突變的蛋白質、製備所述突變的蛋白質的方法、編碼所述突變的蛋白質的基因與流程

2023-06-08 11:57:21 2

本發明涉及一種突變的蛋白質，一種製備所述突變的蛋白質的方法，編碼所述突變的蛋白質的基因，攜帶所述基因的重組載體和植物，控制甲羥戊酸產量和類異戊二烯產量的方法，以及控制3-羥基-3-甲基戊二醯-輔酶A還原酶活性的方法。

背景技術：

在類萜生物合成通路中，3-羥基-3-甲基戊二醯-輔酶A還原酶(以下也稱之為HMGR或HMG-CoA還原酶)是異戊二烯單體(異戊烯基二磷酸)生物合成的限速酶。已知HMGR的酶活性受可逆的翻譯後磷酸化控制，具體而言，眾所周知，通過C端絲氨酸磷酸化滅活酶活性是動物中HMGR的翻譯後調控機制。這在植物中也得到了確認，特別是在非專利文獻1中，C端絲氨酸對應的第577位絲氨酸殘基的磷酸化導致的酶活性降低在擬南芥(Arabidopsis thaliana)中得到了確認。

也存在增加類萜產量而無需基因重組的方法，例如通過使用膽固醇生物合成抑制劑來增加類萜產量的方法，但仍然存在改善增加類萜產量及其類似物的方法的空間，並存在進一步研發這些技術的需求。

引用列表

非專利文獻

非專利文獻1:Dale S.等，歐洲生物化學期刊233(2),506-513(1995)

技術實現要素：

技術問題

本發明的一個目的是解決這些問題，並提供一種通過突變HMGR的特定胺基酸殘基而獲得的突變的蛋白質，其為類萜生物合成通路中異戊二烯單體生物合成的限速酶。本發明的另一目的在於提供一種製備該突變的蛋白質的方法，編碼該突變的蛋白質的基因，以及攜帶該基因的重組載體和植物，以及提供一種控制3-羥基-3-甲基戊二醯-輔酶A還原酶活性的方法。另一個目的是提供一種控制甲羥戊酸產量和類異戊二烯產量的方法。

問題的解決方案

本發明涉及一種突變的蛋白質，其中在3-羥基-3-甲基戊二醯-輔酶A還原酶中，選自於由SEQ ID NO：1所示的擬南芥3-羥基-3-甲基戊二醯-輔酶A還原酶的第91位、225位、257位、287位、339位、411位、470位、509位和574位胺基酸殘基、以及與前述相當的位置的胺基酸殘基構成的組的至少一種胺基酸殘基被缺失，或被其它胺基酸殘基取代。

與擬南芥3-羥基-3-甲基戊二醯-輔酶A還原酶的第91位、225位、257位、287位、411位、470位、509位和574位胺基酸殘基位置相當的胺基酸殘基優選分別是SEQ ID NO：10所示的橡膠樹(Hevea brasiliensis)3-羥基-3-甲基戊二醯-輔酶A還原酶的第70位、214位、246位、276位、400位、459位、498位和563位胺基酸殘基。

與擬南芥3-羥基-3-甲基戊二醯-輔酶A還原酶的第411位、470位、509位和574位胺基酸殘基位置相當的胺基酸殘基優選分別是SEQ ID NO：70所示的橡膠樹3-羥基-3-甲基戊二醯-輔酶A還原酶的第35位、94位、133位和198位胺基酸殘基。

與擬南芥3-羥基-3-甲基戊二醯-輔酶A還原酶的第91位、225位、257位、287位、339位、411位、470位、509位和574位胺基酸殘基位置相當的胺基酸殘基優選分別是SEQ ID NO：71所示的橡膠樹3-羥基-3-甲基戊二醯-輔酶A還原酶的第81位、225位、257位、287位、339位、411位、470位、509位和574位胺基酸殘基。

與擬南芥3-羥基-3-甲基戊二醯-輔酶A還原酶的第225位、257位、287位、339位、411位、470位、509位和574位胺基酸殘基位置相當的胺基酸殘基優選分別是SEQ ID NO：72所示的橡膠樹3-羥基-3-甲基戊二醯-輔酶A還原酶的第243位、275位、305位、357位、429位、488位、527位和592位胺基酸殘基。

與擬南芥3-羥基-3-甲基戊二醯-輔酶A還原酶的第91位、225位、287位、339位、411位、和470位胺基酸殘基位置相當的胺基酸殘基優選分別是SEQ ID NO：73所示的橡膠樹3-羥基-3-甲基戊二醯-輔酶A還原酶的第73位、243位、305位、357位、429位和488位胺基酸殘基。

選自於由SEQ ID NO:1的第91位和第339位胺基酸殘基、以及與前述相當的位置的胺基酸殘基構成的組的至少一種胺基酸殘基優選被天冬氨酸或穀氨酸取代。

選自於由SEQ ID NO：1的第225位、257位、287位、411位、470位、509位和574位胺基酸殘基、以及與前述相當的位置的胺基酸殘基構成的組的至少一種胺基酸殘基優選被缺失，或被丙氨酸、苯丙氨酸或半胱氨酸取代。

選自於由SEQ ID NO：1的第91位和第339位胺基酸殘基、以及與前述相當的位置的胺基酸殘基構成的組的至少一種胺基酸殘基優選被缺失，或被丙氨酸或苯丙氨酸取代。

選自於由SEQ ID NO：1的第225位、257位、287位、411位、470位、509位和574位胺基酸殘基、以及與前述相當的位置的胺基酸殘基構成的組的至少一種胺基酸殘基優選被天冬氨酸或穀氨酸取代。

本發明也涉及一種通過使用所述突變的蛋白質控制類異戊二烯產量的方法。

本發明也涉及一種通過使用所述突變的蛋白質控制甲羥戊酸產量的方法。

本發明涉及一種基因，其編碼所述突變的蛋白質。

本發明還涉及一種使用所述基因控制類異戊二烯產量的方法。

本發明還涉及一種使用所述基因控制甲羥戊酸產量的方法。

本發明還涉及一種攜帶所述基因的重組載體。

本發明涉及一種攜帶所述基因的植物。

本發明還涉及一種使用所述植物控制類異戊二烯產量的方法。

本發明還涉及一種使用所述植物控制甲羥戊酸產量的方法。

本發明還涉及一種產類異戊二烯的植物，其攜帶所述基因。

本發明還涉及一種使用所述產類異戊二烯的植物控制類異戊二烯產量的方法。

本發明還涉及一種使用所述產類異戊二烯的植物控制甲羥戊酸產量的方法。

本發明還涉及一種控制3-羥基-3-甲基戊二醯-輔酶A還原酶活性的方法，其中在3-羥基-3-甲基戊二醯-輔酶A還原酶中，選自於由SEQ ID NO：1所示的擬南芥3-羥基-3-甲基戊二醯-輔酶A還原酶的第91位、225位、257位、287位、339位、411位、470位、509位和574位胺基酸殘基、以及與前述相當的位置的胺基酸殘基構成的組的至少一種胺基酸殘基被缺失，或被其它胺基酸殘基取代

選自於由SEQ ID NO：1所示的第91位和第339位胺基酸殘基、以及與前述相當的位置的胺基酸殘基構成組的至少一種胺基酸殘基優選被天冬氨酸或穀氨酸取代。

選自於由SEQ ID NO：1的第225位、257位、287位、411位、470位、509位和574位胺基酸殘基、以及與前述相當的位置的胺基酸殘基構成的組的至少一種胺基酸殘基優選被缺失、或被丙氨酸、苯丙氨酸或半胱氨酸取代。

選自於由SEQ ID NO：1的第91位和第339位胺基酸殘基、以及與前述相當的位置的胺基酸殘基構成的組的至少一種胺基酸殘基優選被缺失、或被丙氨酸或苯丙氨酸取代。

本發明還涉及一種生產突變的蛋白質的方法，所述方法包括下述步驟：在3-羥基-3-甲基戊二醯-輔酶A還原酶中，選自於由SEQ ID NO：1所示的擬南芥3-羥基-3-甲基戊二醯-輔酶A還原酶的第91位、225位、257位、287位、339位、411位、470位、509位和574位胺基酸殘基、以及與前述相當的位置的胺基酸殘基構成的組的至少一種胺基酸殘基被缺失、或被其它胺基酸殘基取代。

選自於由SEQ ID NO：1的第91位和第339位胺基酸殘基、以及與前述相當的位置的胺基酸殘基構成的組的至少一種胺基酸殘基優選被天冬氨酸或穀氨酸取代。

本發明的有益效果

本發明的突變的蛋白質是通過將HMGR的特定胺基酸殘基缺失，或被其它胺基酸殘基取代而獲得的突變的蛋白質，所述HMGR是類萜生物合成通路中異戊二烯單體生物合成的限速酶。結果，可以通過製備該突變的蛋白質或其內引入了編碼該突變的蛋白質的基因的轉化體來控制HMGR酶活性、以及甲羥戊酸和類異戊二烯產量。

附圖說明

圖1顯示了類萜生物合成通路的一部分。

具體實施方式

本申請發明人進行了各種研究以增加類萜生物合成通路中生物合成的類萜的量。類萜生物合成通路的一部分如圖1所示。如圖1所示，類萜生物合成通路中涉及多種不同的酶，但是本申請發明人專注於3-羥基-3-甲基戊二醯-輔酶A還原酶(HMGR)，其為異戊二烯單體生物合成的限速酶，所述異戊二烯構成了類萜的基本骨架。

眾所周知，HMGR的C端絲氨酸，例如擬南芥HMGR的第577位絲氨酸，涉及調控它的活性。具體而言，當C端絲氨酸被磷酸化後，HMGR的活性喪失。基於該原因，將絲氨酸取代為丙氨酸以防止絲氨酸磷酸化的突變體(參見例如非專利文獻1)是眾所周知的。本領域廣泛認為，上述突變體的活性將不被磷酸化控制。因此，在本申請之日，本領域普遍認為，當C端絲氨酸被丙氨酸取代時，HMRG的活性不再受磷酸化控制。

儘管存在這種技術常識，但本申請發明人對HMGR胺基酸殘基磷酸化的進一步研究結果發現，除了已知的絲氨酸殘基，還有新的胺基酸殘基涉及控制酶活性。

具體而言，已經發現在表達根據非專利文獻1已知的突變的HMGR的擬南芥植物轉化體中，突變的HMGR的酶活性通過進一步磷酸酶處理而增加，其中所述HMGR的C端絲氨酸已被丙氨酸取代以使HMGR的酶活性不因絲氨酸的磷酸化而滅活。這表明，除了已知的絲氨酸殘基，還有其它胺基酸殘基作為磷酸化位點涉及控制HMGR酶活性。這是一個非常顯著的發現，其與上述普通技術知識相反，而本領域技術人員不能預料到該發現。在活的擬南芥中，根據需要通過磷酸化酶(激酶)來進行磷酸化。

基於該啟示，本申請發明人接下來找到了用於控制HMGR酶活性的新的磷酸化位點。具體而言，我們篩選了除已知的絲氨酸殘基(相當於如上所述的第577位絲氨酸)以外的涉及控制HMGR酶活性的胺基酸殘基，我們從不同類型的HMGR的高度保守的序列或換言之其保守區域中包含的胺基酸殘基中，識別了9種可以控制HMGR活性的胺基酸殘基。然後，我們通過製備突變的蛋白質來證明可以升高、降低或維持HMGR酶活性，或換言之控制HMGR酶活性；其中，所述突變的蛋白質中，9個所識別的具體胺基酸殘基被缺失或被替換。

能夠用作磷酸化位點的胺基酸殘基的例子包括絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、組氨酸、精氨酸和賴氨酸。

因此，通過製備具有導入的編碼如上所述的本發明中製備的突變的蛋白質的基因的轉化體，可以控制轉化體的HMGR酶活性，並因此控制甲羥戊酸產量和類異戊二烯產量。

具體而言，通過將相當於SEQ ID NO：1所示的擬南芥HMGR第91位的蘇氨酸殘基和第339位的絲氨酸殘基取代為其它胺基酸殘基，以及優選地取代為天冬氨酸或穀氨酸而製備的突變的HMGR具有增強的酶活性。

而且，通過將相當於SEQ ID NO：1所示的擬南芥HMGR第225位的酪氨酸殘基、第257位的酪氨酸殘基、第287位的絲氨酸殘基、第411位的絲氨酸殘基、第470位的蘇氨酸殘基、第509位的蘇氨酸殘基以及第574位的酪氨酸殘基取代為其它胺基酸殘基，以及優選地取代為丙氨酸、苯丙氨酸或半胱氨酸而製備的突變的HMGR也具有增強的酶活性。

因此，在導入了編碼這些突變的HMGR的基因的植物中，酶活性增強以及下遊代謝物含量增加。結果，通過將編碼這種突變的HMGR的基因導入到例如橡膠樹中，可以增強橡膠樹中的酶活性以及增加作為下遊代謝物生物合成的天然橡膠的量。

另一方面，通過將相當於SEQ ID NO：1所示的擬南芥HMGR的第91位的蘇氨酸殘基和第339位的絲氨酸殘基取代為其它胺基酸殘基或優選地取代為丙氨酸或苯丙氨酸而製備的突變的HMGR具有降低的酶活性。

而且，通過將相當於SEQ ID NO：1所示的擬南芥HMGR的第225位的酪氨酸殘基、第257位的酪氨酸殘基、第287位的絲氨酸殘基、第411位的絲氨酸殘基、第470位的蘇氨酸殘基、第509位的蘇氨酸殘基以及第574位的酪氨酸殘基取代為其它胺基酸殘基，以及優選地取代為天冬氨酸或穀氨酸而製備的突變的HMGR具有降低的酶活性。

因此，在導入了編碼這些突變的HMGR的基因的植物中，酶活性下降並且下遊代謝物含量也下降。結果，通過將編碼這種突變的HMGR的基因導入到植物中，可降低植物中可食用部分中的HMGR酶活性，並降低作為下遊代謝物的有害的甾體生物鹼或類倍半萜烯的量；其中，所述植物在例如馬鈴薯(茄鹼)、番茄(番茄苷)、萵苣(山萵苣素)或大豆(A組大豆皂苷)等植物的可食用部分中積累有害的物質或更苦的物質。

提高植物中HMGR功能的傳統方法主要是通過基因過表達，沒有人想到該酶的多個胺基酸涉及其活性。基於基因重組，可以預測基因過表達，但是在本發明中，該活性可以通過胺基酸取代來控制。這意味著，沒有重組的該修飾是可能的，允許獲得比重組更容易的處理和更大的工業實用性。

在說明書中，HMGR涉及一種將羥甲基戊二醯-輔酶A(HMG-CoA)催化還原為甲羥戊酸(MVA)的酶，HMGR的酶活性代表了該還原反應的活性，不同的生物物種均含有該酶。而且，不同的HMGR類型可能存在於一個生物物種中。

磷酸化是通過生物體含有的激酶，根據需要在體內執行的反應；在體內用作酶等作用的蛋白質中，這些作用的存在與否、以及力度等受磷酸化和去磷酸化控制。

(突變的蛋白質)

在HMGR中，通過將選自於由SEQ ID NO：1所示的擬南芥HMGR的第91位、225位、257位、287位、339位、411位、470位、509位和第574位胺基酸殘基、以及與前述相當的位置的胺基酸殘基構成的組的至少一種胺基酸殘基被缺失、或被其它胺基酸殘基取代而獲得本發明的突變的蛋白質。

SEQ ID NO：1所示的擬南芥HMGR的第91位、225位、257位、287位、339位、411位、470位、509位和第574位胺基酸殘基以及與前述相當的位置的胺基酸殘基是指，不論HMGR類型如何，HMGR中高度保守的序列中的胺基酸殘基或換言之HMGR中保守區域中包含的胺基酸殘基。保守區域是指具有類似的序列(結構)的位點；針對蛋白質，推測它是一種具有類似功能的位點。當SEQ ID NO：1所示的源於擬南芥的HMGR和另一種HMGR具有共同的保守區域時，可以推測後者同時擁有相當於SEQ ID NO：1所示的擬南芥HMGR的第91位、225位、257位、287位、339位、411位、470位、509位或574位胺基酸殘基的胺基酸殘基，以及保守區域中的胺基酸殘基起到與SEQ ID NO：1所示的擬南芥HMGR中的胺基酸殘基類似作用。在本發明中，通過多序列比對事先選擇HMGR的保守區域，以及從被確定為高度保守的那些中選擇胺基酸殘基的位置。

在說明書中，可以根據下述實施例進行多個序列比對。

包含與SEQ ID NO：1所示的擬南芥HMGR的第91位、225位、257位、287位、339位、411位、470位、509位和第574位胺基酸殘基相當的位置的胺基酸殘基的保守區域沒有特別地限定，只要它們是分別包含與SEQ ID NO：1所示的擬南芥HMGR第91位、225位、257位、287位、339位、411位、470位、509位和574位胺基酸殘基相當的位置的胺基酸殘基的保守區域即可，但是它們與SEQ ID NO：1所示的擬南芥HMGR的保守區域序列的序列相似度為優選至少60％、更優選至少70％、更優選至少75％、更優選至少80％、更優選至少85％、更優選至少88％、最優選至少90％、甚至最優選至少92％，最優選至少95％，特別是更優選至少98％，並且沒有上限。

包含SEQ ID NO：1所示的擬南芥HMGR的特定胺基酸殘基的保守區域如下所示：

包含第48位胺基酸殘基的保守區域是SEQ ID NO：2的第48至58位胺基酸殘基的序列；包含第91位胺基酸殘基的保守區域是SEQ ID NO：3的第85至91位胺基酸殘基的序列；包含第225位胺基酸殘基的保守區域是SEQ ID NO：4的第222至235位胺基酸殘基的序列；包含第257位胺基酸殘基的保守區域是SEQ ID NO：5的第256至269位胺基酸殘基的序列；包含第287位胺基酸的保守區域是SEQ ID NO：91的第282至299位胺基酸殘基的序列；包含第339位胺基酸殘基的保守區域是SEQ ID NO：6的第331位至339位胺基酸殘基的序列；包含第411位胺基酸殘基的保守區域是SEQ ID NO：7的第401位至416位胺基酸殘基的序列；包含第470位胺基酸殘基的保守區域是SEQ ID NO：8的第468至481位胺基酸殘基的序列；包含第509位胺基酸殘基的保守區域是SEQ ID NO：9的第497位至521位胺基酸殘基的序列；以及包含第574位胺基酸殘基的保守區域是SEQ ID NO：92的第570至578位胺基酸殘基的序列。上述序列相似性是指相對於這些保守區域的序列的序列相似性。

