一種利用rna恆溫擴增的結核分枝桿菌核酸檢測試劑盒的製作方法
2023-10-30 07:05:27
專利名稱：一種利用rna恆溫擴增的結核分枝桿菌核酸檢測試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及核分枝桿菌TB體外分子生物法檢測領域，特別是涉及一種利用RNA恆 溫擴增的結核分枝桿菌核酸檢測試劑盒。
背景技術：
結核分枝桿菌(M. Tuberculosis, TB)是人及動物結核病(tuberculosis)的病原 菌，屬於放射菌目分枝桿菌科分枝桿菌屬。可以分為人型、牛型、鳥型、鼠型、冷血動物型和 近年來發現的非洲型。對人類致病的主要為人型，牛型桿菌較少見，鳥類桿菌更少見，非典 型分枝桿菌也可引起類似結核樣病變，但少見。前三型由於發現的較早，已經在1901年倫 敦國際結核病會議以後得到完全確認，被稱為經典結核桿菌。對人畜威脅最大的正式經典 結核桿菌。結核桿菌為細長或微彎曲的桿菌，長1 4 μ m，寬0. 2 0. 5 μ m，呈單個或分枝 狀排列，無莢膜、無鞭毛、無芽胞。在陳舊的病灶和培養物中，形態常不典型，可呈顆粒狀、串 球狀、短棒狀、長絲型。牛型菌比人型菌較短而粗。禽型菌具有多型性，有時呈杆狀或鏈球 狀等。結核桿菌為專性需氧菌。營養要求高，在含有蛋黃、馬鈴薯、甘油和天門冬素等的固 體培養基上才能生長。生長條件以37 37. 5度、pH為6. 5 6. 8最適合，生長緩慢，在固 體培養基上需要2 8周才出現肉眼可以看見的菌落。目前對結核病診斷主要依靠實驗室診斷與臨床體症相結合。實驗室診斷主要包括 塗片檢查、培養法、抗原抗體檢測、PCR和TMA等。1.細菌學方法塗片鏡檢法將待檢測或者預處理的標本塗於玻片上，固定後進行染色，待幹後進 行鏡檢。抗酸桿菌陰性(一)連續觀察300個不同視野，未發現抗酸桿菌。抗酸桿菌陽性——報告抗酸桿菌菌數1 8條/300視野——抗酸桿菌陽性⑴3 9條/100視野—抗酸桿菌陽性(++):1 9條/10視野——抗酸桿菌陽性(+++) :1 9條/每視野——抗酸桿菌陽性(++++)彡10條/每視野痰塗片直接鏡檢是檢測抗酸桿菌(AFB)最普遍的實驗室診斷方法，特異性較高， 但靈敏性較低，塗片中分枝桿菌要達到103 104CFU/ml才可檢測出陽性結果，且僅能檢出 1/2-3/4的活動性結核患者，漏檢率相當高。培養法取消化後的痰液混勻，用無菌吸管接種在培養基斜面，接種後斜面向上於 37°C恆溫培養箱內，每周觀察細菌生長情況，陽性生長者經塗片萋一尼氏染色法驗證後隨 時報告結果，培養至8周仍未見細菌生長者，報告分枝桿菌陰性。羅氏(L0wenstein Jensen)培養法是目前檢測MTB的「金標準」，但其檢測周期長 (8周)，導致無法及時確診結核患者，並無法及時治療。
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2.免疫學方法結核菌素皮膚試驗(tuberculin skin test,TST)結核菌素通常是指舊結核菌素 (OT)和結核菌純蛋白衍生物(PPD)，常用於結核病流行病學調查、結核菌感染情況監測、卡 介苗接種前試驗、結核病輔助診斷。MTB在體內感染主要引起細胞介導的免疫反應，一直是 篩選結核分枝桿菌潛伏感染的重要方法，已被應用多年，並得到廣泛的承認，雖然此方法在 世界範圍內應用的非常廣泛，但是從靈敏度和特異性來說，它不是一個理想的檢測方法。為 預防結核而接種卡介苗的人群，將會對PPD產生假陽反應。結核病的免疫學機制主要是機體對結核分枝桿菌所引起的細胞免疫反應。人體初 次感染結核分枝桿菌後使T淋巴細胞致敏轉化為記憶T淋巴細胞，當人體再次接觸結核分 枝桿菌後，機體會迅速產生效應T淋巴細胞並產生多種細胞因子發揮免疫效應，其中幹擾 素(IFNl)是最為關鍵的細胞因子。因此，檢測IFN-y水平或分泌IFN-I的效應T細胞的水 平就可以判斷是否存在結核感染。ELISA方法近年來血清學方法檢測結核抗體倍受國內外學者關注。