目標蛋白質的純化方法與流程

2023-06-13 19:56:51 1

【
技術領域：
：】本發明涉及目標蛋白質的純化方法。
背景技術：
：：向大腸桿菌、酵母、細胞等的宿主導入編碼目標蛋白質的重組基因，可使重組蛋白質表達。對於表達的重組蛋白質，解析功能或結構，或為了作為製劑等利用而需要高的純化度。在蛋白質的純化中，一般使用各種的層析等。在mayanksaraswat,et.al.reviewarticle：preparativepurificationofrecombinantproteins.vol2013:18,2013中，作為重組蛋白質的純化方法之一，記載了離子交換層析。技術實現要素：【發明要解決的技術課題】本發明以提供可簡便地得到高純度的重組蛋白質的純化方法作為課題。【解決課題的技術方案】本發明是目標蛋白質的純化方法，其包括使含肽標籤的胺基酸序列、蛋白質分解酶的切斷位點的胺基酸序列及目標蛋白質的胺基酸序列的融合蛋白質和蛋白質分解酶在溶液中接觸，從融合蛋白質切斷肽標籤的工序、及通過使含肽標籤、目標蛋白質和蛋白質分解酶的溶液與離子交換樹脂接觸，分離目標蛋白質和肽標籤，取得含目標蛋白質的溶液的工序，在融合蛋白質中，蛋白質分解酶的切斷位點的胺基酸序列在肽標籤的胺基酸序列和目標蛋白質的胺基酸序列之間，肽標籤是聚陰離子性或聚陽離子性。【發明效果】可由簡便的方法得到純化度高的重組蛋白質。【附圖說明】【圖1】是模式地顯示本實施方式的純化方法的原理的圖。(a)顯示混雜蛋白質除去工序、(b)顯示肽標籤切斷工序、(c)顯示目標蛋白質取得工序。【圖2】是顯示在實施例1中的sds(十二烷基硫酸鈉)-聚丙烯醯胺凝膠電泳(sds-page)的結果的圖。【圖3】是顯示在實施例2中的sds-page的結果的圖。【圖4】是顯示在實施例3中的sds-page的結果的圖。【圖5】是顯示在實施例4中的sds-page的結果的圖。【圖6】是顯示在實施例5中的sds-page的結果的圖。【圖7】是顯示在實施例6中的sds-page的結果的圖。【圖8】是顯示在實施例7中的sds-page的結果的圖。【圖9】是顯示在實施例8中的sds-page的結果的圖。【圖10】是顯示在實施例9中的sds-page的結果的圖。【圖11】是顯示在實施例10中的sds-page的結果的圖。【圖12】是顯示在實施例11中的sds-page的結果的圖。【圖13】是顯示在實施例12中的sds-page的結果的圖。【圖14】是顯示在實施例13中的sds-page的結果的圖。【圖15】是顯示在比較例1中的sds-page的結果的圖。【圖16】是顯示在實施例14中的sds-page的結果的圖。【圖17】是顯示在實施例15中的sds-page的結果的圖。【圖18】是顯示在實施例16中的sds-page的結果的圖。【圖19】是顯示在實施例17中的sds-page的結果的圖。【圖20】是顯示在實施例18中的sds-page的結果的圖。【圖21】是顯示在實施例19中的sds-page的結果的圖。【圖22】是顯示在實施例20中的sds-page的結果的圖。【圖23】是顯示在實施例21中的sds-page的結果的圖。【圖24】是顯示在實施例22中的sds-page的結果的圖。【圖25】是顯示在實施例23中的sds-page的結果的圖。【圖26】是顯示在實施例24中的sds-page的結果的圖。【圖27】是顯示在實施例25中的sds-page的結果的圖。【圖28】是顯示在實施例26中的sds-page的結果的圖。【圖29】是顯示在實施例27中的sds-page的結果的圖。【圖30】是顯示在實施例28中的sds-page的結果的圖。【實施方式】本發明的純化方法包括從融合蛋白質切斷肽標籤的工序(肽標籤切斷工序)，及分離目標蛋白質和肽標籤而取得目標蛋白質的工序(目標蛋白質取得工序)。(肽標籤切斷工序)在肽標籤切斷工序中，在溶液中使蛋白質分解酶接觸於含肽標籤和目標蛋白質的融合蛋白質而從融合蛋白質切斷肽標籤。融合蛋白質含肽標籤和目標蛋白質的胺基酸序列。肽標籤是含2個殘基以上的酸性胺基酸殘基的聚陰離子性肽標籤或含2以上鹼性胺基酸殘基的聚陽離子性肽標籤。作為肽標籤，使用聚陰離子性肽標籤時，就酸性胺基酸殘基的數而言，為了基於肽標籤和目標蛋白質之間的等電點的差異，由離子交換樹脂的分離變得更良好，優選12個殘基以上，更優選18個殘基以上，再優選24個殘基以上，特別優選30個殘基以上，最優選36個殘基以上。一方面，酸性胺基酸殘基數的上限不特別限定，但從對融合蛋白質的立體結構的影響等的觀點來看優選100殘基以下，更優選70殘基以下。聚陰離子性肽標籤中所含的酸性胺基酸殘基可為天冬氨酸殘基或穀氨酸殘基的任一方，也可為兩方。聚陰離子性肽標籤除了酸性胺基酸殘基之外，也可含中性胺基酸殘基及/或鹼性胺基酸殘基，酸性胺基酸殘基數對肽標籤整體的胺基酸殘基數的比例，為了與切斷的肽標籤等的分離變得更良好，優選20％以上，更優選60％以上。另外，在肽標籤整體的序列中，含酸性胺基酸殘基的胺基酸序列可以是酸性胺基酸殘基全部連續的序列，也可為1個或多個的中性胺基酸殘基及/或鹼性胺基酸殘基介於酸性胺基酸殘基之間。聚陰離子性肽標籤的等電點，為了與目標蛋白質的分離變得更良好，優選5以下，更優選4以下。等電點是水溶液中的正和負的離子濃度變得相等之時的ph的值，例如，可由等電點電泳等測定。作為聚陰離子性肽標籤的優選的具體例，可舉出下述肽標籤1～8(d；天冬氨酸殘基、e；穀氨酸殘基)。肽標籤1eeeeeedddddd(de12，seqidno：1)肽標籤2eeeeeeeeeddddddddd(de18，seqidno：2)肽標籤3eeeeeeeeeeeedddddddddddd(de24，seqidno：3)肽標籤4eeeeeeeeeeeeeeeddddddddddddddd(de30，seqidno：4)肽標籤5eeeeeeeeeeeeeeeeeedddddddddddddddddd(de36，seqidno：5)肽標籤6nvegktgnatdeeeeeeeeeeeeddddddddddddedsgaeiqdddeegfddeeefddddddehddddleneeneleeleervearkk(ded，seqidno：6)肽標籤7dlsnvegktgnatdeeeeeeeeeeeeddddddddddddedsgae(des，seqidno：7)肽標籤8eeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeee(eo24，seqidno：8)當作為肽標籤使用聚陽離子性標籤時，就鹼性胺基酸殘基的數而言，為了基於肽標籤和目標蛋白質之間的等電點的差異，由離子交換樹脂的分離變得更良好，優選12個殘基以上，更優選18個殘基以上，還優選24個殘基以上。