一種檢測人類y染色體微缺失的試劑盒的製作方法

2023-10-27 18:26:12

一種檢測人類y染色體微缺失的試劑盒的製作方法
【專利摘要】本發明涉及染色體缺失檢測領域，具體涉及一種檢測人類Y染色體微缺失的試劑盒。本發明確定最優的STS分布及PCR擴增體系，將15個STS分配到4管中設計特定的引物，進行多重PCR擴增，建立了一種符合2013版EAA/EMQN指南要求的Y染色體微缺失檢測測試劑盒，所述試劑盒檢測特異性強、靈敏度高和條帶均一性好。實現一次試驗即可檢測和確證Y染色體的微缺失類型，滿足2013版EAA/EMQN指南的「基本分析」和「拓展分析」要求，可方便快速地為Y染色體微缺失的臨床處理提供科學、全面的依據。
【專利說明】一種檢測人類Y染色體微缺失的試劑盒

【技術領域】
[0001] 本發明涉及染色體缺失檢測領域，具體涉及一種檢測人類Υ染色體微缺失的試劑 盒。

【背景技術】
[0002] 人類Υ染色體長臂上存在與精子生成密切相關的無精子因子（Azoospermia factor，AZF)，無精子因子發生微小的DNA片段缺失稱之為Y染色體微缺失。發生Y染色體 微缺失，會引起精子生成障礙，導致少、弱、畸形精子症甚至無精子症。據WHO統計，男性原 發性無精子症與少精子症患者中約10%?15%存在Y染色體微缺失。在精子生成障礙引 起的男性不育患者中，Y染色微缺失的發生率是居於第二位的遺傳因素。
[0003] 目前，AZF被劃分為3個區，S卩AZFa、AZFb和AZFc，這些區域的任何一個或多個 缺失都將導致精子發生障礙，造成少、弱、畸形精子症甚至無精子症，最終導致不育在AZF 的3個區中，每個區域均有明確的序列標籤位點（Sequence tagged site, STS)可供識 另1J ;每個區域的缺失機理和缺失的斷裂點均已明確。由歐洲男科協會（European Academy of Andrology，EAA)和歐洲分子遺傳質控網（European Molecular Genetics Quality Network, EMQN)聯合發布的1999版和2004版《Y染色體微缺失分子診斷實踐指南》均推 薦使用多重PCR-瓊脂糖凝膠檢測STS的方法來檢測Υ染色體的微缺失。同時，指南推薦每 個區域檢測2個STS，分別為AZFa檢測sY84和sY86, AZFb檢測sY127和sY134, AZFc檢測 sY254和sY255,若每個區域的2個STS發生缺失時，則代表該區域發生缺失；並指出通過以 上6個STS可以檢測出幾乎所有臨床相關的微缺失或95%文獻報導的AZF微缺失，足以滿 足常規診斷。2013年，EAA和EMQN發布新版指南，在上述指南的基礎上提出Y染色體微缺 失檢測的流程圖，並將上述的6個STS的檢測定義為"基礎分析"，若"基礎分析"中，某個區 域的2個STS發生缺失，則必須進行後續的"拓展分析"，選擇該缺失區域的近端和遠端斷裂 點上下遊的STS和Y染色體遠端的異染色質標籤進行檢測確證，判斷是否該區域發生完全 缺失或Y染色體異染色質化。另外，指南明確指出，不推薦檢測獨立的基因特異性缺失來進 行Y染色體微缺失檢測。
[0004] 現有的產品均能檢測指南推薦的6個STS，即：sY84、sY86、sY127、sY134、sY254、 sY255,可以滿足2013版EAA/EMQN指南"基本分析"的需求，但均不能滿足2013版EAA/EMQN 指南的"拓展分析"需求。有些產品（如北京閱微、Promega)還含有2013版EAA/EMQN指南 不推薦檢測的STS或獨立的基因。因此，根據2013版EAA/EMQN指南的檢測流程圖，這些產 品的檢測結果是不足以出具報告指導臨床或進行遺傳諮詢的。
[0005] 另外，現有產品採用的技術平臺也具有局限性。
[0006] 1)多重PCR-瓊脂糖凝膠電泳。首先，瓊脂糖凝膠電泳的檢測方法，檢測靈敏度低， 產物量（上樣量）較少時條帶不易判別，難以區分弱陽性與陰性，容易造成假陽性或假陰 性；其次，該方法的解析度低，擴增片段之間必須達到30bp以上，才能較好區分。再者，瓊脂 糖凝膠電泳從制膠、上樣到信號讀取，均需人工操作，工作量大。
[0007] 2)多重實時螢光PCR。該方法雖然具有簡便、快速的優勢，但需要設計特異性的檢 測探針並進行報告基團的修飾，難度較大且價格昂貴。
[0008] 3)其他平臺，如北京閱微（CN 102912028A)採用測序儀進行檢測，北京海斯特（CN 103571957A)採用DHPLC進行檢測。測序儀和HPLC價格昂貴，儀器操作和結果判讀專業性 要求高，不利於推廣。


