖2提供映射模型110的反演的說明性表示，在圖2中所述映射模型110的反演被表示為反演映射模型210。例如，通過估計參數113的正確值(例如，ε (推進)和λ (完成效率)參數兩者的值)，將觀測的流圖(q) 103的信號值反演回去，以給出理論流圖(P) 101的信號值。相關領域中的普通技術人員將認識到，提供圖I和2中所表示的信號值僅僅是出於說明的目的，並且寬範圍的信號值是可能的。由此，不應將它們示為限制性的。一些實施例以下面概述的兩個相繼階段(i)和(ii)執行反演映射對於每個核甘酸種類流i :(i)_通過核甘酸種類添加延伸新生分子
權利要求
1.一種用於遞歸地校正與從模板分子的基本相同的副本的群體產生的序列數據的相位同步相關聯的誤差的方法，該方法包括 (a)檢測響應於測序反應期間引入的多個核甘酸種類而產生的多個信號； (b)針對從每個核甘酸種類檢測的信號產生觀測的值；(C)利用推進值和不完全延伸值從觀測的值定義多個正摻入值和多個負摻入值； (d)利用噪聲值修訂推進值和不完全延伸值，其中噪聲值是從與負摻入值相關聯的多個觀測的值導出的； (e)利用修訂的推進值和修訂的不完全延伸值重新定義該多個正摻入值和該多個負摻入值；以及 (f)重複步驟(d)-(e)，直到該多個正摻入值和該多個負摻入值收斂為止。
2.根據權利要求I所述的方法，其中 所述正摻入值和所述負摻入值是整數，並且優選地，所述正摻入值是I，所述負摻入值是O。
3.根據權利要求I所述的方法，其中 利用參數估計模型確定步驟(C)中採用的推進值和不完全延伸值。
4.根據權利要求I所述的方法，其中 在步驟(c)之前，利用閾值值分配所述正摻入值和所述負摻入值，其中在所述觀測的值高於閾值值時分配正摻入值，在所述觀測的值低於閾值值時分配負摻入值。
5.根據權利要求4所述的方法，其中 所述閾值值包括在O和I之間的範圍內的值，並且優選地，所述閾值值約為O. 2。
6.根據權利要求4所述的方法，其中 通過利用參考序列定義閾值值，以預測沒有核甘酸種類存在的多個位置。
7.根據權利要求I所述的方法，其中 噪聲值是與來自引入的多個核甘酸種類的負摻入值相關聯的觀測的值的平均值，並且優選地，所述引入的多個核甘酸種類包括前48個引入的核甘酸種類。
8.根據權利要求I所述的方法，其中 並行執行多個測序反應，其中針對測序反應中的每一個執行步驟(a)-(f)。
9.一種用於遞歸地校正與從模板分子的基本相同的副本的群體產生的序列數據的相位同步相關聯的誤差的方法，該方法包括以下步驟 (a)檢測響應於測序反應期間引入的多個核甘酸種類而產生的多個信號； (b)針對從每個核甘酸種類檢測的信號產生觀測的值；(C)利用推進值和不完全延伸值從觀測的值定義多個正摻入值和多個負摻入值； (d)利用噪聲值修訂推進值和不完全延伸值，其中噪聲值是從與負摻入值相關聯的多個觀測的值導出的； (e)利用修訂的推進值和修訂的不完全延伸值重新定義該多個正摻入值和該多個負摻入值；以及 (f)重複步驟(d)-(e)，直到所述推進值和所述不完全延伸值收斂為止。
10.一種用於遞歸地校正與從模板分子的基本相同的副本的群體產生的序列數據的相位同步相關聯的誤差的儀器，該儀器包括(a)測序儀器部件，其檢測響應於測序反應期間引入的多個核甘酸種類而產生的多個信號; (b)計算機，該計算機包括在其上存儲的可執行代碼，其執行包括以下步驟的方法 i.針對從每個核甘酸種類檢測的信號產生觀測的值； ii.利用推進值和不完全延伸值從觀測的值定義多個正摻入值和多個負摻入值； iii.利用噪聲值修訂推進值和不完全延伸值，其中噪聲值是從與負摻入值相關聯的多個觀測的值導出的； iv.利用修訂的推進值和修訂的不完全延伸值重新定義該多個正摻入值和該多個負摻入值；以及 V.重複步驟iii-iv，直到所述推進值和所述不完全延伸值收斂為止。
11.根據權利要求10所述的儀器，其中 所述正摻入值和所述負摻入值是整數，並且優選地，所述正摻入值是I，所述負摻入值是O。
12.根據權利要求10所述的儀器，其中 利用參數估計模型確定步驟(ii)中採用的推進值和不完全延伸值。
13.根據權利要求10所述的儀器，其中 在步驟(ii)之前，所述計算機利用閾值值分配所述正摻入值和所述負摻入值，其中在所述觀測的值高於閾值值時分配正摻入值，在所述觀測的值低於閾值值時分配負摻入值。
14.根據權利要求13所述的儀器，其中 所述閾值值包括在O和I之間的範圍內的值，並且優選地，所述閾值值約為O. 2。
15.根據權利要求13所述的系統，其中 所述計算機利用參考序列定義閾值值，以預測沒有核甘酸種類存在的多個位置。
16.根據權利要求10所述的系統，其中 噪聲值是與來自通過測序儀器引入的多個核甘酸種類的負摻入值相關聯的觀測的值的平均值，並且優選地，所述引入的多個核甘酸種類包括前48個引入的核甘酸種類。
17.根據權利要求10所述的儀器，其中 所述測序系統並行執行多個測序反應，其中所述計算機針對測序反應中的每一個執行步驟(i)-(v)。
全文摘要
描述了一種用於校正與從模板分子的群體產生的序列數據的相位同步相關聯的誤差的方法的實施例，該方法包括以下步驟檢測響應於測序反應期間引入的核甘酸種類而產生的信號；針對從每個核甘酸種類檢測的信號產生觀測的值；利用推進值和不完全延伸值從觀測的值定義正摻入值和負摻入值；利用從與負摻入值相關聯的觀測的值導出的噪聲值修訂推進值和不完全延伸值；利用修訂的推進值和修訂的不完全延伸值重新定義正摻入值和負摻入值；以及重複修訂和重新定義的步驟，直到正摻入值和負摻入值收斂為止。
文檔編號G06F19/24GK102834828SQ201180017716
公開日2012年12月19日 申請日期2011年3月29日 優先權日2010年3月31日
發明者Y-J·陳, C·T·A·黃 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司