一種鮮味肽及其製備方法與應用
2023-10-17 02:36:41 2
1.本發明屬於食品加工技術和調味基料領域，具體涉及一種鮮味肽及其製備方法與應用。
背景技術：
2.鮮味肽是一種能夠彌補或增強食品原有風味的肽類物質，它可以改善食品品質，提高味覺的感知度，增強消費者的食慾。鮮味肽不僅味道鮮美，還能提供如胺基酸類等營養物質，具有巨大的市場潛力。近年來動植物蛋白肽研究在國內外有較深的研究，但對南極磷蝦酶法製備鮮味肽的研究較少。南極磷蝦脫脂粉蛋白含量高，鮮味突出，是進行鮮味肽研究的理想原料。因此對南極磷蝦鮮味肽的製備研究、利用水產蛋白資源和提高調味品檔次具有深遠的意義。
3.酶解法是當前鮮味肽製備的主要方法。由於酶解條件溫和、副產物少、安全高效、過程可控、肽得率高，選擇適當的蛋白酶水解動植物蛋白製備活性肽成為研究熱點。通過複合蛋白酶水解南極磷蝦脫脂粉得到的酶解液甜鮮味突出，腥味和苦味較弱，營養物質豐富。本發明人研究發現，在2000u/g的酶活下，利用胰蛋白酶與風味蛋白酶的複合蛋白酶水解南極磷蝦脫脂粉，得到的鮮味肽富含穀氨酸（glu）、纈氨酸（val）和天冬氨酸（asp）等17種胺基酸。其中呈鮮、甜味的胺基酸佔胺基酸總量的50.41%，其中與鮮味形成具有關鍵作用的游離穀氨酸和游離天冬氨酸共佔總游離胺基酸的22.53%，故樣品整體具有較好的感官滋味。
4.隨著我國漁業的發展，水產品的綜合利用也越來越引起人們的重視。但水產品自身所帶有的腥味成分破壞了其特有的風味，阻礙了其發展。目前應用於水產品脫腥的方法主要有物理脫腥方法、化學脫腥方法和生物脫腥方法。生物脫腥方法應用範圍受限制，一般只能用於液體魚製品或發酵魚製品。單一的物理和化學脫腥方法應用較為廣泛，但容易有重金屬元素富集。而本發明人研究發現，利用活性炭和硅藻土複合脫腥脫色，脫色率可達到55.12%且對汞（hg)、砷（as）和鎘（cd）等10種元素都有去除的效果，且使得其含量降低3-180倍不等，具有良好的脫除效果。因此利用複合蛋白酶法水解南極磷蝦脫脂粉製備鮮味肽，具有廣闊的市場應用前景。
技術實現要素：
5.本發明的目的是為了提供一種鮮味強烈、調味效果好且食用安全的鮮味肽。
6.本發明的另一目的是為了提供一種以南極磷蝦脫脂粉為原料，利用複合蛋白酶法水解且通過活性炭和硅藻土複合脫腥脫色脫重金屬的方法，從而製備出甜鮮味突出、口感飽滿、雜質較少的鮮味肽。
7.本發明的再一目的是為了提供上述鮮味肽作為食品添加劑和調味基料的用途。
8.本發明的再一目的是為了提供上述鮮味肽在製備降低膽固醇藥物以及功能性食品輔料中的應用。
9.為實現上述發明目的，本發明通過以下技術方案實現：
一種鮮味肽，其包含序列如seq id no:1所示的胺基酸。
10.如上所述的一種鮮味肽的製備方法，包括以下步驟：（s.1）酶解液的製備：取南極磷蝦脫脂粉加水攪拌均勻後添加風味蛋白酶和胰蛋白酶，超聲輔助酶解，酶解結束後進行加熱滅酶，反應結束後進行離心，取上清液留存備用，得到南極磷蝦酶解液；（s.2）酶解液的雜質脫除：向步驟（s.1）中得到的南極磷蝦酶解液中加入活性炭，水浴加熱，冷卻後離心，取上清液並向其中加入硅藻土，過濾得到脫腥脫色脫重金屬後的南極磷蝦酶解液；（s.3）酶解液的超濾分級：將步驟（s.2）中得到的脫腥脫色脫重金屬後的南極磷蝦酶解液進行超過濾，收集濾出液，然後進行冷凍乾燥凍幹成粉，得到鮮味肽。
11.作為優選，所述步驟（s.1）中加入的南極磷蝦脫脂粉與水的料液比為1:5~1:10g/ml。
12.作為進一步優選，所述步驟（s.1）中加入的南極磷蝦脫脂粉與水的料液比為1:8g/ml。
13.步驟（s.1）中加入的南極磷蝦脫脂粉與水的料液比低於1:5g/ml時，南極磷蝦脫脂粉與水的混合體系過於粘稠，容易出現結塊貼壁等現象，導致酶解不充分。而加入的南極磷蝦脫脂粉與水的料液比高於1:10g/ml時，耗水量增多，成本增加。
14.作為優選，所述步驟（s.1）中添加的風味蛋白酶和胰蛋白酶的總酶活為1500~3500u/g，風味蛋白酶和胰蛋白酶的比例為1:2~1:8。