【發明內容】

[0009] 本發明所要解決的技術問題是：提供一種檢測人類Y染色體微缺失的試劑盒，在 一次試驗中同時滿足"基本分析"和"拓展分析"的要求，且方便、快速、結果可靠，有效地減 少操作人員的工作量，降低檢測成本。
[0010]為了解決上述技術問題，本發明採用的技術方案為：提供一種檢測人類Y染色體 微缺失的試劑盒，包括PCR反應液I、PCR反應液II、PCR反應液III和PCR反應液IV ;
[0011] 所述PCR反應液I包括：特異性擴增ZFX/Y位點的引物，特異性擴增Y染色體 sY254位點、sY105位點、SY1192位點、sY88位點的引物；
[0012] 所述ZFX/Y位點的序列如：SEQ ID N0 :1 ;
[0013] 所述sY254位點的序列如：SEQ ID NO :2 ;
[0014] 所述sY105位點的序列如：SEQ ID NO :3 ;
[0015] 所述sY1192位點的序列如：SEQ ID NO :4 ;
[0016] 所述sY88位點的序列如：SEQ ID NO :5 ;
[0017] 所述PCR反應液II包括：特異性擴增ZFX/Y位點的引物，特異性擴增Y染色體sY84 位點、sY127位點、sY1065位點、sY153位點的引物；
[0018] 所述sY84位點的序列如：SEQ ID N0 :6 ;
[0019] 所述sY127位點的序列如：SEQ ID NO :7 ;
[0020] 所述sY1065位點位點的序列如：SEQ ID NO :8 ;
[0021] 所述sY153位點的序列如：SEQ ID NO :9 ;
[0022] 所述PCR反應液III包括：特異性擴增ZFX/Y位點的引物，特異性擴增Y染色體sY86 位點、sY160位點、sY121位點、sY255位點的引物；
[0023] 所述sY86位點的序列如：SEQ ID N0 :10 ;
[0024] 所述sY160位點的序列如：SEQ ID NO :11 ;
[0025] 所述sY121位點的序列如：SEQ ID NO :12 ;
[0026] 所述sY255位點的序列如：SEQ ID NO :13 ;
[0027] 所述PCR反應液IV包括：特異性擴增ZFX/Y位點的引物，特異性擴增Y染色體SRY 位點、sY254位點、sY82位點、sY1064位點的引物。
[0028] 所述SRY位點的序列如：SEQ ID N0 :14 ;
[0029] 所述sY254位點的序列如：SEQ ID NO :15 ;
[0030] 所述sY82位點的序列如：SEQ ID NO :16 ;
[0031] 所述sY1064位點的序列如：SEQ ID NO :17。
[0032] 本發明有益效果：目前，現有的Y染色體微缺失檢測均只能滿足2013版EAA/EMQN 指南的"基本分析"的要求，不能滿足2013版EAA/EMQN指南Y染色體微缺失檢測流程圖及 "拓展分析"的要求，檢測結果不夠科學全面，有些產品甚至還可檢測2013版EAA/EMQN指南 不推薦使用的STS或基因，使檢測結果的臨床解釋複雜化，不利於對臨床的指導。
[0033] 本發明在每個AZF微缺失區段除了選擇"基本分析"的STS外，還在區段斷裂點的 上下遊選擇就近的STS用於"擴展分析"，本發明確定最優的STS分布及PCR擴增體系，將 15個STS分配到4管中進行多重PCR擴增，建立了一種符合2013版EAA/EMQN指南要求的 Y染色體微缺失檢測方法，並開發相應的檢測試劑盒，所述試劑盒檢測特異性強、靈敏度高 和條帶均一性好。實現一次試驗即可檢測和確證Y染色體的微缺失類型，滿足2013版EAA/ EMQN指南的"基本分析"和"拓展分析"要求，可方便快速地為Y染色體微缺失的臨床處理 提供科學、全面的依據。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0034] 圖1為本發明試劑盒的正常男性DNA樣本檢測圖；
[0035] 圖2為本發明試劑盒的人類Y染色體微缺失AZFc區缺失樣本檢測圖。