結核診斷尤 其是菌陰性結核病診斷仍是結核病防治中亟待研究和解決的問題。目前結核抗體仍是活動 性結核病，特別是菌陰性結核病和肺外結核病診斷中的重要輔助診斷手段。由於結核患者 免疫功能、遺傳背景和接受的治療不同而導致對MTB抗原識別的差異以及結核患者對抗原 的識別存在階段特異性，目前任何一個單一的抗原或商品化的組合抗原檢測試劑盒都無法 檢測出所有結核患者血清中的抗結核抗體，篩選MTB特異性抗原，組成聯合抗原是目前血 清學診斷的研究方向。目前結核桿菌抗體的檢測大部分採用ELISA方法，ELISA方法具有簡單、低廉的特 點，但目前許多方法還不太成熟，在特異性和靈敏度方面有待提高。隨著結核分枝桿菌幾種 特異性抗原的發現與純化，實驗技術的不斷改進，ELISA檢測血清結核抗體已在國內臨床實 驗應用，檢測結核抗體有助於結核病的診斷和鑑別診斷。用ELISA檢測結核分枝桿菌抗體 操作簡單、經濟，是活動性肺結核的有效診斷方法。3.分子生物學法在分枝桿菌菌種鑑定、流行病學研究、基因組比較分析、耐藥性監測等方面，分子 生物學方法對結核病診斷和治療起重要輔助作用，主要技術包括PCR、測序、指紋圖譜、生物 晶片、TMA等。PCR:是一種根據核酸複製原理採用分子技術模擬細胞內核酸複製過程的體外擴 增技術，目前已發展出了巢式或套式PCR、多重PCR、逆轉錄PCR、嵌合螢光PCR等多種PCR技 術，PCR技術與其它分子技術相結合產生的新興技術更是層出不窮。1989年，Hance等最先 報導將PCR技術應用於TB的檢測，其突出特點是靈敏度高，可以檢測出1 IOOfg純化的 分枝桿菌DNA，相當於1 20個MTB，與傳統的痰塗片抗酸染色和培養方法相比，其敏感性 得到了大大提高。此外，與傳統檢測方法相比，PCR檢測的報告周期短，1 2天即可發出報 告，因此對於TB的早期診斷具有獨到的優勢，但同時該方法存在的假陽性、標本中PCR抑制 物質導致的假陰性等問題還有待進一步改進。TMA:採用轉錄介導的擴增技術對靶核酸進行擴增，採用化學發光物丫啶酯標記的 DNA探針與擴增的靶基因進行雜交，探針與擴增產物雜交後利用雜交保護試驗去除未雜交 的標記探針，最後利用化學發光儀檢測化學發光信號。由於採用了轉錄介導擴增技術、雜交保護檢測技術和化學發光等多種敏感的分子技術，具有高度的敏感性和特異性。研究表明 TMA對塗陽TB診斷的敏感性達到92 100%，對塗陰TB診斷的敏感性也可達40 93%， 對所有臨床標本檢測的特異性均在95%以上，因此具有極大的應用潛力。Gen-Probe公司 的TMA檢測試劑盒已獲得美國FDA的批准應用於臨床TB的診斷，不足之處在於操作較為復 雜，技術不易掌握，且需要配套的化學發光檢測儀，因而在臨床的推廣應用較為困難。本公司已申請了專利核酸恆溫同步放大檢測方法(Simultaneous Amplification andTestiTB, SAT)(申請號200810111479. 0)；在此項技術的基礎上，本發明結核分枝桿菌 (TB)核酸檢測試劑盒採用的是SAT技術，核酸擴增使用M-MLV反轉錄酶和T7 RNA多聚酶來 同時實現，反轉錄酶用於產生靶標核酸(RNA)的一個DNA拷貝，T7 RNA多聚酶從DNA拷貝上 產生多個RNA拷貝，帶有螢光標記的優化探針和擴增後產生的RNA拷貝特異結合，從而產生 螢光，該螢光信號可由檢測儀器捕獲。該試劑盒能夠檢測痰液中的TBrRNA，具有特異性高、 靈敏度高和汙染低(擴增產物RNA在自然環境下易於降解)的特點。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是克服現有技術特異性、靈敏性不高，實驗汙染不易 控制的缺點，提供一種超聲破碎細菌菌體釋放出菌體核酸RNA及恆溫核酸同步放大檢測技 術(SAT)對結核分枝桿菌(TB)進行檢測的試劑盒。本發明的一種利用RNA恆溫擴增的結核分枝桿菌核酸檢測試劑盒，包括(1) TB稀釋液含0. 1 1 % RNAse抑制劑的滅菌DEPC水溶液；(2)TB反應液為dNTPs和NTPs擴增所需組份，主要包含Tris 10 50mM， MgCl2IO 40mM，dNTP 0. 