15.作為進一步優選，所述步驟（s.1）中添加的風味蛋白酶和胰蛋白酶的總酶活為2000u/g，風味蛋白酶和胰蛋白酶的比例為1:5。
16.步驟（s.1）中添加的風味蛋白酶和胰蛋白酶的總酶活量和比例影響南極磷蝦酶解液的水解度和鮮味肽的肽得率。此外，風味蛋白酶的添加，可去除苦澀味，改善口感。同時提高蛋白有效利用率，降低生產的成本。
17.作為優選，所述步驟（s.1）中超聲輔助酶解的反應條件為：在功率為100~300w，溫度為25~45℃下，進行超聲波預處理，然後水浴加熱酶解1~5小時。
18.作為進一步優選，所述步驟（s.1）中超聲輔助酶解的反應條件為：在功率為180w，溫度為30℃下，進行超聲波預處理6~14min，然後水浴加熱至41℃酶解3小時。
19.作為進一步優選，所述步驟（s.1）中得到的南極磷蝦酶解液的水解度為19~38%。
20.南極磷蝦酶解液的水解度影響製備鮮味肽的肽得率。南極磷蝦酶解液的水解度越高，鮮味肽的肽得率越高。
21.作為優選，所述步驟（s.1）和步驟（s.2）中離心分離上清液的條件為：在溫度為2~6℃下以轉速為8000~10000r/min離心10~20min。
22.作為進一步優選，所述步驟（s.1）和步驟（s.2）中離心分離上清液的條件為：在溫度為4℃下以轉速為8000r/min離心15min。
23.作為優選，所述步驟（s.2）中加入的活性炭佔南極磷蝦酶解液的質量百分比為1~5%，每30ml上清液中添加硅藻土的含量為3~15g。
24.作為進一步優選，所述步驟（s.2）中加入的活性炭佔南極磷蝦酶解液的質量百分比為2.5%，每30 ml上清液中添加硅藻土的含量為9g。
25.當活性炭添加量低於1%、每30ml上清液中硅藻土添加量低於3g時，容易致使去腥味、脫色、脫除重金屬的效果不佳。當活性炭添加量高於5%、每30ml上清液中硅藻土添加量高於15g時，容易造成多肽得率過低。同時，活性炭和硅藻土添加過量，容易有殘留。
26.作為優選，所述步驟（s.2）中水浴加熱的條件為：在溫度為30~60℃下水浴加熱30~150min。
27.作為進一步優選，所述步驟（s.2）中水浴加熱的條件為：在溫度為45℃下水浴加熱90min。
28.如上所述的一種鮮味肽在食品加工技術和調味基料中的應用。
29.如上所述的一種鮮味肽在製備降低膽固醇藥物以及功能性食品輔料中的應用。
30.因此，本發明具有以下有益效果：（1）本發明通過複合蛋白酶法水解南極磷蝦脫脂粉得到的鮮味肽甜鮮味突出，口感飽滿，腥味和苦味較弱，營養物質豐富，調味效果好；（2）本發明通過活性炭和硅藻土復配使用，有效對製備的鮮味肽脫除腥味、脫色且脫除其中含有的重金屬，食用安全，具有良好的脫除效果；（3）本發明製備的鮮味肽能有效降低膽固醇含量，有助於調節人體生理機能，具有廣闊的市場應用前景。
附圖說明
31.圖1為鮮味肽的製備工藝流程圖。
32.圖2為南極磷蝦蛋白胺基酸組成圖。
33.圖3為鮮味肽的脫色效果以及多肽損失率圖。
34.圖4為鮮味肽的脫重金屬效果圖。
35.圖5為脫色前後的南極磷蝦酶解液中重金屬含量的測定。
36.圖6為膽酸鈉標準曲線圖。
37.圖7為消化前後不同濃度下的多肽對膽酸鈉抑制率的測定。
具體實施方式
38.下面結合說明書附圖以及具體實施例對本發明做進一步描述。本領域普通技術人員在基於這些說明的情況下將能夠實現本發明。此外，下述說明中涉及到的本發明的實施例通常僅是本發明一部分的實施例，而不是全部的實施例。因此，基於本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動的前提下所獲得的所有其他實施例，都應當屬於本發明保護的範圍。
39.實施例1一種鮮味肽的製備方法，具體包括以下步驟：（s.1）酶解液的製備：稱取5g南極磷蝦脫脂粉，按照料液比為1:8（g/ml）加入純水攪拌均勻。然後添加總質量佔南極磷蝦脫脂粉水溶液質量2.5%的風味蛋白酶和胰蛋白酶（其中風味蛋白酶和胰蛋
