檢測靶dna序列的方法和採用該方法的基因晶片及應用的製作方法
2023-10-27 18:13:07 1
專利名稱：檢測靶dna序列的方法和採用該方法的基因晶片及應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種基因序列的分子生物學檢測方法，以及利用該方法進行基因序 列檢測的基因晶片，以及該方法的應用。
背景技術：
目前對遺傳背景相關基因(致病基因、腫瘤異常基因)；細菌、病毒、轉基因動 植物的轉基因成分的檢測主要通過設計引物並對相應的DNA片段進行PCR擴增，然後通 過後續的檢測平臺來實現檢測的目的。通過PCR擴增進行檢測，容易導致假陰性(PCR 擴增失敗)或假陽性(PCR擴增汙染)等結果，從而影響基因序列檢測的正確性和效率。 另外，PCR擴增所需要的靶基因的量較大，在樣品稀少的情況下，較難滿足檢測需求。
發明內容
本發明的目的是提供一種無需PCR擴增，能對靶基因進行直接檢測，避免假陽 性和假陰性結果出現的檢測靶DNA序列的方法；另外提供了一種是用該方法的進行靶 DNA序列檢測的基因晶片；以及該方法的應用。為實現上述目的，本發明檢測靶DNA序列的方法包括如下步驟，步驟1 將RNA探針與靶DNA接觸並退火，所述的RNA探針的一端固定在基 片上，RNA探針包括靠近固定端的檢測序列和靠近游離端的記號序列，所述的靶DNA具 有與RNA探針中檢測序列互補的區段；步驟2 用核糖核酸酶水解退火後形成的DNA:RNA異源雙鏈中RNA部分，釋 放出靶DNA和該RNA探針中的記號序列；步驟3:洗滌除去游離的靶DNA、記號序列和核糖核酸酶，用帶標記的記號 DNA結合檢測序列未被水解的固定在基片上的RNA探針，所述的記號DNA與RNA探針 的記號序列互補，從而對靶DNA進行序列分析。其中，步驟2中的核糖核酸酶為核糖核酸酶H;記號DNA上的標記為生物素標 記、螢光標記或同位素標記。本發明所述的靶DNA為單鏈DNA或雙鏈DNA，所述的雙鏈DNA在步驟1退 火前變性形成單鏈DNA，靶DNA上與RNA探針中檢測序列互補的序列可以僅是靶DNA 上的一個片段。本發明步驟2中釋放出的靶DNA與該體系中其他RNA探針上互補的檢測序列再 次退火結合，形成DNA:RNA異源雙鏈，循環往復步驟2的過程直至體系中所有的含互補 檢測序列的RNA探針均被水解。一種基因晶片，RNA探針1的一端固定在晶片載體上，RNA探針包括靠近晶片 載體固定端的檢測序列和靠近游離端的記號序列，晶片載體上設置陣列式樣點，RNA探 針根據檢測序列的不同固定於不同的樣點內。使用時，向各個樣點內加入樣品DNA，按本發明所述的方法進行操作後，檢測
3各個樣點內標記，樣品DNA含有與晶片上未檢測到標記的樣點內RNA探針的檢測序列互 補的序列。本發明所述的樣品DNA —般為用戶送檢的未知樣品，其中可能含有與RNA探針 中檢測序列互補的靶DNA序列，也可能是不含有靶DNA序列的未知DNA序列。採用本發明所述的方法可用於檢測遺傳遺傳背景相關基因(致病基因、腫瘤異 常基因)。採用本發明所述的方法可用於檢測細菌或病毒的基因。採用本發明所述的方法可用於檢測轉基因動植物的轉基因成分。使用本發明的檢測方法對靶DNA進行檢測，無需對靶基因進行PCR擴增，直接 對靶DNA進行檢測，從而避免了 PCR檢測中出現的假陰性和假陽性結果，提高了檢測正 確率，同時極大的減少了實驗室由於PCR擴增及後續檢測所導致的核酸汙染；另外，該 檢測方法僅需極少量的靶DNA分子就可以實現檢測目的。
圖1為本發明檢測靶DNA序列的方法的示意圖；圖2為本發明檢測樣品DNA基因晶片的結果檢測示意圖。
