一種具有表面塗層的細胞培養裝置的製作方法

2023-10-17 06:09:04 2

專利名稱：一種具有表面塗層的細胞培養裝置的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種具有表面塗層的細胞培養裝置，還涉及一種用於細胞培養的方法。
背景技術：
細胞生長的外環境對細胞的生長形態和功能都有重要的影響。在體內，細胞被錯綜複雜的腳手架似的細胞外腔所包圍，它影響著細胞的極化、生長以及細胞的運動。所以， 在細胞組織工程或體外實驗中，除了需無菌、維持適當溫度和提供一定的營養條件模擬體內生理環境使細胞生存、生長之外，還非常有必要構建一種細胞培養的外環境使得細胞能夠保持一種更為接近體內的形態，有利於了解細胞在體內生理狀態下的功能特徵和評估細胞在病理狀態下的作用。通常的體外培養使用聚苯乙烯合成的培養瓶皿表面或其它普通表面，這些表面對水或培養基沒有疏水性，接觸角在30度左右，是一個二維培養環境，細胞在這種表面上受到的限制相對較小而常常呈平鋪的形態，功能特徵也發生變化。一直以來，研究者都在尋求一種能使維持細胞自然形態的體外培養方式，目前已取得了一定發展，其中使用三維形式的培養物質進行三維培養為研究的熱點，例如專利CN101484574A公開了一種含聚合的高內相比乳液聚合物的細胞培養底物，經調整和修飾後用於常規的細胞三維培養，典型的用於哺乳動物細胞培養，還公開了該底物在細胞培養系統中的使用方法以研究和分析細胞的增殖、分化及功能化；專利CN1973029A公開了用於細胞培養和組織工程的一種納米纖絲結構，在細胞培養中主要用於細胞增殖和/或分化的環境，其中納米纖絲結構由一種或多種納米纖維網絡限定，納米纖維包括直徑為約1000納米或更少的聚合物細纖維；還有研究者使用比如組織切片或器官培養的方法來研究細胞的功能。雖然這些方法有利於模擬細胞在體內的環境，但仍存在某些不足如用於細胞培養的底物其配製較麻煩，不易控制；同一底物用於同一細胞培養，可能產生不同的結果，即重複性不好；培養時細胞存活率可能受到影響；特別對於研究單種細胞的結構功能來說，目標細胞生長在培養基質內導致觀察比較困難，且培養方式相對比較複雜，所以並沒有被廣泛應用於單種或單個細胞的研究。

發明內容
本發明的目的在於提供一種製備方便、穩定性好、生物相容性好易於細胞生長的， 有利於構建類似於體內的細胞外環境的具有表面塗層的細胞培養裝置，其能防止灰塵、油脂、微生物孢子、汙物等粘附，並使得細胞能夠保持一種更為接近體內的形態，從而有利於了解細胞在體內生理狀態下的功能特徵及評估細胞在病理狀態下作用的；本發明的另一目的在於提供一種用於細胞培養的方法。本發明的上述技術目的是通過以下技術方案得以實現的一種具有表面塗層的細胞培養裝置，它包括塑料基層和表面塗層，所述表面塗層為納米材料層，表面塗層對水的接觸角大於150度、分形維數為2. 2 2. 3。
上述接觸角大於150度的納米材料具有超疏水性，能有效防止灰塵、油脂、汙物等的粘附，分形維數反映了複雜形態佔有空間的有效性，實驗研究發現分形維數為2. 2^2. 3、 接觸角大於150度的納米材料能構建類似於體內的細胞外環境，有利於細胞維持類似體內的形態結構、具有較好的生物相容性和易於觀察目標細胞。為了獲得更優的安全性和無菌性，作為本發明的優選，所述納米材料層鋪展或塗
覆於塑料基層上。作為本發明的優選，上述具有表面塗層的細胞培養裝置可通過如下步驟獲得
(1)將三棕櫚酸甘油酯在65 70°C下熔化1(T15min ；
(2)將熔融的三棕櫚酸甘油酯鋪展或塗覆於塑料基層上；
(3)在1(T20min內快速冷卻凝固後加熱至4(T45°C後保溫10 hr，形成表面對水的接觸角大於150度、分形維數為2. 23士0. 03的具有表面塗層的細胞培養裝置。作為本發明的優選，所述步驟(2)中鋪展或塗覆的厚度太薄則表面塗層易剝落，太厚，不利於細胞觀察，選擇5(Γ100 μ m較為適宜。作為本發明的另一優選，上述具有表面塗層的細胞培養裝置還可以通過如下步驟獲得
