在線供氣、供液空心旋轉圓盤式細胞三維培養器的製作方法

2023-10-27 17:12:12 5

專利名稱：在線供氣、供液空心旋轉圓盤式細胞三維培養器的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物醫學工程、組織工程(Tissue Engineering)技術中的培養器，特別是涉及生物醫學工程中細胞／組織培養所使用的在線供氣、供液空心旋轉圓盤式細胞三維培養器。
美國宇航局(NASA)Johnson中心在生物培養器RWV系統的基礎上，發展了兩類適合於臨床實驗用的細胞培養器，其中有一類簡稱HARV(High Aspect Ratio Vessel)系統，如文獻[1]Culturing a Future，Fall 1998．MicroGravity NEWS．(如

圖1)所示。該系統的細胞培養器採用雙圓盤結構，即主要包括空心圓盤式氣室2和空心圓盤式細胞培養室1，氣室2和細胞培養室1之間夾裝氣／液交換膜，細胞培養室1的外固定壁上設有與細胞培養室1相通的進液管A和出液管B，圖1中的C為取樣管，氣室2的外固定壁上設有進氣孔和出氣孔(圖中未示出)，氣泵通過進氣孔將新鮮氣體通入氣室，交換後的氣體由出氣孔排出，細胞培養室1的新鮮培養液的注入，必須在停機狀態下進行，即停機後，打開進液管和出液管上的閥門，通過出液管排出使用過的培養液，通過進液管注入新鮮培養液。這種細胞培養器特點是直徑／長度比很大，它對於發展個體化細胞療法和基因治療有重要意義，美國的一些醫學中心正在進行臨床實驗研究。所謂高、寬、長比(HAR)，意味培養室軸向尺度(h)與徑向尺度(D)之比遠小於1(h／D＜＜1)。從流體力學原理來說，雙圓盤培養器開始旋轉後經過一段時間圓盤之間的粘性流體將象固體一樣和圓盤一起運動，故細胞在一定條件下(取決於轉速和培養液黏度的匹配)可克服重力沉降，細胞懸浮於旋轉圓盤間，獲得三維生長的條件。由圖1不難看出，NASA的HARV系統通過作為空心圓盤形培養室側壁的氣／液交換膜在線供氣，也就是說只能在線供氣而不能在線供液。其培養液的更新是通過圓盤另一側上注射孔進行的，而且，培養液更換前必須先停機，不能連續運行，而使所培養的細胞沉降在一定區域，在靜態下更新培養液，然後再重新啟動，這必然造成兩個問題
1、在間歇過程中，重力沉降使得細胞沉著於細胞培養室壁面形成接觸抑止，從而幹擾乃至破壞了細胞的三維生長；2、旋轉的雙圓盤之間的粘性流體在建立穩定的流場以後，象固體一樣和圓盤一起運動，流體微元之間無相對運動，因而流動剪應力趨於零。但在啟動(流場建立)和停機(流場消失)過程中，流態改變造成的動態應力是不可忽略的。而且在此過程中，流體不僅有軸向和徑向運動，還有軸向運動(可參閱文獻2Schilichting《邊界層理論》p．114-121)，這種軸向流動有可能帶動細胞碰撞培養室側壁或粘附、展布於側壁，由於h／D＜＜1，這種可能性是不可忽視的，高密度培養時尤其如此。培養時間越長，間歇——啟動次數越多，引起的不利於細胞生長的問題越大。
本發明的目的在於克服已有技術的培養器在更新培養液時必須先停機，不能連續運行，在培養過程中停機時，出現細胞沉著於培養室壁面形成接觸而抑止細胞生長的缺陷；為了解決真正實現細胞在培養器內三維培養和提高培養效果，從而提供一種在動態供氣的同時，也在線供液的在線供氣、供液空心旋轉圓盤式細胞三維培養器。