【具體實施方式】
[0036] 為詳細說明本發明的技術內容、構造特徵、所實現目的及效果，以下結合實施方式 並配合附圖詳予說明。
[0037] 本發明最關鍵的構思在於：本發明每個AZF微缺失區段除了選擇"基本分析"的 STS外，還在區段斷裂點的上下遊選擇就近的STS用於"擴展分析"，選擇15個擴增片段的 長度不同的STS區段，確定最優的STS分布及PCR擴增體系，將15個STS分配到4管中進 行多重PCR擴增。
[0038] 實施例1
[0039] 1、技術基礎
[0040] 1. 1利用已知的Y染色體微缺失及STS的研究成果進行多重PCR反應液的設計和 實施。
[0041] 其主要研究內容包括：根據2013版EAA/EMQN指南的要求和推薦的STS，選擇AZF 微缺失各區域的STS ;根據所選的各STS的擴增片段長度和區域分布設計4管STS PCR擴 增組合；每管STS擴增組合用相應的STS擴增引物進行多重PCR擴增，特異性地獲得各STS 的目標片段。每管STS擴增組合均用人類鋅指蛋白基因 ZFX/Y作為實驗內控，第IV管STS 擴增組合擴增雄性性別決定基因（Sex-determine Region of Y一Chromosome，SRY)作為性 別異常對照。
[0042] 1. 2利用毛細管電泳儀進行多重PCR擴增產物的檢測
[0043] 毛細管電泳（capillary electrophoresis, CE)，是一類以毛細管為分離通道、以 高壓直流電場為驅動力的新型液相分離技術。與傳統的電泳方法相比，毛細管可實現高效、 快速、微量和自動化檢測。
[0044] 將多重PCR擴增獲得的4管STS擴增產物置於毛細管電泳儀（YN seplOO)中，設定 電泳程序，毛細管電泳儀將自動進行上樣、電泳分離和結果記錄，無需人員值守，快速方便。
[0045] 2、具體技術實施方案
[0046] 2. 1STS的選擇及其引物的驗證
[0047] 根據2013版EAA/EMQN指南的要求，每個AZF微缺失區段除了選擇"基本分析"的 STS外，還需在區段斷裂點的上下遊選擇就近的STS用於"擴展分析"，已確證各區段是否發 生區段完整缺失。根據2013版EAA/EMQN指南的推薦，本發明選擇的STS見表1。
[0048] 表1本發明選擇的各區段檢測STS
[0049]