(1)將烷基烯酮二聚體在7(T75°C下熔化5 10min ；
(2)將熔融的烷基烯酮二聚體鋪展或塗覆於塑料基層上；
(3)在1(T15min內快速冷卻凝固後加熱至45飛0°C後維持40 min,形成表面對水的接觸角大於150度、分形維數為2. 27士0. 03的具有表面塗層的細胞培養裝置。作為本發明的優選，所述步驟(2)中鋪展或塗覆的厚度太薄則表面塗層易剝落，太厚，不利於細胞觀察，選擇6(Γ80 μ m較為適宜。作為本發明的優選，所述用於細胞培養的塑料基層為培養皿、培養板、培養瓶中的一種。本發明還提供用於細胞培養的方法，是將細胞種植於上述任一所述的具有表面塗層的細胞培養裝置上進行培養，使得細胞能夠保持一種更為接近體內的形態和功能。綜上所述，本發明與現有技術相比，具有以下突出優點及有益效果
1.本發明的表面塗層為超疏水性納米材料層，可降低塗層表面能，賦予塗層表面超疏水能力，穩定性好，能有效防止灰塵、油脂、微生物孢子、汙物等粘附，從而利於提供一種無菌無塵的細胞體外培養環境；
2.研究發現，本發明的表面塗層能構建類似於體內的細胞外環境，使細胞維持一種更為接近體內的形態結構，從而有利於了解細胞在體內生理狀態下的功能特徵及評估細胞在病理狀態下的作用；
3.本發明製備方便，具有較好的生物相容性，易於觀察目標細胞；在本發明表面塗層上生長的細胞可以用於免疫化學染色、原位雜交實驗、細胞成份也可以用於定性或定量的分析，具有很強的實用性和應用性。


圖1為實施例1的細胞培養裝置的表面掃描電鏡(SEM)照片A電壓5.0KV， Bar=40 μ m ;B 電壓 10. OKV, Bar=80 μ m。
圖2為水分別在實施例IA和實施例2B的細胞培養裝置上的照片(Bar=500 μπι)。圖3為大鼠星形膠質細胞在不同培養裝置上培養不同時間後進行骨架蛋白 actin染色後的照片(Bar=25ym):A普通細胞培養裝置；B為實施例1的具有表面塗層的細
胞培養裝置。圖4為大鼠星形膠質細胞在不同培養裝置上培養的初級突起個數、分支個數、突起長度比值、細胞分形維數的比較(爐<0. 05; #7X0.01; #爐<0. 001)。圖5為大鼠星形膠質細胞在不同培養裝置上培養的細胞死亡率(採用Hoechst/ PI 染色)(*/X0. 05)。圖6為大鼠膠質瘤C6細胞在不同培養裝置上培養不同時間後進行骨架蛋白 actin染色後的照片(Bar=50 μ m) =A普通細胞培養裝置；B為實施例1的細胞培養裝置。圖7為實施例2的細胞培養裝置的表面SEM照片A電壓5. OKV, Bar=IOO μ m ;B電壓 5. OKV, Bar=80μ m。圖8為星形膠質細胞在不同培養裝置上培養2 d後進行骨架蛋白actin染色後的照片(Bar=50 μ m) =A普通細胞培養裝置；B為實施例2的細胞培養裝置。圖9為大鼠膠質瘤C6細胞在不同培養裝置上培養2 d後進行骨架蛋白actin染色後照片(Bar=20 μ m) =A普通細胞培養裝置；B為實施例2的細胞培養裝置。
具體實施例方式下面結合實施例和附圖對本發明作進一步詳細說明。本具體實施例僅僅是對本發明的解釋，其並不是對發明的限制，本領域技術人員在閱讀完本說明書後可以根據需要對本實施例做出任何修改，但只要在本發明的權利要求範圍內都受到專利法的保護。實施例1
一種具有表面塗層的細胞培養裝置，其通過如下步驟獲得
(1)將三棕櫚酸甘油酯在65 70°C下熔化1(T15min ；
(2)將熔融的三棕櫚酸甘油酯鋪展或塗覆於塑料培養皿上，鋪展或塗覆厚度為 50 100μπι ；