一方面，鹼性胺基酸殘基數的上限不特別限定，但從對融合蛋白質的立體結構的影響等的觀點來看，優選100殘基以下，更優選70殘基以下。聚陽離子性肽標籤中所含的鹼性胺基酸殘基是選自精氨酸酸殘基、組氨酸殘基及賴氨酸殘基的1種或2種以上。聚陽離子性肽標籤除了鹼性胺基酸殘基之外，也可含中性胺基酸殘基及/或酸性胺基酸殘基，就鹼性胺基酸殘基數對肽標籤整體的胺基酸殘基數的比例而言，為了與切斷的肽標籤等的分離變得更良好，優選20％以上，更優選60％以上。另外，在肽標籤整體的序列中，含鹼性胺基酸殘基的胺基酸序列可以鹼性胺基酸殘基全部連續的序列，也可為1個或多個的中性胺基酸殘基及/或酸性胺基酸殘基介於鹼性胺基酸殘基之間。聚陽離子性肽標籤的等電點，為了與目標蛋白質的分離變得更良好，優選10以上，更優選11以上。目標蛋白質不特別限定，例如，可舉出酶、受體、幹擾素類、白細胞介素類、抗體、螢光蛋白質等的蛋白質。目標蛋白質的等電點不特別限定，但當肽標籤是聚陰離子性時，為了與肽標籤等的分離變得更良好，優選5以上，更優選6以上。一方面，當肽標籤是聚陽離子性時，等電點優選8以下，更優選7以下。在融合蛋白質中，肽標籤也可結合於目標蛋白質的n末端側或c末端側的任一側。蛋白質分解酶識別的切斷位點的胺基酸序列插入於目標蛋白質和肽標籤的胺基酸序列之間。蛋白質分解酶識別的切斷位點不特別限定，但例如，可舉出hrv3c、prescission蛋白酶、因子xa、凝血酶、tev蛋白酶等的蛋白質分解酶的識別序列等。通過使蛋白質分解酶在溶液中與融合蛋白質接觸，可從融合蛋白質切斷肽標籤。反應溫度及反應時間可根據蛋白質分解酶的種類等適宜設定。融合蛋白質的等電點不特別限定，但當肽標籤是聚陰離子性時，為了切斷的肽標籤等和目標蛋白質的分離變得更良好，優選不足6，更優選不足5。一方面，當肽標籤是聚陽離子性時，優選9以上，更優選10以上。(目標蛋白質取得工序)在目標蛋白質取得工序中，使經蛋白質分解酶處理的試樣溶液接觸離子交換樹脂，分離目標蛋白質和肽標籤而取得含目標蛋白質的溶液。在蛋白質分解酶反應後的溶液中，含被切斷的肽標籤、目標蛋白質及蛋白質分解酶。從融合蛋白質切斷肽標籤，則由於在目標蛋白質和肽標籤上發生等電點的差異，通過使蛋白質分解酶反應後的溶液與離子交換樹脂接觸，基於等電點的差異分離目標蛋白質和肽標籤。當肽標籤是聚陰離子性時，優選作為離子交換樹脂使用陰離子交換樹脂。如果使含由蛋白質分解酶反應後的聚陰離子性肽標籤、目標蛋白質及蛋白質分解酶的溶液通過陰離子交換樹脂，則聚陰離子性肽標籤與陰離子交換樹脂結合，但目標蛋白質不與離子交換樹脂結合而通過。可通過採集此通過級分取得含目標蛋白質的溶液。作為陰離子交換樹脂的離子交換基，不特別限定，可使用季銨(qa)、季氨基乙基(qae)、二乙基氨基乙基(deae)等，具體而言可舉出hitraphpq(gehealthcare公司)、toyopearlgigacapq-650m、toyopearlq-600car、toyopearlqae-550、toyopearldeae-650m、toyopearlsuperq-650m(以上、tosoh公司)、q101、de101(以上、三菱化學公司)等。作為離子交換基的載體，可使用纖維素、葡聚糖、瓊脂糖、親水性乙烯基聚合物等。含聚陰離子性肽標籤、目標蛋白質及蛋白質分解酶的溶液的鹽濃度，為了與聚陰離子性肽標籤的分離變得更良好，優選500mm以下，更優選250mm以下。另外，溶液的ph優選5以上、9以下，更優選6以上、8以下。作為在溶液的鹽濃度及ph的調整中使用的緩衝液，可使用磷酸緩衝液、檸檬酸緩衝液、醋酸緩衝液、tris緩衝液、mops緩衝液、hepes緩衝液等。在這些的緩衝液中，含為了得到緩衝作用而使用的與弱酸或弱鹼的鹽，但除此之外，可使用氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣等的鹽。在本說明書中，緩衝液或試樣溶液等的鹽濃度是指以這樣的緩衝作用作為目的的鹽以外的鹽的濃度。當肽標籤是聚陽離子性時，優選使用陽離子交換樹脂。與聚陰離子性肽標籤同樣地，如果使含由蛋白質分解酶反應後的聚陽離子性肽標籤、目標蛋白質及蛋白質分解酶的溶液通過陽離子交換樹脂，則聚陽離子性肽標籤與陽離子交換樹脂結合，但由於目標蛋白質不與陽離子交換樹脂結合而通過，可通過採集此通過級分取得含目標蛋白質的溶液。作為陽離子交換樹脂的離子交換基，不特別限定，可使用磺基丙基(sp)、羧基甲基(cm)等，具體而言可舉出spsepharose,cmsepharose(以上gehealthcare公司)、sp-5pw,sp-npr,cm-5pw,cm-stat(以上、tosoh公司)等。作為離子交換基的載體，可使用纖維素、葡聚糖、瓊脂糖、親水性乙烯基聚合物等。含聚陽離子性肽標籤、目標蛋白質及蛋白質分解酶的溶液的鹽濃度，為了與聚陽離子性肽標籤的分離變得更良好，優選500mm以下，更優選250mm以下。另外，溶液的ph優選5以上、9以下，更優選6以上、8以下。蛋白質分解酶的等電點優選與目標蛋白質的等電點不同。由此，用蛋白質分解酶切斷肽標籤之後，可容易地分離目標蛋白質和蛋白質分解酶。蛋白質分解酶也可融合肽標籤。由此，可將蛋白質分解酶的等電點調整到期望的值。作為與蛋白質分解酶融合的肽標籤，可使用和與上述的融合蛋白質結合的肽標籤相同的肽標籤。結合於蛋白質分解酶的肽標籤的胺基酸序列和與融合蛋白質結合的肽標籤的胺基酸序列可相同，也可不同。為了可將被切斷的肽標籤和蛋白質分解酶由離子交換樹脂同時分離，當結合於融合蛋白質的肽標籤是聚陰離子性時，優選將蛋白質分解酶的肽標籤也作為聚陰離子性，當結合於融合蛋白質的肽標籤是聚陽離子性時，優選使聚陽離子性肽標籤也結合於蛋白質分解酶。更適宜地是與融合蛋白質中所含的肽標籤相同的胺基酸序列。由此，蛋白質分解酶達到與目標蛋白質不同的等電點，並且達到與目標蛋白質不同的等電點。融合肽標籤的蛋白質分解酶，為了迴避由自身分解，優選無此蛋白質分解酶識別的切斷位點。