具體實施例方式下面對本發明中出現的部分術語進行進一步解釋，本文中術語「核糖核酸酶H」也稱為RNase H，指的是一種核糖核酸內切酶， 特異性水解DNA:RNA雜交鏈上RNA鏈的磷酸二酯鍵，產生5'核苷酸，該酶對單鏈的 核酸(單鏈DNA或單鏈RNA)、雙鏈DNA或雙鏈RNA沒有作用。本文中術語「退火」指的是兩條單鏈多核苷酸通過互補鹼基之間的氫鍵形成雙 鏈分子的過程。可發生核酸鏈之間，可以形成雙鏈DNA分子、雙鏈RNA或DNA-RNA 雜交分子。本文中術語「變性」指的是核酸分子由穩定的雙螺旋結構松解為無規則線性結 構的現象。變性時維持雙螺旋穩定性的氫鍵斷裂，鹼基間的堆積力遭到破壞，但不涉及 到其一級結構的改變。為詳細說明本發明的技術內容、構造特徵、所實現目的及效果，以下結合實施 方式並配合附圖詳予說明。如圖1所示，本發明的檢測靶DNA序列的方法包括如下步驟，步驟1 將RNA探針1與靶DNA2接觸並退火，所述的RNA探針1的一端固定 在基片上，RNA探針1包括靠近固定端的檢測序列11和靠近游離端的記號序列12，所述 的靶DNA2具有與RNA探針1中檢測序列11互補的區段；步驟2 用核糖核酸酶3水解退火後形成的DNA:RNA異源雙鏈4中RNA部分， 釋放出靶DNA2和該RNA探針1中的記號序列12 ；步驟3 洗滌除去游離的靶DNA2、記號序列12和核糖核酸酶3，用帶標記的記 號DNA5結合檢測序列11未被水解的固定在基片上的RNA探針1，所述的記號DNA5與 RNA探針1的記號序列12互補，從而對靶DNA2進行序列分析。
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其中，步驟2中的核糖核酸酶3為核糖核酸酶H;記號DNA5上的標記為生物素 標記、螢光標記或同位素標記，或者其他任何現有可行的標記方式。本發明所述的靶DNA2為單鏈DNA或雙鏈DNA，所述的雙鏈DNA在步驟1退 火前變性形成單鏈DNA。本發明步驟2中釋放出的靶DNA2與該體系中其他RNA探針1上互補的檢測序 列11再次退火結合，形成DNA:RNA異源雙鏈4，循環往復步驟2的過程直至體系中所有 的含互補檢測序列11的RNA探針1均被水解。如圖2所示，採用本發明所述的方法檢測樣品DNA的基因晶片，RNA探針1的 一端固定在晶片載體6上，RNA探針1包括靠近晶片載體6固定端的檢測序列11和靠近 游離端的記號序列12。晶片載體6上設置陣列式樣點61，RNA探針1根據檢測序列11 的不同固定於不同的樣點61內。使用時，向各個樣點61內加入樣品DNA，按本發明所述的方法進行操作後，檢 測各個樣點61內標記，樣品DNA含有與晶片上未檢測到標記的樣點61內RNA探針1的 檢測序列11互補的序列。該基因晶片的具體檢測步驟及原理如下當固定了 RNA探針的晶片樣點內加入樣品DNA和核糖核酸酶H的混合液反應， 靶DNA片段將與RNA探針的檢測序列結合，這時，核糖核酸酶H將特異性識別所形成 的DNA:RNA異源雙鏈部分並選擇性的水解該異源雙鏈的RNA鏈部分。隨後靶DNA片 段和RNA探針記號序列釋放，靶DNA片段繼續與晶片樣點內的其他RNA探針檢測序列 結合，這時，核糖核酸酶H將再次特異性識別所形成的DNA:RNA異源雙鏈部分並選擇性 的水解該異源雙鏈的RNA鏈部分。這一 「靶DNA片段結合-酶水解-靶DNA片段和 RNA探針記號序列釋放」的過程將持續進行，直到所有含有與靶DNA互補的檢測基因 的RNA探針分子被水解。隨後，洗滌去除游離的靶DNA、記號序列和核糖核酸酶。然 後，加入記號DNA，記號DNA將與留在晶片上的RNA探針的記號序列特異性結合。