一種蘇雲金芽孢桿菌及其應用的製作方法

2023-10-28 03:08:37

本申請涉及蘇雲金芽孢桿菌，其對植物的真菌病害具有預防和/或減輕的效果。

背景技術：

蘇雲金芽孢桿菌(bacillusthuringiensis,bt)是一種廣泛分布於自然界的革蘭氏陽性菌。現有技術中對其的研究主要集中在殺蟲功能上。

然而，蘇雲金芽孢桿菌對微生物，例如真菌或細菌的抑菌報導較少；通過其誘導植物產生抗病性的報導也鮮見。

技術實現要素：

申請人在篩選細菌殺蟲功能的情況下，意外的發現了一株能夠高效誘導植物產生抗病性的新菌株，該菌株被定名為ippbiotsr045。經過常規的形態學鑑定以及多位點序列分型和進一步的系統發育分析，確定該菌株在分類學上屬於蘇雲金芽孢桿菌(bacillusthuringiensis)。

由於蘇雲金芽孢桿菌對人畜安全無毒、對環境友好等優點，其為生物預防和/或減輕植物病害的發生提供了一種有效的方法。本申請的蘇雲金芽孢桿菌菌株ippbiotsr045應用於生產，可以達到成本低、有效預防和/或減輕植物病害的目的。同時，由於ippbiotsr045為野生菌株，相比於工程菌株，其作為藥劑開發省去了環境安全性評價等環節，因此，較通過工程菌和/或轉基因植物來預防和/或減輕植物病害具有不言而喻的優勢。雖然本申請的野生菌株ippbiotsr045並不在於否定工程菌菌株的可應用性，然而在轉基因倍受部分群體質疑的當下，野生菌更容易獲得公眾在安全性方面的認可，因而作為野生型菌株的ippbiotsr045在這方面具有獨特的優勢。

因此，本申請之一提供了一種蘇雲金芽孢桿菌(bacillusthuringiensis)，該菌株被定名為ippbiotsr045，該菌株保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為cgmccno.13302。

對ippbiotsr045遺傳改良後得到的工程菌可以賦予其更優和/或更多的性能，例如可以結合菌株自身的特性，根據實際應用增加和/或拓寬其誘導植物的抗病性能，使其兼具抗菌的性能，使其具有殺蟲和/或抗蟲的性能。即通過對ippbiotsr045遺傳改良，使其兼具如上性能中的至少一種。由於該工程菌株以蘇雲金芽孢桿菌ippbiotsr045為改造對象(即)，向其中轉入和/或敲除特定的基因和/或序列等，因此，該菌株仍然為蘇雲金芽孢桿菌。因此，本申請之二提供了一種對本申請之一所述的蘇雲金芽孢桿菌進行遺傳改良後得到的工程菌。如上所述，雖然轉基因倍受部分群體質疑，然而將蘇雲金芽孢桿菌進行遺傳改良後得到的工程菌並不直接供人類或動物食用。而且在將其投放市場進行商業化之前，需要首先通過國家有關部門的安全性評價，以避免產生安全性問題。根據工程菌的安全性結論以及國家有關部門的批准，然後對其合理使用。

本申請之三提供了一種組合物，所述組合物包含如本申請之一所述的蘇雲金芽孢桿菌和/或如本申請之二所述的工程菌。

在一個具體實施方式中，所述組合物可以為固態形式，也可以為液態形式。所述組合物還可以包含與本申請的蘇雲金芽孢桿菌具有增效作用的其他物質。例如該物質可以是微生物來源誘導植物能夠產生抗病的物質，也可以是誘導植物能夠產生抗病的化合物，還可以是誘導植物能夠產生抗病的其他微生物等等；再如該物質可以是微生物來源抑菌物質，也可以是抑菌化合物，還可以是具有抑菌作用的其他微生物等等。所述組合物進一步可以包括與本申請的蘇雲金芽孢桿菌相配合的輔劑、增稠劑、分散劑和/或能使所述芽孢桿菌增殖的營養組分，例如所述輔劑可以選自棉子油、蓖麻油、桐油、液體石蠟、豆油、a1、a2、鄰苯二甲酸二甲酯、鄰苯二甲酸二丁酯等中的至少一種；增稠劑有膨潤土、硬脂酸鋁、qh凝膠、龍膠粉、f1、黃原膠等中的至少一種：分散劑有拉開粉、nno、lfs、b1、碳黑等中的至少一種。