與SEQ ID NO：1所示的擬南芥HMGR的每個保守區域的序列的序列相似度如上所述，但是更優選如下所述。

針對包含與第91位胺基酸殘基相當的位置的胺基酸殘基的保守區域，其與包含對應SEQ ID NO：1的擬南芥HMGR的第91位胺基酸殘基的保守區域(SEQ ID NO：3)的序列相似度優選為至少71％，更優選至少85％，特別優選100％。

針對包含與第225位胺基酸殘基相當的位置的胺基酸殘基的保守區域，其與包含對應SEQ ID NO：1的擬南芥HMGR的第225位胺基酸殘基的保守區域(SEQ ID NO：4)的序列相似度優選為至少64％，更優選至少71％，更優選至少78％，特別優選至少85％，最優選至少92％，最優選100％。

針對包含與第257位胺基酸殘基相當的位置的胺基酸殘基的保守區域，其與包含對應SEQ ID NO：1的擬南芥HMGR的第257位胺基酸殘基的保守區域(SEQ ID NO：5)的序列相似度優選為至少64％，更優選至少71％，更優選至少78％，特別優選至少85％，最優選至少92％，最優選100％。

針對包含與第287位胺基酸殘基相當的位置的胺基酸殘基的保守區域，其與包含對應SEQ ID NO：1的擬南芥HMGR的第287位胺基酸殘基的保守區域(SEQ ID NO：91)的序列相似度優選為至少60％，更優選至少71％，更優選至少78％，特別優選至少82％，最優選至少87％，最優選100％。

針對包含與第339位胺基酸殘基相當的位置的胺基酸殘基的保守區域，其與包含對應SEQ ID NO：1的擬南芥HMGR的第339位胺基酸殘基的保守區域(SEQ ID NO：6)的序列相似度優選為至少66％，更優選至少77％，還更優選至少88％，特別優選100％。

針對包含與第411位胺基酸殘基相當的位置的胺基酸殘基的保守區域，其與包含對應SEQ ID NO：1的擬南芥HMGR的第411位胺基酸殘基的保守區域(SEQ ID NO：7)的序列相似度優選為至少62％，更優選至少68％，還更優選至少75％，特別優選至少81％，進一步特別優選至少87％，最優選至少93％，甚至最優選100％。

針對包含與第470位胺基酸殘基相當的位置的胺基酸殘基的保守區域，其與包含對應SEQ ID NO：1的擬南芥HMGR的第470位胺基酸殘基的保守區域(SEQ ID NO：8)的序列相似度優選為至少64％，更優選至少71％，還更優選至少78％，特別優選至少85％，最優選至少92％，甚至最優選100％。

針對包含與第509位胺基酸殘基相當的位置的胺基酸殘基的保守區域，其與包含對應SEQ ID NO：1的擬南芥HMGR的第509位胺基酸殘基的保守區域(SEQ ID NO：9)的序列相似度優選為至少68％，更優選至少72％，還更優選至少76％，特別優選至少84％，最優選至少96％，甚至最優選100％。

針對包含與第574位胺基酸殘基相當的位置的胺基酸殘基的保守區域，其與包含對應SEQ ID NO：1的擬南芥HMGR的第574位胺基酸殘基的保守區域(SEQ ID NO：92)的序列相似度優選為至少71％，更優選至少85％，還更優選100％。

第91位、225位、257位、287位、339位、411位、470位、509位和第574位胺基酸殘基、以及與前述相當的位置的胺基酸殘基優選絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、組氨酸、精氨酸和賴氨酸，並且更優選絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸。可以推測這些胺基酸殘基極大地參與了控制HMGR酶活性，因為它們是可能在體內被磷酸化的胺基酸。

具體而言，SEQ ID NO：1的擬南芥HMGR的第91位為蘇氨酸，第225位為酪氨酸，第257位為酪氨酸，第287位為絲氨酸，第339位為絲氨酸，第411位為絲氨酸，第470位為蘇氨酸，第509位為蘇氨酸以及第574位為酪氨酸。

針對與SEQ ID NO：1所示的擬南芥HMGR的第91位、225位、257位、287位、339位、411位、470位、509位和第574位胺基酸殘基相當的位置的胺基酸殘基，在SEQ ID NO：10所示的源於橡膠樹的HMGR(HMG1)的情況下，例如，第91位的蘇氨酸相當於第70位蘇氨酸，第225位酪氨酸相當於第214位酪氨酸，第257位酪氨酸相當於第246位酪氨酸，第287位絲氨酸相當於第276位絲氨酸，第411位絲氨酸相當於第400位絲氨酸，第470位蘇氨酸相當於第459位蘇氨酸，第509位蘇氨酸相當於第498位蘇氨酸，以及第574位酪氨酸相當於第563位酪氨酸，以及沒有相當於第339位絲氨酸的胺基酸殘基，因為該HMGR沒有相當於包含第339位絲氨酸的保守區域的保守區域。

而且，在SEQ ID NO：11所示的源自橡膠草(Taraxacum koksaghyz)的HMGR的情況下，第91位蘇氨酸相當於第81位蘇氨酸，第225位酪氨酸相當於第223位酪氨酸，第287位絲氨酸相當於第285位絲氨酸，第411位絲氨酸相當於第409位絲氨酸，第470位蘇氨酸相當於第468位蘇氨酸，第509位蘇氨酸相當於第507位蘇氨酸，以及第574位酪氨酸相當於第572位酪氨酸，並且沒有相當於第257位酪氨酸和第339位絲氨酸的胺基酸殘基，因為該HMGR沒有相當於分別包含第257位酪氨酸和第339位絲氨酸的保守區域的保守區域。

而且，在SEQ ID NO：70所示的源自橡膠樹的HMGR(HMG2)的情況下，第411位絲氨酸相當於第35位絲氨酸，第470位蘇氨酸相當於第94位蘇氨酸，第509位蘇氨酸相當於第133位蘇氨酸，以及第574位酪氨酸相當於第198位酪氨酸，並且沒有相當於第91位、225位、257位和第339位的胺基酸殘基，因為該HMGR沒有相當於分別包含第91位、225位、257位和第339位胺基酸殘基的保守區域的保守區域。

而且，在SEQ ID NO：71所示的源自橡膠樹的HMGR(HMG3)的情況下，第91位蘇氨酸相當於第81位蘇氨酸，第225位酪氨酸相當於第225位酪氨酸，第257位酪氨酸相當於第257位酪氨酸，第287位絲氨酸相當於第287位絲氨酸，第339位絲氨酸相當於第339位絲氨酸，第411位絲氨酸相當於第411位絲氨酸，第470位蘇氨酸相當於第470位蘇氨酸，第509位蘇氨酸相當於第509位蘇氨酸，以及第574位酪氨酸相當於第574位酪氨酸。

而且，在SEQ ID NO：72所示的源自橡膠樹的HMGR(HMG4)的情況下，第225位酪氨酸相當於第243位酪氨酸，第257位酪氨酸相當於第275位酪氨酸，第287位絲氨酸相當於第305位絲氨酸，第339位絲氨酸相當於第357位絲氨酸，第411位絲氨酸相當於第429位絲氨酸，第470位蘇氨酸相當於第488位蘇氨酸，第509位蘇氨酸相當於第527位蘇氨酸，以及第574位酪氨酸相當於第592位酪氨酸，並且沒有相當於第91位的蘇氨酸的胺基酸殘基，因為該HMGR沒有相當於包含第91位蘇氨酸的保守區域的保守區域。

而且，在SEQ ID NO：73所示的源自橡膠樹的HMGR(HMG5)的情況下，第91位蘇氨酸相當於第73位蘇氨酸，第225位酪氨酸相當於第243位酪氨酸，第287位絲氨酸相當於第305位絲氨酸，第339位絲氨酸相當於第357位絲氨酸，第411位絲氨酸相當於第429位絲氨酸，以及第470位蘇氨酸相當於第488位蘇氨酸，並且沒有相當於第257位酪氨酸和第509位蘇氨酸的胺基酸殘基，因為該HMGR沒有相當於包含第257位酪氨酸和第509位蘇氨酸的保守區域的保守區域。

包含前述實施例的具體實施例如下面表1所示。

本發明的突變的蛋白質是通過胺基酸殘基修飾得到的，其中選自由第91位、225位、257位、287位、339位、411位、470位、509位和574位胺基酸殘基、以及與前述相當的位置的胺基酸殘基構成的組的至少一種胺基酸殘基被缺失，或被其它胺基酸殘基取代。通過該修飾，可以根據需要在體內人工地控制特定胺基酸殘基的可逆的磷酸化，從而控制HMGR的酶活性以及甲羥戊酸產量。也可以控制類異戊二烯的產量，因為HMGR是類萜生物合成通路的限速酶。

該取代的其它胺基酸殘基沒有特別的限定，只要它與取代前的胺基酸不同即可，但是其優選為丙氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸或穀氨酸。當丙氨酸、苯丙氨酸或半胱氨酸被取代時，磷酸化變得不可能；然而通過取代為天冬氨酸或穀氨酸，可以模擬磷酸化以及得到組成性磷酸化狀態。缺失或取代的方法沒有特別地限定，可以使用已知的方法。例如，可以通過聚合酶鏈反應(PCR)缺失或取代特定胺基酸殘基，所述PCR使用與缺失或取代位點的核苷酸序列重疊的引物；其中編碼缺失或取代位點的胺基酸殘基的三個核苷酸全部被缺失，或被編碼要取代的其它胺基酸的核苷酸(1至3個核苷酸取代)所取代。

優選地，在HMGR中，選自由第91位、225位、257位、287位、339位、411位、470位、509位和574位胺基酸殘基、以及與前述相當的位置的胺基酸殘基構成的組的至少一種胺基酸殘基被天冬氨酸或穀氨酸取代。通過將胺基酸殘基取代為天冬氨酸或穀氨酸，可以模擬磷酸化狀態，或換言之獲得組成性磷酸化狀態，從而控制HMGR的酶活性。

而且，在HMGR中，優選選自由第91位、225位、257位、287位、339位、411位、470位、509位和574位胺基酸殘基、以及與前述相當的位置的胺基酸殘基構成的組的至少一種胺基酸殘基被缺失或被丙氨酸、苯丙氨酸或半胱氨酸取代。通過使該胺基酸殘基缺失或者將其取代為丙氨酸、苯丙氨酸或半胱氨酸，可以防止磷酸化，或換言之去除磷酸化位點，從而控制HMGR的酶活性。

所述缺失、丙氨酸取代、苯丙氨酸取代和半胱氨酸取代在去除磷酸化位點方面具有類似的效應，但是考慮到原始胺基酸殘基對蛋白質的作用，優選取代的胺基酸殘基具有與原始胺基酸殘基類似的結構(三維大小、佔用面積等)。具體而言，當原始胺基酸殘基是酪氨酸時，優選苯丙氨酸取代；當它為絲氨酸或蘇氨酸時為丙氨酸取代或半胱氨酸取代。

具體地，選自於由第91位和339位胺基酸殘基、以及與前述相當的位置的胺基酸殘基構成的組的至少一種胺基酸殘基優選被天冬氨酸或穀氨酸取代；更優選，選自於由第91位和339位胺基酸殘基、以及與前述相當的位置的胺基酸殘基構成的組的至少一種胺基酸殘基被天冬氨酸或穀氨酸取代。HMGR的酶活性可以通過這種取代而改善。

具體地，選自於由第91位和339位胺基酸殘基、以及與前述相當的位置的胺基酸殘基構成的組的至少一種胺基酸殘基優選被缺失，或被丙氨酸或苯丙氨酸取代。通過該取代，HMGR的酶活性將被抑制或維持，由於磷酸化可以被抑制，因此也可抑制磷酸化導致的酶活性的增加。

具體地，選自於由第225位、257位、287位、411位、470位、509位和574位的胺基酸殘基、以及與前述相當的位置的胺基酸殘基構成的組的至少一種胺基酸殘基優選被天冬氨酸或穀氨酸取代。通過這種取代，可以降低或消除HMGR的酶活性。

具體地，優選選自於由第225位、257位、287位、411位、470位、509位和574位胺基酸殘基、以及與前述相當的位置的胺基酸殘基構成的組的至少一種胺基酸殘基被缺失或被丙氨酸、苯丙氨酸或半胱氨酸取代。通過這種取代，可以維持HMGR的酶活性；由於磷酸化可以被抑制，因此也可以抑制由磷酸化導致的酶活性劣化。

因為即便是在保守區域含有不同的胺基酸殘基的HMGR也具有上述類似的功能，故HMGR沒有特別的限定，只要其具有相當於選自下組的至少一個保守區域的保守區域即可：由含有SEQ ID NO：1所示的擬南芥HMGR的第91位、225位、257位、287位、339位、411位、470位、509位和574位胺基酸殘基的保守區域構成的組；並且對其與SEQ ID NO:1所示的擬南芥HMGR的胺基酸序列的序列相似度沒有特定下限，但是該序列相似度優選為至少50％，更優選至少60％，還更優選至少75％，更優選至少78％，最優選至少80％。低於50％，其與上述各保守區域的序列相似度不在上述範圍之內。

除了SEQ ID NO：1所示的擬南芥(Arabidopsis thaliana)HMGR以外，HMGR的例子包括來自下述的HMGR：橡膠樹(Hevea brasiliensis)、水稻(Oryza sativa)、擬南芥、馬鈴薯(Solanum tuberosum L.)、番茄(Solanum lycopersicum)、南苜蓿(Medicago polymorpha)、萵苣(Lactuca sativa Lettuce)、橡膠草(Taraxacum koksaghyz)、短角蒲公英(Taraxacum brevicorniculatum)(一種產生橡膠的蒲公英)、灰白銀膠菊(Parthenium argentatum)、苦苣菜(Sonchus oleraceus)、木薯(Manihot esculenta)、杜仲(Eucommia ulmoides)、澤漆(Euphorbia helioscopia L.)。從這些之中，HMGR優選源自選自於由下述構成的組的至少一種植物：橡膠樹、萵苣(Lactuca sativa Lettuce)、橡膠草(Taraxacum koksaghyz)、短角蒲公英(Taraxacum brevicorniculatum)、灰白銀膠菊(Parthenium argentatum)、苦苣菜(Sonchus oleraceus)、木薯(Manihot esculenta)、擬南芥(Arabidopsis thaliana)、杜仲(Eucommia ulmoides)、澤漆(Euphorbia helioscopia L.)。橡膠樹(Hevea brasiliensis)HMGR是特別優選的。

本發明的HMGR可包括存在於一個生物物種中的多種HMGR，例如SEQ ID NO：1表示的HMG1(s)、在擬南芥HMGR的情況下，如SEQ ID NO：69等所示的HMG2、以及SEQ ID NO：10所示的HMG1、SEQ ID NO：70所示的HMG2、SEQ ID NO：71所示的HMG3、SEQ ID NO：72所示的HMG4、在橡膠樹HMGR的情況下，如SEQ ID NO：73等所示的HMG5。其它例子如表1所示。

本發明的突變的蛋白質可通過傳統的已知方法製備，即通過如下所述地製備重組載體，以及使用能夠表達靶蛋白的微生物、酵母、動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞、動物、昆蟲、植物等，以製備具有導入的編碼靶蛋白的基因的轉化體以表達靶蛋白。也可使用傳統已知方法純化本發明的的突變的蛋白質，例如，如果該突變的蛋白質和融合到靶蛋白的組氨酸標籤或類似物共同表達，則可以使用特定的柱子容易地純化突變的蛋白質。

可使用傳統已知的方法來確定本發明的突變的蛋白質的酶活性，例如一種製備具有導入的編碼靶蛋白的基因的轉化體的方法，所述靶蛋白使用例如大腸桿菌來表達，並通過將酶活性測量方法對應確定其活性從而確定靶蛋白功能的存在與否。

(基因)

本發明的基因是編碼突變的蛋白質的基因。由於該基因編碼突變的蛋白質，由該基因表達的突變的蛋白質可以用於控制HMGR酶活性以及甲羥戊酸產量。也可以控制類異戊二烯產量，因為HMGR是類萜生物合成通路的限速酶。

本發明的基因的例子包括具有SEQ ID NO：12的第1至1776個核苷酸的核苷酸序列的DNA，在嚴謹條件下與核苷酸序列和SEQ ID NO：12的第1至1776個核苷酸的核苷酸序列互補的DNA雜交並編碼具有HMGR活性的蛋白質的DNA；以及與SEQ ID NO：12的第1至1776個核苷酸的核苷酸序列的序列相似度具有至少60％、優選至少80％、更優選至少90％、還更優選至少95％，特別優選至少98％的DNA，所述DNA編碼具有HMGR活性的蛋白質。

此處所用的「雜交」是指將DNA與具有特定核苷酸序列的DNA，或該DNA的一部分進行雜交的步驟。因此，具有特定苷酸序列的DNA或該DNA的一部分的核苷酸序列的長度足夠用作Northern或Southern雜交分析的探針，或用作PCR分析中的寡核苷酸引物。用作探針的該DNA可具有至少100個鹼基的長度，優選至少200個鹼基，更優選至少500個鹼基，儘管它也可以是至少10個鹼基，長度方面優選至少15個鹼基的DNA。

執行DNA雜交試驗的技術是眾所周知的。根據例如分子克隆(Molecular Cloning)，第2版和第3版(2001)、通用和分子細菌學方法(Methods for General and Molecular Bacteriology)，ASM出版社(1994)、免疫學方法手冊，學院出版社(分子學)、以及很多其它標準教科書，可以確定實驗進行的雜交條件。

該嚴謹條件可包括，例如DNA固定化過濾器在42℃下過夜溫育，以及DNA探針溶於包含50％甲醯胺、5×SSC(750mM氯化鈉、75mM檸檬酸鈉)、50mM磷酸鈉(pH 7.6)、5×Denhardt's溶液、10％硫酸葡聚糖、以及20μg/l變性的鮭魚精子DNA的溶液中，隨後在大約65℃下，在例如0.2×SSC溶液中衝洗該過濾器。也可以使用較低的嚴謹條件。嚴謹性的變化可通過操控甲醯胺濃度(低比例的甲醯胺導致更低的嚴謹性)、鹽濃度或溫度完成。例如，較低的嚴謹條件包括在37℃下，在包含6×SSCE(20×SSCE:3mol/l氯化鈉、0.2mol/l磷酸二氫鈉、0.02mol/l的EDTA，pH 7.4)、0.5％SDS、30％甲醯胺、以及100μg/l的變性鮭魚精子DNA的溶液中過夜溫育，然後在50℃下在包含0.1％SDS的1×SSC溶液中衝洗。除此之外，為了得到更低的嚴謹性，雜交之後的衝洗可在上述較低的嚴謹條件下在較高鹽濃度(例如5×SSC)下完成。

