酶法檢測腺苷脫氨酶試劑盒的製作方法

2023-10-17 02:54:14 2

專利名稱：酶法檢測腺苷脫氨酶試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物試劑，具體涉及ー種檢測試劑盒，尤其涉及ー種酶法檢測腺苷脫氨酶試劑盒。
背景技術：
腺苷脫氨酶(ADA)是嘌呤核苷代謝中重要的重要酶類，屬於巰基酶，每個分子至少含2個活性巰基，因而其能對氯汞甲酸完全抑制。另外，ADA能催化腺嘌呤核苷轉變為次黃嘌呤核苷，再經核苷磷酸化酶作用生成次黃嘌呤，其代謝終產物為尿酸。ADA廣泛分布於人體各組織中，以胸腺、脾和其他淋巴組織中含量最高，肝、肺、腎和骨胳肌等處含量較低。 血液中ADA主要存在於紅細胞、粒細胞和淋巴細胞，其活性約為血清的40 70倍，該酶在 T淋巴細胞比B淋巴細胞活性更高。目前，腺苷脫氨酶(ADA)在臨床的應用主要有一、用於肝膽疾病的診斷1.急性肝炎患者ADA與ALT均顯著升高。B型肝炎患者ALT的升高大於ADA，而非甲非B肝炎病人ADA的升高大於ALT，非甲非B肝炎患者ADA活性極度升高者多易轉變為遷延性肝炎。2.慢性肝炎患者ADA活性均升高，慢性活動型肝炎比非活動型升高更甚。 3.肝纖維化、肝硬化及慢性肝炎患者ADA活性顯著升高而ALT不升高，所以同時測定ALT和 ADA更具有臨床價值。4.阻塞性黃疸ADA不升高，而肝細胞性黃疸ADA活性升高，因此測定血清ADA有助於黃疸類型的鑑別診斷。ニ、用於結核性胸膜炎及結核性腹膜炎的診斷胸腹腔積液ADA活性測定，可區別胸腹腔積液的性質。結核性胸膜炎及結核性腹膜炎病人胸腹腔積液中ADA活性明顯高於癌症和心衰性胸腔積液中的ADA活性，且積液中ADA/血清ADA的比值大於1，所以測定胸腹水和血清ADA活性及比值是診斷結核性胸膜炎和結核性腹膜炎的一項可靠有效的指標。三、傷寒病傷寒病人ADA活性顯著升高，明顯高於非傷寒的發熱患者，ADA敏感性達100%，特異性92. 3 %，傷寒發病初期可高於正常人2 4倍，極期及緩解期仍持續處於高水平，至病程第4周逐漸降低，所以ADA檢測對傷寒病的早期診斷很有價值。四、其它疾病如傳染性單核細胞增多症、粟粒性結核、風溼熱、溶血性貧血、白血病及部分腫瘤病人，血清ADA可不同程度的升高。聯合免疫缺陷病(SCID)，全身各組織細胞 ADA活性均缺少。結核性腦膜炎病人的腦脊液中ADA活性升高，其它腦膜炎不升高，因此腦脊液中ADA活性測定可鑑別結核性腦膜炎。ADA活性的檢測方法一般有生化法和放射核素法，後者靈敏度高，但有放射性汙染，所以生化方法應用較廣泛。比色法採用顯色反應測定，以單位時間內釋放出來的氨量來推算ADA活性。目前中國多採用此法，其優點為無需特殊儀器和試劑；但僅適用於手工操作，且反應時間長，幹擾因素也較多，難以獲得快速而準確的結果。酶偶聯法偶聯，一般使用嘌呤核苷磷酸化酶(Purine nucleosidehosphorylase, PNP)和黃嘌呤氧化酶(Xanthine Oxidase, X0D)過氧化物酶(PEROXIDASE，ΡΕ0)。過氧化氫在過氧化物酶作用下與N乙醛ー N — 3一甲基苯胺和氨基安替比林反應生成醌染料，動力學連續監測醌濃度來測定ADA活性。此法特異性好，精密度高，重複性好，線性範圍可達 200U/I，顯著優於已知的其他化學法。試劑穩定性較好，2°C 8C溫度下儲存可穩定一年， 該方法應用較多。酶法原理腺苷AM >次黃苷+NH4+次黃苷+Pi PNP >次黃嘌呤+核糖-1-磷酸次黃嘌呤_ >尿酸+ H202+4-AAP+EHSPT ￡迎 > 紅色醌衍生物+H2O但是目前該檢測方法有些缺點，PNP(嘌呤核苷磷酸化酶)試劑價格昂貴、使用價格高，PNP試劑不穩定，試劑反應速度慢，試劑容易受到鹼性磷酸酶的幹擾等。

發明內容