5 5mM，NTP 1 10mM，PVP40 1 10%，KCl 5 40mM ；(3)TB檢測液為恆溫擴增時必需的引物和螢光探針溶解在TE溶液(IOmM Tris和 ImM EDTA的混合液)中配製而成，引物探針序列均選自長516bp TB 16SrRNA基因保守區， 序列見序列表SEQ. ID. N014 ； (4) SAT酶液為恆溫擴增時必需的多酶組分體系，含T7RNA聚合酶200 2000U/ 反應、M-MLV 反轉錄酶 400 4000U/ 反應、2 IOmM HEPES pH7. 5、10 100mMN-acetyl-L-cysteine>0. 04 ~ 0. 4mM zinc acetate、10 IOOmM trehalose、40 200mM Tris-HCl pH 8. 0、40 200mM KClU IOmM EDTA、2 20% (v/v)TritonX-100、 10 — 40% (v/v) glycerol ；(5) TB陽性對照；為IO2 105CFU/ml結核分枝桿菌的菌液；(6)TB陰性對照為不含有SEQ. ID. N014核酸序列或不含有結核分枝桿菌的的溶液。稀釋液主要含RNase抑制劑濃度為0. 1 1 %，RNase抑制劑能夠使RNase迅速失 活，有效保存RNA，超聲破碎菌體使靶標RNA得到了釋放，樣本放在該稀釋液中，延長了樣本 的保存時間，稀釋液組分為滅菌DEPC水和0. 1 RNase抑制劑。SAT酶液中所含的T7RNA聚合酶、M-MLV反轉錄酶，其穩定性直接決定了擴增反應 的擴增效率和試劑盒的使用有效期。該SAT酶液中加有穩定劑，經長期穩定性試驗，穩定性 可達10個月，保證了試劑盒有效期達6個月。TB檢測液中TB螢光探針為分子信標，是一類高特異性、高敏感性的分子探針，由兩端分別共價標記有螢光染料和淬滅劑的單鏈核酸分子組成，呈髮夾型或莖環結構，分子 信標的環部分和靶標互補，兩頭由於互補而成為莖，分子信標探針與線性的TaqMan探針相 比，因其髮夾結構的打開需要一定的力，因而特異性要好於線性探針。TB檢測液中TB引物， 依照SAT擴增的原理設計了 5』端帶有T7啟動子序列尾巴的下遊引物和特異的上遊引物， 下遊引物特異序列與靶標完全互補，上遊引物與靶標完全一致，保證了本試劑盒可準確進 行TB檢測的SAT反應。TB檢測液中的引物包含有以下一對或幾對序列TB T7 序列見序列表 SEQ. ID. NO1-5 ；TB nT7 序列見序列表 SEQ. ID. N06-10。TB檢測液中的探針包含有以下一種或幾種序列TB probe 序列見序列表 SEQ. ID. NOl 1-13。由於SAT擴增易受多種因素影響而使擴增失敗，使試劑盒使用人員判斷失誤得出 錯誤的結論，本發明的試劑盒中的TB陽性對照和TB陰性對照，均含有本試劑盒已述及TB 稀釋液，其中TB陽性對照還含有一定濃度的TB菌，濃度約為IO2 105CFU/ml。使用本試 劑盒時，每次應同時做平行對照的質量控制，且結果應同時滿足陽性對照dt ^ 35，陰性對 照dt無數值或為40，否則此次實驗視為無效。(dt表示樣本曲線與閾值線交點的橫坐標讀 數，與一般實時螢光PCR實驗結果的ct值類似)TB陽性對照和TB臨界弱陽性對照中的TB菌液，可以通過多種方法製備所得，其中 一種製備方法如下(1)將從中國醫學細菌保藏中心購買的H37Ra(ATCC25177)標準菌株擴大培養；(2)採用細菌計數法對培養的菌液進行計數；(3)將計數的培養物用TB稀釋液稀釋成陽性對照，所含菌液濃度為IO2 IO5CFU/ ml ο(4)將陽性對照用TB稀釋液稀釋100倍成臨界弱陽性對照，所含菌液濃度為1 103CFU/mL·本發明的檢測試劑盒檢測TB菌液的分析靈敏度為10CFU/ml，該靈敏度已完全滿 足臨床檢驗要求，故本發明的檢測試劑盒特異性高、靈敏度高，且擴增產物RNA在自然環境 下易於降解而汙染低。本發明試劑盒可用於痰液標本的檢測。