本申請之四提供了一種農藥製劑，所述農藥製劑包含如本申請之一所述的蘇雲金芽孢桿菌、本申請之二所述的工程菌和本申請之三所述的組合物中的至少一種。在一個具體實施方式中，所述農藥製劑可以為固態形式，也可以為液態形式。所述農藥製劑還可以包含與本申請的蘇雲金芽孢桿菌具有增效作用的其他物質。例如該物質可以是微生物來源誘導植物能夠產生抗病的物質，也可以是誘導植物能夠產生抗病的化合物，還可以是誘導植物能夠產生抗病的其他微生物等等；再如該物質可以是微生物來源抑菌物質，也可以是抑菌化合物，還可以是具有抑菌作用的其他微生物等等。所述農藥製劑進一步可以包括與本申請的蘇雲金芽孢桿菌相配合的輔劑、增稠劑和分散劑中的至少一種，例如所述輔劑可以選自棉子油、蓖麻油、桐油、液體石蠟、豆油、a1、a2、鄰苯二甲酸二甲酯、鄰苯二甲酸二丁酯等中的至少一種；增稠劑有膨潤土、硬脂酸鋁、qh凝膠、龍膠粉、f1、黃原膠等中的至少一種：分散劑有拉開粉、nno、lfs、b1、碳黑等中的至少一種。

在一個具體實施方式中，所述農藥製劑的劑型為懸浮劑、油懸劑、粉劑、可溼性粉劑和顆粒劑中的至少一種。

本申請之五提供了如本申請之一所述的蘇雲金芽孢桿菌、如本申請之二所述的工程菌、如本申請之三所述的組合物以及如本申請之四所述的農藥製劑中的至少一種的應用。

在一個具體實施方式中，所述蘇雲金芽孢桿菌、所述工程菌、所述組合物和所述農藥製劑中的至少一種用於預防和/或減輕植物的真菌病害。

本領域的技術人員公知，核盤菌屬(sclerotinia)真菌是危害作物和蔬菜的世界性的重要的植物病原菌，其能夠引起植物的菌核病、軟腐病、溼腐病、猝倒病和白杆等至少60種病害。核盤菌屬(sclerotinia)的真菌可以廣泛地侵染很多單子葉和雙子葉植物，例如包括單子葉植物中的洋蔥和鬱金香等。核盤菌屬(sclerotinia)中最為典型的病原菌當屬核盤菌(sclerotiniasclerotiorum(lib.)debary)。核盤菌(sclerotiniasclerotiorum(lib.)debary)能夠侵染包括野生植物和農作物在內的75科278屬408種或亞種植物。核盤菌(sclerotiniasclerotiorum(lib.)debary)的寄主包括單子葉和雙子葉植物，其中，例如包括雙子葉植物中的油料作物(如油菜、向日葵、大豆和花生等)、葉類和蔬菜作物(如小白菜、菸草、萬苣、番琉、前子、豌豆和扁豆等)、觀賞植物(如一品紅等)以及水果類植物(如梨、藍蕃和草蕃等)。目前對核盤菌屬(sclerotinia)引起的病害防治主要依靠化學農藥，然而化學防治不僅成本高、汙染環境，而且防效也不理想；同時，食品的安全性也受到嚴重影響。為了克服化學農藥的缺陷，可以用所述蘇雲金芽孢桿菌、所述工程菌、所述組合物和所述農藥製劑中的至少一種來預防和/或減輕由核盤菌屬(sclerotinia)真菌引起的植物病害。

因此，在一個具體實施方式中，所述真菌病害為菌核病、軟腐病、溼腐病、猝倒病和白杆中的至少一種。

在一個優選地具體實施方式中，所述真菌病害為菌核病。

在一個具體實施方式中，所述真菌病害的病原菌為核盤菌屬(sclerotinia)真菌中的至少一種。

在一個優選地具體實施方式中，所述真菌病害的病原菌為核盤菌(sclerotiniasclerotiorum)。

在一個具體實施方式中，所述蘇雲金芽孢桿菌、所述工程菌、所述組合物和所述農藥製劑中的至少一種用於預防和/或減輕具有bnhel基因的植物上發生的真菌病害。

在一個具體實施方式中，所述蘇雲金芽孢桿菌、所述工程菌、所述組合物和所述農藥製劑中的至少一種用於預防和/或減輕單子葉植物和/或雙子葉植物上發生的真菌病害。例如，所述單子葉植物為具有bnhel基因的單子葉植物；所述雙子葉植物為具有bnhel基因的雙子葉植物。