記 號DNA進行了生物素標記、或螢光標記、或同位素標記、或者其他任何可行的標記，通 過對記號DNA進行檢測，即能實現靶DNA序列的分析。不含有與靶DNA互補的檢測 序列的RNA探針不能被降解，保留在晶片表面，能被檢測到；而含有與靶DNA互補的 檢測序列的RNA探針的檢測序列與靶DNA特異結合，形成了 DNA:RNA異源雙鏈，被核 糖核酸酶特異性降解，其上的記號序列游離出來後被洗滌去除，因此無法被檢測到。這 樣就可以判斷樣品DNA含有與晶片上未檢測到標記的樣點內RNA探針的檢測序列互補的 序列。採用本發明所述的方法可以用於檢測遺傳背景相關基因，如致病基因、腫瘤異 常基因。採用本發明所述的方法可以用於檢測細菌或病毒的基因。採用本發明所述的方法可以用於檢測轉基因動植物的轉基因成分。以上所述僅為本發明的實施例，並非因此限制本發明的專利範圍，凡是利用本 發明說明書及附圖內容所作的等效結構或等效流程變換，或直接或間接運用在其他相關 的技術領域，均同理包括在本發明的專利保護範圍內。實施例1
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本實施例使用本發明的基因晶片對志賀氏菌進行檢測，其中靶DNA來自志賀氏菌基因組，為雙鏈DNA，由SEQ ID NO 1構成；RNA探針由人工合成，由SEQ ID NO 2構成，SEQ ID NO 2的1-22位所 示的序列為檢測序列，23-42位所示的序列為記號序列；RNA探針的檢測序列與SEQ ID NO 1的478-499位所示的序列相同，與該序列的互補鏈互補；記號DNA由人工合成，由SEQ ID NO 3構成，其中5，端進行了生物素標 記；具體實驗方法如下1、基因組DNA提取；取1.5ml培養物轉入離心管中，12,000 Xg離心3min ；棄上清液，將細菌沉澱物懸浮於100 μ L ddH20，用渦旋混合器充分混勻；用漂子架住離心管，置於沸水浴中，IOmin ；取出後立刻離心lOmin，上清液即為所製備的基因組DNA溶液。2、基因晶片法檢測試劑包被液0.05mol/L磷酸氫二鈉溶液(pH8.5)；封閉液3%牛血清白蛋白或 0.5%酪蛋白溶液洗滌液PBST ；終止液2MH2S04步驟用經包被液稀釋的RNA探針(Ο.ΙμΜ)ΙΟΟμ 包被核酸結合板，4°C 過夜。次日，用封閉液200yL於37°C封閉60min。用洗滌液洗滌3次，備用。在 封閉液洗滌後的包被板上每孔加入樣品DNA和核糖核酸酶H的混合液25 μ L(DNA量 10-1000拷貝；核糖核酸酶總量5U)，再加入雜交液lOOyL。混勻後，37°C反應60min， 用洗滌液洗滌5次(去除游離的靶DNA、記號序列和核糖核酸酶)；每孔中加入記號 DNA(0.01yM)100uL,混勻後，37°C反應60min，用洗滌液洗滌5次(去除游離的記號 DNA)。每孔中加入鏈親和素標記的辣根過氧化物酶100 μ L，37°C反應30min，用洗滌 液洗滌5次。每孔加入顯色液100 μ L，37°C顯色IOmin ；每孔加入終止液100 μ L終止 反應。以630nm為參考波長，于波長492nm處測定吸光度。其中，各孔加入如下樣品陰性對照樣品ddH20 ；陽性對照樣品陽性對照樣品為一段合成的寡核苷酸DNA序列，該序列與RNA 探針的檢測序列互補，此實施例中該陽性對照序列為SEQID NO: 4。該陽性對照濃度為 0.01 μ M，每孔加入lyL，另外加入核糖核酸酶H，總體積為25 μ L。