如果使用融合肽標籤的蛋白質分解酶，則在蛋白質分解酶反應後的溶液中，含被切斷的肽標籤、目標蛋白質及融合了肽標籤的蛋白質分解酶。如果使此溶液通過離子交換樹脂，則融合肽標籤的蛋白質分解酶與被切斷的肽標籤一同與離子交換樹脂結合。一方面，目標蛋白質不與離子交換樹脂結合而通過。因此，不另行經分離蛋白質分解酶的工序，可在通過級分中取得高純度的目標蛋白質。在本實施方式中，在肽標籤切斷工序之前，也可包括使融合蛋白質表達的工序及除去混雜蛋白質的工序。(表達工序)融合蛋白質可通過根據公知的表達重組蛋白質的方法，向載體導入含編碼肽標籤的鹼基序列和編碼目標蛋白質的鹼基序列的多核苷酸之後，向宿主細胞導入載體，使融合蛋白質在宿主細胞表達而取得。編碼肽標籤的多核苷酸及編碼目標蛋白質的多核苷酸可由化學合成等公知的方法取得，可將其作為模板根據公知的基因擴增方法擴增。通過將擴增的多核苷酸和表達載體由限制性內切酶處理，使用適當的dna連接酶使其結合，可構建含各自編碼肽標籤和目標蛋白質的多核苷酸的表達重組的載體。對於表達載體的構建，編碼肽標籤的多核苷酸也可配置於編碼目標蛋白質的多核苷酸的5』側或3』側的任一側。在編碼肽標籤的鹼基序列和編碼目標蛋白質的鹼基序列之間，插入有編碼蛋白質分解酶識別的切斷位點的鹼基序列。作為宿主，不特別限定，可使用大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞、蟲體、動物細胞、植物細胞等。作為表達載體，無特別限制，可舉出質粒載體、噬菌體載體、病毒載體等，可根據使用的宿主適宜選擇。在表達載體中，也可含複製起點、啟動子序列、增強子序列等的調節序列、選擇標誌物等的序列。向宿主導入表達載體可根據宿主根據公知的方法進行，例如，可舉出磷酸鈣法、電穿孔法、脂轉染法等。這樣，可得到向宿主細胞導入表達載體的轉化體。使得到的轉化體在適宜的條件下溫育，可使融合蛋白質產生。使融合蛋白質表達之後，對於宿主的細胞、組織、蟲體等，根據需要，進行提取、破碎、離心分離、增溶、體液採集等的處理，作為細胞培養液、提取液、勻漿物、溶解液、體液等取得試樣溶液。在試樣溶液的調製中，可使用磷酸緩衝液、檸檬酸緩衝液、醋酸緩衝液、tris緩衝液、mops緩衝液、hepes緩衝液等的緩衝液。在這些緩衝液中，含為了得到緩衝作用而使用的與弱酸或弱鹼的鹽，但除此之外，可使用氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣等的鹽。在本說明書中，緩衝液的鹽濃度是指以這樣的緩衝作用作為目的的鹽以外的鹽的濃度。緩衝液的鹽濃度，從融合蛋白質的穩定性及在分離工序中的調整的容易性等的觀點來看，優選50mm以上500mm以下，更優選50mm以上250mm以下。另外緩衝液的ph，從融合蛋白質的穩定性及在分離工序中的調整的容易性等的觀點來看，優選5以上9以下，更優選6以上8以下。使用大腸桿菌表達系統取得試樣時，作為表達載體，可使用質粒載體。作為質粒載體，具體而言，可舉出pet、pgex、pcold、pmal、pcal等。在表達載體中，也可含複製起點、lac、t7、tac等的啟動子序列、增強子序列、氨苄西林抗性基因、卡那黴素抗性基因、四環素抗性基因等的選擇標誌物的序列。向大腸桿菌導入表達載體可由磷酸鈣法、電穿孔法、脂轉染法等進行。表達載體導入後，通過用含選擇標誌物的培養基培養，可選擇向大腸桿菌導入表達載體的轉化體。使這樣得到的轉化體在適宜的條件下增殖之後，根據選擇的啟動子表達誘導，使融合蛋白質產生。使融合蛋白質表達之後，可對大腸桿菌進行破碎等而取得含融合蛋白質及大腸桿菌來源的混雜蛋白質的試樣溶液。作為表達系統使用蠶等的蟲體或昆蟲細胞時，可使用轉移載體。將轉移載體與杆狀病毒dna一同轉導到昆蟲細胞中之後，可由同源重組向杆狀病毒dna插入目的基因。作為轉移載體，具體而言，可舉出pm01、pm02、phs01、phs02等。轉移載體優選含多角體蛋白啟動子、p10啟動子等的啟動子。作為昆蟲細胞，例如可舉出sf9、sf21、high5、tn-368、bm5等。作為杆狀病毒，例如，可舉出核多角體病病毒(npv)，具體而言，可例示acmnpv、bmnpv等。通過向昆蟲細胞導入轉移載體和線性化的杆狀病毒dna，發生同源重組，得到了插入目的基因的重組杆狀病毒。通過向蟲體或昆蟲細胞接種等含重組杆狀病毒的病毒溶液，可使重組杆狀病毒感染。蠶等的蟲體可為成蟲、蛹及幼蟲的任何的形態。通過使重組杆狀病毒感染於蟲體或昆蟲細胞，飼育或培養1～7天，可使融合蛋白質表達。使融合蛋白質表達之後，可對蟲體或昆蟲細胞進行破碎等而取得含融合蛋白質和蟲體或昆蟲細胞來源的混雜蛋白質的試樣溶液。蛋白質分解酶也可同樣地由公知的表達系統表達。在上述融合蛋白質的表達中，通過以蛋白質分解酶作為目標蛋白質，可得到融合肽標籤的蛋白質分解酶。融合蛋白質和蛋白質分解酶可向宿主導入插入含編碼兩方的胺基酸序列的鹼基序列的多核苷酸的載體而使表達。另外，也可向宿主導入了導入編碼融合蛋白質的多核苷酸的載體和插入編碼蛋白質分解酶的多核苷酸的載體而使表達。另外，也可向宿主導入插入編碼融合蛋白質的多核苷酸的載體，向宿主導入插入編碼蛋白質分解酶的多核苷酸的載體，各自單獨表達之後，混合。此時，宿主可為同種，也可為異種，從表達後的處理容易性等來看，優選同種。作為融合蛋白質，例如，可舉出將作為目標蛋白質的nad(p)h脫氫酶,醌1人(nq01，pi＝8.91，seqidno：9)或螢光素酶(pi＝6.71，seqidno：10)和上述肽標籤1～8融合，其間插入蛋白質分解酶hrv3c識別的切斷位點的下述構建體1～12。另外，作為融合了肽標籤的蛋白質分解酶，可舉出將作為蛋白質分解酶的hrv3c(pi＝8.46，seqidno：11)和上述肽標籤7融合的下述構建體13。構建體1de12-hrv3csite-nq01(seqidno：12)構建體2de18-hrv3csite-nq01(seqidno：13)構建體3de24-hrv3csite-nq01(seqidno：14)構建體4de30-hrv3csite-nq01(seqidno：15)構建體5de36-hrv3csite-nq01(seqidno：16)構建體6ded-hrv3csite-nq01(seqidno：17)構建體7des-hrv3csite-nq01(seqidno：18)構建體8eo24-hrv3csite-nq01(seqidno：19)構建體9nq01-hrv3csite-ded(seqidno：20)構建體10nq01-hrv3csite-des(seqidno：21)構建體11ded-hrv3csite-螢光素酶(seqidno：22)構建體12des-hrv3csite-螢光素酶(seqidno：23)構建體13ded-hrv3c(seqidno：24)(混雜蛋白質除去工序)在含如上所述表達的融合蛋白質的試樣溶液中，含宿主來源的內源性蛋白質等的混雜蛋白質。