圖1為實施例4本發明試劑盒檢測病人痰液標本的擴增圖。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明 而不用於限制本發明的範圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之後，本領域技術人 員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定 的範圍。實施例1TB核酸RNA的提取，具體步驟為
1.取痰液1.5ml，視痰標本性狀加入1 2倍體積的4%NaOH於無菌樣品管中，渦 旋振蕩lmin，使痰液充分勻化，室溫放置15min 20min。2.樣品處理管(1.5ml離心管，數量為待測樣本數+2)，分別標記待處理樣品編號 及陽性、陰性對照；3.取液化好的痰液標本Iml於樣品處理管中，13000rpm離心5min，棄上清；加入 Iml生理鹽水重懸洗滌，13000rpm離心5min，棄上清，加入50 μ L TB稀釋液重懸。4.將處理好的50 μ 1樣本及50 μ 1陽性對照，50 μ 1陰性對照放入超聲處理器中 進行超聲處理15min，超聲功率為300W。5.超聲結束後，取2μ 1處理物加入含擴增檢測液的潔淨微量反應管中，此擴增檢 測液包含30 μ ITB反應液和2 μ 1 TB檢測液，檢測液中包含的引物和探針序列分別為TB Τ7 序列見序列表 SEQ. ID. NO1-5 ；TB nT7 序列見序列表 SEQ. ID. N06-10 ；TB Probe 序列見序列表 SEQ. ID. NOl 1-13。實施例2SAT核酸擴增檢測1.將含有擴增檢測液的潔淨微量反應管放入恆溫預熱裝置中，60°C保溫10分鐘， 42°C保溫5分鐘；同時將SAT酶液也預熱到42°C ；2.向微量反應管中加入10 μ 1已預熱的酶液(加樣tip頭不要接觸微量反應管， 如有接觸請務必更換tip頭)，加酶後蓋上管蓋1200rpm震蕩15秒鐘混勻；3.將微量反應管快速轉至合適的恆溫螢光檢測儀器，42°C反應40分鐘，設定每1 分鐘檢測一次螢光，共檢測40次；4.反應結束後，直接將微量反應管取出浸泡於10% 84消毒液中，取微量反應管應 小心操作，嚴禁打開反應管(防止汙染反應區)！實驗結束後用10% 84消毒液清潔工作區 及用具，最後用清水擦拭乾淨。5.參考值1.閾值設定以閾值線剛好超過正常陰性對照擴增曲線的最高點。2. dt彡35的樣本為陽性；3. 35 < dt < 40的樣本建議重新檢測，檢測結果dt < 40的樣本為陽性；4. dt無數值或為40的樣本為陰性。注dt表示樣本曲線與閾值線交點的橫坐標讀數(與一般實時螢光PCR實驗結果 的Ct值類似)6.質量控制每次檢測均設置陽性對照和陰性對照，且結果應同時滿足陽性對照 dt ( 35，陰性對照dt無數值或為40，否則此次實驗視為無效。實施例3TB試劑盒各組份的配製和組裝試劑盒組分TB稀釋液含0. 1 1 % RNAse抑制劑的滅菌DEPC水溶液；TB 反應液含 dNTPs 和 NTPs,主要包含 Tris 10 50mM, MgCl2 10 40mM, dNTP 0. 5 5mM，NTP 1 10mM，PVP40 1 10%，KCl 5 40mM ；
SAT酶液含T7RNA聚合酶200 2000U/反應、M-MLV反轉錄酶400 4000U/反應、 2 IOmMHEPES pH7. 5、10 IOOmM N-acetyl-L-cysteine、0. 04 0. 4mM zinc acetate、 10 IOOmM trehalose,40 200mM Tris-HCl pH 8. 0、40 200mM KC1、1 IOmM EDTA, 2 20% (v/v) Triton X_100、10 40% (v/v) glycerol ；TB檢測液含TB特異引物、特異螢光探針，引物和探針均溶解於TE溶液(IOmM Tris和ImM EDTA的混合液)；TB陽性對照含102CFU/ml 105CFU/ml TB菌的溶液；TB陰性對照為不含有SEQ. ID. N014核酸序列或不含有結核分枝桿菌的的溶液， 用於檢驗操作過程及試劑的有效性。