在一個具體實施方式中，所述蘇雲金芽孢桿菌、所述工程菌、所述組合物和所述農藥製劑中的至少一種用於預防和/或減輕草本植物上發生的真菌病害。例如，所述草本植物為具有bnhel基因的草本植物。

在一個具體實施方式中，所述蘇雲金芽孢桿菌、所述工程菌、所述組合物和所述農藥製劑中的至少一種用於預防和/或減輕十字花科植物上發生的真菌病害。

在一個優選地具體實施方式中，所述十字花科植物選自蕓薹屬(brassica)植物和蘿蔔屬(raphanus)植物中的至少一種。

在一個更優選地具體實施方式中，所述蕓薹屬植物選自油菜(brassicacampestris)、大白菜(brassicarapa)、小白菜(brassicachinensis)和甘藍(brassicaoleracea)中的至少一種。其中甘藍(brassicaoleracea)可以包括結球甘藍(brassicaoleraceal.var.capitatal)、羽衣甘藍(brassicaoleraceavar.acephalaf.tricolor)、抱子甘藍(brassicaoleraceavar.gemmifera)、芥藍(brassicaoleraceavar.albiflorakuntze)、花椰菜(brassicaoleraceal.var.botrytisl.)、青花菜(brassicaoleraceal.var.italicplanch)中的至少一個變種。

其中，舉例來說明防治油菜病害的重要性。油菜是中國主要的油料作物，油菜菌核病是油菜生產中的重要病害之一，常年株發病率高達10％至30％，嚴重的達80％以上；病株一般減產10％至70％。通過利用本申請的所述蘇雲金芽孢桿菌、所述工程菌、所述組合物和所述農藥製劑中的至少一種可以有效預防和/或減輕油菜菌核病。

根據植物病害的流行病學及預測，一般可以確定真菌病害的流行性發生情況，包括真菌病害發生的作物、時間和地點。據此，可以在真菌病害發生之前進行對植物進行處理，以達到防病和/或減輕病害發生的目的。因此，在一個具體實施方式中，在所述植物發病之前，施用至少一次所述蘇雲金芽孢桿菌、所述工程菌、所述組合物和所述農藥製劑中的至少一種。

在一個具體實施例中，蘇雲金芽孢桿菌、所述工程菌、所述組合物和所述農藥製劑中的至少一種施用於準備種植所述植物的環境，或生長有所述植物的環境中。

隨著現代農業的興起，傳統依賴於土地的種植方式受到了不同程度的挑戰，植物的種植，特別是蔬菜的種植已經在向無土化栽培方向發展，但植物生長所賴以的養分等因素仍是必不可少的。因此，依據真菌病害中土傳病害和種傳病害的傳播特性，蘇雲金芽孢桿菌、所述工程菌、所述組合物和所述農藥製劑中的至少一種除了可以施向種植所述植物的傳統的土壤，還可以施向無土栽培基質等用於維持所述植物用根汲取營養的基質。當然本領域的人員能夠理解，依據真菌病害中氣傳病害和介體傳病害等的傳播特性，向生長的植物的葉、莖、花、果實、穀粒、種子、樹幹和根噴施蘇雲金芽孢桿菌、所述工程菌、所述組合物和所述農藥製劑中的至少一種也能夠達到一定的目的，因此，也可以向所述植物的葉片噴施蘇雲金芽孢桿菌、所述工程菌、所述組合物和所述農藥製劑中的至少一種。

因此，在一個具體實施例中，準備種植植物的環境，或生長有所述植物的環境包括土壤、無土栽培基質和植物生長營養液中的至少一種。

在一個具體實施例中，蘇雲金芽孢桿菌、所述工程菌、所述組合物和所述農藥製劑中的至少一種施用於所述植物的植株；其中所述植包括草本植物和/或木本植物；草本植物的植株包括根、莖、葉、花、果實和種子中的至少一部分；木本植物的植株包括根、主幹、側枝、葉、花、果實和種子中的至少一部分。

在一個具體實施例中，通過噴灑施用所述蘇雲金芽孢桿菌、所述工程菌、所述組合物和所述農藥製劑中的至少一種。

在一個具體實施例中，通過噴灑，機械摻和，通過與肥料、強化劑混合或者作為預混劑而施用所述蘇雲金芽孢桿菌、所述工程菌、所述組合物和所述農藥製劑中的至少一種於所述準備種植植物的環境，或生長有所述植物的環境。