本發明所要解決的技術問題在於克服上述不足之處，提供ー種加速腺苷脫氨酶反應，提高試劑穩定性的酶法檢測腺苷脫氨酶的試劑。本發明提供了一種酶法檢測腺苷脫氨酶試劑盒，該試劑盒由下列試劑1和試劑2組成的
試劑1 (3L)
緩衝液10-200mmol/L
toos (N-乙基-N- (2-羥基-3-磺丙基)-3--甲基苯胺鈉鹽)
l-100mmol/L
Triton x_100(曲拉通 100)0. 01-20ml/L
苯甲酸鈉20-100mmol/L
FeC13l-100mmol/L
PNP (嘌呤核苷磷酸化酶)10-20u/L
Xot (黃嘌呤氧化酶)20-30u/L
Peo (過氧化物酶)200-300u/L
甘油醛10-100g/L
砷酸鈉10-100g/L
試劑2 (IL)
磷酸氫ニ鈉10-200mmol/L
KCl10-500mmol/L
甘露醇10-200mmol/L
proclin300(生物防腐剤)0. 01-0. 5ml/L
腺苷10-200mmol/L
4-氨基替比林l_5mmol/L0
所述試劑1緩衝液選自TRIS(三羥弓ヨ基氨基甲燒 tris (hydroxymethyl)
aminomethaneハ MOPS (3-(N-嗎啉)丙磺酸 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid)或 HEPES 0-羥乙基哌嗪乙磺酸 4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid)。
4
本發明酶法檢測腺苷脫氨酶試劑盒，在使用時，試劑1加檢測樣本後再加入試劑 2，即可進行檢測。本發明的另一目的是提供了酶法檢測腺苷脫氨酶試劑盒的製備方法包括下列步 驟(一 )製備試劑 1 (3L)(1)先向容器內加入為總量80%的去離子水；(2)依次加入緩衝液、toos、Triton x-100 (曲拉通 100)苯甲酸鈉、FeC13、甘油醛、砷酸鈉；(3)加入酶PNP (嘌呤核苷磷酸化酶)、Xot (黃嘌呤氧化酶)、Peo (過氧化物酶)；(4)最後加入剩餘的去離子水混合均勻；( 二)製備試劑 2 : (1L)向容器內依次加入磷酸氫二鈉、KC1、甘露醇、proclin300、腺苷、4-氨基替比林混合均勻。本發明基於下列原理(1)選用促進劑加速腺苷脫氨酶的反應，其中酶的複合促進劑為FeC13、苯甲酸 鈉、TrionX-100 (表面活性劑)；(2)選用複合抑制劑，確保反應的特異性，抑制鹼性磷酸酶的幹擾，複合抑制劑為 甘油醛；(3)添加了特殊的酶保護劑如甘露醇，確保試劑的穩定性。本發明的試劑盒檢測效果好(1)0. 1M FeCl3、苯甲酸鈉、Triton x_100作為複合激活劑對反應的靈敏度提高，時 間縮短。(2)本發明的試劑盒對試劑中的酶有很強的保護作用，隨著時間的推移，對酶的 保護作用會更明顯，12個月後加保護劑的試劑與沒加保護劑的試劑相比，殘存酶活率升高 57%。
具體實施例方式實施例1製備酶法檢測腺苷脫氨酶試劑盒組成試劑1 : (3L)TRIS 緩衝液150mmoltoos6mmolTriton x-1006ml苯甲酸納60mmolFeC139mmolPNP30uXot90uPeo660u
甘油醛60g
砷酸鈉240g
試劑2 (IL)
磷酸氫ニ鈉5Ommol
KClIOmmol
甘露醇2Ommol
proclin3000. 5ml
腺苷15mmol
4-氨基替比林jmmol
製備
(一)製備試劑1:(3L)
(1)先向容器內加入2. 4L的去離子水；
(2)依次加入TRIS緩衝液、toos、Triton χ-
苯甲酸鈉、FeC13、甘油醛、砷酸鈉；
(3)加入酶PNP (嘌呤核苷磷酸化酶)、
Xot (黃嘌呤氧化酶)、Peo (過氧化物酶)；
(4)最後加入剰餘的水混合均勻；