白酶的總酶活為2000u/g，添加比例為1:5）。在功率為180w，溫度為30℃下，進行超聲波預處理10min，然後水浴加熱至41℃酶解3h。酶解結束後加熱至100℃，滅酶10min。反應結束後進行離心，取上清液留存備用，得到南極磷蝦酶解液；（s.2）酶解液的雜質脫除：向步驟（s.1）中得到的南極磷蝦酶解液中加入2.5%活性炭，在45℃恆溫下水浴加熱90min進行脫腥、脫色、脫除重金屬。待雜質脫除後的南極磷蝦酶解液冷卻至4℃時進行過濾，再以8000r/min的轉速離心15min，取上清液並向其中添加9g/30ml的硅藻土（即每30ml上清液中添加硅藻土的含量為9g）。重複該步驟操作1次。最後抽濾得到脫腥脫色脫重金屬後的南極磷蝦酶解液；（s.3）酶解液的超濾分級：選取分子量為1000da的超濾膜，將超濾杯頂端進氣口處的軟管與氮氣鋼瓶上的減壓閥直接相連（氮氣瓶調整壓力為0.05~0.50mpa）。將超濾杯置於磁力攪拌器上，打開磁力攪拌器使攪拌子以合適的轉速轉動。從而對步驟（s.2）中得到的脫腥脫色脫重金屬後的南極磷蝦酶解液進行超濾，收集濾出液。然後對濾出液進行冷凍乾燥48h，凍幹成粉，得到鮮味肽。
40.實施例2本實施例中，一種鮮味肽的製備方法，具體包括以下步驟：（s.1）酶解液的製備：稱取5g南極磷蝦脫脂粉，按照料液比為1:8（g/ml）加入純水攪拌均勻。然後添加總質量佔南極磷蝦脫脂粉水溶液質量2.5%的風味蛋白酶和胰蛋白酶（其中風味蛋白酶和胰蛋白酶的總酶活為2000u/g，添加比例為1:5）。在功率為180w，溫度為30℃下，進行超聲波預處理10min，然後水浴加熱至25℃酶解3h。酶解結束後加熱至100℃，滅酶10min。反應結束後進行離心，取上清液留存備用，得到南極磷蝦酶解液。步驟（s.2）中酶解液的雜質脫除和步驟（s.3）中酶解液的超濾分級過程等同於實施例1。
41.實施例3本實施例中，一種鮮味肽的製備方法，具體包括以下步驟：（s.1）酶解液的製備：稱取5g南極磷蝦脫脂粉，按照料液比為1:8（g/ml）加入純水攪拌均勻。然後添加總質量佔南極磷蝦脫脂粉水溶液質量2.5%的風味蛋白酶和胰蛋白酶（其中風味蛋白酶和胰蛋白酶的總酶活為2000u/g，添加比例為1:5）。在功率為180w，溫度為30℃下，進行超聲波預處理10min，然後水浴加熱至45℃酶解3h。酶解結束後加熱至100℃，滅酶10min。反應結束後進行離心，取上清液留存備用，得到南極磷蝦酶解液。步驟（s.2）中酶解液的雜質脫除和步驟（s.3）中酶解液的超濾分級過程等同於實施例1。
42.酶解液的超濾分級過程等同於實施例1。
43.實施例4本實施例中，一種鮮味肽的製備方法，具體包括以下步驟：（s.1）酶解液的製備：稱取5g南極磷蝦脫脂粉，按照料液比為1:8（g/ml）加入純水攪拌均勻。然後添加總質量佔南極磷蝦脫脂粉水溶液質量2.5%的風味蛋白酶和胰蛋白酶（其中風味蛋白酶和胰蛋
白酶的總酶活為2000u/g，添加比例為1:5）。在功率為180w，溫度為30℃下，進行超聲波預處理10min，然後水浴加熱至41℃酶解1h。酶解結束後加熱至100℃，滅酶10min。反應結束後進行離心，取上清液留存備用，得到南極磷蝦酶解液。步驟（s.2）中酶解液的雜質脫除和步驟（s.3）中酶解液的超濾分級過程等同於實施例1。
44.實施例5本實施例中，一種鮮味肽的製備方法，具體包括以下步驟：（s.1）酶解液的製備：稱取5g南極磷蝦脫脂粉，按照料液比為1:8（g/ml）加入純水攪拌均勻。然後添加總質量佔南極磷蝦脫脂粉水溶液質量2.5%的風味蛋白酶和胰蛋白酶（其中風味蛋白酶和胰蛋白酶的總酶活為2000u/g，添加比例為1:5）。在功率為180w，溫度為30℃下，進行超聲波預處理10min，然後水浴加熱至41℃酶解5h。酶解結束後加熱至100℃，滅酶10min。反應結束後進行離心，取上清液留存備用，得到南極磷蝦酶解液。步驟（s.2）中酶解液的雜質脫除和步驟（s.3）中酶解液的超濾分級過程等同於實施例1。