(3)在1(T20min內快速冷卻凝固後加熱至4(T45°C後保溫10 hr。該細胞培養裝置表面的SEM照片見圖1，其中表面的橫截面(圖IB) SEM圖像用盒計數法計算分形維數為2. 23士0. 03，水在其表面的照片見圖2A，用接觸角測量儀測量該表面對水的接觸角為 150^160度，表明該材料具有超疏水性。脊椎動物中樞神經系統中呈星形的神經膠質細胞即星形膠質細胞，其可調節細胞外離子和化學環境，支持腦血屏障，為神經組織提供營養物質，是哺乳動物腦內分布最廣泛的一類細胞，也是膠質細胞中體積最大的一種，在體內具有大量突起的精細立體結構。但是在普通細胞培養裝置如塑料或玻璃培養表面培養時，星形膠質細胞常呈扁平的多角型，失去大量的突起。我們將大鼠的皮層星形膠質細胞種植於上述具有表面塗層的細胞培養裝置上進行培養(培養基為DMEM含10%胎牛血清，37°C，5% C02)，培養1 d、2 d、3 d後進行細胞骨架 actin染色(染料為rhodamine-phalloidin，Molecularfrobes)，然後在螢光顯微鏡下拍攝照片見圖3B，在相同條件下對種植於普通細胞培養裝置表面的星形膠質細胞培養相同的時間，然後進行細胞骨架actin染色，照片見圖3A，對比A和B可以發現星形膠質細胞外表顯著不同，在普通細胞培養裝置表面上呈多角的扁平的形狀，顯示出異質性和無組織性，而星形膠質細胞在三棕櫚酸甘油酯超疏水納米材料上成多突起狀態，具有複雜的形態結構， 與體內形態更為接近。我們還比較了在普通細胞培養裝置上培養的星形膠質細胞與在具有表面塗層的細胞培養裝置上培養的星形膠質細胞的突起個數(圖4A、B)、突起長度(圖4C)和細胞的分形維數(圖4D，反映細胞結構複雜性的指標)，發現在具有三棕櫚酸甘油酯超疏水納米材料表面塗層的細胞培養裝置上星形膠質細胞的初級突起個數和分支個數(包括二級及其以上的突起個數)明顯多於普通材料上星形膠質細胞、相對突起長度((細胞中心至突起頂端長度一細胞內圓半徑的差值)X 100%/細胞中心至突起頂端長度)明顯長於普通細胞培養裝置上星形膠質細胞，同時細胞分形維數也明顯大於普通細胞培養裝置上的星形膠質細胞的分形維數。由此表明，在三棕櫚酸甘油酯超疏水納米材料上，星形膠質細胞形態更為接近體內的多突起、突起較長的複雜形態，更有利於了解細胞體內生理狀態下的功能特徵及評估細胞在病理狀態下的作用。我們還進一步比較了在具有三棕櫚酸甘油酯超疏水納米材料表面塗層的細胞培養裝置上和在普通細胞培養裝置上培養的星形膠質細胞的死亡率(圖5)，發現在具有表面塗層的細胞培養裝置上培養的細胞死亡率低於在普通細胞培養裝置上培養的死亡率，特別是培養2 d時的死亡率明顯低於普通細胞培養裝置上的星形膠質細胞死亡率，表明具有表面塗層的細胞培養裝置具有較好的生物相容性。此外，還將大鼠膠質瘤C6細胞(可從上海博耀生物科技有限公司購得)種植於上述具有表面塗層的細胞培養裝置上進行培養(DMEM含10%胎牛血清，37°C，5% C02)，培養2 d 後進行細胞骨架actin染色，然後在螢光顯微鏡下拍攝照片(圖6B)。在相同條件下對種植於普通細胞培養裝置表面的同一膠質瘤C6細胞培養相同的時間，然後進行細胞骨架actin 染色，照片見圖6A，對比A和B可以發現大鼠膠質瘤細胞C6在普通細培養裝置表面上呈雙極的形態，而在三棕櫚酸甘油酯超疏水納米材料上成多分支狀態，有大量的細小的突起， 表明其結構更為複雜，提示這種材料能使細胞保持一種更為接近體內的形態。實施例2
一種具有表面塗層的細胞培養裝置，其通過如下步驟獲得
(1)將烷基烯酮二聚體在7(T75°C下熔化5 10min ；
(2)將熔融的烷基烯酮二聚體鋪展或塗覆於塑料培養板或培養瓶上，鋪展或塗覆的厚度為60 80 μ m ；
(3)在1(T15min內快速冷卻凝固後加熱至45飛0°C後維持40 min。該細胞培養裝置表面的SEM照片見圖7。其中表面的橫截面(圖7B)SEM圖像用於盒計數法計算分形維數為 2. 27士0. 03，用接觸角測量儀測量該表面對水的接觸角為15(Γ160度(圖2Β)，表明該表面具有超疏水性。