在本申請中沒有特殊說明的情況下，本申請中的術語均屬於現有技術中所指的通用術語。

附圖說明

圖1為接入病原菌7天時，ippbiotsr045菌株與空白對照組處理後的油菜照相圖片。其中，圖中上面的一行油菜為空白對照組；下面的一行為ippbiotsr045菌株處理組。

圖2為bnhel基因的相對轉錄水平。

圖3為ippbiotsr045的mega軟體構建系統發育樹。

菌株保藏

本申請篩選的微生物被定名為ippbiotsr045(本申請中的編號)，該菌株保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為cgmccno.13302，保藏日期為2016年11月15日，保藏地址為：北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所。其系統分類為蘇雲金芽孢桿菌(bacillusthuringiensis)。

具體實施方式

下面結合實施例和附圖對本申請做以下詳細說明。但這些實施例僅是範例性的，並不對本申請的範圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本申請的精神和範圍下可以對本申請技術方案的細節和形式進行修改和替換，但這些修改和替換均落入本申請的保護範圍內。

培養基：bt培養使用lb液體培養基(胰蛋白腖10.0g/l，酵母提取物5.0g/l，nacl10.0g/l，121℃滅菌20min)，lb固體培養基(lb液體培養基加瓊脂15g/l)。病原真菌培養使用pda固體培養基，購自北京冰達生物科技有限公司。

實施例1

菌株的分離與鑑定

使用lb固體培養基對2015年5月在北京香山採集的土樣進行芽孢桿菌篩選與分離。首先利用無菌水對土樣進行梯度稀釋，然後將系列稀釋的樣品置於70℃的水浴鍋中10分鐘，在無菌條件下取100微升的不同梯度下的稀釋液塗布於lb固體平板上，並於30℃培養16-48小時，對菌落形態為無粘液、溼潤、厚實且菌落外沿稍有擴散而不很整齊的菌落進行純化，然後保藏純化出的單菌落，以備用於後續的菌種鑑定和生物活性分析。

對純化的單菌落在30℃條件下lb培養，不同時間取樣鏡檢觀察菌落形態特徵、晶體特徵等。在lb培養基上培養不同階段觀察結果如下，營養體：呈杆狀，兩端鈍圓，大小約1.0×0.5μm至1.5×0.5μm；單個或兩個以上呈鏈狀存在。芽孢：橢圓形，大小約1.0×0.5μm至1.3×0.5μm，為休眠體；對高溫或者乾燥等不良環境有較強的抵抗力。伴孢晶體：球形、菱形和方形等。這些形態特徵與《常見細菌系統鑑定手冊》(東秀珠等編著，科學出版社.2001年)中描述的芽孢桿菌形態特徵基本一致，初步判斷具有這種形態菌落的菌株屬於蘇雲金芽孢桿菌。對分離的菌株進行編號。

實施例2

活性測定

病原真菌：核盤菌(sclerotiniasclerotiorum(lib.)debary)由武漢科諾公司提供。

根據實施例1分離的164株bt野生菌株。

供試植物：白菜型油菜(brassicacampestrisl.)，品種為新四月蔓，栽培用土為營養土：蛭石＝2:1，光照時間14h(7,000lux)，黑暗時間10h種植時間約30天，種植地點在中國農業科學院植物保護研究所溫室。

bt菌株抑菌活性的檢測：以164株野生bt菌株和5株實驗室常用菌株(bt185、g03、hd73、hd73-和hbf-18)為出發菌株，首先以核盤菌為指示菌，通過平板對峙實驗排除其中能產生抑菌活性物質的菌株。通過該實驗共排除了12株能產生抑菌活性物質菌株，隨後對剩餘的142菌株進行誘導活性的檢測。

誘導活性bt菌株的篩選：對於經過bt抑菌活性分析後剩餘的142株bt菌，分別取10μlbt甘油菌液加入1ml的lb液體培養基，於2ml離心管中，30℃，220r/min，震蕩培養12h。上述活化後的菌液1％轉接於20mllb液體培養基，30℃，220r/min，震蕩培養24h。將上述菌液移入50ml離心管中，4℃、10000r/min，離心5min，棄上清，取10ml的無菌水將沉澱懸浮均勻形成菌懸液。