本發明的目的是這樣實現的本發明所提供的在線供氣、供液空心旋轉圓盤式細胞三維培養器，包括培養器主體、馬達、底座、支架及供氣-排氣和供液-排液系統，其特徵在於培養器主體為一空心圓盤體，其內部軸向依次平行地設置氣室、細胞培養室、培養液流動室和培養液回流室，氣室和細胞培養室之間夾裝氣／液交換膜，細胞培養室和培養液流動室之間夾裝液／液交換膜，培養液流動室的另一圓形壁面為固定壁，其上沿同一徑向位置處設置若干回流孔，該回流孔與培養液回流室相通，氣室的外固定壁上設有與培養器主體外部相通的餘氣出口，底座上平行放置的兩支架上水平設置一對中空轉軸將培養器主體懸空支撐，其中，一根中空轉軸的端部與氣室的圓形外固定壁固定，其內空腔為輸送新鮮空氣的氣體通道與氣室氣路相通，另一根中空轉軸端部與培養液流動室的圓形固定壁固定，其內同心地設置一培養液流動管，培養液流動管內腔與培養液流動室液路相通，位於培養液回流室的中空轉軸的軸壁上設有若干培養液回流孔，該培養液回流孔與培養液回流室相通，該中空轉軸露出支架外的轉軸段上套固一隔離器，隔離器為一固定在支架上的空心圓柱體，其內部徑向設置與其中心線垂直的培養液進口和代謝物出口，培養液進口中安裝進液管與位於中空轉軸中的培養液流動管相通，代謝物出口中安裝代謝物出口管與中空轉軸內的環形通道相通，隔離器中的培養液進口與代謝物出口之間以及培養液進口的另一側各設置將其密封隔開的密封圈，馬達通過變速機構帶動上述兩中空轉軸同步轉動，其供氣-排氣系統包括氣源、氣泵及輸氣管道，與氣泵相連的輸氣管道與固定在氣室固定壁上的中空轉軸的內腔相連通，供液-排液系統包括儲液器、液泵及輸液管道，與液泵相連的輸液管道與隔離器中的培養液進液管相連通。
上述的代謝物出口管的出口端通過輸液管道連通阻尼器，阻尼器連通培養液透析器，透析器出口分別連通代謝物收集器和氣／液交換器，氣／液交換器連通儲液器，儲液器出口與隔離器上的進液管相連通。
所述的供氣-排氣系統的氣源與氣室相連的輸液管道上設有穩壓、調壓閥，氣室的餘氣出口通過排氣管道連接在餘氣收集器上。
本發明提供的在線供氣、供液空心旋轉圓盤式細胞三維培養器工作原理為液泵將儲液器中的新鮮培養液從隔離器上的進液管進入培養液流動室，在培養器轉動過程中，培養液藉助離心力均勻分布並通過液／液交換膜為細胞培養室在線供給營養並帶出代謝物，完成交換的培養液即代謝物經回流孔流入培養液回流室，再經中空轉軸上回流孔流入中空轉軸內的環形回流通道，從隔離器上的代謝物出口管流出，此時，已完成新舊培養液的交換。由於流出的代謝物液體中含有部分新鮮培養液，為了節約原料，降低成本，將流出的代謝物流體經阻尼器送入培養液透析器經過透析，之後其代謝物送入代謝物收集器，經透析的培養液經過氣／液交換器之後，調節培養液的氧含量和PH值，並添加營養和生長因子後流回培養液儲液器以供循環使用；同時，在培養器的另一側，一定配比的高富氧氣體從進口端裝有進氣濾膜的中空轉軸內的氣體通道進入氣室，通過夾裝在細胞培養室與氣室之間的氣／液交換膜進行氧氣與二氧化碳交換，為細胞培養室提供新鮮氧氣，並帶出廢氣，廢氣通過餘氣出口回收到餘氣收集器中，完成氣體交換。氣源與氣室相連的輸液管道上設有穩壓、調壓閥。在該培養器中，細胞培養室內的細胞，一方面通過液／液交換膜對細胞進行營養補充，排洩出的代謝物，另一方面通過氣／液交換膜對細胞培養室中的細胞進行氧氣的補充與廢氣的排出，從而實現了在線供氣、供液的細胞三維培養。