因此，在目標蛋白質取得工序前，也可包括分離融合蛋白質和混雜蛋白質，除去混雜蛋白質的工序。「分離融合蛋白質和混雜蛋白質」包括將融合蛋白質提取－純化，收容到與混雜蛋白質不同的容器中。混雜蛋白質可基本上被完全地分離，也可將混雜蛋白質的一部分分離。通過分離混雜蛋白質的一部分或全部，可使融合蛋白質的純度提高。混雜蛋白質是指宿主來源的內源性蛋白質等融合蛋白質或目標蛋白質以外的蛋白質。融合蛋白質通過使肽標籤融合於目標蛋白質，達到以可與混雜蛋白質充分地分離的程度發生等電點的差。如上所述，融合蛋白質的等電點，當肽標籤是聚陰離子性時，優選不足6，更優選不足5，當肽標籤是聚陽離子性時，優選9以上，更優選10以上。多數蛋白質由於等電點一般是6～7，如果融合蛋白質的等電點是這樣的範圍，則融合蛋白質和混雜蛋白質的分離變得更容易，可使融合蛋白質的純度提高。作為分離手段，不特別限定，可使用公知的分離手段，但優選為了得到了與混雜蛋白質的良好的分離而由離子交換樹脂分離。當肽標籤是聚陰離子性時，更優選由陰離子交換樹脂分離。作為陰離子交換樹脂的離子交換基，不特別限定，可使用季銨(qa)、季氨基乙基(qae)、二乙基氨基乙基(deae)等，具體而言可舉出hitraphpq(gehealthcare公司)、toyopearlgigacapq-650m、toyopearlq-600car、toyopearlqae-550、toyopearldeae-650m、toyopearlsuperq-650m(以上、tosoh公司)、q101、de101(以上、三菱化學公司)等。作為離子交換基的載體，可使用纖維素、葡聚糖、瓊脂糖、親水性乙烯基聚合物等。通過使含融合蛋白質和混雜蛋白質的試樣溶液通過陰離子交換樹脂，使融合蛋白質與陰離子交換樹脂結合。其後，例如使溶出液的鹽濃度升高而使混雜蛋白質溶出之後，通過用高鹽濃度的溶出液將融合蛋白質從離子交換樹脂溶出，可純化融合蛋白質。作為使溶出液的鹽濃度升高的方法，可舉出階段性地改變鹽濃度而使目的蛋白質溶出的逐步法、連續地改變鹽濃度而使目的蛋白質溶出的梯度法。作為緩衝液，可使用磷酸緩衝液、檸檬酸緩衝液、醋酸緩衝液、tris緩衝液、mops緩衝液、hepes緩衝液等的緩衝液。緩衝液的鹽濃度，從與混雜蛋白質分離及融合蛋白質的穩定性等的觀點來看，優選設為50mm以上、2000mm以下的範圍，更優選50mm以上、1000mm以下的範圍。特別是，如果將緩衝液的鹽濃度設為600mm以上、更優選為750mm以上，則與混雜蛋白質的分離變得更良好。另外，緩衝液的ph的範圍雖不特別限制，但從與混雜蛋白質分離及融合蛋白質的穩定性等的觀點來看，優選5以上9以下的範圍，更優選6以上8以下的範圍。當肽標籤是聚陽離子性時，優選使用陽離子交換樹脂。作為陽離子交換樹脂的離子交換基，不特別限定，可使用磺基丙基(sp)、羧基甲基(cm)等，具體而言可舉出spsepharose,cmsepharose(以上gehealthcare公司)、sp-5pw,sp-npr,cm-5pw,cm-stat(以上、tosoh公司)等。作為離子交換基的載體，可使用纖維素、葡聚糖、瓊脂糖、親水性乙烯基聚合物等。與使用陰離子交換樹脂時同樣地，通過使溶出液的鹽濃度升高，可純化融合蛋白質，但緩衝液的鹽濃度，從與混雜蛋白質的分離及融合蛋白質的穩定性等的觀點來看，優選設為50mm以上、2000mm以下的範圍，更優選50mm以上、1000mm以下的範圍。另外，緩衝液的ph的範圍雖不特別限制，但從與混雜蛋白質分離及融合蛋白質的穩定性等的觀點來看，優選5以上9以下的範圍，更優選6以上8以下的範圍。圖1是顯示本發明的一實施方式的模式圖，(a)顯示混雜蛋白質除去工序、(b)顯示肽標籤切斷工序、(c)顯示目標蛋白質取得工序。基於此圖說明本實施方式的純化方法的原理。使融合蛋白質在宿主細胞表達時，在細胞破碎液等的試樣溶液中，除了融合蛋白質20之外，含宿主來源的內源性蛋白質等的混雜蛋白質21a～21f。混雜蛋白質21的等電點從低到高依a到f的順序。在此實施方式中，使聚陰離子性肽標籤20b結合於目標蛋白質20a，由此，融合蛋白質20的等電點降低。等電點降低的融合蛋白20可在陰離子交換樹脂10保持至高鹽濃度。一方面，大部分宿主來源的混雜蛋白質無法在陰離子交換樹脂10保持至同程度的鹽濃度。基於這樣的等電點的差異分離融合蛋白質和混雜蛋白質。具體而言，如果使試樣接觸陰離子交換樹脂10，則等電點高的混雜蛋白質21a不與陰離子交換樹脂結合而通過。此外的混雜蛋白質和融合蛋白質20與陰離子樹脂20結合。如果使溶出液的鹽濃度升高，則從等電點高的混雜蛋白質順序溶出(21b～d)。融合蛋白質20進一步由高鹽濃度的溶出液溶出。在此溶出級分中含與融合蛋白質20等電點相近的混雜蛋白質21e及21f。通過這樣調整溶出液的鹽濃度，因為可分離多種混雜蛋白質，可得到高純度的融合蛋白質。另外，由於融合蛋白質和混雜蛋白質之間的等電點的差異相對大，由階段性地改變鹽濃度而使蛋白質溶出的逐步法也得到良好的分離(圖1(a))。融合蛋白質20在目標蛋白質20a和肽標籤20b之間含蛋白質分解酶22識別的切斷位點20c。在融合了肽標籤的蛋白質分解酶22中，在蛋白質分解酶20a上結合了肽標籤22b。如果在溶液中使融合蛋白質20和蛋白質分解酶22反應，則從融合蛋白質20切斷肽標籤20b(圖1(b))。在反應後的溶液中，含目標蛋白質20a、被切斷的肽標籤20b、融合了肽標籤的蛋白質分解酶22及在混雜蛋白質除去工序中殘留的混雜蛋白質21e、21f。由於等電點低的肽標籤20b被切斷，目標蛋白質20a與融合蛋白質20相比等電點變高。另外，混雜蛋白質21e及21f由於與融合蛋白質20等電點比較接近，目標蛋白質20a的等電點變得比這些高。再者，目標蛋白質20a的等電點也變得比將被切斷的肽標籤20b及肽標籤22b融合的蛋白質分解酶22高。