從每株菌的菌懸液中取100μl分別加入到900μl的無菌水中，混勻，依次稀釋到10-7。取10-5、10-6、10-7三個稀釋梯度的菌液各100μl塗板計數，三個重複，30℃培養箱培養過夜。菌落數在100-300之間視為有效梯度，本次實驗有效梯度為10-6，根據平板計數法換算出各株菌的菌懸液濃度，且將各株菌的菌懸液濃度調節到1.0×1010cfu/ml後使用。最後確定本次實驗將500μl的1.0×1010cfu/ml菌懸液稀釋成10ml，噴於植物根部附近土壤表面，每株菌處理3株油菜，空白對照組噴等量的無菌水。誘導後五天，在每株油菜的葉片上接一個核盤菌菌餅，置於22℃培養箱中，24h內保持90％溼度，隨後適當降低溼度。接入病原菌後2天、5天、7天統計病斑直徑。

3次重複結果顯示，檢測的142株菌中的18株菌可以不同的程度的誘導油菜產生抗病性，其中編號為ippbiotsr045對油菜抗病效果較好，測得接入病原菌7天時的病斑直徑為0.92±0.46cm；而空白對照組在接入病原菌7天時的病斑直徑為5.23±0.45cm；另外沒有誘導油菜產生抗病性的菌株中，編號菌株為ippbiotsr04a1的組別在接入病原菌7天時的病斑直徑為5.72±0.80cm。lsd統計學分析顯示，ippbiotsr045和空白對照組在α＝0.05水平上存在顯著的差異；ippbiotsr045和ippbiotsr04a1在α＝0.05水平上存在顯著的差異；而ippbiotsr04a1和空白對照組在α＝0.05水平上不存在顯著的差異。ippbiotsr045菌株與空白對照組7天時的照片圖見圖1。

耐熱活性分析：將有誘導活性的18株bt菌株活化後，1％轉接，震蕩培養24h，將菌液100℃，加熱30min，同上述方法誘導油菜，每個處理設三個重複，同時用未加熱菌液誘導，對照組用等量的無菌水處理。發現包括ippbiotsr045在內的6株仍有誘導活性，而其它12株喪失活性。綜合耐熱前的活性分析，ippbiotsr045菌株的活性最好。其中，在該耐熱活性分析中，測得接入病原菌7天時，ippbiotsr045的病斑直徑為1.12±0.85cm；接入病原菌7天時，與耐熱分析平行處理的未加熱的ippbiotsr045的病斑直徑為1.01±0.11cm；而接入病原菌7天時，空白對照組的病斑直徑為5.58±0.42cm。lsd統計學分析顯示，ippbiotsr045的加熱與未加熱的處理在α＝0.05水平上不存在顯著的差異，但兩者均與空白對照在α＝0.05水平上存在顯著的差異。可見，在ippbiotsr045菌株中，對油菜誘導抗病性的物質具有耐熱特定，初步排除了不耐高溫的環脂肽這一物質。另外，由於bt不產生脂多糖，因此對油菜誘導抗病性的物質也排除了脂多糖。

實施例3

油菜的誘導抗病性與茉莉酸信號途徑關鍵基因bnhel表達的關係

誘導油菜產生抗病性的操作同實施例2。

提取ippbiotsr045菌株誘導前、誘導後2天、5天和7天油菜葉片的總rna，利用promegagoscripttmreversetranscriptionsystem反轉錄試劑盒反轉錄合成cdna，通過螢光定量pcr檢測茉莉酸途徑關鍵基因bnhel的相對轉錄水平，以actin基因為內參基因。其中，以上述cdna為模板，利用引物helf：gccatcaccatcggtatctatt(seqidno.1)，helr：ggtgaggaacacaaggactaat(seqidno.2)，tiangensuperrealpremixplus(sybrgreen)superreal螢光定量預混試劑增強版試劑盒進行螢光定量pcr；內參使用的引物為actinf：gtgccgatctacgaaggttatg(seqidno.3)；actinr：gtaccctctctcggtgagaat(seqidno.4)。ippbiotsr045菌株誘導前、誘導後2天、5天和7天的油菜葉中的bnhel基因的相對轉錄水平見圖2，結果顯示誘導後2天該基因的表達量顯著上調，誘導後5天其表達量顯著下調。可見，油菜的誘導抗病性與茉莉酸信號途徑的關鍵基因bnhel顯著相關。由於本領域的技術人員知道植物中廣泛地存在茉莉酸信號途徑，結合該實驗結果可以合理地得出ippbiotsr045可以誘導植物的茉莉酸信號途徑的關鍵基因bnhel的上調，因此，可以合理地得出ippbiotsr045可以誘導具有bnhel基因的植物對核盤菌屬(sclerotinia)真菌，特別是核盤菌(sclerotiniasclerotiorum)的抗病性。