45.實施例6本實施例中，一種鮮味肽的製備方法，具體包括以下步驟：（s.1）酶解液的製備：稱取5g南極磷蝦脫脂粉，按照料液比為1:8（g/ml）加入純水攪拌均勻。然後添加總質量佔南極磷蝦脫脂粉水溶液質量2.5%的風味蛋白酶和胰蛋白酶（其中風味蛋白酶和胰蛋白酶的總酶活為2000u/g，添加比例為1:2）。在功率為180w，溫度為30℃下，進行超聲波預處理10min，然後水浴加熱至41℃酶解3h。酶解結束後加熱至100℃，滅酶10min。反應結束後進行離心，取上清液留存備用，得到南極磷蝦酶解液。步驟（s.2）中酶解液的雜質脫除和步驟（s.3）中酶解液的超濾分級過程等同於實施例1。
46.實施例7本實施例中，一種鮮味肽的製備方法，具體包括以下步驟：（s.1）酶解液的製備：稱取5g南極磷蝦脫脂粉，按照料液比為1:8（g/ml）加入純水攪拌均勻。然後添加總質量佔南極磷蝦脫脂粉水溶液質量2.5%的風味蛋白酶和胰蛋白酶（其中風味蛋白酶和胰蛋白酶的總酶活為2000u/g，添加比例為1:8）。在功率為180w，溫度為30℃下，進行超聲波預處理10min，然後水浴加熱至41℃酶解3h。酶解結束後加熱至100℃，滅酶10min。反應結束後進行離心，取上清液留存備用，得到南極磷蝦酶解液。步驟（s.2）中酶解液的雜質脫除和步驟（s.3）中酶解液的超濾分級過程等同於實施例1。
47.實施例8一種鮮味肽的製備方法，具體包括以下步驟：（s.1）酶解液的製備：稱取10g南極磷蝦脫脂粉，按照料液比為1:5（g/ml）加入純水攪拌均勻。然後添加總質量佔南極磷蝦脫脂粉水溶液質量7%的風味蛋白酶和胰蛋白酶（其中風味蛋白酶和胰蛋白酶的總酶活為1500u/g，添加比例為1:2）。在功率為100w，溫度為25℃下，進行超聲波預處理6min，然後水浴加熱至41℃酶解1小時。酶解結束後加熱至100℃，滅酶10min。反應結束後進行離心，取上清液留存備用，得到南極磷蝦酶解液；
（s.2）酶解液的雜質脫除：向步驟（s.1）中得到的南極磷蝦酶解液中加入1%活性炭，在30℃恆溫下水浴加熱150min進行脫腥、脫色、脫除重金屬。待雜質脫除後的南極磷蝦酶解液冷卻至2℃時進行過濾，再以9000r/min的轉速離心20min，取上清液並向其中添加3g/30ml的硅藻土（即每30ml上清液中添加硅藻土的含量為3g）。重複該步驟操作1次。最後抽濾得到脫腥脫色脫重金屬後的南極磷蝦酶解液；（s.3）酶解液的超濾分級：選取分子量為1000da的超濾膜，將超濾杯頂端進氣口處的軟管與氮氣鋼瓶上的減壓閥直接相連（氮氣瓶調整壓力為0.05~0.50mpa）。將超濾杯置於磁力攪拌器上，打開磁力攪拌器使攪拌子以合適的轉速轉動。從而對步驟（s.2）中得到的脫腥脫色脫重金屬後的南極磷蝦酶解液進行超濾，收集濾出液。然後對濾出液進行冷凍乾燥48h，凍幹成粉，得到鮮味肽。
48.實施例9一種鮮味肽的製備方法，具體包括以下步驟：（s.1）酶解液的製備：稱取10g南極磷蝦脫脂粉，按照料液比為1:10（g/ml）加入純水攪拌均勻。然後添加總質量佔南極磷蝦脫脂粉水溶液質量4.5%的風味蛋白酶和胰蛋白酶（其中風味蛋白酶和胰蛋白酶的總酶活為3500u/g，添加比例為1:8）。在功率為300w，溫度為45℃下，進行超聲波預處理14min，然後水浴加熱酶解5小時。酶解結束後加熱至100℃，滅酶10min。反應結束後進行離心，取上清液留存備用，得到南極磷蝦酶解液；（s.2）酶解液的雜質脫除：向步驟（s.1）中得到的南極磷蝦酶解液中加入5%活性炭（活性炭/南極磷蝦酶解液），在60℃恆溫下水浴加熱30min進行脫腥、脫色、脫除重金屬。待雜質脫除後的南極磷蝦酶解液冷卻至6℃時進行過濾，再以10000r/min的轉速離心10min，取上清液並向其中添加15g/30ml的硅藻土（即每30ml上清液中添加硅藻土的含量為15g）。重複該步驟操作1次。最後抽濾得到脫腥脫色脫重金屬後的南極磷蝦酶解液；（s.3）酶解液的超濾分級：選取分子量為1000da的超濾膜，將超濾杯頂端進氣口處的軟管與氮氣鋼瓶上的減壓閥直接相連（氮氣瓶調整壓力為0.05~0.50mpa）。將超濾杯置於磁力攪拌器上，打開磁力攪拌器使攪拌子以合適的轉速轉動。從而對步驟（s.2）中得到的脫腥脫色脫重金屬後的南極磷蝦酶解液進行超濾，收集濾出液。然後對濾出液進行冷凍乾燥60h，凍幹成粉，得到鮮味肽。