因此，如果稀釋此溶液而使鹽濃度降低，使通過陰離子交換樹脂10，則被切斷的肽標籤20b、融合肽標籤的蛋白質分解酶22及混雜蛋白質21e、21f與陰離子交換樹脂10結合，但目標蛋白質20a不結合而通過。通過採集此通過級分，可取得高純度的目標蛋白質20a(圖1(c))。【實施例】以下，對於本發明還舉實施例詳細地進行說明，但本發明不以任何方式限於這些實施例。【實施例1[融合蛋白質de12-hrv3csite-nq01(構建體1；pi＝5.84)的表達及純化]】對肽標籤1(de12)融合於作為目標蛋白的nad(p)h脫氫酶,醌1人(nq01，pi＝8.91)的n末端側，nq01和de12之間含蛋白質分解酶hrv3c識別的切斷位點hrv3csite的融合蛋白質進行表達及純化。(1)pm01_de12載體的構建構建向pm01載體插入肽標籤de12的載體pm01_de12。使編碼de12的多核苷酸(seqidno：25及26)退火成對，調製插入子部分。將pm01載體(sysmex公司)的nhei位點用nhei(寶生物公司)處理，使用in-fusionhd克隆試劑盒(clonetech公司)插入插入子部分。用構建的載體轉化stellar感受態細胞之後，播種到lba板上，於37℃下培養16hr。從此轉化體根據常規方法挑選氨苄西林抗性轉化體，進行質粒的純化。為了確認挑選的克隆的鹼基序列，使用測序確認用引物1(seqidno：27)及引物2(seqidno：28)，用bigdyeterminatorv3.1(thermoscientific公司)進行pcr反應之後，用dna測序儀(thermoscientific公司)解析。將導入有插入子部分、此外的部分無變異的載體作為pm01_de12。(2)pm01_de12_hrv3csite_nq01的構建構建向pm01_de12插入編碼nq01(seqidno：9)的多核苷酸(seqidno：29)的表達載體pm01_de12_hrv3csite_nq01。插入子部分準備編碼nq01的多核苷酸和對應於插入子部分的引物3f(seqidno：30)及3r(seqidno：31)，作為pcr酶，使用kod-plus-(東洋紡公司)，用下述pcr條件擴增。將擴增的pcr產物用1.0％(w/v)瓊脂糖電泳進行電泳，將與插入子部分的長度一致的部分從凝膠切出而純化而調製插入子部分。將pm01_de12載體的smai位點用smai(寶生物公司)處理，使用in-fusionhd克隆試劑盒(clonetech公司)插入插入子部分。用構建的載體轉化stellar感受態細胞(clonetech公司)之後，播種到lba板上。於37℃下培養16hr，從此轉化體根據常規方法挑選氨苄西林抗性轉化體，進行質粒的純化。為了確認挑選的克隆的鹼基序列，使用測序確認用的引物1及2，用bigdyeterminatorv3.1(thermoscientific公司)進行pcr反應之後，用dna測序儀(thermoscientific公司)解析。將導入有插入子部分、此外的部分無變異的載體作為pm01_de12_hrv3csite_nq01。反應1：94.0℃、2分鐘；反應2：94.0℃、15秒鐘；反應3：52.0℃、30秒鐘；反應4：68.0℃、每1kbp1分鐘；反應5：將反應2～反應4重複30次(3)重組杆狀病毒的製作及融合蛋白質de12-hrv3csite-nq01的表達向蠶培養細胞(bmn細胞)導入pm01_de12_hrv3csite_nq01和杆狀病毒dna，進行病毒的同源重組。將此培養細胞培養6天，回收重組病毒後，向蠶的蛹接種用milliq水稀釋50倍的病毒溶液，溫育6天。(4)de12-hrv3csite-nq01的純化溫育後，回收蠶的蛹，每1隻加50ml的緩衝液(20mmtris-hcl(ph8.0),150mmnacl,1片完全無edta(1tabletcompleteedtafree)(roche),phenyltiourea)而勻漿，對溶液進行離心(8,000g、10分鐘)後，將上清級分用0.8μm的濾劑過濾，回收濾液。將回收的濾液加載到離子交換樹脂(hitrapqhp(1ml))，使用混合20mmtris-hcl(ph8.0,150mmnacl，緩衝液a)和20mmtris-hcl(ph8.0,1000mmnacl，緩衝液b)的溶液純化。各回收首先僅使緩衝液a(nacl濃度150mm)流過離子交換樹脂(el0)、用緩衝液a：緩衝液b的3:1混合溶液(nacl濃度363mm)溶出(el1)、用緩衝液a：緩衝液b的1:1混合溶液(nacl濃度575mm)溶出(el2)、用緩衝液a：緩衝液b的1:3混合溶液(nacl濃度788mm)溶出(el3)，最後僅用緩衝液b(nacl濃度1000mm)溶出(el4)的級分。(5)de12-hrv3csite-nq01的檢測sds(十二烷基硫酸鈉)-聚丙烯醯胺凝膠電泳(sds-page)使用5-20％梯度凝膠及電泳裝置(aproscience公司)實施。將樣品和trissdsβ-me樣品處理液(cosmo-bio公司)以1:1容量比混合，100℃下、處理3分鐘之後，將5μl加載到凝膠。作為分子量標誌物，將bluestar(日本genetics公司)加載到2.5μl凝膠。將加載樣品的凝膠以電壓400v電泳14分鐘之後，使用轉印turbo印跡系統(bio-rad公司)轉印到膜上。將轉印的膜設置於i-bind系統(thermofisherscientific公司)，實施抗原抗體反應。在抗原抗體反應中，將抗-flag(註冊商標)m2-過氧化物酶(hrp)抗體(merck公司)或抗-nq01抗體(cellsignaling公司和抗-igg(h+lchain)(mouse)pab-hrp(beckman公司)稀釋2000倍而使用，檢測的hrp試劑使用luminataforte(merck公司)、檢測機使用geldocxr+系統(bio-rad公司)。實施蛋白印跡之後，將使用的膜用gelcodebluestainreagent(thermofisherscientific公司)染色，使額外的染色脫色之後，使用geldocxr+系統(bio-rad公司)對圖像進行攝影。結果示於圖2。