上述不同條件中的變化可通過包含或取代用於抑制雜交實驗背景的封閉液來完成。為了兼容性，包含封閉液可能需要改變雜交條件。

可使用傳統已知方法來證實在上述嚴謹條件下與DNA雜交的DNA編碼特定蛋白質，以及例如該核苷酸序列可通過例如測序儀來證實。

(重組載體)

本發明的基因可以被導入到質粒中從而得到帶有編碼HMGR的基因的重組載體。該重組載體被用於在大腸桿菌等中表達靶蛋白，或作為製備另一轉化體的載體。用於導入的質粒沒有特別限定。

當該重組載體被用於表達靶蛋白時，該宿主優選但不限定於真核生物，儘管也可使用任何能夠表達靶蛋白的微生物、酵母、動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞、動物、昆蟲、植物等。

(轉化體)

本發明的基因可以被導入到宿主中以獲得帶有編碼上述HMGR的基因的轉化體。由於HMGR酶活性是在體內帶有導入基因的轉化體中獲得的，故使得增加、降低或控制甲羥戊酸的產量是可能的，其中所述靶蛋白在所述轉化體中表達，以及所述甲羥戊酸是通過HMGR催化和生物合成的。因此，通過產類異戊二烯的植物的轉化體可以推測控制類異戊二烯產量是可能的，因為HMGR活性在帶有導入基因的轉化體中被體內控制，所述HMGR是類異戊二烯生物合成通路的限速酶。

用於該轉化體的宿主沒有特別的限定，只要是帶有HMGR的有機物即可，但從這些之中，優選產類異戊二烯的植物以便於控制甲羥戊酸產量以及類異戊二烯產量。產類異戊二烯的植物的例子包括橡膠樹以及其它橡膠品種；苦苣菜(Sonchus oleraceus)、花葉滇苦菜(Sonchus asper)、長裂苦苣菜(Sonchus brachyotus)和其它苦苣菜品種；高大一枝黃花(Solidago altissima)、毛果一枝黃花亞種Asiatica(Solidago virgaurea subsp.Asiatica)、毛果一枝黃花亞種leipcarpa(Solidago virgaurea subsp.Leipcarpa)、毛果一枝黃花亞種leipcarpa f.paludosa(Solidago virgaurea subsp.leipcarpa f.paludosa)、毛果一枝黃花亞種Gigantea(Solidago virgaurea subsp.Gigantea)、巨大一枝黃花leiophylla(Solidago gigantea Ait.var.leiophylla Fernald)和其它一枝黃花屬品種；向日葵(Helianthus annuus)、絹毛葵(Helianthus argophyllus)、黑紫向日葵(Helianthus atrorubens)、瓜葉葵(Helianthus debilis)、千瓣葵(Helianthus decapetalus)、高葵花(Helianthus giganteus)和其它向日葵品種；蒲公英(Taraxacum)、蒲公英venustum H.Koidz(Taraxacum venustum H.Koidz)、蒲公英hondoense Nakai(Taraxacum hondoense Nakai)、寬果蒲公英(Taraxacum platycarpum Dahlst)、日本蒲公英(Taraxacum japonicum)、藥蒲公英(Taraxacum officinale Weber)、橡膠草(Taraxacum koksaghyz)、短角蒲公英(Taraxacum brevicorniculatum)(一種產生橡膠的蒲公英)和其它蒲公英品種；無花果(Ficus carica)、橡膠榕(Ficus elastica)、薜荔(Ficus pumila L.)、天仙果(Ficus erecta Thumb.)、菲律賓榕(Ficus ampelas Burm.f.)、黃果榕(Ficus benguetensis Merr.)、澀葉榕(Ficus irisana Elm.)、厚葉榕(Ficus microcarpa L.f.)、常綠榕(Ficus septica Burm.f.)、孟加拉榕(Ficus benghalensis)和其它榕品種；灰白銀膠菊(Parthenium argentatum)、銀膠菊(Parthenium hysterophorus)、豚草(Ambrosia artemisiifolia)(銀膠菊(Parthenium hysterophorus))和其它銀膠菊品種；澤漆(Euphorbia helioscopia L.)、大戟屬lasiocaula Boiss和其他大戟屬品種；和萵苣(Lactuca sativa Lettuce)和其它萵苣品種；木薯(Manihot esculenta)和其它木薯品種；杜仲(Eucommia ulmoides)和其它杜仲品種；擬南芥(Arabidopsis thaliana)和其它擬南芥品種；及類似物。從這些之中產類異戊二烯的植物優選為選自於由以下植物構成的組的至少一種：橡膠樹屬、苦苣菜屬、蒲公英屬、銀膠菊屬、萵苣屬、木薯屬、鼠耳芥屬、杜仲屬和大戟屬，更優選地為選自於由以下構成的組的至少一種：橡膠樹(Hevea brasiliensis)、萵苣(Lactuca sativa)、橡膠草(Taraxacum koksaghyz)、短角蒲公英(Taraxacum brevicorniculatum)、灰白銀膠菊(Parthenium argentatum)：,苦苣菜(Sonchus oleraceus)、木薯(Manihot esculenta)、擬南芥(Arabidopsis thaliana)、杜仲(Eucommia ulmoides)和澤漆(Euphorbia helioscopia L.)，並且更優選橡膠樹(Hevea brasiliensis)、萵苣(Lactuca sativa)或橡膠草(Taraxacum koksaghyz)。

上述重組載體可以用作表達載體，並可以使用能夠在宿主細胞中進行自我複製的那些或能夠包含到宿主細胞的染色體中的那些。

可以使用已知的表達載體，例如pET160、pBI或pUC載體、Ti質粒，以及菸草花葉病毒載體。

可以使用任何用於將DNA導入植物細胞的方法來導入重組載體。例子包括使用土壤農桿菌(JP-A S59-140885，JP-A S60-70080，WO 94/00977)、電穿孔方法(JP-A S60-251887)、以及使用粒子槍(JP-B 2606856，JP-B 2517813)等的方法。

可以通過上述或其它方法製備轉化體(轉基因植物細胞)。

(點突變育種)

也可通過突變育種技術製備具有修飾的HMGR的植物，所述突變育種技術使用相關位點的核苷酸序列作為育種標記物。可以使用下述作為突變育種技術：普通突變植物生產方法和普通突變篩選方法例如定向誘導基因組局部突變(TILLING)。由於本發明的基因作為點突變的結果被包含在突變體(突變的植物細胞)中，因此修飾後的HMGR被表達從而取代野生型HMGR以提供HMGR酶活性，從而可以增加、減少以及控制甲羥戊酸產量，所述甲羥戊酸是通過HMGR催化和生物合成的。因此，通過產類異戊二烯的植物的突變體，推測可以控制類異戊二烯產量，因此HMGR的活性在突變體中被控制，所述HMGR是類異戊二烯生物合成通路中的一個限速酶。

本發明也提供一種帶有本發明基因的產類異戊二烯的植物。該產類異戊二烯的植物沒有特別限定，只要它是帶有轉基因植物細胞或突變的植物細胞的產類異戊二烯的植物即可。從概念上，該產類異戊二烯的植物不僅包括如上所述製備的轉基因植物細胞或突變的植物細胞，而且也包括例如，它們的後代或克隆，甚至是通過這些細胞傳代獲得的後代植物。一旦得到具有導入到植物細胞基因組的DNA或載體的植物細胞或表達通過點突變修飾的HMGR的突變的植物細胞，可以通過有性繁殖或無性繁殖、組織培養、細胞培養、細胞融合、或其它技術從轉基因植物細胞或突變的植物細胞中得到它們的後代或克隆。而且，該轉基因植物細胞或突變的植物細胞，或它們的後代或克隆也可用於得到生殖材料(例如種子、水果、插條、塊莖、塊根、嫩枝、不定芽、不定胚、愈傷組織(calluse)、原生質體)，並且它們可以用於批量生產產類異戊二烯的植物。

從轉基因植物細胞或突變的植物細胞中使植物再生的技術是已知的，例如Doi等公開了用於桉樹的技術(JP-A H11-127025)，Fujimura等公開了用於水稻的技術(Fujimura等(1995)，植物組織培養通訊，第2卷第74頁)，Shillito等公開了用於玉米的技術((Shillito等(1989)，生物/技術，第7卷第581頁-)，Visser等公開了用於馬鈴薯的技術(Visser等(1989)，理論與應用遺傳學，第78卷第589頁-)，以及Akama等公開了用於擬南芥的技術(Akama等(1992)，植物細胞報告，第12卷第7頁-)。根據這些文件，本領域技術人員可以從轉基因植物細胞或突變的植物細胞中再生植物。

可以通過眾所周知的方法確定靶蛋白基因是否在再生的植物中表達。例如，可使用蛋白質印跡分析(western blot analysis)來評估靶蛋白的表達。

可以從轉基因植物或突變的植物中得到種子，例如如下所述：將轉基因植物或突變的植物植根於適當的介質中，然後移植到盆中含水的土壤中，在適當的培養條件下使其長大直至最終產生種子，然後收集種子。而且，植物也可以從種子開始長大，例如如下所述：將來自如上所述的轉基因植物或突變的植物的種子播種在含水土壤中，在適當的培養條件下使其成長為植物。

在本發明中，可以通過使用產類異戊二烯的植物來控制甲羥戊酸產量、類異戊二烯產量和類萜產量，所述產類異戊二烯的植物攜帶有本發明的基因以生產甲羥戊酸、類異戊二烯和類萜。具體而言，如上所述獲得的轉基因植物細胞或突變的植物細胞、從轉基因植物細胞或突變的植物細胞得到的愈傷組織、從該愈傷組織再分化的細胞、或其類似物可以在適當的介質中被培養，或者從轉基因植物細胞中再生的轉基因植物、從突變的植物細胞中再生的突變的植物、由從轉基因植物或突變的植物中得到的種子成長而來的植物、或其類似物可以在適當的培養條件下成長以生產甲羥戊酸、類異戊二烯和類萜。由於甲羥戊酸、類異戊二烯和類萜生物合成通路中的限速酶的酶活性被本發明的轉化體或突變體中的修飾的蛋白質控制，因此可以控制通過所述蛋白質(酶)催化並生物合成的甲羥戊酸的產量，從而控制類異戊二烯產量以及進一步地，類萜產量。

在說明書中，「類萜」是個通用術語，用於指具有異戊二烯(C5H8)單元的聚合物。類萜的例子包括聚合物例如單萜(C10)、倍半萜烯(C15)、雙萜(C20)、二倍半萜(C25)、三萜烯(C30)、四萜烯(C40)以及天然橡膠。在說明書中，「類異戊二烯」是指具有異戊二烯(C5H8)單元的化合物，並且從概念上講包括類萜。

在本發明中，可以通過修飾上述9種胺基酸殘基的至少一種胺基酸殘基來控制甲羥戊酸產量、類異戊二烯產量和類萜產量，但是如果對這9種胺基酸殘基中的兩種以上進行修飾，則本發明的效果會更顯著。

實施例

結合實施例，將詳細解釋本發明，但是本發明並不限於這些實施例。

(新的磷酸化位點存在的啟發性證據)

具有將擬南芥的HMGR1的第577位絲氨酸替換為丙氨酸的突變的HMGR1(以下稱之為S577A-HMGR1)，被轉染至缺少內源性HMGR1的擬南芥突變體以生產表達S577A-HMGR1的擬南芥轉化體，其中已知絲氨酸577的磷酸化會降低酶活性。從表達S577A-HMGR1(HMGR是ER定位的膜蛋白)的該轉基因植物中收集ER組分。當包含S577A-HMGR1的ER組分經磷酸酶處理後，發現其酶活性以與下述相同的方式增加：即當包含來自表達野生型HMGR1的擬南芥的野生型HMGR的ER組分經磷酸酶處理後。蛋白印跡法證實表達S577A-HMGR1的轉基因植物和表達野生型HMGR1的轉基因植物中積累的HMGR含量具有可比性。這表明除了已知的磷酸化位點(絲氨酸577)之外，還存在參與控制HMGR的酶活性的新的磷酸化位點(胺基酸殘基)。

(計算機模擬(in silico)幹擾HMGR磷酸化位點)

對表1所示植物執行多個序列比對以尋找高度保守的序列部分(保守區域)。同時，從全長序列中篩選出可能經歷磷酸化的胺基酸殘基，並從這些殘基中選擇保守區域中包含的預期的磷酸化位點。該結果如表1所示。

用於進行多序列比對的軟體被稱為IdentityX，以及用於篩選可能經歷磷酸化的胺基酸殘基(磷酸化位點)的軟體被稱為PhosPhAt。

(構建HMGR表達載體)

SEQ ID NO：12的序列，其為SEQ ID NO：1所示的源自擬南芥的HMGR的S型DNA序列(以下稱之為HMG1S)，使用下述引物通過PCR進行擴增。使用大腸桿菌通過熱休克方法將所得PCR產物克隆至pENTR/D-TOPO以得到被稱為pENTR/HMG1S的入門載體。使用DH5α作為大腸桿菌通過pENTR Directional TOPO克隆試劑盒來製備入門載體。

(引物1：SEQ ID NO:13)

5'-CACCATGGATCTCCGTCGGAGGCCTC-3'

(引物2：SEQ ID NO:14)

5'-CGCCTCGAGTCATGTTGTTGTTGTTGTCG-3'

(製備表達載體(重組載體))

使用以上得到的pENTR/HMG1S，將靶蛋白的部分基因序列重組並轉染至pET160-DEST以得到pDEST/HMG1S表達載體。將Gateway系統(Invitrogen)的LR反應用於重組反應。

(製備突變的HMGR表達載體)

使用pDEST/HMG1作為模板通過PrimeSTAR HS(Takara)執行PCR反應。每份PCR反應溶液的樣品(25μl)的組成為1至5ng質粒，0.75μl各個如下所示的用於各突變的正向或反向引物(各10pmol/μl)、5μl的5×primestar緩衝液(Mg2+)、2μl的dNTPmix、0.25μl的primestar HS、以及15.75μl的milliQ水。使用下述預定的反應循環執行PCR：步驟1：98℃下2分鐘，步驟2：98℃下10秒，步驟3：60℃下15秒，步驟4：在68℃下8分鐘，步驟2至4重複17次。一部分PCR產物(7μl)被電泳，當觀察到擴增時，將0.2μl的DpnI添加到剩下的PCR產物中，並在37℃反應3小時。將2μl反應溶液添加到20μl自製的大腸桿菌(DH5α)化學感受態細胞，並且通過熱休克方法轉化細胞。所有的細菌培養均接種到包含50μg/ml的氨苄青黴素的LB瓊脂培養基中並在37℃下過夜培養。在培養之後，通過克隆PCR篩選得到的克隆。使用Qiagen質粒小量提取試劑盒執行質粒提取，並通過測序確認突變插入以得到期望的突變的HMG1S表達載體。通過該方法製備總共34種突變的HMG1S表達載體。也包括作為陽性對照的絲氨酸-577突變的HMG1S。使用ABI3130XI測序儀通過BigDye Terminator Cycle Sequencing V3.0Ready Reaction Kit(美國應用生物系統)進行序列確認。

用於製備各突變的HMG1S的引物如下所示。

(用於HMG1S的第225位突變酪氨酸的引物)

(用於pHMG1S/Y225F的引物)

(引物3(正向)：SEQ ID NO:15)

5』-ttgatTTTgaatcgattttggggcaatgc-3』

(引物4(反向)：SEQ ID NO:16)

5』-ttgatTTTgaatcgattttggggcaatgc-3』

(用於pHMG1S/Y225D的引物)

(引物5(正向)：SEQ ID NO:17)

5』-ttaccgttggatggatttgatGATgaatcgattttggggcaatgc-3』

(引物6(反向)：SEQ ID NO:18)

5』-gcattgccccaaaatcgattcGGCatcaaatccatccaacggtaa-3』

(用於pHMG1S/Y225E的引物)

(引物7(正向)：SEQ ID NO:19)

5』-ttaccgttggatggatttgatGAGgaatcgattttggggcaatgc-3』

(引物8(反向)：SEQ ID NO:20)

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(用於pHMG1S/Y257D的引物)

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(用於pHMG1S/Y574F的引物)

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(用於pHMG1S/Y574D的引物)

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(用於pHMG1S/Y574E的引物)

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(引物68(反向)：SEQ ID NO:104)

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(用於pHMG1S/S577A的引物)

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5』-caatagaGCCagccgagacatctctggagcaacg-3』

(引物52(反向)：SEQ ID NO:64)

5』-cggctGGCtctattgtatttcatgtgacttctcac-3』

(用於pHMG1S/S577D的引物)

(引物53(正向)：SEQ ID NO:65)

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(引物54(反向)：SEQ ID NO:66)

5』-gctccagagatgtctcggctGTCtctattgtatttcatgtgac-3』

(用於pHMG1S/S577E的引物)

(引物55(正向)：SEQ ID NO:67)

5』-gtcacatgaaatacaatagaGAAagccgagacatctctggagc-3』

(引物56(反向)：SEQ ID NO:68)

5』-gctccagagatgtctcggctTTCtctattgtatttcatgtgac-3』

(製備表達突變的HMGR的轉化體)

使用上述得到的各突變的HMG1S表達載體，通過熱休克方法轉化大腸桿菌，以獲得表達各突變的HMG1S的轉化體。BL21star(DE3)用作大腸桿菌。

(突變的HMGR的表達)

上述得到的表達各突變的HMG1S的各大腸桿菌轉化體在2ml LB液體培養基中在37℃下過夜培養，培養之後的細菌培養物被轉移至50ml LB液體培養基中，然後在37℃下搖床培養2小時，隨後添加IPTG至終濃度為0.5mM，並在20℃下培養細胞6小時。向全部LB液體培養基中添加氨苄青黴素至濃度為50μg/ml。在完成所有培養步驟之後，將全部量的各細菌培養物在4℃下以5000g離心5分鐘以收集細胞，然後在–20℃下保存顆粒。