本發明的效果克服了已有技術在培養細胞過成中停機加液造成細胞沉降而損壞的缺點，為了實現動態在線供液、供氣，裝置可連續運行，避免間歇性停機對所培養細胞的不利影響，從而消除HARV系統對個體化療法和基因治療可能造成的隱患，達到真正的細胞三維培養，從而提供一種在線供氣、供液旋轉圓盤式片層細胞三維培養器。
下面結合附圖和實施例對本發明進行詳細說明圖1為已知細胞培養器(HARV)結構示意圖；圖2為本發明的在線供氣、供液空心旋轉圓盤式細胞三維培養器結構示意圖；圖3為圖2中空心園盤體形培養器主體的結構和與軸連接的結構示意圖；圖4為隔離器的結構示意圖。
其中細胞培養室1 氣室2培養液流動室3氣／液交換膜4 液／液交換膜5培養液回流室6氣體通道7 培養器主體8 餘氣出口9回流孔10、11培養液流動管12 環形回流通道13進液管14代謝物出口管15 培養液進口16代謝物出口17密封圈18 變速機構19馬達20 支架21 底座22中空轉軸W、Q隔離器S本發明所提供的在線供氣、供液空心旋轉圓盤式細胞三維培養器，包括培養器主體8、馬達20、底座22、支架21及供氣-排氣和供液-排液系統，其特徵在於培養器主體8為一空心圓盤體，其內部軸向依次平行地設置氣室2、細胞培養室1、培養液流動室3和培養液回流室6，氣室2和細胞培養室1之間夾裝氣／液交換膜4，細胞培養室1和培養液流動室3之間夾裝液／液交換膜5，培養液流動室3的另一圓形壁面為固定壁，其上沿同一徑向位置處設置若干回流孔10，該回流孔10與培養液回流室6相通，氣室2的外固定壁上設有與培養器主體8外部相通的餘氣出口9，底座22上平行放置的兩支架21上水平設置一對中空轉軸W和Q將培養器主體8懸空支撐，其中，一根中空轉軸W的端部與氣室2的圓形外固定壁固定，其內空腔為輸送新鮮空氣的氣體通道7與氣室2氣路相通，另一根中空轉軸Q的端部和培養液流動室3的圓形固定壁固定，其內同心地設置一培養液流動管12，培養液流動管12內腔與培養液流動室3相通，位於培養液回流室6的中空轉軸Q的軸壁上設有若干培養液回流孔11，培養液回流孔11和培養液回流室6相通，該中空轉軸Q露出支架21外的轉軸段上套固一隔離器S，隔離器S為一固定在支架21上的空心圓柱體，其內部徑向設置與其中心線垂直的培養液進口16和代謝物出口17，培養液進口16中安裝進液管14與位於中空轉軸Q中的培養液流動管12的培養液進口16相通，代謝物出口17中安裝的代謝物出口管15與中空轉軸Q內的環形回流通道13上的代謝物出口17相通，隔離器S中進液口16與代謝物出口17之間以及進液口16的另一側各設置將其密封隔開的密封圈18，馬達20通過變速機構19帶動上述兩中空轉軸W、Q同步轉動，本發明的供氣-排氣系統包括氣源、氣泵及輸氣管道，與氣泵相連的輸氣管道與固定在氣室2固定壁上的中空轉軸W相連通，即與氣泵相連的輸氣管道與中空轉軸W的內腔為氣體通道7的進氣口相通，氣源與氣室相連的輸氣管道上設有穩壓、調壓閥，以控制進入氣室的氣體壓力，氣室2的餘氣出口9通過輸氣管道連接在餘氣收集器上；供液-排液系統包括培養液儲液器、液泵及輸液管道，與液泵相連的輸液管道與隔離器S的培養液進管14相連通；代謝物出液管15的出口端通過輸液管道連通阻尼器，阻尼器出口連通培養液透析器，培養液透析器出口分別連通代謝物收集器和氣／液交換器，氣／液交換器連通儲液器，儲液器出口與隔離器S上的進液管14相連通。