在圖2中，m是分子量標誌物、泳道1是勻漿物溶液、泳道2是離心後的上清級分、泳道3是離心後的沉澱級分、泳道4～泳道7是離子交換樹脂的通過級分1～4、泳道8是由緩衝液a(nacl濃度150mm)的溶出級分(el0)、泳道9是由緩衝液a：緩衝液b的3:1混合溶液(nacl濃度363mm)的溶出級分(el1)、泳道10是由緩衝液a：緩衝液b的1:1混合溶液(nacl濃度575mm)的溶出級分(el2)、泳道11是由緩衝液a：緩衝液b的1:3混合溶液(nacl濃度788mm)的溶液級分(el3)、泳道12是由緩衝液b(nacl濃度1000mm)的溶出級分(el4)的電泳結果。用虛線包圍的部分表示含目標蛋白質的條帶。各泳道的說明在圖3～15中通用。【實施例2[融合蛋白質de18-hrv3csite-nq01(構建體2；pi＝5.03)的表達及純化]】對肽標籤2(de18)融合於作為目標蛋白的nq01的n末端側，nq01和de18之間含hrv3csite的融合蛋白質進行表達及純化。除了代替編碼肽標籤de12的多核苷酸而使用編碼de18(seqidno：2)的多核苷酸(seqidno：32及33)調製插入子部分之外，與實施例1同樣地構建pm01_de18載體。再與實施例1同樣地，構建pm01_de18_hrv3csite_nq01，製作重組杆狀病毒之後，進行融合蛋白質de18-hrv3csite-nq01的表達、純化及檢測。結果示於圖3。【實施例3[融合蛋白質de24-hrv3csite-nq01(構建體3；pi＝4.78)的表達及純化]】對肽標籤3(de24)融合於作為目標蛋白的nq01的n末端側，nq01和de24之間含hrv3csite的融合蛋白質進行表達及純化。(1)pm01_de24載體的構建向pm01載體插入編碼肽標籤de24的多核苷酸的載體pm01_de24如以下一樣構建。準備編碼肽標籤6(ded，seqidno：6)的多核苷酸(seqidno：34)和對應於插入子部分的引物4f(seqidno：35)及4r(seqidno：36)，作為pcr酶使用kod-plus-(東洋紡公司)，用與實施例1相同的pcr條件擴增。將擴增的pcr產物用1.0％(w/v)瓊脂糖電泳進行電泳，將與插入子部分的長度一致的部分從凝膠切出，純化而調製插入子部分。將pm01載體(sysmex公司)的smai位點用smai(寶生物公司)處理，使用in-fusionhd克隆試劑盒(clonetech公司)插入插入子部分。用構建的載體轉化stellar感受態細胞(clonetech公司)之後，播種到lba板上。於37℃下培養16hr，從此轉化體根據常規方法挑選氨苄西林抗性轉化體，進行質粒的純化。為了確認挑選的克隆的鹼基序列，使用測序確認用的引物1及2，用bigdyeterminatorv3.1(thermoscientific公司)進行pcr反應之後，用dna測序儀(thermoscientific公司)解析。將導入有插入子部分、此外的部分無變異的載體作為pm01_de24。(2)與實施例1同樣地構建，pm01_de24_hrv3csite_nq01，製作重組杆狀病毒之後，進行融合蛋白質de24-hrv3csite-nq01的表達、純化及檢測。結果示於圖4。【實施例4[融合蛋白質de30-hrv3csite-nq01(構建體4；pi＝4.61)的表達及純化]】對肽標籤4(de30)融合於作為目標蛋白的nq01的n末端側，nq01和de30之間含hrv3csite的融合蛋白質進行表達及純化。除了代替編碼肽標籤de12的多核苷酸而使用編碼de30(seqidno：4)的多核苷酸(seqidno：37及38)調製插入子部分之外，與實施例1同樣地構建pm01_de30載體。再與實施例1同樣地，構建pm01_de30_hrv3csite_nq01，製作重組杆狀病毒之後，進行融合蛋白質de30-hrv3csite-nq01的表達、純化及檢測。結果示於圖5。【實施例5[融合蛋白質de36-hrv3csite-nq01(構建體5；pi＝4.49)的表達及純化]】對肽標籤5(de36)融合於作為目標蛋白的nq01的n末端側，nq01和de36之間含hrv3csite的融合蛋白質進行表達及純化。除了代替編碼肽標籤de12的多核苷酸而使用編碼de36(seqidno：5)的多核苷酸(seqidno：39及40)調製插入子部分之外，與實施例1同樣地構建pm01_de36載體。再與實施例1同樣地，構建pm01_de36_hrv3csite_nq01，製作重組杆狀病毒之後，進行融合蛋白質de36-hrv3csite-nq01的表達、純化及檢測。結果示於圖6。【實施例6[融合蛋白質ded-hrv3csite-nq01(構建體6；pi＝4.26)的表達及純化]】對肽標籤6(ded)融合於作為目標蛋白的nq01的n末端側，nq01和ded之間含hrv3csite的融合蛋白質進行表達及純化。(1)phs01_ded載體的構建向phs01載體插入肽標籤ded(seqidno：6)的載體phs01_ded如以下一樣構建。準備編碼肽標籤ded的多核苷酸(seqidno：34)和對應於插入子部分的引物5f(seqidno：41)及5r(seqidno：42)，作為pcr酶使用kod-plus-(東洋紡公司)，用與實施例1相同的pcr條件擴增。將擴增的pcr產物用1.0％(w/v)瓊脂糖電泳進行電泳，將與插入子部分的長度一致的部分從凝膠切出，純化而調製插入子部分。將phs01載體(sysmex公司)的nhei位點用nhei(寶生物公司)處理，使用in-fusionhd克隆試劑盒(clonetech公司)插入插入子部分。用構建的載體轉化stellar感受態細胞之後，播種到lba板上。於37℃下培養16hr，從此轉化體根據常規方法挑選氨苄西林抗性轉化體，進行質粒的純化。為了確認挑選的克隆的鹼基序列，使用測序確認用的引物1及2，用bigdyeterminatorv3.1(thermoscientific公司)進行pcr反應之後，用dna測序儀(thermoscientific公司)解析。將導入有插入子部分、此外的部分無變異的載體作為phs01_ded。(2)與實施例1同樣地構建hs01_ded_hrv3csite_nq01，製作重組杆狀病毒之後，進行融合蛋白質ded-hrv3csite-nq01的表達、純化及檢測。結果示於圖7。【實施例7[融合蛋白質des-hrv3csite-nq01(構建體7；pi＝4.55)的表達及純化]】對肽標籤7(des)融合於作為目標蛋白的nq01的n末端側，nq01和des之間含hrv3csite的融合蛋白質進行表達及純化。