將大鼠皮層星形膠質細胞種植於具有烷基烯酮二聚體超疏水納米材料的細胞培養裝置上進行培養(培養基為DMEM含10%胎牛血清，37°C，5% C02)，培養3天後進行細胞骨架actin染色，然後在螢光顯微鏡下拍攝照片見圖8B ；在相同條件下對種植於普通細胞培養裝置表面的星形膠質細胞培養相同的時間，培養後的細胞骨架actin染色照片見圖8A，對比A和B可以發現星形膠質細胞外表顯著不同，在普通細胞培養裝置表面上呈扁平多角的形態，而在具有烷基烯酮二聚體超疏水納米材料表面塗層的細胞培養裝置表面上有較多突起，與體內形態更為接近。此外，還將大鼠膠質瘤細胞C6種植於上述具有表面塗層的細胞培養裝置上進行培養(DMEM含0. 1%胎牛血清、ImM dbcAMP, 37°C, 5% CO2),培養2 d後進行細胞骨架actin 染色，然後在螢光顯微鏡下拍攝照片圖9B，在相同條件下對種植於普通細胞培養裝置表面的同一膠質瘤細胞C6培養相同的時間，培養後的細胞骨架actin染色照片見圖9A，對比A 和B可以發現大鼠膠質瘤C6細胞在普通細胞培養裝置表面上呈多角的扁平的形狀，而在具有表面塗層的細胞培養裝置表面上成多分支狀態，有大量的細小的突起，三維結構觀察成立體形態。分析細胞的分析維數後發現，大鼠膠質瘤C6細胞在烷基烯酮二聚體超疏水納米材料上的分形維數為1.27士0. 06，而普通表面為1. 14士0. 04 UKQ. 05)，表明其結構更為複雜，提示這種材料能使細胞保持一種更為接近體內的形態。本發明中未詳盡部分均為本領域技術人員所熟知的技術。
權利要求
1.一種具有表面塗層的細胞培養裝置，其特徵在於它包括塑料基層和表面塗層，所述表面塗層為納米材料層，表面塗層對水的接觸角大於150度、分形維數為2. 2^2. 3。
2.根據權利要求1所述一種具有表面塗層的細胞培養裝置，其特徵在於所述納米材料層鋪展或塗覆於塑料基層上。
3.根據權利要求2所述一種具有表面塗層的細胞培養裝置，其特徵在於其通過如下步驟獲得(1)將三棕櫚酸甘油酯在65 70°C下熔化1(T15min ；(2)將熔融的三棕櫚酸甘油酯鋪展或塗覆於塑料基層上；(3)在l(T20min內快速冷卻凝固後加熱至4(T45°C後保溫10hr，形成表面對水的接觸角大於150度、分形維數為2. 23士0. 03的具有表面塗層的細胞培養裝置。
4.根據權利要求3所述一種具有表面塗層的細胞培養裝置，其特徵在於所述步驟(2)中鋪展或塗覆厚度為5(Γ100 μ m。
5.根據權利要求2所述一種具有表面塗層的細胞培養裝置，其特徵在於其通過如下步驟獲得(1)將烷基烯酮二聚體在7(T75°C下熔化5 10min ；(2)將熔融的烷基烯酮二聚體鋪展或塗覆於塑料基層上；(3)在1(T15min內快速冷卻凝固後加熱至45飛0°C後維持40 min,形成表面對水的接觸角大於150度、分形維數為2. 27士0. 03的具有表面塗層的細胞培養裝置。
6.根據權利要求5所述一種具有表面塗層的細胞培養裝置，其特徵在於所述步驟(2)中鋪展或塗覆的厚度為6(Γ80 μ m。
7.根據權利要求1至6任一所述一種具有表面塗層的細胞培養裝置，其特徵在於所述塑料基層為培養皿、培養板、培養瓶中的一種。
8.一種用於細胞培養的方法，其特徵在於將細胞種植於權利要求廣7任一所述的具有表面塗層的細胞培養裝置上進行培養，使得細胞能夠保持一種更為接近體內的形態和功能。
全文摘要
本發明公開了一種具有表面塗層的細胞培養裝置，它包括塑料基層和表面塗層，所述表面塗層為納米材料層，表面塗層對水的接觸角大於150度、分形維數為為2.2~2.3，該納米材料層鋪展或塗覆於塑料基層上。本發明還公開了一種用於細胞培養的方法，是將細胞種植於具有表面塗層的細胞培養裝置上進行培養，使得細胞能夠保持一種更為接近體內的形態和功能。本發明製備方便、穩定性好、生物相容性好且易於細胞生長，有利於了解細胞在體內生理狀態下的功能特徵及評估細胞在病理狀態下作用的，具有很強的實用性和應用性。
文檔編號C12M3/00GK102559494SQ201210051188
公開日2012年7月11日 申請日期2012年3月1日 優先權日2012年3月1日
發明者徐曉武, 戴海斌, 方文軍, 王喆, 胡薇薇, 陳忠, 魏雲海 申請人:浙江大學