49.對比例1本實施例中，一種鮮味肽的製備方法，具體包括以下步驟：（s.1）酶解液的製備：稱取5g南極磷蝦脫脂粉，按照料液比為1:8（g/ml）加入純水攪拌均勻。然後添加總質量佔南極磷蝦脫脂粉水溶液質量2.5%的風味蛋白酶和胰蛋白酶（其中風味蛋白酶和胰蛋白酶的總酶活為2000u/g，添加比例為1:5）。在功率為180w，溫度為30℃下，進行超聲波預處理10min，冷卻，然後水浴加熱至20℃酶解3h。酶解結束後加熱至100℃，滅酶10min。反應結
束後進行離心，取上清液留存備用，得到南極磷蝦酶解液。步驟（s.2）中酶解液的雜質脫除和步驟（s.3）中酶解液的超濾分級過程等同於實施例1。
50.對比例2本實施例中，一種鮮味肽的製備方法，具體包括以下步驟：（s.1）酶解液的製備：稱取5g南極磷蝦脫脂粉，按照料液比為1:8（g/ml）加入純水攪拌均勻。然後添加總質量佔南極磷蝦脫脂粉水溶液質量2.5%的風味蛋白酶和胰蛋白酶（其中風味蛋白酶和胰蛋白酶的總酶活為2000u/g，添加比例為1:5）。在功率為180w，溫度為30℃下，進行超聲波預處理10min，冷卻，然後水浴加熱至50℃酶解3h。酶解結束後加熱至100℃，滅酶10min。反應結束後進行離心，取上清液留存備用，得到南極磷蝦酶解液。步驟（s.2）中酶解液的雜質脫除和步驟（s.3）中酶解液的超濾分級過程等同於實施例1。
51.對比例3本實施例中，一種鮮味肽的製備方法，具體包括以下步驟：（s.1）酶解液的製備：稱取5g南極磷蝦脫脂粉，按照料液比為1:8（g/ml）加入純水攪拌均勻。然後添加總質量佔南極磷蝦脫脂粉水溶液質量2.5%的風味蛋白酶和胰蛋白酶（其中風味蛋白酶和胰蛋白酶的總酶活為2000u/g，添加比例為1:5）。在功率為180w，溫度為30℃下，進行超聲波預處理10min，冷卻，然後水浴加熱至41℃酶解0.5h。酶解結束後加熱至100℃，滅酶10min。反應結束後進行離心，取上清液留存備用，得到南極磷蝦酶解液。步驟（s.2）中酶解液的雜質脫除和步驟（s.3）中酶解液的超濾分級過程等同於實施例1。
52.對比例4本實施例中，一種鮮味肽的製備方法，具體包括以下步驟：（s.1）酶解液的製備：稱取5g南極磷蝦脫脂粉，按照料液比為1:8（g/ml）加入純水攪拌均勻。然後添加總質量佔南極磷蝦脫脂粉水溶液質量2.5%的風味蛋白酶和胰蛋白酶（其中風味蛋白酶和胰蛋白酶的總酶活為2000u/g，添加比例為1:5）。在功率為180w，溫度為30℃下，進行超聲波預處理10min，冷卻，然後水浴加熱至41℃酶解6h。酶解結束後加熱至100℃，滅酶10min。反應結束後進行離心，取上清液留存備用，得到南極磷蝦酶解液。步驟（s.2）中酶解液的雜質脫除和步驟（s.3）中酶解液的超濾分級過程等同於實施例1。
53.對比例5本實施例中，一種鮮味肽的製備方法，具體包括以下步驟：（s.1）酶解液的製備：稱取5g南極磷蝦脫脂粉，按照料液比為1:8（g/ml）加入純水攪拌均勻。然後添加總質量佔南極磷蝦脫脂粉水溶液質量2.5%的風味蛋白酶和胰蛋白酶（其中風味蛋白酶和胰蛋白酶的總酶活為2000u/g，添加比例為1:1）。在功率為180w，溫度為30℃下，進行超聲波預處理10min，冷卻，然後水浴加熱至41℃酶解3h。酶解結束後加熱至100℃，滅酶10min。反應結束後進行離心，取上清液留存備用，得到南極磷蝦酶解液。步驟（s.2）中酶解液的雜質脫除和步驟（s.3）中酶解液的超濾分級過程等同於實施例1。
54.對比例6