除了作為對應於插入子部分的引物，使用引物6f(seqidno：43)及6r(seqidno：44)之外，與實施例6同樣地，構建phs01_des。與實施例1同樣地構建phs01_des_hrv3csite_nq01，製作重組杆狀病毒之後，進行融合蛋白質des-hrv3csite-nq01的表達、純化及檢測。結果示於圖8。【實施例8[融合蛋白質eo24-hrv3csite-nq01(構建體8；pi＝4.73)的表達及純化]】對肽標籤8(eo24)融合於作為目標蛋白的nq01的n末端側，nq01和eo24之間含hrv3csite的融合蛋白質進行表達及純化。(1)phs01_eo24的構建使編碼肽標籤eo24的多核苷酸(seqidno：45及46)退火成對，調製插入子部分。將phs01載體(sysmex公司)的nhei位點用nhei(寶生物公司)處理，使用in-fusionhd克隆試劑盒(clonetech公司)插入插入子部分。用構建的載體轉化stellar感受態細胞(clonetech公司)之後，播種到lba板上。於37℃下培養16hr，從此轉化體根據常規方法挑選氨苄西林抗性轉化體，進行質粒的純化。為了確認挑選的克隆的鹼基序列，使用測序確認用的引物1及2，用bigdyeterminatorv3.1(thermoscientific公司)進行pcr反應之後，用dna測序儀(thermoscientific公司)解析。將導入有插入子部分、此外的部分無變異的載體作為phs01_eo24。(2)與實施例1同樣地構建phs01_eo24_hrv3csite_nq01，製作重組杆狀病毒之後，進行融合蛋白質eo24-hrv3csite-nq01的表達、純化及檢測。結果示於圖9。【實施例9[融合蛋白質nq01-hrv3csite-ded(構建體9；pi＝4.26)的表達及純化]】對肽標籤ded融合於作為目標蛋白的nq01的c末端側，nq01和ded之間含hrv3csite的融合蛋白質進行表達及純化。(1)phs02_ded載體的構建向phs02載體插入編碼肽標籤ded的多肽的載體phs02_de12如以下一樣構建。準備編碼肽標籤ded的多核苷酸(seqidno：34)和對應於插入子部分的引物7f(seqidno：47)及7r(seqidno：48)，作為pcr酶使用kod-plus-(東洋紡公司)，用與實施例1相同的pcr條件擴增。將擴增的pcr產物用1.0％(w/v)瓊脂糖電泳進行電泳，將與插入子部分的長度一致的部分從凝膠切出，純化而調製插入子部分。將phs02載體(sysmex公司)的nhei位點用nhei(寶生物公司)處理，使用in-fusionhd克隆試劑盒(clonetech公司)插入插入子部分。用構建的載體轉化stellar感受態細胞(clonetech公司)之後，播種到lba板上。於37℃下培養16hr，從此轉化體根據常規方法挑選氨苄西林抗性轉化體，進行質粒的純化。為了確認挑選的克隆的鹼基序列，使用測序確認用的引物1及2，用bigdyeterminatorv3.1(thermoscientific公司)進行pcr反應之後，用dna測序儀(thermoscientific公司)解析。將導入有插入子部分、此外的部分無變異的載體作為phs02_ded。(2)除了作為對應於插入子部分的引物，使用引物8f(seqidno：49)及8r(seqidno：50)之外，與實施例1同樣地構建phs02_nq01_hrv3csite_ded。(3)還與實施例1同樣地製作重組杆狀病毒，進行融合蛋白質nq01-hrv3csite-ded的表達、純化及檢測。結果示於圖10。【實施例10[融合蛋白質nq01-hrv3csite-des(構建體10；pi＝4.55)的表達及純化]】對肽標籤des融合於作為目標蛋白的nq01的c末端側，nq01和des之間含hrv3csite的融合蛋白質進行表達及純化。(1)除了作為引物，使用9f(seqidno：51)及9r(seqidno：52)之外，與實施例9同樣地，構建phs02_des。(2)與實施例9同樣地構建phs01_nq01_hrv3csite_des。(3)與實施例1同樣地製作重組杆狀病毒，進行融合蛋白質nq01-hrv3csite-des的表達、純化及檢測。結果示於圖11。【實施例11[融合蛋白質ded-hrv3csite-螢光素酶(構建體11；pi＝4.47)的表達及純化]】(1)phs01_ded載體的構建與實施例6同樣地構建phs01_ded。(2)phs01_ded_hrv3csite_螢光素酶的構建準備編碼螢光素酶的多核苷酸(seqidno：53)和對應於插入子部分的引物10f(seqidno：54)及10r(seqidno：55)，作為pcr酶使用kod-plus-(東洋紡公司)，用與實施例1相同的pcr條件擴增。將擴增的pcr產物用1.0％(w/v)瓊脂糖電泳進行電泳，將與插入子部分的長度一致的部分從凝膠切出，純化而調製插入子部分。將phs01_ded載體的smai位點用smai(寶生物公司)處理，使用in-fusionhd克隆試劑盒(clonetech公司)插入插入子部分。用構建的載體轉化stellar感受態細胞(clonetech公司)之後，播種到lba板上。於37℃下培養16hr，從此轉化體根據常規方法挑選氨苄西林抗性轉化體，進行質粒的純化。為了確認挑選的克隆的鹼基序列，使用測序確認用的引物1及2，用bigdyeterminatorv3.1(thermoscientific公司)進行pcr反應之後，用dna測序儀(thermoscientific公司)解析。將導入有插入子部分、此外的部分無變異的載體作為phs01_ded_hrv3csite_螢光素酶。(3)與實施例1同樣地製作重組杆狀病毒，進行融合蛋白質ded-hrv3csite-螢光素酶的表達、純化及檢測。結果示於圖12。【實施例12[融合蛋白質des-hrv3csite-螢光素酶(構建體12；pi＝4.75)的表達及純化]】除了代替phs01_ded載體而使用在實施例7中構建的phs01_des載體之外，與實施例11同樣地構建phs02_des_hrv3csite_螢光素酶。與實施例1同樣地，製作重組杆狀病毒，進行融合蛋白質des-hrv3csite-螢光素酶的表達、純化及檢測。