(收集和純化突變的HMGR)

將以上得到的各細菌細胞樣品溶解到添加了100μM AEBSF、10μM亮抑酶肽、10mM DTT以及0.1％溶解酵素的結合緩衝液(40mM磷酸鈉(pH8.0)、1mM EDTA、300mM氯化鈉、0.1％TritonX-100、10％甘油、0.8mM咪唑)中。該細菌細胞在冰上冷卻時通過Sonifier 450超聲波儀(Branson)被破碎(破碎條件：工作周期(duty cycle)為50％，輸出控制(output control)為2.5，1分鐘×3)。然後在4℃下以15,000rpm離心15分鐘，並將事先用結合緩衝液衝洗三次的100μl Ni-NTA瓊脂糖(Qiagen)添加到上清液中。將混合物在4℃下旋轉搖動1小時，然後在4℃和8000rpm下離心5分鐘。然後將樹脂轉移至空柱子上(Bio-Rad)，並使用衝洗緩衝液(20mM咪唑、其它成分與結合緩衝液類似)衝洗三次。將添加了100μM AEBSF、10μM亮抑酶肽和10mM DTT的15μl洗脫液(430mM咪唑，其它成分與結合緩衝液類似)添加到樹脂上，然後將其在4℃以15,000rpm離心1分鐘進行洗脫。將另外的20μl洗脫液添加到樹脂，然後通過在4℃以15,000rpm離心1分鐘來洗脫。得到總共35μl組氨酸標籤純化的突變的HMG1S蛋白質溶液。

通過聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)確認得到的各蛋白質的數量和純度。針對定量，對BSA標準溶液(100ng、300ng、1μg)同時進行電泳，進行CBB染色之後使用Gel Doc XR+和Image Lab，從凝膠中檢測並確定帶的強度。

(確定突變的HMGR的酶活性)

將1.65ng純化之後得到的各HMG1S突變體添加到反應溶液(1mM NADPH、0.4mg/ml BSA、40mM磷酸鈉(pH 8.0)、1mM EDTA、50mM氯化鈉、1％TritonX-100、10％甘油、4mM DTT)中，並在37℃下預溫育5分鐘，隨後添加20μM 14C標記的HMG-CoA(Perkin Elmer)(反應溶液終體積為26μl)，以及混合物在37℃反應15分鐘。添加5μl的1mg/ml的甲羥戊酸內酯和5μl 6N鹽酸，然後將混合物在室溫下停留15分鐘，然後通過添加125μl飽和的pH6.0的磷酸鉀緩衝液來中和混合物。添加300μl乙酸乙酯，並劇烈混合，然後將混合物在20℃下以15,000rpm離心5分鐘。在液體閃爍計數儀中，分析上清液中的乙酸乙酯層的放射性。各突變的HMG1S的酶活性結果如表2所示。酶活性表示為比活性，其中野生型HMG1S設置為等於1。

[表1]

在表1中，括號中的數字代表與用作標準的擬南芥HMGR(S型)的各保守區域的序列相似度的百分比(％)。「-」是指不存在相應的保守區域或特定胺基酸殘基。

根據表1，可以發現在帶有保守區域的其它類型HMGR中，存在對應前述胺基酸殘基的胺基酸殘基，其中所述保守區域相當於含有如SEQ ID NO：1所示的擬南芥HMGR(HMG1S)的第91位、225位、257位、287位、339位、411位、470位、509位和574位胺基酸殘基的保守區域。

在表2中，「-」意味著酶活性被消除，而分數為1或以上是指酶活性高於野生型。

根據表2的結果，首先表明當選自由SEQ ID NO：1所示的擬南芥HMGR的第225位、257位、287位、411位、470位、509位和574位胺基酸殘基構成的組的至少一種胺基酸殘基被天冬氨酸或穀氨酸取代時，酶活性被降低或消除。

同時它也表明，當選自由SEQ ID NO：1所示的擬南芥HMGR的第225位、257位、287位、411位、470位、509位和574位胺基酸殘基構成的組的至少一種胺基酸殘基被丙氨酸或苯丙氨酸取代時，與野生型相比，其酶活性降低但是也相對維持穩定。這表明其可以阻止體內磷酸化，並因此防止因那些位點的磷酸化而導致的酶活性抑制，因此可以維持穩定的酶活性。

接下來，當選自由SEQ ID NO：1所示的擬南芥HMGR第91位和339位胺基酸殘基構成的組的至少一種胺基酸殘基被天冬氨酸或穀氨酸取代時，酶活性增加。

也表明，當丙氨酸取代SEQ ID NO：1所示的擬南芥HMGR的第91位和/或339位胺基酸殘基時，其酶活性與野生型HMGR相比增加，但是低於那些假磷酸化的突變體。

這是顯然的，因為在野生型中，這些胺基酸殘基根據需要在體內被磷酸化，因此其酶活性被認為因為磷酸化而增加，在具有丙氨酸取代的能夠抑制磷酸化的突變體中，酶活性被維持或被抑制。

然而，結果表明，當丙氨酸、天冬氨酸或穀氨酸取代SEQ ID NO：1所示的擬南芥HMGR的第48位胺基酸殘基時，酶活性與野生型沒有區別，因此HMGR酶活性是不可控的。

這些結果表明，HMGR酶活性可以通過使選自於由SEQ ID NO：1所示的擬南芥HMGR的第91位、225位、257位、287位、339位、411位、470、509和574位胺基酸殘基構成的組的至少一種胺基酸被缺失、或被其它胺基酸殘基取代來控制。

表1和2的結果也可以證明，HMGR酶活性可以通過使選自於由SEQ ID NO：1所示的擬南芥HMGR的第91位、225位、257位、287位、339位、411位、470、509位和574位胺基酸殘基構成的組的至少一種胺基酸殘基被缺失，或被其它胺基酸殘基取代來控制。

這是顯然的，在表達突變的蛋白質的轉化體中甲羥戊酸產量以及類異戊二烯產量和類萜產量也是可控的，其中選自於由SEQ ID NO：1所示的擬南芥HMGR第91位、225位、257位、287位、339位、411位、470位、509位和574位胺基酸殘基構成的組的至少一種胺基酸殘基被缺失或被其它胺基酸殘基取代。

(構建HbHMGR表達載體)

SEQ ID NO：105的序列，其為SEQ ID NO：10所示的來自橡膠樹的HMG1的DNA序列(以下稱之為HbHMG1)，使用下述引物通過PCR進行擴增。將得到的PCR產物使用大腸桿菌通過熱休克方法克隆至pENTR/D-TOPO以得到稱為pENTR/HbHMG1的入門載體。使用DH5α大腸桿菌，通過pENTR Directional TOPO克隆試劑盒製備入門載體。

(引物69：SEQ ID NO:106)

5'-CACCATGGACACCACCGGCCGGCTCCACCAC-3'

(引物70：SEQ ID NO:107)

5'-CGCCTCGAGTCAAGATGCAGCTTTAGACAT-3'

(製備表達載體(重組載體))

使用pENTR/HbHMG1，將靶蛋白的部分基因序列進行重組並轉染至pET160-DEST中以得到表達載體pDEST-HbHMG1。Gateway系統(Invitrogen)的LR反應用於重組反應。

(製備突變的HbHMGR表達載體)

使用pDEST/HbHMG1作為模板通過PrimeSTAR HS(Takara)執行PCR反應。每份((25μl)PCR反應溶液樣品的組成為1-5ng質粒、0.75μl如下所示的用於各突變的正向或反向引物、5μl用於primestar(Mg2+)的5×緩衝液、2μl dNTPmix、0.25μl primestar HS、以及15.75μl milliQ水。使用下述預定反應循環執行PCR：步驟1：在98℃下2分鐘，步驟2：98℃下10秒鐘，步驟3：60℃下15秒，步驟4：68℃下8分鐘，步驟2至4重複17分鐘。將一部分PCR產物(7μl)進行電泳，並且當觀察到擴增時，向PCR殘留產物中添加0.2μl DpnI，並在37℃下反應3小時。將2μl反應溶液添加到20μl自製的大腸桿菌(DH5α)化學感受態細胞中，然後通過熱休克方法轉化細胞。將全部細菌培養物接種至包含50μg/ml氨苄青黴素的LB瓊脂培養基中，並在37℃下過夜培養。在培養之後，通過克隆PCR篩選得到的克隆。通過Plasmid迷你試劑盒(Qiagen)執行質粒提取，並通過測序確認突變的插入以獲得期望的突變的HbHMG1表達載體。通過該方法製備了總共21種突變的HbHMG1表達載體。包括作為陽性對照的絲氨酸-566位(相當於擬南芥的HMG1S的577位絲氨酸)突變的HbHMG1。使用ABI3130XI測序儀通過BigDye Terminator Cycle Sequencing V3.0Ready Reaction Kit(美國應用生物系統公司)進行序列確認。

製備各突變的HbHMG1中使用的引物如下所示。

(用於pHbHMG1/Y214F的引物)

(引物71(正向)：SEQ ID NO:108)

5』-gtagaagggttcgatTTCgagtcgattttaggac-3』

(引物72(反向)：SEQ ID NO:109)

5』-gtcctaaaatcgactcGAAatcgaacccttctac-3』

(用於pHbHMG1/Y214E的引物)

(引物73(正向)：SEQ ID NO:110)

5』-gtagaagggttcgatGAAgagtcgattttaggaca-3』

(引物74(反向)：SEQ ID NO:111)

5』-tgtcctaaaatcgactcTTCatcgaacccttctac-3』

(用於pHbHMG1/Y246F的引物)

(引物75(正向)：SEQ ID NO:112)

5』-gctgaacgggcgggagTTCtctgttccaatggc-3』

(引物76(反向)：SEQ ID NO:113)

5』-gccattggaacagaGAActcccgcccgttcagc-3』

(用於pHbHMG1/Y246E的引物)

(引物77(正向)：SEQ ID NO:114)

5』-gctgaacgggcgggagGAAtctgttccaatggc-3』

(引物78(反向)：SEQ ID NO:115)

5』-gccattggaacagaTTCctcccgcccgttcagc-3』

(用於pHbHMG1/S400A的引物)

(引物79(正向)：SEQ ID NO:116)

5』-gaaggacgtggcaaaGCCgttgtttgtgag-3』

(引物80(反向)：SEQ ID NO:117)

5』-ctcacaaacaacGGCtttgccacgtccttc-3』

(用於pHbHMG1/S400D的引物)

(引物81(正向)：SEQ ID NO:118)

5』-tgaaggacgtggcaaaGACgttgtttgtgaggcaattatcaag-3』

(引物82(反向)：SEQ ID NO:119)

5』-cttgataattgcctcacaaacaacGTCtttgccacgtccttca-3』

(用於pHbHMG1/S400E的引物)

(引物83(正向)：SEQ ID NO:120)

5』-tgaaggacgtggcaaaGAAgttgtttgtgaggcaattatcaag-3』

(引物84(反向)：SEQ ID NO:121)

5』-cttgataattgcctcacaaacaacTTCtttgccacgtccttca-3』

(用於pHbHMG1/T459C的引物)

(引物85(正向)：SEQ ID NO:122)

5』-ctgcaatctttattgccTGTggccaggatccagc-3』

(引物86(反向)：SEQ ID NO:123)

5』-gctggatcctggccACAggcaataaagattgcag-3』

(用於pHbHMG1/T459D的引物)

(引物87(正向)：SEQ ID NO:124)

5』-tcgtatctgcaatctttattgccGATggccaggatccagcacaga-3』

(引物88(反向)：SEQ ID NO:125)

5』-tctgtgctggatcctggccATCggcaataaagattgcagatacga-3』

(用於pHbHMG1/T459E的引物)

(引物89(正向)：SEQ ID NO:126)

5』-tcgtatctgcaatctttattgccGAAggccaggatccagcacaga-3』

(引物90(反向)：SEQ ID NO:127)

5』-tctgtgctggatcctggccTTCggcaataaagattgcagatacga-3』

(用於pHbHMG1/T498C的引物)

(引物91(正向)：SEQ ID NO:128)

5』-ctccattgaggtgggtTGTgtcggaggtggaactc-3』

(引物92(反向)：SEQ ID NO:129)

5』-gagttccacctccgacACAacccacctcaatggag-3』

(用於pHbHMG1/T498D的引物)

(引物93(正向)：SEQ ID NO:130)

5』-accatgccctccattgaggtgggtGACgtcggaggtggaactcaac-3』

(引物94(反向)：SEQ ID NO:131)

5』-gttgagttccacctccgacGTCacccacctcaatggagggcatggt-3』

(用於pHbHMG1/T498E的引物)

(引物95(正向)：SEQ ID NO:132)

5』-accatgccctccattgaggtgggtGAAgtcggaggtggaactcaac-3』

(引物96(反向)：SEQ ID NO:133)

5』-gttgagttccacctccgacTTCacccacctcaatggagggcatggt-3』

(用於pHbHMG1/S566A的引物)

(引物97(正向)：SEQ ID NO:134)

5』-gtcacatgaagtacaacagaGCCagcaaagatatgtctaaagct-3』

(引物98(反向)：SEQ ID NO:135)

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(用於pHbHMG1/S566D的引物)

(引物99(正向)：SEQ ID NO:136)

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(引物100(反向)：SEQ ID NO:137)

5』-agctttagacatatctttgctGTCtctgttgtacttcatgtgact-3』

(用於pHbHMG1/S276A的引物)

(引物101(正向)：SEQ ID NO:138)

5』-cttgtcaggtggggccaccGCCgtcttgttgaaggatggcatgac-3』

(引物102(反向)：SEQ ID NO:139)

5』-gtcatgccatccttcaacaagacGGCggtggccccacctgacaag-3』

(用於pHbHMG1/S276D的引物)

(引物103(正向)：SEQ ID NO:140)

5』-caggtggggccaccGACgtcttgttgaagg-3』

(引物104(反向)：SEQ ID NO:141)

5』-ccttcaacaagacGTCggtggccccacctg-3』

(用於pHbHMG1/S276E的引物)

(引物105(正向)：SEQ ID NO:142)

5』-cttgtcaggtggggccaccGAAgtcttgttgaaggatggcatgac-3』

(引物106(反向)：SEQ ID NO:143)

5』-gtcatgccatccttcaacaagacTTCggtggccccacctgacaag-3』

(用於pHbHMG1/Y563F的引物)

(引物107(正向)：SEQ ID NO:144)

5』-gtcaagagtcacatgaagTTCaacagatccagc-3』

(引物108(反向)：SEQ ID NO:145)

5』-gctggatctgttGAActtcatgtgactcttgac-3』

(用於pHbHMG1/Y563D的引物)

(引物109(正向)：SEQ ID NO:146)

5』-gtcaagagtcacatgaagGACaacagatccagc-3』

(引物110(反向)：SEQ ID NO:147)

5』-gctggatctgttGTCcttcatgtgactcttgac-3』

(用於pHbHMG1/Y563E的引物)

(引物111(正向)：SEQ ID NO:148)

5』-gtcaagagtcacatgaagGAAaacagatccagc-3』

(引物112(反向)：SEQ ID NO:149)

5』-gctggatctgttTTCcttcatgtgactcttgac-3』

(製備表達突變的HbHMGR的轉化體)

使用上述得到的各突變的HbHMG1表達載體，通過熱休克方法轉化大腸桿菌，以獲得表達各突變的HbHMG1的轉化體。BL21Star(DE3)用作大腸桿菌。

(突變的HbHMGR的表達)

上述得到的表達各突變的HbHMG1的各大腸桿菌轉化體在2ml LB液體培養基中在37℃下過夜培養，培養之後的細菌培養物被轉移至50ml LB液體培養基中，然後在37℃下搖床培養2小時，隨後添加IPTG至終濃度為0.5mM，並在20℃下培養細胞6小時。向全部LB液體培養基中添加氨苄青黴素至濃度為50μg/ml。在完成所有培養步驟之後，將全部量的各細菌培養物在4℃下以5000g離心5分鐘以收集細胞，然後在–20℃下保存顆粒。

(收集和純化突變的HbHMGR)

將以上得到的各細菌細胞樣品溶解到添加了100μM AEBSF、10μM亮抑酶肽、10mM DTT以及0.1％溶解酵素的結合緩衝液(40mM磷酸鈉(pH8.0)、1mM EDTA、300mM氯化鈉、0.1％TritonX-100、10％甘油、0.8mM咪唑)中。該細菌細胞在冰上冷卻時通過Sonifier450超聲波儀(Branson)被破碎(破碎條件：工作周期(duty cycle)為50％，輸出控制(output control)為2.5，1分鐘×3)。然後在4℃下以15,000rpm離心15分鐘，並將事先用結合緩衝液衝洗三次的100μl Ni-NTA瓊脂糖(Qiagen)添加到上清液中。將混合物在4℃下旋轉搖動1小時，然後在4℃和8000rpm下離心5分鐘。然後將樹脂轉移至空柱子上(Bio-Rad)，並使用衝洗緩衝液(20mM咪唑、其它成分與結合緩衝液類似)衝洗三次。將添加了100μM AEBSF、10μM亮抑酶肽和10mM DTT的15μl洗脫液(430mM咪唑，其它成分與結合緩衝液類似)添加到樹脂上，然後將其在4℃以15,000rpm離心1分鐘進行洗脫。將另外的20μl洗脫液添加到樹脂，然後通過在4℃以15,000rpm離心1分鐘來洗脫。得到總共35μl組氨酸標籤純化的突變的HMG1S蛋白質溶液。

通過聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)確認得到的各蛋白質的數量和純度。針對定量，對BSA標準溶液(100ng、300ng、1μg)同時進行電泳，進行CBB染色之後使用Gel Doc XR+和Image Lab從凝膠中檢測並確定帶的強度。

(確定突變的HbHMGR的酶活性)