樣品1含有10拷貝的靶DNA ；樣品2含有100拷貝的靶DNA ；樣品3含有1000 拷貝的靶DNA;檢測結果扣除值為陰性對照的吸光度值減少0.2。陰性對照吸光度值應不低於1.5。陽性對照應為陽性，且吸光度值應不高於0.2，如小於0.05按0.05計。點樣孔(列)123平均陰性對照樣品2.3172.4092.4152.380樣品1(10拷貝)0.7350.7930.8120.780樣品2(100拷貝)0.6930.7170.6590.670樣品3(1000拷貝)0.6270.6510.6900.658陽性對照樣品0.0560.0690.0530.059說明本發明的方法及採用該方法的基因晶片能夠快速，靈敏的檢測出樣品中是 否含有靶DNA並反映出其含量的多寡。其可用於檢測細菌或病毒的基因。實施例2 本實施例使用本發明的基因晶片對轉基因玉米Btll的轉基因成分CrylA(b)的 DNA進行檢測，其中靶DNA來自轉基因玉米Btl 1，為雙鏈DNA，由SEQ IDNO 5構成；RNA探針由人工合成，由SEQ ID NO 6構成，SEQ ID NO 6的1-21位所 示的序列為檢測序列，22-41位所示的序列為記號序列；RNA探針的檢測序列與SEQ ID NO 1的214-234位所示的序列相同，與該序列的互補鏈互補；記號DNA由人工合成，由SEQ ID NO: 7構成，其中5，端進行了生物素標 記；具體實驗方法如下1、基因組 DNA 提取(提取液成分Tris-HCl pH7.5, 150mM ； NaCl IOOmM ； EDTApH8.0, 15mM ； CTAB 1.5% ； β-ME 1.5% (使用前加))。稱取一定量的玉米葉，液氮研成細末，每克材料加95°C預熱的CTAB提取液 2mL和5yL β-巰基乙醇，快速攪拌均勻後，65°C水浴60_90min。加入等體積氯仿。 輕微轉動半小時直至分層。室溫800rpm，離心lOmin，上清液加2/3體積異丙醇沉澱 DNA。粗DNA經TE溶解，RNA酶消化RNA，酚/氯仿、氯仿純化，最後乙醇析出 DNA。2、基因晶片法檢測試劑包被液0.05mol/L磷酸氫二鈉溶液(pH8.5)；封閉液3%牛血清白蛋白或 0.5%酪蛋白溶液洗滌液PBST ；終止液2MH2S04步驟用經包被液稀釋的RNA探針(Ο.ΙμΜ)ΙΟΟμ 包被核酸結合板，4°C 過夜。次日，用封閉液200yL於37°C封閉60min。用洗滌液洗滌3次，備用。在 封閉液洗滌後的包被板上每孔加入樣品DNA和核糖核酸酶H的混合液25 μ L(DNA量 10-1000拷貝；核糖核酸酶總量5U)，再加入雜交液lOOyL。混勻後，37°C反應60min， 用洗滌液洗滌5次(去除游離的靶DNA、記號序列和核糖核酸酶)；每孔中加入記號
7DNA(0.01yM)100uL,混勻後，37°C反應60min，用洗滌液洗滌5次(去除游離的記號 DNA)。每孔中加入鏈親和素標記的辣根過氧化物酶100 μ L，37°C反應30min，用洗滌 液洗滌5次。每孔加入顯色液100 μ L，37°C顯色IOmin ；每孔加入終止液100 μ L終止 反應。以630nm為參考波長，于波長492nm處測定吸光度。其中，各孔加入如下樣品陰性對照樣品ddH20 ；陽性對照樣品陽性對照樣品為一段合成的寡核苷酸DNA序列，該序列與RNA 探針的檢測序列互補，此實施例中該陽性對照序列為SEQID NO: 8。該陽性對照濃度為 0.01 μ M，每孔加入lyL，另外加入核糖核酸酶H，總體積為25 μ L。樣品1含有10拷貝的靶DNA ；樣品2含有100拷貝的靶DNA ；樣品3含有1000 拷貝的靶DNA;檢測結果扣除值為陰性對照的吸光度值減少0.2。陰性對照吸光度值應不低於1.5。陽性對照應為陽性，且吸光度值應不高於0.2，如小於0.05按0.05計。