實施例4應用模式之臨床樣本痰液的檢測本檢測模式為本發明的最佳體現試劑的製備同實施例3，試劑的生產在GMP車間 進行，結核分枝桿菌痰液臨床樣本為常州市第三人民醫院提供的臨床實驗樣品，編號為TB 痰液標本1 8，另設陰性對照、陽性對照各一個。標本的核酸提取同實施例1，SAT擴增檢 測及判定同實施例2，所使用的螢光PCR儀為MX-3005P。結果見附圖1，與金標準培養法檢 測結果完全相同。
權利要求
一種利用RNA恆溫擴增的結核分枝桿菌核酸檢測試劑盒，包括(1)TB稀釋液為含RNase抑制劑的滅菌DEPC水溶液；(2)TB反應液為含dNTPs和NTPs擴增所需組份，具體包含Tris 10～50mM，MgCl210～40mM，dNTP 0.5～5mM，NTP 1～10mM，PVP40 1～10％，KCl 5～40mM；(3)TB檢測液為恆溫擴增時必需的TB引物和TB螢光探針溶解在TE溶液中配製而成，引物探針序列均選自長516bp TB 16S rRNA基因保守區，序列見序列表SEQ.ID.NO14；(4)SAT酶液為恆溫擴增時必需的多酶組分體系，含T7RNA聚合酶200～2000U/反應、M-MLV反轉錄酶400～4000U/反應、2～10mM HEPES pH7.5、10～100mMN-acetyl-L-cysteine、0.04～0.4mM zinc acetate、10～100mM trehalose、40～200mM Tris-HCl pH8.0、40～200mM KCl、1～10mM EDTA、2～20％(v/v)TritonX-100、10～40％(v/v)glycerol；(5)TB陽性對照；為含102～105CFU/ml結核分枝桿菌的菌液；(6)TB陰性對照為不含有SEQ.ID.NO14核酸序列或不含有結核分枝桿菌的的溶液。
2.根據權利要求1所述的結核分枝桿菌核酸檢測試劑盒，其特徵在於所述(1)中的 稀釋液液中RNase抑制劑的濃度為0. 1 1%，其餘成分為滅菌DEPC水。
3.根據權利要求1所述的結核分枝桿菌核酸檢測試劑盒，其特徵在於所述(3)中的 TB檢測液中TB螢光探針為分子信標。
4.根據權利要求3所述的結核分枝桿菌核酸檢測試劑盒，其特徵在於所述的TB檢測 液中的探針包含有以下一種或幾種序列TB Probe 序列見序列表SEQ. ID.N011-13。
5.根據權利要求1所述的結核分枝桿菌核酸檢測試劑盒，其特徵在於所述的TB檢測 液中，至少一條TB引物的5』端帶有T7啟動子序列。
6.根據權利要求5所述的結核分枝桿菌核酸檢測試劑盒，其特徵在於所述的引物序 列含有以下一對或幾對序列TB T7 序列見序列表SEQ. ID. NO 1-5 ；TB nT7 序列見序列表 SEQ. ID. N06-10。
7.根據權利要求1所述的結核分枝桿菌核酸檢測試劑盒，其特徵在於所述的TB陽性 對照和TB臨界弱陽性對照中結核分枝桿菌菌液，製備方法包括下列步驟(1)將H37Ra標準菌株擴大培養；(2)採用細菌計數法對培養的菌液進行計數；(3)將計數的培養物用TB稀釋液稀釋成陽性對照，所含菌液濃度為102 105CFU/ml；(4)TB陽性對照用TB稀釋液稀釋100倍即為TB臨界弱陽性對照，所含菌液濃度為1 103CFU/mlo
全文摘要
本發明涉及一種利用超聲波破碎細菌釋放出靶標RNA及恆溫核酸同步放大檢測技術(SAT)對結核分枝桿菌(TB)進行檢測的試劑盒，包含TB稀釋液、TB反應液、TB檢測液、SAT酶液、TB陽性對照、TB陰性對照。本發明的檢測試劑盒特異性高、靈敏度高，且擴增產物RNA在自然環境下易於降解而汙染低。
文檔編號C12Q1/68GK101886124SQ20101018445
公開日2010年11月17日 申請日期2010年5月25日 優先權日2010年5月25日
發明者於明輝, 居金良, 方亮 申請人:上海仁度生物科技有限公司