(ニ)製備試劑2= (IL)
向容器內依次加入磷酸氫ニ鈉、KCl、甘露醇、
proclin300、腺苷、4-氨基替比林混合均勻。
實施例2
試劑1 (3L)
MOPS緩衝液150mmol
toos6mmo 丄
Triton χ-10012ml
苯甲酸鈉72mmol
FeC1315mmol
PNP54u
Xot90u
Peo600u
甘油醛90g
砷酸鈉54g
試劑2 (IL)
磷酸氫ニ鈉40mmol
KCl15mmol
甘露醇25mmol
proclin3000. 5ml
腺苷16mmol
4-氨基替比林2mmol
製備方法同實施例1。實施例3試劑1:(3L)HEPES 緩衝液toosTriton x-100苯甲酸鈉FeC13PNPXotPeo甘油醛砷酸鈉試劑2:αυ磷酸氫ニ鈉 50mmolKCl2mmol甘露醇20mmolproclin300 0.3ml腺苷15mmol4-氨基替比林 2mmol製備方法同實施例1實施例4本發明實施例1的試劑盒檢測效果試驗(1)0. IM !^Cl3、苯甲酸鈉、Triton χ-100作為複合激活對反應的影響試劑1中加入0. IM !^eCl3、苯甲酸鈉、Triton x_100，與沒有加入這些物質的試劑進行比對。測定方法步驟ー輸入參數於自動生化分析儀■ 溫度37°C，主波長550nm，次波長800nm，Rl 225ul.R2 75ul.樣本 6ul讀數點0-270-10步驟ニ 測定前將Rl與R2平衡至室溫.，然後放入試劑倉內步驟三輸入定標因子2100複合激活劑對反應的影響
300mmol 6mmol 6ml 9mmol 6mmol 30u 60u 90u 60g 60g
權利要求
1.一種酶法檢測腺苷脫氨酶試劑盒，其特徵在幹，所述試劑盒由下列試劑1和試劑2組成試劑1 :3L 緩衝液toosTriton χ-100苯甲酸鈉FeC13PNPXotPeo甘油醛砷酸鈉試劑2 =IL 磷酸氫ニ鈉 KCl甘露醇proclin300腺苷4-氨基替比林10-200mmol/Ll-100mmol/L.0.01-20ml/L20-100mmol/Ll-100mmol/L10-20u/L30-40u/L200-300u/L10-100g/L10-100g/L ；10-200mmol/L 10-500mmol/L 10-200mmol/L 0. 01-0. 5ml/L 10-200mmol/L l_5mmol/L0
2.根據權利要求1所述酶法檢測腺苷脫氨酶試劑盒的製備方法，其特徵在幹，所述試劑1緩衝液選自TRIS、MOPS或HEPES0
3.—種如權利要求1所述酶法檢測腺苷脫氨酶試劑盒的製備方法，其特徵在於，該方法包括下列步驟(一)製備試劑1 :3L(1)向容器內加入為總量80%的去離子水；(2)依次加入緩衝液、toos、Tritonχ-100、 苯甲酸鈉、FeC13、甘油醛、砷酸鈉；(3)加入酶，PNP,Xot, Peo ；(4)最後加入剰餘的水混合均勻； (ニ)製備試劑2:IL向容器內依次加入緩衝液、KC1、甘露醇、 proclin300、腺苷、4-氨基替比林混合均勻。
全文摘要
本發明公開了一種酶法檢測腺苷脫氨酶試劑盒。本發明試劑盒由試劑1和試劑2組成。本發明的試劑盒通過加入酶的複合促進劑，對反應的靈敏度提高，加速了腺苷脫氨酶的反應；選用複合抑制劑，確保了反應的特異性；添加酶保護劑，對試劑中的酶有很強的保護作用，提高了試劑的穩定性。本發明的試劑盒對酶的保護作用更明顯，經過與沒加保護劑的試劑相比，經過12個月後，殘存酶活率升高51％。本發明的試劑盒有較好的臨床應用前景。
文檔編號C12Q1/28GK102586397SQ20111000428
公開日2012年7月18日 申請日期2011年1月11日 優先權日2011年1月11日
發明者孫衛兵, 景晟 申請人:上海復星長徵醫學科學有限公司