實施例4

活性菌株ippbiotsr045進一步的分類鑑定

1.多位點序列分型

多位點序列分型(multilocussequencetyping，mlst)是近年來發展很快的分子生物學分析方法，其具有很高的分辨能力，既適於分子流行病學研究，也可用於分子進化學的研究。通過分析多個450bp左右的管家基因(housekeepinggene)核心片段的核酸序列，從而對菌株的等位基因進行多樣性的比較，不同的菌株對應不同的序列型(sequencetype)。所以mlst越來越多的被作進行國際間菌株比較的常用工具，以及建立一種更為準確的分型系統方法，並且將其應用於研究出現的不同的抗生素抵抗株、毒力或抗原的相關特殊基因型，及新的變異株引起的疾病流行等流行病學分析，進行生物進化和種群結構的研究。

1.1提取基因組

s1：5ml1mtris-hcl，1ml0.5medta，171.15g蔗糖，ph7.0，定容至500ml，115℃20min滅菌。

s2：10％sds4ml+ddh2o6ml，ph4.8-5.2。

s3：5m異硫氰酸胍，1mnaac。

te：10mmtris-hcl3ml，1mmedta600ul，ph8.0，定容至300ml。

提取ippbiotsr045菌株和已知的11株芽孢桿菌菌株(其中，蘇雲金芽孢桿菌3株，分別為hbf18、bt185和g03；蠟狀芽孢桿菌(bacilluscereus)4株，分別為6a25、6a97、6a33和6a73；韋氏芽孢桿菌(bacillusweihenstephanensis)4株，分別為6a50、6a21、6a22和6a23)的基因組，具體方法如下：

(1)菌株在lb固體培養基上劃線，30℃過夜培養，刮取100μg菌體到1.5mlep管中；

(2)加入150μls1(加溶菌酶和石英砂)懸浮，于振蕩器上劇烈振蕩，混勻，無需用槍頭吹打；

(3)加200μls2，充分混勻；再加入400μl的s3，充分混勻，劇烈震蕩；

(4)取上清，加等體積的異丙醇，混勻，-20℃靜置20min；

(5)取出離心，12000rpm，10min，棄上清；

(6)加入70％的乙醇清洗，12000rpm，10min；

(7)倒掉乙醇，再次12000rpm，3min；

(8)用槍頭吸乾上清，室溫晾乾；

(9)再加入100μl的te或者質粒提取試劑盒中eluent(每毫升te或eluent中加10μl的rnasea)溶解沉澱；

(10)-20℃保存備用。

提取的基因組利用瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示提取的基因組效果良好。

1.2pcr引物的設計與合成

根據pubmlst(http://pubmlst.org/bcereus/info/primers.shtml)發布的bcgroup的七個管家基因引物序列進行合成。

七個管家基因分別是：glpf(甘油吸收有利蛋白，glyceroluptakefacilitatorprotein)、gmk(假定的鳥苷酸激酶，putativeguanylatekinase)、ilvd(二羥酸脫水酶，dihydroxy-aciddehydratase)、pta(磷酸轉乙醯酶，phosphateacetyltransferase)、pur(phosphoribosylaminoimidazolecarboxamide)、pyca(丙酮酸羧化酶，pyruvatecarboxylase)以及tpi(磷酸丙糖異構酶，triosephosphateisomerase)。所選取的七個管家基因名稱，引物名稱及序列(5』-3』)，擴增長度見下表1。

表1

1.3pcr擴增

將提取成功的每個菌株基因組dna分別稀釋到10ng/μl左右作為pcr擴增模板，採用50μl反應體系，分別對7個目的管家基因進行pcr擴增。擴增體系包含有，taqpcrmastermix(25μl)，正反向引物(各1μl)、基因組dna(2μl)和ddh2o(21μl)。