將1.65ng純化之後得到的各HbHMG1突變體添加到反應溶液(1mM NADPH、0.4mg/ml BSA、40mM磷酸鈉(pH 8.0)、1mM EDTA、50mM氯化鈉、1％TritonX-100、10％甘油、4mMDTT)中，並在37℃下預溫育5分鐘，隨後添加20μM 14C標記的HMG-CoA(Perkin Elmer)(反應溶液終體積為26μl)，以及混合物在37℃反應15分鐘。添加5μl的1mg/ml的甲羥戊酸內酯和5μl 6N鹽酸，然後將混合物在室溫下停留15分鐘，然後通過添加125μl飽和的pH6.0的磷酸鉀緩衝液來中和混合物。添加300μl乙酸乙酯，並劇烈混合，然後將混合物在20℃下以15,000rpm離心5分鐘。在液體閃爍計數儀中，分析上清液中的乙酸乙酯層的放射性。各突變的HbHMG1的酶活性結果如表3所示。酶活性表示為比活性，並且野生型HMG1S的酶活性設為等於1。

在表3中，「-」意味著酶活性被消除，而分數為1或以上是指酶活性高於野生型。

根據表3的結果，首先表明當選自由SEQ ID NO：10所示的橡膠樹HMG1的第214位、246位、276位、400位、459位、498位和563位胺基酸殘基構成的組的至少一種胺基酸殘基被天冬氨酸或穀氨酸取代時，酶活性被降低或消除。

同時它也表明，當選自SEQ ID NO：10所示的橡膠樹HMG1的第214位、246位、276位、400位、459位、498位和563位胺基酸殘基的至少一種胺基酸殘基被丙氨酸、苯丙氨酸或半胱氨酸取代時，其酶活性與野生型相當或者低於野生型但是也相對維持穩定。這表明其可以阻止體內磷酸化，並因此防止因那些位點的磷酸化而導致的酶活性抑制，因此可以維持穩定的酶活性。

序列表部分的自由文字

SEQ ID NO:1：源自擬南芥(Arabidopsis thaliana)的HMGR(S型)的胺基酸序列

SEQ ID NO:2：包含SEQ ID NO：1的擬南芥(Arabidopsis thaliana)中第48位胺基酸殘基的保守區域的胺基酸序列

SEQ ID NO:3：包含SEQ ID NO：1的擬南芥(Arabidopsis thaliana)中第91位胺基酸殘基的保守區域的胺基酸序列

SEQ ID NO:4：包含SEQ ID NO：1的擬南芥(Arabidopsis thaliana)中第225位胺基酸殘基的保守區域的胺基酸序列

SEQ ID NO:5：包含SEQ ID NO：1的擬南芥(Arabidopsis thaliana)中第257位胺基酸殘基的保守區域的胺基酸序列

SEQ ID NO:6：包含SEQ ID NO：1的擬南芥(Arabidopsis thaliana)中第339位胺基酸殘基的保守區域的胺基酸序列

SEQ ID NO:7：包含SEQ ID NO：1的擬南芥(Arabidopsis thaliana)中第411位胺基酸殘基的保守區域的胺基酸序列

SEQ ID NO:8：包含SEQ ID NO：1的擬南芥(Arabidopsis thaliana)中第470位胺基酸殘基的保守區域的胺基酸序列

SEQ ID NO:9：包含SEQ ID NO：1的擬南芥(Arabidopsis thaliana)中第509位胺基酸殘基的保守區域的胺基酸序列

SEQ ID NO:10：源自橡膠樹(Hevea brasiliensis)的HMG1的胺基酸序列

SEQ ID NO:11：源自橡膠草(Taraxacum koksaghyz)的HMGR的胺基酸序列

SEQ ID NO:12：編碼源自擬南芥(Arabidopsis thaliana)的HMGR(S型)的基因的核苷酸序列

SEQ ID NO:13：引物1

SEQ ID NO:14：引物2

SEQ ID NO:15：引物3

SEQ ID NO:16：引物4

SEQ ID NO:17：引物5

SEQ ID NO:18：引物6

SEQ ID NO:19：引物7

SEQ ID NO:20：引物8

SEQ ID NO:21：引物9

SEQ ID NO:22：引物10

SEQ ID NO:23：引物11

SEQ ID NO:24：引物12

SEQ ID NO:25：引物13

SEQ ID NO:26：引物14

SEQ ID NO:27：引物15

SEQ ID NO:28：引物16

SEQ ID NO:29：引物17

SEQ ID NO:30：引物18

SEQ ID NO:31：引物19

SEQ ID NO:32：引物20

SEQ ID NO:33：引物21

SEQ ID NO:34：引物22

SEQ ID NO:35：引物23

SEQ ID NO:36：引物24

SEQ ID NO:37：引物25

SEQ ID NO:38：引物26

SEQ ID NO:39：引物27

SEQ ID NO:40：引物28

SEQ ID NO:41：引物29

SEQ ID NO:42：引物30

SEQ ID NO:43：引物31

SEQ ID NO:44：引物32

SEQ ID NO:45：引物33

SEQ ID NO:46：引物34

SEQ ID NO:47：引物35

SEQ ID NO:48：引物36

SEQ ID NO:49：引物37

SEQ ID NO:50：引物38

SEQ ID NO:51：引物39

SEQ ID NO:52：引物40

SEQ ID NO:53：引物41

SEQ ID NO:54：引物42

SEQ ID NO:55：引物43

SEQ ID NO:56：引物44

SEQ ID NO:57：引物45

SEQ ID NO:58：引物46

SEQ ID NO:59：引物47

SEQ ID NO:60：引物48

SEQ ID NO:61：引物49

SEQ ID NO:62：引物50

SEQ ID NO:63：引物51

SEQ ID NO:64：引物52

SEQ ID NO:65：引物53

SEQ ID NO:66：引物54

SEQ ID NO:67：引物55

SEQ ID NO:68：引物56

SEQ ID NO:69：源自擬南芥(Arabidopsis thaliana)的HMG2的胺基酸序列

SEQ ID NO:70：源自橡膠樹(Hevea brasiliensis)的HMG2的胺基酸序列

SEQ ID NO:71：源自橡膠樹(Hevea brasiliensis)的HMG3的胺基酸序列

SEQ ID NO:72：源自橡膠樹(Hevea brasiliensis)的HMG4的胺基酸序列

SEQ ID NO:73：源自橡膠樹(Hevea brasiliensis)的HMG5的胺基酸序列

SEQ ID NO:74：源自萵苣(Lactuca sativa Lettuce)的HMGR(TC18019)的胺基酸序列

SEQ ID NO:75：源自萵苣(Lactuca sativa Lettuce)的HMGR(TC23858)的胺基酸序列

SEQ ID NO:76：源自萵苣(Lactuca sativa Lettuce)的HMGR(TC19509)的胺基酸序列

SEQ ID NO:77：源自萵苣(Lactuca sativa Lettuce)的HMGR(TC22046)的胺基酸序列

SEQ ID NO:78：源自萵苣(Lactuca sativa Lettuce)的HMGR(TC22228)的胺基酸序列

SEQ ID NO:79：源自萵苣(Lactuca sativa Lettuce)的HMGR(TC23348)的胺基酸序列

SEQ ID NO:80：源自木薯(Manihot esculenta)的HMGR(003982m)的胺基酸序列

SEQ ID NO:81：源自木薯(Manihot esculenta)的HMGR(004209m)的胺基酸序列

SEQ ID NO:82：源自杜仲(Eucommia ulmondes)的HMGR的胺基酸序列

SEQ ID NO:83：源自澤漆(Euphorbia helioscopia L.)的HMGR的胺基酸序列

SEQ ID NO:84：源自水稻(Oryza sativa)的HMG1的胺基酸序列

SEQ ID NO:85：源自馬鈴薯(Solanum tuberosum L.)的HMG1的胺基酸序列

SEQ ID NO:86：源自馬鈴薯(Solanum tuberosum L.)的HMG2的胺基酸序列

SEQ ID NO:87：源自馬鈴薯(Solanum tuberosum L.)的HMG3的胺基酸序列

SEQ ID NO:88：源自番茄(Solanum lycopersicum)的HMG2的胺基酸序列

SEQ ID NO:89：源自南苜蓿(Medicago polymorpha)的HMG4的胺基酸序列

SEQ ID NO:90：源自南苜蓿(Medicago polymorpha)的HMG5的胺基酸序列

SEQ ID NO:91：包含SEQ ID NO：1的擬南芥(Arabidopsis thaliana)的第287位胺基酸殘基的保守區域的胺基酸序列

SEQ ID NO:92：包含SEQ ID NO：1的擬南芥(Arabidopsis thaliana)的第574位胺基酸殘基的保守區域的胺基酸序列

SEQ ID NO:93：引物57

SEQ ID NO:94：引物58

SEQ ID NO:95：引物59

SEQ ID NO:96：引物60

SEQ ID NO:97：引物61

SEQ ID NO:98：引物62

SEQ ID NO:99：引物63

SEQ ID NO:100：引物64

SEQ ID NO:101：引物65

SEQ ID NO:102：引物66

SEQ ID NO:103：引物67

SEQ ID NO:104：引物68

SEQ ID NO:105：編碼源自橡膠樹(Hevea brasiliensis)的HMG1的基因的核苷酸序列

SEQ ID NO:106：引物69

SEQ ID NO:107：引物70

SEQ ID NO:108：引物71

SEQ ID NO:109：引物72

SEQ ID NO:110：引物73

SEQ ID NO:111：引物74

SEQ ID NO:112：引物75

SEQ ID NO:113：引物76

SEQ ID NO:114：引物77

SEQ ID NO:115：引物78

SEQ ID NO:116：引物79

SEQ ID NO:117：引物80

SEQ ID NO:118：引物81

SEQ ID NO:119：引物82

SEQ ID NO:120：引物83

SEQ ID NO:121：引物84

SEQ ID NO:122：引物85

SEQ ID NO:123：引物86

SEQ ID NO:124：引物87

SEQ ID NO:125：引物88

SEQ ID NO:126：引物89

SEQ ID NO:127：引物90

SEQ ID NO:128：引物91

SEQ ID NO:129：引物92

SEQ ID NO:130：引物93

SEQ ID NO:131：引物94

SEQ ID NO:132：引物95

SEQ ID NO:133：引物96

SEQ ID NO:134：引物97

SEQ ID NO:135：引物98

SEQ ID NO:136：引物99

SEQ ID NO:137：引物100

SEQ ID NO:138：引物101

SEQ ID NO:139：引物102

SEQ ID NO:140：引物103

SEQ ID NO:141：引物104

SEQ ID NO:142：引物105

SEQ ID NO:143：引物106

SEQ ID NO:144：引物107

SEQ ID NO:145：引物108

SEQ ID NO:146：引物109

SEQ ID NO:147：引物110

SEQ ID NO:148：引物111

SEQ ID NO:149：引物112

SEQ ID NO:150：引物113

SEQ ID NO:151：引物114

SEQUENCE LISTING

SUMITOMO RUBBER INDUSTRIES, LTD.

MUTEIN, METHOD FOR PRODUING SAID MUTEIN, GENE ENCODING SAID MUTEIN, RECOMBINANT VECTOR AND PLANT BEARING SAID GENE, METHOD FOR CONTROLLING AMOUNT OF MEVALONIC ACID PRODUCED AND AMOUNT OF ISOPRENOID PRODUCED, METHOD FOR CONTROLLING 3-HYDROXY-3-METHYLGLUTARYL-COA REDUCTASE ACTIVITY

SR2104WO

PCT/JP2015/064821

2015-05-22

JP 2014-107508

2014-05-23

151

PatentIn version 3.5

592

PRT

Arabidopsis thaliana

Met Asp Leu Arg Arg Arg Pro Pro Lys Pro Pro Val Thr Asn Asn Asn

1 5 10 15

Asn Ser Asn Gly Ser Phe Arg Ser Tyr Gln Pro Arg Thr Ser Asp Asp

20 25 30

Asp His Arg Arg Arg Ala Thr Thr Ile Ala Pro Pro Pro Lys Ala Ser

35 40 45

Asp Ala Leu Pro Leu Pro Leu Tyr Leu Thr Asn Ala Val Phe Phe Thr

50 55 60

Leu Phe Phe Ser Val Ala Tyr Tyr Leu Leu His Arg Trp Arg Asp Lys

65 70 75 80

Ile Arg Tyr Asn Thr Pro Leu His Val Val Thr Ile Thr Glu Leu Gly

85 90 95

Ala Ile Ile Ala Leu Ile Ala Ser Phe Ile Tyr Leu Leu Gly Phe Phe

100 105 110

Gly Ile Asp Phe Val Gln Ser Phe Ile Ser Arg Ala Ser Gly Asp Ala

115 120 125

Trp Asp Leu Ala Asp Thr Ile Asp Asp Asp Asp His Arg Leu Val Thr

130 135 140

Cys Ser Pro Pro Thr Pro Ile Val Ser Val Ala Lys Leu Pro Asn Pro

145 150 155 160

Glu Pro Ile Val Thr Glu Ser Leu Pro Glu Glu Asp Glu Glu Ile Val

165 170 175

Lys Ser Val Ile Asp Gly Val Ile Pro Ser Tyr Ser Leu Glu Ser Arg

180 185 190

Leu Gly Asp Cys Lys Arg Ala Ala Ser Ile Arg Arg Glu Ala Leu Gln

195 200 205

Arg Val Thr Gly Arg Ser Ile Glu Gly Leu Pro Leu Asp Gly Phe Asp

210 215 220

Tyr Glu Ser Ile Leu Gly Gln Cys Cys Glu Met Pro Val Gly Tyr Ile

225 230 235 240

Gln Ile Pro Val Gly Ile Ala Gly Pro Leu Leu Leu Asp Gly Tyr Glu

245 250 255

Tyr Ser Val Pro Met Ala Thr Thr Glu Gly Cys Leu Val Ala Ser Thr

260 265 270

Asn Arg Gly Cys Lys Ala Met Phe Ile Ser Gly Gly Ala Thr Ser Thr

275 280 285

Val Leu Lys Asp Gly Met Thr Arg Ala Pro Val Val Arg Phe Ala Ser

290 295 300

Ala Arg Arg Ala Ser Glu Leu Lys Phe Phe Leu Glu Asn Pro Glu Asn

305 310 315 320

Phe Asp Thr Leu Ala Val Val Phe Asn Arg Ser Ser Arg Phe Ala Arg

325 330 335

Leu Gln Ser Val Lys Cys Thr Ile Ala Gly Lys Asn Ala Tyr Val Arg

340 345 350

Phe Cys Cys Ser Thr Gly Asp Ala Met Gly Met Asn Met Val Ser Lys

355 360 365

Gly Val Gln Asn Val Leu Glu Tyr Leu Thr Asp Asp Phe Pro Asp Met

370 375 380

Asp Val Ile Gly Ile Ser Gly Asn Phe Cys Ser Asp Lys Lys Pro Ala

385 390 395 400

Ala Val Asn Trp Ile Glu Gly Arg Gly Lys Ser Val Val Cys Glu Ala

405 410 415

Val Ile Arg Gly Glu Ile Val Asn Lys Val Leu Lys Thr Ser Val Ala

420 425 430

Ala Leu Val Glu Leu Asn Met Leu Lys Asn Leu Ala Gly Ser Ala Val

435 440 445

Ala Gly Ser Leu Gly Gly Phe Asn Ala His Ala Ser Asn Ile Val Ser

450 455 460

Ala Val Phe Ile Ala Thr Gly Gln Asp Pro Ala Gln Asn Val Glu Ser

465 470 475 480

Ser Gln Cys Ile Thr Met Met Glu Ala Ile Asn Asp Gly Lys Asp Ile

485 490 495

His Ile Ser Val Thr Met Pro Ser Ile Glu Val Gly Thr Val Gly Gly

500 505 510

Gly Thr Gln Leu Ala Ser Gln Ser Ala Cys Leu Asn Leu Leu Gly Val

515 520 525

Lys Gly Ala Ser Thr Glu Ser Pro Gly Met Asn Ala Arg Arg Leu Ala

530 535 540

Thr Ile Val Ala Gly Ala Val Leu Ala Gly Glu Leu Ser Leu Met Ser

545 550 555 560

Ala Ile Ala Ala Gly Gln Leu Val Arg Ser His Met Lys Tyr Asn Arg

565 570 575

Ser Ser Arg Asp Ile Ser Gly Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr

580 585 590

PRT

Arabidopsis thaliana

Ser Asp Ala Leu Pro Leu Pro Leu Tyr Leu Thr

1 5 10

PRT

Arabidopsis thaliana

Thr Pro Leu His Val Val Thr

1 5

PRT

Arabidopsis thaliana

Gly Phe Asp Tyr Glu Ser Ile Leu Gly Gln Cys Cys Glu Met

1 5 10

PRT

Arabidopsis thaliana

Glu Tyr Ser Val Pro Met Ala Thr Thr Glu Gly Cys Leu Val

1 5 10

PRT

Arabidopsis thaliana

Ser Ser Arg Phe Ala Arg Leu Gln Ser

1 5

PRT

Arabidopsis thaliana

Ala Val Asn Trp Ile Glu Gly Arg Gly Lys Ser Val Val Cys Glu Ala

1 5 10 15

PRT

Arabidopsis thaliana

Ile Ala Thr Gly Gln Asp Pro Ala Gln Asn Val Glu Ser Ser

1 5 10

PRT

Arabidopsis thaliana

His Ile Ser Val Thr Met Pro Ser Ile Glu Val Gly Thr Val Gly Gly

1 5 10 15

Gly Thr Gln Leu Ala Ser Gln Ser Ala

20 25

575

PRT

Hevea brasiliensis

Met Asp Thr Thr Gly Arg Leu His His Arg Lys His Ala Thr Pro Val

1 5 10 15

Glu Asp Arg Ser Pro Thr Thr Pro Lys Ala Ser Asp Ala Leu Pro Leu

20 25 30

Pro Leu Tyr Leu Thr Asn Ala Val Phe Phe Thr Leu Phe Phe Ser Val

35 40 45

Ala Tyr Tyr Leu Leu His Arg Trp Arg Asp Lys Ile Arg Asn Ser Thr

50 55 60

Pro Leu His Ile Val Thr Leu Ser Glu Ile Val Ala Ile Val Ser Leu

65 70 75 80

Ile Ala Ser Phe Ile Tyr Leu Leu Gly Phe Phe Gly Ile Asp Phe Val

85 90 95

Gln Ser Phe Ile Ala Arg Ala Ser His Asp Val Trp Asp Leu Glu Asp

100 105 110

Thr Asp Pro Asn Tyr Leu Ile Asp Glu Asp His Arg Leu Val Thr Cys

115 120 125

Pro Pro Ala Asn Ile Ser Thr Lys Thr Thr Ile Ile Ala Ala Pro Thr

130 135 140

Lys Leu Pro Thr Ser Glu Pro Leu Ile Ala Pro Leu Val Ser Glu Glu

145 150 155 160

Asp Glu Met Ile Val Asn Ser Val Val Asp Gly Lys Ile Pro Ser Tyr

165 170 175

Ser Leu Glu Ser Lys Leu Gly Asp Cys Lys Arg Ala Ala Ala Ile Arg

180 185 190

Arg Glu Ala Leu Gln Arg Met Thr Arg Arg Ser Leu Glu Gly Leu Pro

195 200 205

Val Glu Gly Phe Asp Tyr Glu Ser Ile Leu Gly Gln Cys Cys Glu Met

210 215 220

Pro Val Gly Tyr Val Gln Ile Pro Val Gly Ile Ala Gly Pro Leu Leu

225 230 235 240

Leu Asn Gly Arg Glu Tyr Ser Val Pro Met Ala Thr Thr Glu Gly Cys

245 250 255

Leu Val Ala Ser Thr Asn Arg Gly Cys Lys Ala Ile Tyr Leu Ser Gly

260 265 270

Gly Ala Thr Ser Val Leu Leu Lys Asp Gly Met Thr Arg Ala Pro Val

275 280 285

Val Arg Phe Ala Ser Ala Thr Arg Ala Ala Glu Leu Lys Phe Phe Leu

290 295 300

Glu Asp Pro Asp Asn Phe Asp Thr Leu Ala Val Val Phe Asn Lys Ser

305 310 315 320

Ser Arg Phe Ala Arg Leu Gln Gly Ile Lys Cys Ser Ile Ala Gly Lys

325 330 335

Asn Leu Tyr Ile Arg Phe Ser Cys Ser Thr Gly Asp Ala Met Gly Met

340 345 350

Asn Met Val Ser Lys Gly Val Gln Asn Val Leu Glu Phe Leu Gln Ser

355 360 365

Asp Phe Ser Asp Met Asp Val Ile Gly Ile Ser Gly Asn Phe Cys Ser

370 375 380

Asp Lys Lys Pro Ala Ala Val Asn Trp Ile Glu Gly Arg Gly Lys Ser

385 390 395 400

Val Val Cys Glu Ala Ile Ile Lys Glu Glu Val Val Lys Lys Val Leu

405 410 415

Lys Thr Asn Val Ala Ser Leu Val Glu Leu Asn Met Leu Lys Asn Leu

420 425 430

Ala Gly Ser Ala Val Ala Gly Ala Leu Gly Gly Phe Asn Ala His Ala

435 440 445

Gly Asn Ile Val Ser Ala Ile Phe Ile Ala Thr Gly Gln Asp Pro Ala

450 455 460

Gln Asn Val Glu Ser Ser His Cys Ile Thr Met Met Glu Ala Val Asn

465 470 475 480

Asp Gly Lys Asp Leu His Ile Ser Val Thr Met Pro Ser Ile Glu Val

485 490 495

Gly Thr Val Gly Gly Gly Thr Gln Leu Ala Ser Gln Ser Ala Cys Leu

500 505 510

Asn Leu Leu Gly Val Lys Gly Ala Asn Lys Glu Ser Pro Gly Ser Asn

515 520 525

Ser Arg Leu Leu Ala Ala Ile Val Ala Gly Ser Val Leu Ala Gly Glu

530 535 540

Leu Ser Leu Met Ser Ala Ile Ala Ala Gly Gln Leu Val Lys Ser His

545 550 555 560

Met Lys Tyr Asn Arg Ser Ser Lys Asp Met Ser Lys Ala Ala Ser

565 570 575

582

PRT

Taraxacum koksaghys

Met Asp Val Gly Arg Arg Ser Ser Leu Lys Pro Ala Ala Thr Lys Gly

1 5 10 15

Lys Thr Met Ala Glu Asp Gln Tyr Asp Asp Gln Ile Phe Lys Ala Asp

20 25 30

Lys Lys Val Val Asp Ala Val Val Asn Pro Leu Pro Val Gly Ile Ser

35 40 45

Asn Gly Val Phe Phe Thr Val Phe Phe Ser Val Val Tyr Phe Leu Leu

50 55 60

Ile Arg Trp Arg Glu Lys Ile Arg Ser Ser Thr Pro Leu His Val Val

65 70 75 80

Thr Met Ser Glu Met Ala Ala Ile Phe Phe Phe Val Ala Ser Phe Ile

85 90 95

Tyr Leu Val Gly Phe Phe Gly Met Ser Phe Val Gln Ala Thr Pro Tyr

100 105 110

Asp Glu Glu Glu Glu Leu Glu Val Asp Glu Thr Glu Ile Val Arg Lys

115 120 125

Glu Asp Thr Arg Val Thr Pro Cys Gly Ala Ala Leu Asp Cys Glu Ser

130 135 140

Asp Val Val Val Lys Gln Val Val Lys Lys Glu Leu Val Phe Thr Pro

145 150 155 160

Thr Asp Thr Thr Val Val Thr Glu Glu Asp Glu Glu Val Ile Gln Ser

165 170 175

Val Val Ser Gly Lys Thr Pro Ser Tyr Ser Leu Glu Ser Lys Leu Gly

180 185 190

Asp Cys Lys Arg Ala Ala Phe Ile Arg Arg Val Ala Leu Glu Arg Ile

195 200 205

Thr Gly Lys Ser Leu Asp Gly Leu Pro Leu Glu Gly Leu Asp Tyr Glu

210 215 220

Ser Ile Leu Gly Gln Cys Cys Glu Met Pro Val Gly Tyr Val Gln Ile

225 230 235 240

Pro Val Gly Val Ala Gly Pro Met Leu Leu Asn Gly Lys Glu Phe Ser

245 250 255

Val Pro Met Ala Thr Thr Glu Gly Cys Leu Val Ala Ser Thr Asn Arg

260 265 270

Gly Phe Lys Ala Ile Tyr Ala Ser Gly Gly Ala Thr Ser Ile Leu Leu

275 280 285

Lys Asp Gly Met Thr Arg Ala Pro Val Val Arg Phe Gly Thr Ala Arg

290 295 300

Arg Ala Ala Asp Leu Lys Phe Phe Leu Glu Glu Pro Leu Asn Phe Glu

305 310 315 320

Thr Leu Ala Ser Val Phe Asn Lys Ser Ser Arg Phe Gly Arg Leu Gln

325 330 335

Lys Ile Gln Cys Ala Ile Ala Gly Lys Asn Leu Tyr Met Arg Phe Thr

340 345 350

Cys Ser Thr Gly Asp Ala Met Gly Met Asn Met Val Ser Lys Gly Val

355 360 365

Gln Asn Val Leu Glu Tyr Leu Gln Ser Asp Phe Pro Asp Met Asp Val

370 375 380

Ile Gly Ile Ser Gly Asn Tyr Cys Ser Asp Lys Lys Pro Ala Ala Val

385 390 395 400

Asn Trp Ile Glu Gly Arg Gly Lys Ser Val Val Cys Glu Ala Ile Ile

405 410 415

Lys Glu Asp Ile Val Lys Lys Val Leu Lys Thr Asn Val Ala Ala Leu

420 425 430

Val Glu Leu Asn Met Leu Lys Asn Leu Thr Gly Ser Ala Met Ala Gly

435 440 445

Ala Leu Gly Gly Phe Asn Ala His Ala Ser Asn Ile Val Ser Ala Val

450 455 460

Tyr Leu Ala Thr Gly Gln Asp Pro Ala Gln Asn Ile Glu Ser Ser His

465 470 475 480

Cys Ile Thr Met Met Glu Ala Val Asn Asp Gly Lys Asp Leu His Val

485 490 495

Ser Val Thr Met Pro Ser Ile Glu Val Gly Thr Val Gly Gly Gly Thr

500 505 510

Gln Leu Ala Ser Gln Ser Ala Cys Leu Asn Leu Leu Gly Val Lys Gly

515 520 525

Ala Asn Arg Glu Ala Ala Gly Glu Asn Ala Arg Gln Leu Ala Lys Val

530 535 540

Val Ala Gly Ser Val Leu Ala Gly Glu Leu Ser Leu Leu Ser Ala Ile

545 550 555 560

Ala Ala Gly Gln Leu Val Asn Ser His Met Lys Tyr Asn Arg Ser Asn

565 570 575

Lys Asp Val Thr Lys Ala

580

1776

DNA

Arabidopsis thaliana

atggatctcc gtcggaggcc tcctaaacca ccggttacca acaacaacaa ctccaacgga 60

tctttccgtt cttatcagcc tcgcacttcc gatgacgatc atcgtcgccg ggctacaaca 120

attgctcctc caccgaaagc atccgacgcg cttcctcttc cgttatatct cacaaacgcc 180

gttttcttca cgctcttctt ctccgtcgcg tattacctcc tccaccggtg gcgtgacaag 240

atccgttaca atacgcctct tcacgtcgtc actatcacag aactcggcgc cattattgct 300

ctcatcgctt cgtttatcta tctcctaggg ttttttggta ttgactttgt tcagtcattt 360

atctcacgtg cctctggtga tgcttgggat ctcgccgata cgatcgatga tgatgaccac 420

cgccttgtca cgtgctctcc accgactccg atcgtttccg ttgctaaatt acctaatccg 480

gaacctattg ttaccgaatc gcttcctgag gaagacgagg agattgtgaa atcggttatc 540

gacggagtta ttccatcgta ctcgcttgaa tctcgtctcg gtgattgcaa aagagcggcg 600

tcgattcgtc gtgaggcgtt gcagagagtc accgggagat cgattgaagg gttaccgttg 660

gatggatttg attatgaatc gattttgggg caatgctgtg agatgcctgt tggatacatt 720

cagattcctg ttgggattgc tggtccattg ttgcttgatg gttatgagta ctctgttcct 780

atggctacaa ccgaaggttg tttggttgct agcactaaca gaggctgcaa ggctatgttt 840

atctctggtg gcgccaccag taccgttctt aaggacggta tgacccgagc acctgttgtt 900

cggttcgctt cggcgagacg agcttcggag cttaagtttt tcttggagaa tccagagaac 960

tttgatactt tggcagtagt cttcaacagg tcgagtagat ttgcaagact gcaaagtgtt 1020

aaatgcacaa tcgcggggaa gaatgcttat gtaaggttct gttgtagtac tggtgatgct 1080

atggggatga atatggtttc taaaggtgtg cagaatgttc ttgagtatct taccgatgat 1140

ttccctgaca tggatgtgat tggaatctct ggtaacttct gttcggacaa gaaacctgct 1200

gctgtgaact ggattgaggg acgtggtaaa tcagttgttt gcgaggctgt aatcagagga 1260

gagatcgtga acaaggtctt gaaaacgagc gtggctgctt tagtcgagct caacatgctc 1320

aagaacctag ctggctctgc tgttgcaggc tctctaggtg gattcaacgc tcatgccagt 1380

aacatagtgt ctgctgtatt catagctact ggccaagatc cagctcaaaa cgtggagagt 1440

tctcaatgca tcaccatgat ggaagctatt aatgacggca aagatatcca tatctcagtc 1500

actatgccat ctatcgaggt ggggacagtg ggaggaggaa cacagcttgc atctcaatca 1560

gcgtgtttaa acctgctcgg agttaaagga gcaagcacag agtcgccggg aatgaacgca 1620

aggaggctag cgacgatcgt agccggagca gttttagctg gagagttatc tttaatgtca 1680

gcaattgcag ctggacagct tgtgagaagt cacatgaaat acaatagatc cagccgagac 1740

atctctggag caacgacaac gacaacaaca acaaca 1776

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-01

caccatggat ctccgtcgga ggcctc 26

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-02

cgcctcgagt catgttgttg ttgttgtcg 29

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-03

ttgattttga atcgattttg gggcaatgc 29

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-04

gattcaaaat caaatccatc caacggtaa 29

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-05

ttaccgttgg atggatttga tgatgaatcg attttggggc aatgc 45

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-06

gcattgcccc aaaatcgatt cggcatcaaa tccatccaac ggtaa 45

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-07

ttaccgttgg atggatttga tgaggaatcg attttggggc aatgc 45

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-08

gcattgcccc aaaatcgatt cctcatcaaa tccatccaac ggtaa 45

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-09

atgagttctc tgttcctatg gctacaacc 29

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-10

acagagaact cataaccatc aagcaacaa 29

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-11

ttgttgcttg atggttatga ggactctgtt cctatggcta caacc 45

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-12

ggttgtagcc ataggaacag agtcctcata accatcaagc aacaa 45

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-13

ttgttgcttg atggttatga ggaatctgtt cctatggcta caacc 45

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-14

ggttgtagcc ataggaacag attcctcata accatcaagc aacaa 45

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-15

ggattgaggg acgtggtaaa gcagttgttt gcgaggctgt aatc 44

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-16

gattacagcc tcgcaaacaa ctgctttacc acgtccctca atcc 44

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-17

ggattgaggg acgtggtaaa gatgttgttt gcgaggctgt aatc 44

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-18

gattacagcc tcgcaaacaa catctttacc acgtccctca atcc 44

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-19

ggattgaggg acgtggtaaa gaagttgttt gcgaggctgt aatc 44

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-20

gattacagcc tcgcaaacaa cttctttacc acgtccctca atcc 44

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-21

gctgcaggcc aagatccagc tcaaaacgtg 30

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-22

ggcctgcagc tatgaataca gcagacac 28

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-23

gctgatggcc aagatccagc tcaaaacgtg 30

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-24

ggccatcagc tatgaataca gcagacac 28

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-25

gctgaaggcc aagatccagc tcaaaacgtg 30

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-26

ggccttcagc tatgaataca gcagacac 28

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-27

ccatctatcg aggtgggggc agtgggagga ggaacacagc ttgc 44

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-28

gcaagctgtg ttcctcctcc cactgccccc acctcgatag atgg 44

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-29

ccatctatcg aggtggggga tgtgggagga ggaacacagc ttgc 44

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-30

gcaagctgtg ttcctcctcc cacatccccc acctcgatag atgg 44

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-31

ccatctatcg aggtggggga agtgggagga ggaacacagc ttgc 44

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-32

gcaagctgtg ttcctcctcc cacttccccc acctcgatag atgg 44

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-33

attgctcctc caccgaaagc agccgacgcg cttcctcttc cgtta 45

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-34

taacggaaga ggaagcgcgt cggctgcttt cggtggagga gcaat 45

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-35

attgctcctc caccgaaagc agacgacgcg cttcctcttc cgtta 45

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-36

taacggaaga ggaagcgcgt cgtctgcttt cggtggagga gcaat 45

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-37

attgctcctc caccgaaagc agaagacgcg cttcctcttc cgtta 45

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-38

taacggaaga ggaagcgcgt cttctgcttt cggtggagga gcaat 45

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-39

aatacgcctc ttcacgtcgt cgcaatcaca gaactcggcg ccatt 45

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-40

aatggcgccg agttctgtga ttgcgacgac gtgaagaggc gtatt 45

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-41

aatacgcctc ttcacgtcgt cgatatcaca gaactcggcg ccatt 45

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-42

aatggcgccg agttctgtga tatcgacgac gtgaagaggc gtatt 45

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-43

aatacgcctc ttcacgtcgt cgaaatcaca gaactcggcg ccatt 45

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-44

aatggcgccg agttctgtga tttcgacgac gtgaagaggc gtatt 45

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-45

cgagtagatt tgcaagactg caagccgtta aatgcacaat cgc 43

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-46

gcgattgtgc atttaacggc ttgcagtctt gcaaatctac tcg 43

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-47

cgagtagatt tgcaagactg caagatgtta aatgcacaat cgc 43

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-48

gcgattgtgc atttaacatc ttgcagtctt gcaaatctac tcg 43

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-49

cgagtagatt tgcaagactg caagaagtta aatgcacaat cgc 43

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-50

gcgattgtgc atttaacttc ttgcagtctt gcaaatctac tcg 43

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-51

caatagagcc agccgagaca tctctggagc aacg 34