本實施例中，一種鮮味肽的製備方法，具體包括以下步驟：（s.1）酶解液的製備：稱取5g南極磷蝦脫脂粉，按照料液比為1:8（g/ml）加入純水攪拌均勻。然後添加總質量佔南極磷蝦脫脂粉水溶液質量2.5%的風味蛋白酶和胰蛋白酶（其中風味蛋白酶和胰蛋白酶的總酶活為2000u/g，添加比例為1:10）。在功率為180w，溫度為30℃下，進行超聲波預處理10min，冷卻，然後水浴加熱至41℃酶解3h。酶解結束後加熱至100℃，滅酶10min。反應結束後進行離心，取上清液留存備用，得到南極磷蝦酶解液。步驟（s.2）中酶解液的雜質脫除和步驟（s.3）中酶解液的超濾分級過程等同於實施例1。
55.對比例7本實施例中，一種鮮味肽的製備方法，具體包括以下步驟：（s.1）酶解液的製備：製備過程等同於實施例1；（s.2）酶解液的雜質脫除：向步驟（s.1）中得到的南極磷蝦酶解液中加入2.5%活性炭，在45℃恆溫下水浴加熱90min進行脫腥、脫色、脫除重金屬。待雜質脫除後的南極磷蝦酶解液冷卻至4℃時進行過濾，再以8000r/min的轉速離心15min，取上清液。重複該步驟操作1次。最後抽濾得到脫腥脫色脫重金屬後的南極磷蝦酶解液；（s.3）酶解液的超濾分級：超濾分級過程等同於實施例1。
56.對比例8本實施例中，一種鮮味肽的製備方法，具體包括以下步驟：（s.1）酶解液的製備：製備過程等同於實施例1；（s.2）酶解液的雜質脫除：取步驟（s.1）中得到的南極磷蝦酶解液在45℃恆溫下水浴加熱90min，然後冷卻至4℃進行過濾。再以8000r/min的轉速離心15min，取上清液並向其中添加9g/30ml的硅藻土（即每30 ml上清液中添加硅藻土的含量為9g）。重複該步驟操作1次。最後抽濾得到脫腥脫色脫重金屬後的南極磷蝦酶解液；（s.3）酶解液的超濾分級：超濾分級過程等同於實施例1。
57.按照實施例1~7以及對比例1~6製備的鮮味肽包含的其中一種胺基酸序列seq id no:1如下表1所示。
58.表1
59.【性能測試及分析】【試驗1】多肽得率的測定分別按照實施例1~7以及對比例1~6的製備方法，將離心過後的水解物倒入潔淨的培養皿中（事先稱量該培養皿的質量），再將樣品放入-80℃的冰箱中進行預凍3~4h。取出放入冷凍乾燥機中進行冷凍乾燥，待完全乾燥後取出並稱量。計算多肽得率，結果如下表2所示。
60.多肽得率計算公式如下：
式中：m1—乾燥後培養皿的總質量（g）；m2—空培養皿的質量（g）；m—稱取的幹基南極磷蝦的質量（g）。
61.【試驗2】水解度的測定按照實施例1~7以及對比例1~6的製備方法，吸取5.0ml南極磷蝦酶解液（作為待測試樣），定容至100ml，再吸取20ml稀釋後的南極磷蝦酶解液置於250ml燒杯中。開動磁力攪拌器（低轉速），用0.05mol/l naoh標準滴定溶液滴定至ph為8.2。加入10ml濃度為37%的甲醛溶液，混勻。再用0.05mol/l naoh標準滴定溶液繼續滴定至ph為9.2，記下消耗氫氧化鈉標準滴定溶液的毫升數。同時取未酶解的南極磷蝦脫脂粉樣品（作為空白試樣），做空白對照試驗。計算水解度，結果如下表2所示。
62.氨基態氮的含量（x）計算公式如下：式中：x—試樣中氨基態氮的含量，mg/ml；v1—待測試樣加入甲醛後消耗naoh標準滴定溶液的體積，ml；v0—空白試樣加入甲醛後消耗naoh標準滴定溶液的體積，ml；v2—吸取稀釋液數，ml；c—naoh標準滴定溶液的實際濃度，mol/l；0.014—與1.00ml氫氧化鈉標準滴定溶液[c(naoh)=1 mol/l]相當的氮的質量，g。
[0063]
水解度（dh）計算公式如下：
[0064]
表2
[0065]
從表2中數據分析比較後可知，在酶解溫度為41℃、酶解時間為3h、酶配比為1:5的
工藝條件下，多肽得率和水解度達到最高。實驗測得多肽得率最高為30.57%，水解度最高為37.52%。
[0066]