對於pta基因的擴增，循環參數為：

其他六個管家基因除退火溫度不同外。其他循環參數設定相同，其中glpf為59℃，gmk和pur均為56℃，pyca為57℃，ilvd和tpi均為58℃。

1.4擴增產物檢測

待擴增反應結束後，取3μl的pcr產物加樣於預先製備加有核酸染料的1％瓊脂糖凝膠點樣孔中進行電泳，電壓140v，10min後取出，紫外分光光度計下拍照、保存。所有菌株均擴增成功。

1.5測序及整理序列

對上述芽孢桿菌的pcr產物進行測序。將每株菌的glpf、gmk、ilvd、pta、pur、pyca和tpi的測序序列分別提交到pubmlst網站中上述相應基因的基因庫中，獲得用於mlst分析的序列長度分別glpf：372bp；gmk：504bp；ilvd：393bp；pta：414bp；pur：348bp；pyca：363bp；tpi：435bp。其中ippbiotsr045的glpf序列如seqidno.19所示，ippbiotsr045的gmk序列如seqidno.20所示，ippbiotsr045的ilvd序列如seqidno.21所示，ippbiotsr045的pta序列如seqidno.22所示，ippbiotsr045的pur序列如seqidno.23所示，ippbiotsr045的pyca序列如seqidno.24所示，ippbiotsr045的tpi序列如seqidno.25所示。然後獲得依次連接的「glpf-gmk-ilvd-pta-pur-pyca-tpi」序列。ippbiotsr045的「glpf-gmk-ilvd-pta-pur-pyca-tpi」序列如seqidno.26所示。

2.實驗菌株的等位基因及st分型結果

採用mlst技術分析芽孢桿菌的7個持家基因位點的核苷酸多態性。在pubmlst網站進行序列分型的確定。該菌對應的「glpf-gmk-ilvd-pta-pur-pyca-tpi」這一組持家基因編號的組合稱為等位基因圖譜(allelicprofile)，並給這個等位基因譜分配一個唯一的編號作為該分離株的核酸型或序列型(sequencetype，sts)。經確認，ippbiotsr045的「glpf-gmk-ilvd-pta-pur-pyca-tpi」序列與已經公開的序列不同，存在一定的差異，其st分型屬於st13，結合該菌株的形態學性狀說明其為一株不同於現有菌株的新的蘇雲金芽孢桿菌菌株。

3.系統發育分析

採用mega6.0軟體對ippbiotsr045和上述已知標準菌株的st型的聯合基因序列(長度均為2829bp)構建nj聚類圖，在核苷酸水平上對芽孢桿菌進行遺傳聚類分析，見圖3。結果ippbiotsr045菌株與蘇雲金芽孢桿菌聚合在一起，說明ippbiotsr045菌株在分類上屬於蘇雲金芽孢桿菌(bacillusthuringiensis)。

該菌株保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為cgmccno.13302，保藏日期為2016年11月15日，保藏地址為：北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所。其系統分類為蘇雲金芽孢桿菌(bacillusthuringiensis)。

lha1760055核苷酸序列表

中國農業科學院植物保護研究所

一種蘇雲金芽孢桿菌及其應用

lha1760055

patentinversion3.5

dna

人工序列

helf

gccatcaccatcggtatctatt；

dna

人工序列

helr

ggtgaggaacacaaggactaat；

dna

人工序列

actin_f

gtgccgatctacgaaggttatg；

dna

人工序列

actin_r

gtaccctctctcggtgagaat；

dna

人工序列

glpf_f

gcgtttgtgctggtgtaagt；

dna

人工序列

glpf_r

ctgcaatcggaaggaagaag；

dna

人工序列

gmk_f

atttaagtgaggaagggtagg；

dna

人工序列

gmk_r

gcaatgttcaccaaccacaa；

dna

人工序列

ilvd_f

cggggcaaacattaagagaa；

dna

人工序列

ilvd_r

ggttctggtcgtttccattc；

dna

人工序列

pta_f

gcagagcgtttagcaaaagaa；

dna

人工序列

pta_r

tgcaatgcgagttgcttcta；

dna

人工序列

pur_f

ctgctgcgaaaaatcacaaa；

dna

人工序列

pur_r

ctcacgattcgctgcaataa；

dna

人工序列

pyca_f

gcgttaggtggaaacgaaag；

dna

人工序列

pyca_r

cgcgtccaagtttatggaat；

dna

人工序列

tpi_f

gcccagtagcacttagcgac；

dna

人工序列

tpi_r

ccgaaaccgtcaagaatgat；

372

dna