實施例1按圖2製作一臺在線供氣、供液空心旋轉圓盤式細胞三維培養器，該培養器包括圖中，空心圓盤形細胞培養室1的直徑為150mm，厚度為120mm，容量為200ml；其內裝入BGC-823人胃癌細胞株，細胞培養室1通過氣／液交換膜4與氣室2相連接；通過液／液交換膜5與培養液流動室3相連接。由細胞培養室1、培養液流動室3、氣室2和培養液回流室6組成的培養器主體是用醫用聚碳酸脂或聚四氟乙烯製作的。
空心圓盤形氣室2與細胞培養室1之間夾裝氣／液交換膜4，另一壁為固定壁，固定壁上設有餘氣出口9，新鮮氣體由氣泵經中空轉軸W內腔的氣體通道7及位於氣體通道7內的進氣濾膜進入氣室2。
培養液流動室3與細胞培養室1之間夾裝液／液交換膜5，其內裝DMEM培養液，微珠載體採用Gtodex-3，另一側壁為固定壁與培養液回流室6鄰接，固定壁上同一直徑處設置若干培養液回流孔10，新鮮培養液由培養液進口管14經中空轉軸Q中的培養液流動管12，進入培養液流動室3，在壓力和離心力作用下更新培養液流動室3內的培養液，代謝出的代謝物經回流孔10進入培養液回流室6，再經回流孔11流入中空轉軸Q內的環形回流通道13，之後，通過隔離機構S的代謝物出口管15流出；氣／液交換膜4為普通矽橡膠膜製作的氣／液交換膜；液／液交換膜5為市售的Miripor膜；兩同心的中空轉軸W、Q的一端分別固定在一對支架21的中心孔內，中空轉軸W的另一端穿入氣室2並固定在氣室2的固定壁上，中空轉軸W的內腔為氣體通道7，氣體通道7與空心圓盤形氣室2相通；中空轉軸Q的另一端穿過培養液回流室6固定在培養液流動室3的固定壁上，該根中空轉軸Q的中放置培養液流動管12，中空轉軸Q內培養液流動管12之外的內腔為環形回流通道13，位於培養液回流室6內的中空轉軸的軸壁上有若干回流孔11，回流孔11通過回流孔10與培養液回流室6液路相通，露出支架21外中空轉軸Q段上有一代謝物出口17，並在該段的中空轉軸Q套固一隔離機構S；新鮮培養液進口管14與供液-排液系統的輸液管道相接；代謝物出口管15通過管道與供液-排液系統中的阻尼器相接；隔離器S中的密封圈18將培養液進出口16和代謝物出口17密封隔開；變速傳動機構19為常規的變速傳動機構；馬達20為市售的驅動馬達；支架21為不鏽鋼支架；底座22為不鏽鋼底座；在隔離器S內密封圈18將培養液進口16和代謝物出口17密封隔開，中空轉軸Q腔內培養液進液管12與培養液流動室3相通，代謝物回流液在軸內壁與培養液進液管12之間的環行回流通道13內回流，通過代謝物出口17流出。兩個用於支撐軸和培養器主體的支架21固定在底座22上，馬達20固定在支架21上，馬達20通過變速機構19帶動兩個同心中空轉軸W、Q同步轉動；供氣-排氣系統中的氣體輸送管道與中空轉軸W的內腔做為氣體通道7的進氣口相通；本實施例的液泵將新鮮培養液從儲液器經輸液管道和培養液進口管14輸入培養液進液管12，再進入培養液流動室3代謝物經培養液回流室6、環形回流通道13，從代謝物出口管15流出。其流出物經阻尼器流入透析器22，分別再流入代謝產物收集器及氣／液交換器，經氣／液交換器的培養液的氧含量和PH值經調節後，並添加營養物和生長因子等後流至儲液器供循環使用。