【試驗3】脫色率的測定按照實施例1以及對比例7~8的製備方法，用紫外分光光度計測定南極磷蝦酶解液在脫色前後的400nm吸光度值來判斷脫色效果。計算脫色率，結果如下表3所示。
[0067]
計算公式如下：
[0068]
【試驗4】雙縮脲法測定多肽損失率按照實施例1以及對比例7~8的製備方法，採用雙縮脲法測定多肽的損失率，結果如下表3所示。以10mg/ml牛血清蛋白（abs）溶液為標準品，以雙縮脲試劑為顯色劑，分別移取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml南極磷蝦酶解液定容至1ml，再分別加入4ml雙縮脲試劑，混合搖勻後在室溫下靜置30min，在540nm波長處測定吸光度值。以蛋白質含量為橫坐標，od540nm作為縱坐標，繪製標準曲線，得到的回歸方程為：y=0.0562x+0.0039，r2=0.9998。計算公式如下：
[0069]
表3
[0070]
從表3及圖3中數據分析比較後可知，向南極磷蝦酶解液中添加活性炭和硅藻土進行複合脫色，脫色效果最好，脫色率高達65.84%。同時，多肽損失率為18.14%，雖比單獨用活性炭或硅藻土脫色情況下的多肽損失率略高，但在可接受範圍內。
[0071]
【試驗5】脫色、脫腥的感官評定按照實施例1的製備方法製備南極磷蝦酶解液。以穀氨酸鈉溶液作為鮮味參比樣，以其濃度分別為0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20mg/ml時對應的鮮味評分1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。然後對製備的南極磷蝦酶解液進行脫色、脫腥前後的感官評價，並對其色澤和風味進行簡單描述。測試結果如下表4所示。
[0072]
表4
[0073]
從表4中數據分析比較後可知，向南極磷蝦酶解液中添加活性炭和硅藻土進行複合脫色、脫腥後，南極磷蝦酶解液顏色變淺，腥澀味減輕，鮮蝦味更明顯。
[0074]
【試驗6】脫重金屬的效果測定按照實施例1的製備方法製備南極磷蝦酶解液，脫腥脫色後進行超濾，凍幹成粉後
得到鮮味肽粉固體，作為實驗樣品。準確稱取一定質量的實驗樣品至40ml聚四氟乙烯坩堝中，加入5ml王水，150℃下反應3h。開蓋，加入10ml 5%硝酸，轉移至50ml容量瓶中定容。上機測試icp-ms，計算公式如下：ms，計算公式如下：ms，計算公式如下：
[0075]
式中：m：分析樣品時所取用的樣品的質量（該數據由分析天平記錄所得），單位g；v0：樣品消解後，定容的體積，單位ml；f：稀釋倍數；co：測試溶液元素的濃度（該數據由儀器測試所得），單位ug/l；c1：樣品消解液原液的元素濃度，單位ug/l；c
x
：所測元素的最終測試結果，單位ug/kg；w(%)：所測元素的最終測試結果，以百分比形式表示。
[0076]
鮮味肽的脫重金屬效果測試結果如圖4所示，脫色前後的南極磷蝦酶解液中重金屬含量的測定如圖5所示。
[0077]
從圖4及圖5中數據分析比較後可知，向南極磷蝦酶解液中添加活性炭和硅藻土進行複合脫除重金屬，能有效降低酶解液中各種重金屬含量。此外，酶解液中重金屬鐵、鋅、銅、鎳的含量顯著降低，達到食品中重金屬限量指標（ppb級），提升食品安全性。
[0078]
【試驗7】多肽分子量的測定按照實施例1的製備方法，採用高效液相色譜法測定水解產物的分子量分布。waters高效液相色譜儀；分析柱：xbridge protein beh 125
åꢀ
sec色譜柱（7.8
×
300mm，粒徑3.5μm，美國waters）；流動相：乙腈/水（40/60，v/v）再加入0.1%三氟乙酸；紫外檢測波長：220nm；流速：0.4ml/min；柱溫：30℃；進樣量：10μl；標準品：細胞色素c（12384da；源葉生物）；抑肽酶（6511.51da；源葉生物）；桿菌肽（1422.69da；源葉生物）；l-氧化型穀胱甘肽（612.63da；源葉生物）和順式-d-羥脯氨酸（131.13da；源葉生物）。測試結果如下表5所示。