權利要求
1.檢測靶DNA序列的方法，其特徵在於其包括如下步驟，步驟1:將RNA探針與靶DNA接觸並退火，所述的RNA探針的一端固定在基片 上，RNA探針包括靠近固定端的檢測序列和靠近游離端的記號序列，所述的靶DNA具有 與RNA探針中檢測序列互補的區段；步驟2:用核糖核酸酶水解退火後形成的DNA:RNA異源雙鏈中RNA部分，釋放出 靶DNA和該RNA探針中的記號序列；步驟3:洗滌除去游離的靶DNA、記號序列和核糖核酸酶，用記號DNA結合檢測 序列未被水解的固定在基片上的RNA探針，所述的記號DNA與RNA探針的記號序列互 補，從而對靶DNA進行序列分析。
2.根據權利要求1所述的檢測靶DNA序列的方法，其特徵在於步驟2中的核糖核 酸酶為核糖核酸酶H。
3.根據權利要求1所述的檢測靶DNA序列的方法，其特徵在於步驟2中的記號 DNA上帶有標記。
4.根據權利要求3所述的檢測靶DNA序列的方法，其特徵在於步驟2中的記號 DNA上的標記為生物素標記、螢光標記或同位素標記。
5.根據權利要求1所述的檢測靶DNA序列的方法，其特徵在於所述的靶DNA為 單鏈DNA或雙鏈DNA，所述的雙鏈DNA在步驟1退火前變性形成單鏈DNA。
6.根據權利要求1至5中任意一種所述的檢測靶DNA序列的方法，其特徵在於所 述的步驟2中釋放出的靶DNA與該體系中其他RNA探針上互補的檢測序列再次退火結 合，形成DNA:RNA異源雙鏈，循環往復步驟2的過程直至體系中所有的含互補檢測序列 的RNA探針均被水解。
7.—種基因晶片，其特徵在於，所述的RNA探針的一端固定在晶片載體上，RNA探 針包括靠近晶片載體固定端的檢測序列和靠近游離端的記號序列。
8.根據權利要求7所述的基因晶片，其特徵在於所述的晶片載體上設置陣列式樣 點，RNA探針根據檢測序列的不同固定於不同的樣點內。
9.根據權利要求8所述的基因晶片，其特徵在於向各個樣點內加入樣品DNA，按 權利要求1至6中任意一種所述的方法進行操作後，檢測各個樣點內標記，樣品DNA含 有與晶片上未檢測到標記的樣點內RNA探針的檢測序列互補的序列。
10.權利要求1至6中任意一項所述的檢測靶DNA序列的方法的應用，其特徵在於 該方法用於檢測遺傳背景相關基因或者用於檢測細菌或病毒的基因或者用於檢測轉基因 動植物的轉基因成分。
全文摘要
本發明公開了一種檢測靶DNA序列的方法，其包括如下步驟，步驟1將RNA探針與靶DNA接觸並退火，所述的RNA探針的一端固定在基片上，RNA探針包括靠近固定端的檢測序列和靠近游離端的記號序列，所述的靶DNA具有與RNA探針中檢測序列互補的區段；步驟2用核糖核酸酶水解退火後形成的DNA:RNA異源雙鏈中RNA部分，釋放出靶DNA和該RNA探針中的記號序列；步驟3洗滌除去游離的靶DNA和記號序列，用帶標記的記號DNA結合檢測序列未被水解的固定在基片上的RNA探針，所述的記號DNA與RNA探針的記號序列互補，從而對靶DNA進行序列分析。使用該方法對靶DNA進行檢測，無需對靶基因進行PCR擴增，直接對靶DNA進行檢測，從而避免了採用PCR擴增檢測的假陰性和假陽性結果，提高了檢測正確率。
文檔編號C12Q1/68GK102010911SQ201010563900
公開日2011年4月13日 申請日期2010年11月29日 優先權日2010年11月29日
發明者張偉紅, 張國寧, 張珮穎, 朱中偉, 楊祥, 柴寶玲, 歐陽輝, 汪朝暉, 胡春凌 申請人:深圳博睿祥暉生物技術有限公司