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-52

cggctggctc tattgtattt catgtgactt ctcac 35

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-53

gtcacatgaa atacaataga gacagccgag acatctctgg agc 43

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-54

gctccagaga tgtctcggct gtctctattg tatttcatgt gac 43

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-55

gtcacatgaa atacaataga gaaagccgag acatctctgg agc 43

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-56

gctccagaga tgtctcggct ttctctattg tatttcatgt gac 43

562

PRT

Arabidopsis thaliana

Met Glu Asp Leu Arg Arg Arg Phe Pro Thr Lys Lys Asn Gly Glu Glu

1 5 10 15

Ile Ser Asn Val Ala Val Asp Pro Pro Leu Arg Lys Ala Ser Asp Ala

20 25 30

Leu Pro Leu Pro Leu Tyr Leu Thr Asn Thr Phe Phe Leu Ser Leu Phe

35 40 45

Phe Ala Thr Val Tyr Phe Leu Leu Ser Arg Trp Arg Glu Lys Ile Arg

50 55 60

Asn Ser Thr Pro Leu His Val Val Asp Leu Ser Glu Ile Cys Ala Leu

65 70 75 80

Ile Gly Phe Val Ala Ser Phe Ile Tyr Leu Leu Gly Phe Cys Gly Ile

85 90 95

Asp Leu Ile Phe Arg Ser Ser Ser Asp Asp Asp Val Trp Val Asn Asp

100 105 110

Gly Met Ile Pro Cys Asn Gln Ser Leu Asp Cys Arg Glu Val Leu Pro

115 120 125

Ile Lys Pro Asn Ser Val Asp Pro Pro Arg Glu Ser Glu Leu Asp Ser

130 135 140

Val Glu Asp Glu Glu Ile Val Lys Leu Val Ile Asp Gly Thr Ile Pro

145 150 155 160

Ser Tyr Ser Leu Glu Thr Lys Leu Gly Asp Cys Lys Arg Ala Ala Ala

165 170 175

Ile Arg Arg Glu Ala Val Gln Arg Ile Thr Gly Lys Ser Leu Thr Gly

180 185 190

Leu Pro Leu Glu Gly Phe Asp Tyr Asn Ser Ile Leu Gly Gln Cys Cys

195 200 205

Glu Met Pro Val Gly Tyr Val Gln Ile Pro Val Gly Ile Ala Gly Pro

210 215 220

Leu Leu Leu Asp Gly Val Glu Tyr Ser Val Pro Met Ala Thr Thr Glu

225 230 235 240

Gly Cys Leu Val Ala Ser Thr Asn Arg Gly Phe Lys Ala Ile His Leu

245 250 255

Ser Gly Gly Ala Phe Ser Val Leu Val Lys Asp Ala Met Thr Arg Ala

260 265 270

Pro Val Val Arg Phe Pro Ser Ala Arg Arg Ala Ala Leu Val Met Phe

275 280 285

Tyr Leu Gln Asp Pro Ser Asn Phe Glu Arg Leu Ser Leu Ile Phe Asn

290 295 300

Lys Ser Ser Arg Phe Ala Arg Leu Gln Ser Ile Thr Cys Thr Ile Ala

305 310 315 320

Gly Arg Asn Leu Tyr Pro Arg Phe Ala Cys Ser Thr Gly Asp Ala Met

325 330 335

Gly Met Asn Met Val Ser Lys Gly Val Gln Asn Val Leu Asp Phe Val

340 345 350

Lys Ser Glu Phe Pro Asp Met Asp Val Ile Gly Ile Ser Gly Asn Tyr

355 360 365

Cys Ser Asp Lys Lys Ala Ser Ala Val Asn Trp Ile Glu Gly Arg Gly

370 375 380

Lys His Val Val Cys Glu Ala Phe Ile Lys Ala Glu Ile Val Glu Lys

385 390 395 400

Val Leu Lys Thr Ser Val Glu Ala Leu Val Glu Leu Asn Thr Leu Lys

405 410 415

Asn Leu Val Gly Ser Ala Met Ala Gly Ser Leu Gly Gly Phe Asn Ala

420 425 430

His Ser Ser Asn Ile Val Ser Ala Val Phe Ile Ala Thr Gly Gln Asp

435 440 445

Pro Ala Gln Asn Val Glu Ser Ser His Cys Met Thr Met Ile Leu Pro

450 455 460

Asp Gly Asp Asp Leu His Ile Ser Val Ser Met Pro Cys Ile Glu Val

465 470 475 480

Gly Thr Val Gly Gly Gly Thr Gln Leu Ala Ser Gln Ala Ala Cys Leu

485 490 495

Asn Leu Leu Gly Val Lys Gly Ser Asn Asn Glu Lys Pro Gly Ser Asn

500 505 510

Ala Gln Gln Leu Ala Arg Ile Val Ala Gly Ser Val Leu Ala Gly Glu

515 520 525

Leu Ser Leu Met Ser Ala Ile Ala Ala Gly Gln Leu Val Lys Ser His

530 535 540

Met Lys Tyr Asn Arg Ser Ser Arg Asp Ile Gly Pro Ser Ser Gln Val

545 550 555 560

Asn Arg

210

PRT

Hevea brasiliensis

Leu Glu Ser Asp Phe Ala Asp Met Asp Val Ile Gly Ile Ser Gly Asn

1 5 10 15

Phe Cys Ser Asp Lys Lys Pro Ala Ala Val Asn Trp Ile Glu Gly Arg

20 25 30

Gly Lys Ser Val Val Cys Glu Ala Ile Ile Lys Glu Glu Val Val Lys

35 40 45

Lys Val Leu Lys Thr Asp Val Ala Leu Leu Val Glu Leu Asn Met Leu

50 55 60

Lys Asn Leu Ala Gly Ser Ala Val Ala Gly Ala Leu Gly Gly Phe Asn

65 70 75 80

Ala His Ala Gly Asn Ile Val Ser Ala Ile Phe Ile Ala Thr Gly Gln

85 90 95

Asp Pro Ala Gln Asn Val Glu Ser Ser His Cys Ile Thr Met Met Glu

100 105 110

Ala Val Asn Asp Gly Lys Asp Leu His Ile Ser Val Thr Leu Pro Ser

115 120 125

Ile Glu Val Gly Thr Val Gly Gly Gly Thr Gln Leu Ala Ser Gln Ser

130 135 140

Ala Cys Leu Asn Leu Leu Gly Val Met Gly Ala Cys Lys Glu Ser Pro

145 150 155 160

Gly Ser Tyr Ser Arg Leu Leu Ala Thr Ile Val Ala Gly Ser Val Leu

165 170 175

Ala Gly Glu Leu Ser Leu Met Ser Ala Ile Ala Ala Gly Gln Leu Val

180 185 190

Lys Ser His Met Lys Tyr Asn Arg Ser Ser Lys Asp Val Ser Lys Ala

195 200 205

Ala Ser

210

586

PRT

Hevea brasiliensis

Met Asp Glu Val Arg Arg Arg Pro Pro Lys His Ile Val Arg Lys Asp

1 5 10 15

His Asp Gly Glu Val Leu Asn Ser Phe Ser His Gly His His Leu Pro

20 25 30

Pro Leu Lys Pro Ser Asp Tyr Ser Leu Pro Leu Ser Leu Tyr Leu Ala

35 40 45

Asn Ala Leu Val Phe Ser Leu Phe Phe Ser Val Ala Tyr Phe Leu Leu

50 55 60

His Arg Trp Arg Glu Lys Ile Arg Lys Ser Thr Pro Leu His Ile Val

65 70 75 80

Thr Phe Pro Glu Ile Ala Ala Leu Ile Cys Leu Val Ala Ser Val Ile

85 90 95

Tyr Leu Leu Gly Phe Phe Gly Ile Gly Phe Val His Ser Phe Ser Arg

100 105 110

Ala Ser Thr Asp Ser Trp Asp Val Glu Glu Tyr Asp Asp Asp Asn Ile

115 120 125

Ile Ile Lys Glu Asp Thr Arg Pro Thr Gly Ala Cys Ala Ala Pro Ser

130 135 140

Leu Asp Cys Ser Leu Ser Leu Pro Thr Lys Ile His Ala Pro Ile Val

145 150 155 160

Ser Thr Thr Thr Thr Ser Thr Leu Ser Asp Asp Asp Glu Gln Ile Ile

165 170 175

Lys Ser Val Val Ser Gly Ser Ile Pro Ser Tyr Ser Leu Glu Ser Lys

180 185 190

Leu Gly Asn Cys Lys Arg Ala Ala Leu Ile Arg Arg Glu Thr Leu Gln

195 200 205

Arg Met Ser Gly Arg Ser Leu Glu Gly Leu Pro Leu Asp Gly Phe Asp

210 215 220

Tyr Glu Ser Ile Leu Gly Gln Cys Cys Glu Met Ala Ile Gly Tyr Val

225 230 235 240

Gln Ile Pro Val Gly Ile Ala Gly Pro Leu Leu Leu Asp Gly Lys Glu

245 250 255

Tyr Thr Val Pro Met Ala Thr Thr Glu Gly Cys Leu Val Ala Ser Ala

260 265 270

Asn Arg Gly Cys Lys Ala Ile Tyr Ala Ser Gly Gly Ala Thr Ser Val

275 280 285

Leu Leu Arg Asp Gly Met Thr Arg Ala Pro Val Val Arg Phe Pro Thr

290 295 300

Ala Lys Arg Ala Ala Asp Leu Lys Phe Phe Met Glu Asp Pro Asp Asn

305 310 315 320

Phe Asp Thr Ile Ala Val Val Phe Asn Lys Ser Ser Arg Phe Ala Arg

325 330 335

Leu Gln Ser Val Gln Cys Ala Ile Ala Gly Lys Asn Leu Tyr Met Arg

340 345 350

Phe Ser Cys Ser Thr Gly Asp Ala Met Gly Met Asn Met Val Ser Lys

355 360 365

Ala Val Gln Asn Val Ile Asp Tyr Leu Gln Asn Asp Phe Pro Asp Met

370 375 380

Asp Val Ile Gly Leu Thr Gly Asn Phe Cys Ala Asp Lys Lys Ala Ala

385 390 395 400

Ala Val Asn Trp Ile Glu Gly Arg Gly Lys Ser Val Val Cys Glu Ala

405 410 415

Ile Ile Lys Glu Glu Val Val Lys Lys Val Leu Lys Thr Asn Val Ala

420 425 430

Ala Leu Val Glu Leu Asn Met Ile Lys Asn Leu Thr Gly Ser Ala Val

435 440 445

Ala Gly Ser Leu Gly Gly Phe Asn Ala His Ala Ser Asn Met Val Thr

450 455 460

Ala Val Tyr Ile Ala Thr Gly Gln Asp Pro Ala Gln Asn Val Glu Ser

465 470 475 480

Ser His Cys Ile Thr Met Met Glu Ala Val Asn Asp Gly Lys Asp Leu

485 490 495

His Ile Ser Val Ser Met Pro Ser Ile Glu Leu Gly Thr Val Gly Gly

500 505 510

Gly Thr Gln Leu Ala Ser Gln Ser Ala Cys Leu Asn Leu Leu Gly Val

515 520 525

Lys Gly Ala Ser Lys Asp Ser Pro Gly Ser Asn Ser Arg Leu Leu Ala

530 535 540

Thr Ile Val Ala Gly Ser Val Leu Ala Gly Glu Leu Ser Leu Met Ser

545 550 555 560

Ala Ile Ala Ala Gly Gln Leu Val Asn Ser His Met Lys Tyr Asn Arg

565 570 575

Ser Ala Lys Asp Val Ser Lys Ile Thr Phe

580 585

606

PRT

Hevea brasiliensis

Met Asp Val Arg Arg Arg Pro Thr Ser Gly Lys Thr Ile His Ser Val

1 5 10 15

Lys Pro Lys Ser Val Glu Asp Glu Ser Ala Gln Lys Pro Ser Asp Ala

20 25 30

Leu Pro Leu Pro Leu Tyr Leu Ile Asn Ala Leu Cys Phe Thr Val Phe

35 40 45

Phe Tyr Val Val Tyr Phe Leu Leu Ser Arg Trp Arg Glu Lys Ile Arg

50 55 60

Thr Ser Thr Pro Leu His Val Val Ala Leu Ser Glu Ile Ala Ala Ile

65 70 75 80

Val Ala Phe Val Ala Ser Phe Ile Tyr Leu Leu Gly Phe Phe Gly Ile

85 90 95

Asp Phe Val Gln Ser Leu Ile Leu Arg Pro Pro Thr Asp Met Trp Ala

100 105 110

Val Asp Asp Asp Glu Glu Glu Thr Glu Glu Gly Ile Val Leu Arg Glu

115 120 125

Asp Thr Arg Lys Leu Pro Cys Gly Gln Ala Leu Asp Cys Ser Leu Ser

130 135 140

Ala Pro Pro Leu Ser Arg Ala Val Val Ser Ser Pro Lys Ala Met Asp

145 150 155 160

Pro Ile Val Leu Pro Ser Pro Lys Pro Lys Val Phe Asp Glu Ile Pro

165 170 175

Phe Pro Thr Thr Thr Thr Ile Pro Ile Leu Gly Asp Glu Asp Glu Glu

180 185 190

Ile Ile Lys Ser Val Val Ala Gly Thr Ile Pro Ser Tyr Ser Leu Glu

195 200 205

Ser Lys Leu Gly Asp Cys Lys Arg Ala Ala Ala Ile Arg Arg Glu Ala

210 215 220

Leu Gln Arg Ile Thr Gly Lys Ser Leu Ser Gly Leu Pro Leu Glu Gly

225 230 235 240

Phe Asp Tyr Glu Ser Ile Leu Gly Gln Cys Cys Glu Met Pro Val Gly

245 250 255

Tyr Val Gln Ile Pro Val Gly Ile Ala Gly Pro Leu Leu Leu Asp Gly

260 265 270

Lys Glu Tyr Ser Val Pro Met Ala Thr Thr Glu Gly Cys Leu Val Ala

275 280 285

Ser Thr Asn Arg Gly Cys Lys Ala Ile His Leu Ser Gly Gly Ala Thr

290 295 300

Ser Val Leu Leu Arg Asp Gly Met Thr Arg Ala Pro Val Val Arg Phe

305 310 315 320

Gly Thr Ala Lys Arg Ala Ala Gln Leu Lys Leu Tyr Leu Glu Asp Pro

325 330 335

Ala Asn Phe Glu Thr Leu Ser Thr Ser Phe Asn Lys Ser Ser Arg Phe

340 345 350

Gly Arg Leu Gln Ser Ile Lys Cys Ala Ile Ala Gly Lys Asn Leu Tyr

355 360 365

Met Arg Phe Cys Cys Ser Thr Gly Asp Ala Met Gly Met Asn Met Val

370 375 380

Ser Lys Gly Val Gln Asn Val Leu Asn Phe Leu Gln Asn Asp Phe Pro

385 390 395 400

Asp Met Asp Val Ile Gly Leu Ser Gly Asn Phe Cys Ser Asp Lys Lys

405 410 415

Pro Ala Ala Val Asn Trp Ile Glu Gly Arg Gly Lys Ser Val Val Cys

420 425 430

Glu Ala Ile Ile Lys Gly Asp Val Val Lys Lys Val Leu Lys Thr Asn

435 440 445

Val Glu Ala Leu Val Glu Leu Asn Met Leu Lys Asn Leu Thr Gly Ser

450 455 460

Ala Met Ala Gly Ala Leu Gly Gly Phe Asn Ala His Ala Ser Asn Ile

465 470 475 480

Val Thr Ala Ile Tyr Ile Ala Thr Gly Gln Asp Pro Ala Gln Asn Val

485 490 495

Glu Ser Ser Asn Cys Ile Thr Met Met Glu Ala Val Asn Asp Gly Gln

500 505 510

Asp Leu His Val Ser Val Thr Met Pro Ser Ile Glu Val Gly Thr Val

515 520 525

Gly Gly Gly Thr Gln Leu Ala Ser Gln Ser Ala Cys Leu Asn Leu Leu

530 535 540

Gly Val Lys Gly Ala Ser Lys Glu Thr Pro Gly Ala Asn Ser Arg Val

545 550 555 560

Leu Ala Ser Ile Val Ala Gly Ser Val Leu Ala Ala Glu Leu Ser Leu

565 570 575

Met Ser Ala Ile Ala Ala Gly Gln Leu Val Asn Ser His Met Lys Tyr

580 585 590

Asn Arg Ala Asn Lys Glu Ala Ala Val Ser Lys Pro Ser Ser

595 600 605

526

PRT

Hevea brasiliensis

Met Asp Ala Arg Arg Arg Pro Thr Ser Gly Asn Pro Ile His Ser Arg

1 5 10 15

Lys Val Lys Ala Leu Glu Asp Glu Asn Thr Gln Lys Pro Ser Asp Ala

20 25 30

Leu Pro Leu His Ile Tyr Leu Thr Asn Ala Leu Cys Phe Thr Val Phe

35 40 45

Phe Trp Val Val Tyr Phe Leu Leu Ser Arg Trp Arg Glu Lys Ile Arg

50 55 60

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65 70 75 80

Val Ala Leu Phe Ala Ser Phe Ile Tyr Leu Leu Gly Phe Phe Gly Ile

85 90 95

Asp Phe Val Gln Ser Leu Ile Leu Arg Pro Pro Thr Asp Met Trp Ala

100 105 110

Val Asp Asp Glu Glu Glu Glu Pro Ala Glu Gln Ile Leu Leu Lys Glu

115 120 125

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130 135 140

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459

PRT

Lactuca sativa Lettuce

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586

PRT

Lactuca sativa Lettuce

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438

PRT

Lactuca sativa Lettuce

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301

PRT

Lactuca sativa Lettuce

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Val Ser Lys Gly Val Gln Asn Val Leu Asp Phe Leu Gln Thr Asp Phe

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Pro Asp Met Asp Val Met Gly Ile Ser Gly Asn Tyr Cys Ser Asp Lys

180 185 190

Lys Pro Ala Ala Val Asn Trp Ile Glu Gly Arg Gly Lys Ser Val Val

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Cys Glu Ala Val Ile Lys Glu Asp Val Val Gln Lys Val Leu Lys Thr

210 215 220

Ser Val Ala Ser Leu Val Glu Leu Asn Met Leu Lys Asn Leu Thr Gly

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Ser Ala Met Ala Gly Ala Leu Gly Gly Phe Asn Ala His Ala Ser Asn

245 250 255

Ile Val Ser Ala Val Tyr Leu Ala Thr Gly Gln Asp Pro Ala Gln Asn

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281

PRT

Lactuca sativa Lettuce

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169

PRT

Lactuca sativa Lettuce

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603

PRT

Manihot esculenta

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589

PRT

Manihot esculenta

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Met Ile Val Asn Ser Val Val Asn Gly Ile Ile Pro Ser Tyr Ser Leu

180 185 190

Glu Ser Lys Leu Gly Asp Cys Lys Arg Ala Ala Val Ile Arg Arg Glu

195 200 205

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Gly Phe Asp Tyr Glu Ser Ile Leu Gly Gln Cys Cys Glu Met Pro Val

225 230 235 240

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305 310 315 320

Pro Asp Asn Phe Asp Thr Leu Ala Val Val Phe Asn Arg Ser Ser Arg

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590

PRT

Eucommia ulmoides

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Ser Phe Ile Ala Arg Ala Ser His Asp Pro Trp Asp Val Asp Asp Asp

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Glu Arg Phe Ile Leu Glu Glu Asp Arg Arg Arg Gly Pro Cys Thr Ala

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Ala Leu Asp Cys Leu Val Gly Pro Val Ala Pro Ser Ile Ser Asp Val

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Arg Lys Leu Met Asp Pro Pro Ala Pro Leu Pro Ser Val Glu Asp Glu

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583

PRT

Euphorbia helioscopia L.

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532

PRT

Oryza sativa

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596

PRT

Solanum tuberosum L.

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595

PRT

Solanum tuberosum L.

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Gly Lys Ser Leu Glu Gly Leu Pro Leu Glu Gly Phe Thr Tyr Glu Ser

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Ala Gly Gln Leu Val Asn Ser His Met Lys Tyr Asn Arg Ser Thr Lys

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Ala Ser Ser

595

574

PRT

Solanum tuberosum L.