[0079]
表5
[0080]
從表5中數據分析比較後可知，通過超濾分級法將水解產物分成不同組分，能夠得到更多分子量低於1kda的肽段。而低分子量（分子量低於1kda）的肽段的比例與鮮味呈正相關，對脫腥脫色脫重金屬後的南極磷蝦酶解液進行超濾分級，有助於提升鮮味肽的鮮味，使得口感更佳。
[0081]
【試驗8】多肽對膽酸鈉抑制率的測定生物活性肽是具有生理調節功能的肽類總稱，一般這類肽相對分子質量較小，在
人體內的消化吸收較蛋白質容易。它不僅能提供人體生長發育所需要的營養，還能調節人體生理機能，起到預防、甚至治療疾病的作用。人體內大約有三分之一的膽固醇會轉變為膽汁酸，膽汁酸一般以膽酸鹽的形式存在，是膽固醇代謝途徑之一。近年來，人們對降膽固醇活性肽的研究日益關注。而生物活性肽可以在其膠束溶液運輸過程中通過競爭代替膽固醇或者是破壞其膠束結構，從而有效降低膽固醇含量。目前對於膽固醇的體外檢測主要採用膽汁酸螯合法，利用了膽汁酸為膽固醇的衍生物，而螯合劑與膽酸鹽形成不溶於水的複合物排出體外，再根據糠醛的顏色反應對膽酸鹽進行檢測，並用紫外分光光度法測定目標化合物的結合率。
[0082]
膽酸鈉標準曲線的建立：分別稱取膽酸鈉 0.04、0.08、0.12、0.16、0.2g 置於100ml棕色容量瓶中，用去離子水定容，配成膽酸鈉標準溶液。採用糠醛顯色法測定膽酸鈉的含量，分別取膽酸鈉標準溶液2ml，加入6ml 40%硫酸溶液，振蕩，加入1%糠醛溶液1ml，混勻，60℃溫育40min，待溫度降到室溫後，於620nm波長處測吸光值。以膽酸鈉的濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪製標準曲線：y=0.3436x-0.0111，r2=0.9992。膽酸鈉標準曲線圖如圖6所示。
[0083]
多肽對膽酸鈉吸附能力的測定：將4ml濃度為1.6mg/ml的膽酸鈉溶液加入到試管中，然後加入2ml濃度為1%、5%和10%的多肽溶液（即按照實施例1的製備方法製得的鮮味肽與水的混合溶液），37℃水浴保溫1h，冷卻至室溫，6000r/min離心10min。吸取上清液2ml按糠醛顯色法測其吸光度，由膽酸鈉標準曲線計算上清液中膽酸鈉濃度。再計算其抑制率y1。計算公式如下：式中：y1為抑制率（%）；p1為膽酸鈉溶液的初始質量濃度（mg/ml）；p2為吸附後膽酸鈉溶液的質量濃度（mg/ml）。
[0084]
體外腸消化後多肽對膽酸鈉抑制率的測定：取0.16g膽酸鈉加入0.15mol/l nacl溶液100ml中，加入2g胰蛋白酶，用1 mol/l nahco3調節ph至7（因為膽汁酸是在腸道參加代謝，所以只模擬腸道ph環境），取4ml濃度為1.6 mg/ml的膽酸鈉溶液加入到試管中，然後加入2ml濃度為1%、5%和10%的多肽溶液（即按照實施例1的製備方法製得的鮮味肽與水的混合溶液），放在37℃水浴恆溫振蕩1~4h，沸水浴10min滅酶，然後以6000r/min 的速度離心10min。吸取上清液1ml，按照標曲的方法測定殘餘膽酸鈉的含量，對膽酸鈉的吸附力公式如下：式中：y1為抑制率（%）；p1為膽酸鈉溶液的初濃度（mg/ml）；p2為反應後膽酸鈉溶液的濃度（mg/ml）。
[0085]
體外腸消化前多肽對膽酸鈉抑制率的測定：本實驗過程與體外腸消化後多肽對膽酸鈉抑制率的測定實驗過程的區別在於：取
0.16g膽酸鈉加入100ml蒸餾水中，其他實驗步驟相同。消化前後不同濃度下的多肽對膽酸鈉抑制率的測定結果如圖7所示。
[0086]
從圖6及圖7中數據分析可知：多肽進行模擬消化後的產物依然具有降膽固醇活性，但是與未被消化的多肽相比，活性有所下降，可能是多肽有一部分被消化或是消化酶對多肽的活性產生了影響。
[0087]
以上所述僅是對本發明的優選實施例及原理進行了詳細說明，對本領域的普通技術人員而言，依據本發明提供的思想，在具體實施方式上會有改變之處，而這些改變也應視為本發明的保護範圍。