【權利要求】
1. 一種檢測人類Y染色體微缺失的試劑盒，其特徵在於，包括PCR反應液I、PCR反應 液II、PCR反應液III和PCR反應液IV ; 所述PCR反應液I包括：特異性擴增ZFX/Y位點的引物，特異性擴增Y染色體sY254位 點、sY105位點、SY1192位點、sY88位點的引物； 所述ZFX/Y位點的序列如：SEQ ID NO :1 ; 所述sY254位點的序列如：SEQ ID NO :2 ; 所述sY105位點的序列如：SEQ ID NO :3 ; 所述sY1192位點的序列如：SEQ ID NO :4 ; 所述sY88位點的序列如：SEQ ID NO :5 ; 所述PCR反應液II包括：特異性擴增ZFX/Y位點的引物，特異性擴增Y染色體sY84位 點、sY127位點、SY1065位點、sY153位點的引物； 所述sY84位點的序列如：SEQ ID NO :6 ; 所述sY127位點的序列如：SEQ ID NO :7 ; 所述sY1065位點位點的序列如：SEQ ID NO :8 ; 所述sY153位點的序列如：SEQ ID NO :9 ; 所述PCR反應液III包括：特異性擴增ZFX/Y位點的引物，特異性擴增Y染色體sY86位 點、sY160位點、sY121位點、sY255位點的引物； 所述sY86位點的序列如：SEQ ID NO :10 ; 所述sY160位點的序列如：SEQ ID NO :11 ; 所述sY121位點的序列如：SEQ ID NO :12 ; 所述sY255位點的序列如：SEQ ID NO :13 ; 所述PCR反應液IV包括：特異性擴增ZFX/Y位點的引物，特異性擴增Y染色體SRY位 點、sY254位點、sY82位點、SY1064位點的引物； 所述SRY位點的序列如：SEQ ID NO :14 ; 所述sY254位點的序列如：SEQ ID NO :15 ; 所述sY82位點的序列如：SEQ ID NO :16 ; 所述sY1064位點的序列如：SEQ ID N0:17。
2. 根據權利要求1所述檢測人類Y染色體微缺失的試劑盒，其特徵在於， 所述PCR反應液I包括： 特異性擴增ZFX的引物，序列如：SEQ ID NO :18和SEQ ID NO :19所示； 特異性擴增ZFY的引物，序列如：SEQ ID NO :20和SEQ ID NO :21所示； 特異性擴增Y染色體sY254位點的引物，序列如：SEQ ID N0:22和SEQ ID N0:23所 示； 特異性擴增Y染色體sY105位點的引物，序列如：SEQ ID NO :24和SEQ ID NO :25所 示； 特異性擴增Y染色體sY1192位點的引物，序列如：SEQ ID NO :26和SEQ ID NO :27所 示； 特異性擴增Y染色體sY88位點的引物，序列如：SEQ ID NO :28和SEQ ID NO :29所示； 所述PCR反應液II包括： 特異性擴增ZFX的引物，序列如：SEQ ID NO :18和SEQ ID NO :19所示； 特異性擴增ZFY的引物，序列如：SEQ ID NO :20和SEQ ID NO :21所示； 特異性擴增Y染色體sY84位點的引物，序列如：SEQ ID NO :30和SEQ ID NO :31所示； 特異性擴增Y染色體sY127位點的引物，序列如：SEQ ID NO :32和SEQ ID NO :33所 示； 特異性擴增Y染色體sY1065位點的引物，序列如：SEQ ID NO :34和SEQ ID NO :35所 示； 特異性擴增Y染色體sY153位點的引物，序列如：SEQ ID NO :36和SEQ ID NO :37所 示； 所述PCR反應液III包括： 特異性擴增ZFX的引物，序列如：SEQ ID NO :18和SEQ ID NO :19所示； 特異性擴增ZFY的引物，序列如：SEQ ID NO :20和SEQ ID NO :21所示； 特異性擴增Y染色體sY86位點的引物，序列如：SEQ ID NO :38和SEQ ID NO :39所示； 特異性擴增Y染色體sY160位點的引物，序列如：SEQ ID NO :40和SEQ ID NO :41所 示； 特異性擴增Y染色體sY121位點的引物，序列如：SEQ ID NO :42和SEQ ID NO :43所 示； 特異性擴增Y染色體sY255位點的引物，序列如：SEQ ID NO :44和SEQ ID NO :45所 示； 所述PCR反應液IV包括： 特異性擴增ZFX的引物，序列如：SEQ ID NO :18和SEQ ID NO :19所示； 特異性擴增ZFY的引物，序列如：SEQ ID NO :20和SEQ ID NO :21所示； 特異性擴增Y染色體短臂SRY位點的引物，序列如：SEQ ID NO :46和SEQ ID NO :47所 示； 特異性擴增Y染色體sY254位點的引物，序列如：SEQ ID NO :48和SEQ ID NO :49所 示； 特異性擴增Y染色體sY82位點的引物，序列如：SEQ ID NO :50和SEQ ID NO :51所示； 特異性擴增Y染色體sY1064位點的引物，序列如：SEQ ID NO :52和SEQ ID NO :53所 /_J、1 o
3. 根據權利要求1所述的檢測人類Y染色體微缺失的試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒 的每個PCR反應液還分別包括：10XPCR Buffer，5XQ Solution，25mM MgCl2,25mM dNUTP， lOOmM dUTP，lU/yL UNG 酶，HotStart Taq 和 250XM 染料。
4. 根據權利要求3所述的檢測人類Y染色體微缺失的試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒 的每個PCR反應液中每條引物的起始濃度為100 μ Μ。
【文檔編號】C12Q1/68GK104152573SQ201410425722
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年8月26日 優先權日:2014年8月26日
【發明者】林斯裡, 滕樂, 田潔 申請人:亞能生物技術（深圳）有限公司