權利要求
1．一種在線供氣、供液空心旋轉圓盤式細胞三維培養器，包括培養器主體、馬達、底座、支架及供氣和供液系統，其特徵在於培養器主體為一空心圓盤體，其內部軸向依次平行地設置氣室、細胞培養室、培養液流動室和培養液回流室，氣室和細胞培養室之間夾裝氣／液交換膜，細胞培養室和培養液流動室之間夾裝液／液交換膜，培養液流動室的另一圓形壁面為固定壁，其上沿同一徑向位置處設置若干回流孔，該回流孔與培養液回流室相通，氣室的外固定壁上設有與培養器主體外部相通的餘氣出口，底座上平行放置的兩支架上水平設置一對中空轉軸將培養器主體懸空支撐，其中，一根中空轉軸的端部與氣室的圓形外固定壁固定，其內腔為輸送新鮮空氣的氣體通道與氣室氣路相通，另一根中空轉軸的端部與培養液流動室的圓形固定壁固定，其內同心地設置一培養液流動管，培養液流動管內腔與培養液流動室相通，位於培養液回流室的中空轉軸的軸壁上設有若干培養液回流孔，該培養液回流孔與培養液回流室相通，該中空轉軸露出支架外的轉軸段上套固一隔離器，隔離器為一固定在支架上的空心圓柱體，其內部徑向設置與其中心線垂直的培養液進口和代謝物出口，培養液進口中安裝進液管與位於中空轉軸中的培養液流動管相通，代謝物出口中安裝代謝物出口管與中空轉軸內的環形通道相通，隔離器中的培養液進口與代謝物出口之間以及培養液進口的另一側各設置將其密封隔開的密封圈，馬達通過變速機構帶動上述兩中空轉軸同步轉動，其供氣-排氣系統包括氣源、氣泵及輸氣管道，與氣泵相連的輸氣管道與固定在氣室固定壁上的中空轉軸的內腔相連通，供液-排液系統包括儲液器、液泵及輸液管道，與液泵相連的輸液管道與隔離器中的培養液進液管相連通。
2．按權利要求1所述的在線供氣、供液空心旋轉圓盤式細胞三維培養器，其特徵在於所述的代謝物出口管的出口端通過輸液管道連通阻尼器，阻尼器出口連通培養液透析器，透析器出口分別連通代謝物收集器和氣／液交換器，氣／液交換器連通儲液器，儲液器出口與隔離器上的進液管相連通。
3．按權利要求1所述的在線供氣、供液空心旋轉圓盤式細胞三維培養器，其特徵在於所述的供氣-排氣系統的氣源與氣室相連的輸液管道上設有穩壓、調壓閥，氣室的餘氣出口通過排氣管道連接在餘氣收集器上。
全文摘要
本發明涉及在線供氣、供液空心旋轉圓盤式細胞三維培養器:包括同心放置的由空心圓盤形細胞培養室、培養液流動室、氣室和培養液回流室構成的培養器主體,細胞培養室兩個側壁分別為液/液交換膜和氣/液交換膜,培養器主體通過轉軸與由馬達驅動的傳動機構連接,馬達驅動傳動機構帶動培養器主體轉動,培養器主體連通供氣和供液系統,實現在線供氣的同時在線連續置換培養液,從而克服了已有培養器只能在線供氣不能在線供液的缺陷。
文檔編號C12M3/00GK1290743SQ9912388
公開日2001年4月11日 申請日期1999年11月16日 優先權日1999年11月16日
發明者陶祖萊, 高宇欣, 李濤, 王翠茹 申請人:中國科學院力學研究所