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602

PRT

Solanum lycopersicum

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115 120 125

Glu Asn Asp Glu Glu Phe Leu Leu Lys Glu Asp Ser Arg Cys Gly Pro

130 135 140

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145 150 155 160

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165 170 175

Ala Pro Leu Ile Thr Ser Ala Ser Ser Gly Glu Asp Glu Glu Ile Ile

180 185 190

Lys Ser Val Val Gln Gly Lys Ile Pro Ser Tyr Ser Leu Glu Ser Lys

195 200 205

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210 215 220

Arg Ile Thr Gly Lys Ser Leu Glu Gly Leu Pro Leu Glu Gly Phe Asn

225 230 235 240

Tyr Glu Ser Ile Leu Gly Gln Cys Cys Glu Met Pro Ile Gly Tyr Val

245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

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290 295 300

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305 310 315 320

Ala Lys Arg Ala Ala Glu Leu Lys Phe Phe Val Glu Asp Pro Ile Lys

325 330 335

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340 345 350

Leu Gln Arg Ile Gln Cys Ala Ile Ala Gly Lys Asn Leu Tyr Met Arg

355 360 365

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370 375 380

Gly Val Gln Asn Val Leu Asp Tyr Leu Gln Asn Glu Tyr Pro Asp Met

385 390 395 400

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405 410 415

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580 585 590

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545

PRT

Medicago polymorpha

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Leu Ile Tyr Leu Thr Ala Phe Phe Gly Val Ala Phe Ile Leu His Tyr

85 90 95

Asp Glu Glu Glu Asp Glu Val Ala Asp Ile Ala Ala Lys Thr Thr Lys

100 105 110

Val Met Pro Asn Leu Pro Glu Glu Ile Leu Val Gln Lys Val Leu Ser

115 120 125

Met Glu Asp Glu Glu Val Val Gly Ala Val Val Ser Gly Ser Ile Pro

130 135 140

Ser Tyr Ser Leu Glu Ser Lys Leu Gly Asp Cys Arg Arg Ala Ala Val

145 150 155 160

Ile Arg Asn Gln Ala Val Glu Arg Val Thr Gly Arg Ser Leu Glu Gly

165 170 175

Leu Pro Met Glu Gly Phe Asp Tyr Asp Ser Ile Leu Gly Gln Cys Cys

180 185 190

Glu Met Pro Ile Gly Phe Val Gln Ile Pro Val Gly Val Ala Gly Pro

195 200 205

Leu Leu Leu Asp Gly Lys Glu Tyr Thr Val Pro Met Ala Thr Thr Glu

210 215 220

Gly Cys Leu Val Ala Ser Thr Asn Arg Gly Cys Lys Ala Ile Tyr Val

225 230 235 240

Ser Gly Gly Ala Ser Ala Val Val Leu Arg Asp Gly Met Thr Arg Ala

245 250 255

Pro Val Val Arg Phe Asn Ser Ala Lys Arg Ala Ser Gln Leu Lys Phe

260 265 270

Phe Leu Glu Asp Pro Leu Asn Phe Asp Ser Ile Ser His Thr Phe Asn

275 280 285

Lys Ser Ser Arg Phe Ala Arg Leu Gln Asn Ile Lys Ala Thr Ile Ala

290 295 300

Gly Lys Asn Leu Tyr Thr Arg Phe Thr Cys Ser Thr Gly Asp Ala Met

305 310 315 320

Gly Met Asn Met Val Ser Lys Gly Val Gln Asn Val Leu Asp Phe Leu

325 330 335

Gln Thr Asp Phe Pro Asp Met Asp Val Ile Gly Ile Ser Gly Asn Phe

340 345 350

Cys Ser Asp Lys Lys Ala Ala Ala Val Asn Trp Ile Glu Gly Arg Gly

355 360 365

Lys Ser Val Val Cys Glu Ala Val Ile Lys Glu Glu Val Val Lys Lys

370 375 380

Val Leu Lys Thr Ser Val Glu Ser Leu Val Glu Leu Asn Met Leu Lys

385 390 395 400

Asn Leu Thr Gly Ser Ala Met Ala Gly Ala Leu Gly Gly Phe Asn Ala

405 410 415

His Ala Ser Asn Ile Val Ser Ala Val Tyr Leu Ala Thr Gly Gln Asp

420 425 430

Pro Ala Gln Asn Val Glu Ser Ser His Cys Met Thr Met Met Glu Ala

435 440 445

Val Asn Asp Gly Lys Asp Leu His Ile Ser Val Thr Met Pro Ser Ile

450 455 460

Glu Val Gly Thr Val Gly Gly Gly Thr Gln Leu Ala Ser Gln Ser Ala

465 470 475 480

Cys Leu Asn Leu Leu Gly Val Lys Gly Ala Ser Lys Glu Ser Pro Gly

485 490 495

Ala Asn Ser Arg Gln Leu Ala Thr Ile Val Ala Gly Ser Val Leu Ala

500 505 510

Gly Glu Leu Ser Leu Met Ser Ala Ile Ala Ala Gly Gln Leu Val Lys

515 520 525

Ser His Met Lys Tyr Asn Arg Ser Asn Lys Asp Val Thr Lys Val Ala

530 535 540

Ser

545

582

PRT

Medicago polymorpha

Met Asp Ala Arg Arg Arg Leu Lys Ser Leu Pro Pro Arg Ser Pro Ala

1 5 10 15

Gly Gly Glu Asn Leu Lys Thr Gln Lys Leu Lys Ser Leu Pro Thr Thr

20 25 30

Thr Thr Gly Glu Asn Leu Asn Ser Gln Thr Val Phe Leu Cys Val Thr

35 40 45

Asn Ala Val Phe Phe Gly Val Phe Phe Ser Val Ala Tyr Phe Leu Leu

50 55 60

His Arg Trp Arg Glu Lys Ile Arg Thr Glu Thr Pro Leu His Val Val

65 70 75 80

Thr Val Ser Glu Thr Ala Ala Ile Val Ser Leu Ile Ala Ser Ala Val

85 90 95

Tyr Leu Leu Gly Phe Phe Gly Ile Gly Ser Arg Thr Ser Phe Pro Asp

100 105 110

Asp Leu Ser Asp Glu Glu Ile Leu Ala Lys Glu Asp Ser Arg Lys Pro

115 120 125

Gly Pro Cys Pro Ala Ala Leu Val Asp Thr Asp Val Lys Pro Pro Pro

130 135 140

Ala Thr Leu Thr Pro Ile Val Ala Pro Val Lys Ile Tyr Glu Val Val

145 150 155 160

Ala Pro Val Asn Leu Thr Pro Glu Asp Glu Glu Ile Ala Lys Ser Val

165 170 175

Val Thr Gly Ser Ile Pro Ser Tyr Ser Leu Glu Ser Arg Leu Ala Asp

180 185 190

Cys Arg Lys Ala Ala Ala Ile Arg Arg Ser Ala Val Gln Thr Ile Thr

195 200 205

Gly Lys Ser Leu Glu Gly Leu Pro Leu Glu Gly Phe Asp Tyr Asp Ser

210 215 220

Ile Leu Gly Gln Cys Cys Glu Met Pro Ile Gly Phe Val Gln Ile Pro

225 230 235 240

Val Gly Val Ala Gly Pro Leu Leu Leu Asp Gly Val Glu Tyr Thr Val

245 250 255

Pro Met Ala Thr Thr Glu Gly Cys Leu Val Ala Ser Thr Asn Arg Gly

260 265 270

Cys Lys Ala Ile His Val Ser Gly Gly Ala Ser Ser Val Leu Leu Arg

275 280 285

Asp Gly Met Thr Arg Ala Pro Val Val Arg Phe Ser Ser Ala Lys Arg

290 295 300

Ala Ala Glu Leu Lys Phe Phe Leu Glu Asp Pro Leu Asn Phe Asp Thr

305 310 315 320

Leu Ala Val Thr Phe Asn Lys Ser Ser Arg Phe Ala Arg Leu Gln Ser

325 330 335

Leu Gln Pro Thr Ile Ala Gly Lys Asn Leu Tyr Ile Arg Phe Arg Cys

340 345 350

Ser Thr Gly Asp Ala Met Gly Met Asn Met Val Ser Lys Gly Val Gln

355 360 365

Asn Val Leu Asp Phe Leu Gln Ser Asp Phe Pro Asp Met Asp Val Ile

370 375 380

Gly Ile Ser Gly Asn Phe Cys Ser Asp Lys Lys Ala Ala Ala Val Asn

385 390 395 400

Trp Ile Glu Gly Arg Gly Lys Ser Val Val Cys Glu Ala Val Ile Lys

405 410 415

Glu Glu Val Val Lys Lys Val Leu Lys Thr Ser Val Glu Ala Leu Val

420 425 430

Glu Leu Asn Met Leu Lys Asn Leu Thr Gly Ser Ala Leu Ala Gly Ala

435 440 445

Leu Gly Gly Phe Asn Ala His Ala Ser Asn Ile Val Ser Ala Val Tyr

450 455 460

Ile Ala Thr Gly Gln Asp Pro Ala Gln Asn Val Glu Ser Ser His Cys

465 470 475 480

Ile Thr Met Met Glu Ala Val Asn Asp Gly Lys Asp Leu His Ile Ser

485 490 495

Val Thr Met Pro Ser Ile Glu Val Gly Thr Val Gly Gly Gly Thr Gln

500 505 510

Leu Ala Ser Gln Ser Ala Cys Leu Asn Leu Leu Gly Val Lys Gly Ala

515 520 525

Asn Thr Glu Ser Pro Gly Ala Asn Ala Arg Leu Leu Ala Thr Ile Val

530 535 540

Ala Gly Ser Val Leu Ala Gly Glu Leu Ser Leu Met Ser Ala Ile Ala

545 550 555 560

Ala Gly Gln Leu Val Lys Ser His Met Lys Tyr Asn Arg Ser Ser Arg

565 570 575

Asp Met Ser Lys Ile Val

580

PRT

Arabidopsis thaliana

Ser Gly Gly Ala Thr Ser Thr Val Leu Lys Asp Gly Met Thr Arg Ala Pro Val

1 5 10 15

PRT

Arabidopsis thaliana

Ser His Met Lys Tyr Asn Arg Ser Ser

1 5

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-57

cttgtcaggt ggggccaccg ccgtcttgtt gaaggatggc atgac 45

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-58

gtcatgccat ccttcaacaa gacggcggtg gccccacctg acaag 45

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-59

gctatgttta tctctggtgg cgccaccgat accgttctta agga 44

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-60

tccttaagaa cggtatcggt ggcgccacca gagataaaca tagc 44

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-61

cttgtcaggt ggggccaccg aagtcttgtt gaaggatggc atgac 45

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-62

gtcatgccat ccttcaacaa gacttcggtg gccccacctg acaag 45

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-63

gtcaagagtc acatgaagtt caacagatcc agcaaagata tgtct 45

100

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-64

100

agacatatct ttgctggatc tgttgaactt catgtgactc ttgac 45

101

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-65

101

gtcaagagtc acatgaagga caacagatcc agcaaagata tgtct 45

102

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-66

102

agacatatct ttgctggatc tgttgtcctt catgtgactc ttgac 45

103

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-67

103

gtcaagagtc acatgaagga aaacagatcc agcaaagata tgtct 45

104

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-68

104

agacatatct ttgctggatc tgttttcctt catgtgactc ttgac 45

105

1728

DNA

Hevea brasiliensis

105

atggacacca ccggccggct ccaccaccga aagcatgcta cacccgttga ggaccgttct 60

ccgaccactc cgaaagcgtc ggacgcgctt ccgcttcccc tctacctgac caacgcggtt 120

ttcttcacgc tgttcttctc ggtggcgtat tacctccttc accggtggcg cgacaagatc 180

cgcaactcca ctccccttca tatcgttact ctctctgaaa ttgttgctat tgtctccctc 240

attgcctctt tcatttacct cctaggattc ttcggtatcg attttgtgca gtcattcatt 300

gcacgcgcct cccatgacgt gtgggacctc gaagatacgg atcccaacta cctcatcgat 360

gaagatcacc gtctcgttac ttgccctccc gctaatatat ctactaagac taccattatt 420

gccgcaccta ccaaattgcc tacctcggaa cccttaattg cacccttagt ctcggaggaa 480

gacgaaatga tcgtcaactc cgtcgtggat gggaagatac cctcctattc tctggagtcg 540

aagctcgggg actgcaaacg agcggctgcg attcgacgcg aggctttgca gaggatgaca 600

aggaggtcgc tggaaggctt gccagtagaa gggttcgatt acgagtcgat tttaggacaa 660

tgctgtgaaa tgccagtggg atacgtgcag attccggtgg ggattgcggg gccgttgttg 720

ctgaacgggc gggagtactc tgttccaatg gcgaccacgg agggttgttt ggtggcgagc 780

actaatagag ggtgtaaggc gatttacttg tcaggtgggg ccaccagcgt cttgttgaag 840

gatggcatga caagagcgcc tgttgtaaga ttcgcgtcgg cgactagagc cgcggagttg 900

aagttcttct tggaggatcc tgacaatttt gataccttgg ccgtagtttt taacaagtcc 960

agtagatttg cgaggctcca aggcattaaa tgctcaattg ctggtaagaa tctttatata 1020

agattcagct gcagcactgg cgatgcaatg gggatgaaca tggtttctaa aggggttcaa 1080

aacgttcttg aatttcttca aagtgatttt tctgatatgg atgtcattgg aatctcagga 1140

aatttttgtt cggataagaa gcctgctgct gtaaattgga ttgaaggacg tggcaaatca 1200

gttgtttgtg aggcaattat caaggaagag gtggtgaaga aggtgttgaa aaccaatgtg 1260

gcctccctag tggagcttaa catgctcaag aatcttgctg gttctgctgt tgctggtgct 1320

ttgggtggat ttaatgccca tgcaggcaac atcgtatctg caatctttat tgccactggc 1380

caggatccag cacagaatgt tgagagttct cattgcatta ccatgatgga agctgtcaat 1440

gatggaaagg atctccatat ctctgtgacc atgccctcca ttgaggtggg tacagtcgga 1500

ggtggaactc aacttgcatc tcagtctgct tgtctcaatt tgcttggggt gaagggtgca 1560

aacaaagagt cgccaggatc aaactcaagg ctccttgctg ccatcgtagc tggttcagtt 1620

ttggctggtg agctctcctt gatgtctgcc attgcagctg ggcagcttgt caagagtcac 1680

atgaagtaca acagatccag caaagatatg tctaaagctg catcttag 1728

106

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-69

106

caccatggac accaccggcc ggctccacca c 31

107

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-70

107

cgcctcgagt caagatgcag ctttagacat 30

108

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-71

108

gtagaagggt tcgatttcga gtcgatttta ggac 34

109

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-72

109

gtcctaaaat cgactcgaaa tcgaaccctt ctac 34

110

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-73

110

gtagaagggt tcgatgaaga gtcgatttta ggaca 35

111

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-74

111

tgtcctaaaa tcgactcttc atcgaaccct tctac 35

112

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-75

112

gctgaacggg cgggagttct ctgttccaat ggc 33

113

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-76

113

gccattggaa cagagaactc ccgcccgttc agc 33

114

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-77

114

gctgaacggg cgggaggaat ctgttccaat ggc 33

115

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-78

115

gccattggaa cagattcctc ccgcccgttc agc 33

116

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-79

116

gaaggacgtg gcaaagccgt tgtttgtgag 30

117

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-80

117

ctcacaaaca acggctttgc cacgtccttc 30

118

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-81

118

tgaaggacgt ggcaaagacg ttgtttgtga ggcaattatc aag 43

119

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-82

119

cttgataatt gcctcacaaa caacgtcttt gccacgtcct tca 43

120

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-83

120

tgaaggacgt ggcaaagaag ttgtttgtga ggcaattatc aag 43

121

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-84

121

cttgataatt gcctcacaaa caacttcttt gccacgtcct tca 43

122

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-85

122

ctgcaatctt tattgcctgt ggccaggatc cagc 34

123

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-86

123

gctggatcct ggccacaggc aataaagatt gcag 34

124

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-87

124

tcgtatctgc aatctttatt gccgatggcc aggatccagc acaga 45

125

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-88

125

tctgtgctgg atcctggcca tcggcaataa agattgcaga tacga 45

126

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-89

126

tcgtatctgc aatctttatt gccgaaggcc aggatccagc acaga 45

127

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-90

127

tctgtgctgg atcctggcct tcggcaataa agattgcaga tacga 45

128

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-91

128

ctccattgag gtgggttgtg tcggaggtgg aactc 35

129

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-92

129

gagttccacc tccgacacaa cccacctcaa tggag 35

130

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-93

130

accatgccct ccattgaggt gggtgacgtc ggaggtggaa ctcaac 46

131

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-94

131

gttgagttcc acctccgacg tcacccacct caatggaggg catggt 46

132

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-95

132

accatgccct ccattgaggt gggtgaagtc ggaggtggaa ctcaac 46

133

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-96

133

gttgagttcc acctccgact tcacccacct caatggaggg catggt 46

134

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-97

134

gtcacatgaa gtacaacaga gccagcaaag atatgtctaa agct 44

135

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-98

135

agctttagac atatctttgc tggctctgtt gtacttcatg tgact 45

136

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-99

136

gtcacatgaa gtacaacaga gacagcaaag atatgtctaa agct 44

137

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-100

137

agctttagac atatctttgc tgtctctgtt gtacttcatg tgact 45

138

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-101

138

cttgtcaggt ggggccaccg ccgtcttgtt gaaggatggc atgac 45

139

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-102

139

gtcatgccat ccttcaacaa gacggcggtg gccccacctg acaag 45

140

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-103

140

caggtggggc caccgacgtc ttgttgaagg 30

141

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-104

141

ccttcaacaa gacgtcggtg gccccacctg 30

142

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-105

142

cttgtcaggt ggggccaccg aagtcttgtt gaaggatggc atgac 45

143

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-106

143

gtcatgccat ccttcaacaa gacttcggtg gccccacctg acaag 45

144

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-107

144

gtcaagagtc acatgaagtt caacagatcc agc 33

145

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-108

145

gctggatctg ttgaacttca tgtgactctt gac 33

146

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-109

146

gtcaagagtc acatgaagga caacagatcc agc 33

147

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-110

147

gctggatctg ttgtccttca tgtgactctt gac 33

148

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-111

148

gtcaagagtc acatgaagga aaacagatcc agc 33

149

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-112

149

gctggatctg ttttccttca tgtgactctt gac 33

150

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-113

150

gtcaagagtc acatgaaggc caacagatcc agcaaagata tgtct 45

151

DNA

Artificial Sequence

PRIMER-114

151

agacatatct ttgctggatc tgttggcctt catgtgactc ttgac 45

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