結果示於圖13。【實施例13[融合蛋白質ded-hrv3c(構建體13；pi＝4.75)的表達及純化]】(1)pet17b_ded_hrv3c的構建準備編碼肽標籤ded的多核苷酸(seqidno：34)及編碼hrv3c的多核苷酸(seqidno：56)和對應於插入子部分的引物11f及11r(seqidno：57及58，ded)以及引物12f及12r(seqidno：59及60，hrv3c)，作為pcr酶使用kod-plus-(東洋紡公司)，用與實施例1相同的pcr條件擴增。將擴增的pcr產物用1.0％(w/v)瓊脂糖電泳進行電泳，將與插入子部分的長度一致的部分從凝膠切出，純化而調製插入子部分。將phs01載體(sysmex公司)的smai位點和nhei位點用smai(寶生物公司)和nhei(寶生物公司)處理，使用in-fusionhd克隆試劑盒(clonetech公司)插入2個插入子部分。構建的載體轉化stellar感受態細胞(clonetech公司)之後，播種到lba板上。於37℃下培養16hr，從此轉化體根據常規方法挑選氨苄西林抗性轉化體，進行質粒的純化。為了確認挑選的克隆的鹼基序列，使用測序確認用的引物1及2，用bigdyeterminatorv3.1(thermoscientific公司)進行pcr反應之後，用dna測序儀(thermoscientific公司)解析。將導入有插入子部分、此外的部分無變異的載體作為phs01_ded_hrv3c。接下來，調製pet17b用的插入子。將phs01_ded_hrv3c作為模板，準備引物13f(seqidno：61)及13r(seqidno：62)，作為pcr酶使用kod-plus-(東洋紡公司)，用與實施例1相同的pcr條件擴增。將擴增的pcr產物用1.0％(w/v)瓊脂糖電泳進行電泳，將與插入子部分的長度一致的部分從凝膠切出，純化而調製插入子部分。將pet17b載體(novagene公司)的ndei位點用ndei(寶生物公司)處理，使用in-fusionhd克隆試劑盒(clonetech公司)插入插入子部分。用構建的載體轉化stellar感受態細胞(clonetech公司)之後，播種到lba板上。於37℃下培養16hr，從此轉化體根據常規方法挑選氨苄西林抗性轉化體，進行質粒的純化。為了確認挑選的克隆的鹼基序列，使用測序確認用的引物14(seqidno：63)及15(seqidno：64)，用bigdyeterminatorv3.1(thermoscientific公司)進行pcr反應之後，用dna測序儀(thermoscientific公司)解析。將導入有插入子部分、此外的部分無變異的載體作為pet17b_ded_hrv3c。(2)ded-hrv3c的表達及純化使用pet17b_ded_hrv3c轉化大腸桿菌，將含氨苄西林的1.5l的lb培養基於37℃培養，在濁度od＝0.6附近冷卻到15℃後，添加iptg而誘導蛋白質的表達。16小時後，用離心(8,000g15分鐘)集菌，於-80℃下冷凍。向冷凍的大腸桿菌添加120ml緩衝液(20mmtris-hcl(ph8.0),150mmnacl,1片完全無edta(1tabletcompleteedtafree)(roche)，用超聲波破碎。破碎的對溶液進行離心(15,000g×30分鐘)後，將上清級分用0.8μm的濾劑過濾，回收濾液。使用將濾液加載到離子交換樹脂(hitrapqhp(1ml))，混合20mmtris-hcl(ph8.0,150mmnacl，緩衝液a)和20mmtris-hcl(ph8.0,1000mmnacl，緩衝液b)的溶液純化。各回收首先僅使緩衝液a(nacl濃度150mm)流過離子交換樹脂(el0)、用緩衝液a：緩衝液b的3:1混合溶液(nacl濃度363mm)溶出(el1)、用緩衝液a：緩衝液b的1:1混合溶液(nacl濃度575mm)溶出(el2)、用緩衝液a：緩衝液b的1:3混合溶液(nacl濃度788mm)溶出(el3)，最後僅用緩衝液b(nacl濃度1000mm)溶出(el4)的級分。(3)與實施例1同樣地檢測融合蛋白質。結果示於圖14。在圖14中，m是分子量標誌物、泳道1是勻漿物溶液、泳道2是離心後的上清級分、泳道3是離心後的沉澱級分、泳道4～泳道7是離子交換樹脂的通過級分1～4，泳道8是由緩衝液a(nacl濃度150mm)的溶出級分(el0)、泳道9是由緩衝液a：緩衝液b的3:1混合溶液(nacl濃度363mm)的溶出級分(el1)、泳道10是由緩衝液a：緩衝液b的1:1混合溶液(nacl濃度575mm)的溶出級分(el2)、泳道11是由緩衝液a：緩衝液b的1:3混合溶液(nacl濃度788mm)的溶液級分(el3)、泳道12是由緩衝液b(nacl濃度1000mm)的溶出級分(el4)的電泳結果。【比較例1[融合蛋白質de6-hrv3csite-nq01(pi＝6.4)的表達及純化]】對肽標籤de6融合於作為目標蛋白的nq01的n末端側，nq01和de6之間含hrv3csite的融合蛋白質進行表達及純化。除了代替編碼肽標籤de12的多核苷酸而使用編碼de6(eeeddd，seqidno：65)的多核苷酸(seqidno：66及67)調製插入子部分之外，與實施例1同樣地構建pm01_de6載體。再與實施例1同樣地構建pm01_de6_hrv3csite_nq01，製作重組杆狀病毒之後，進行融合蛋白質de6-hrv3csite-nq01的表達、純化及檢測。結果示於圖15。(對於實施例1～13及比較例1的結果)在比較例1(de6-hrv3csite-nq01、pi＝6.4)中，所有的級分中含融合蛋白質分離不充分。與此相比，在實施例1～13中均示良好的分離。特別是結合18個殘基以上的酸性胺基酸殘基的肽標籤的融合蛋白質保持於離子交換樹脂至500mm以上的高鹽濃度，與混雜蛋白質的分離變得更良好(實施例2～13)。另外，在3種目標蛋白質的任一種中均得到了良好的分離(實施例6～7、11～13)。另外，肽標籤，作為酸性胺基酸殘基，無論含天冬氨酸殘基及穀氨酸殘基兩方，還是僅含任一方均顯示同等良好的分離(實施例3、8)。肽標籤的結合位置無論是目標蛋白質的n末端側或c末端側的任一側，分離均良好(實施例6～7、9～10)。【實施例14[從融合蛋白質de12-hrv3csite-nq01分離目標蛋白質nq01及檢測]】使蛋白質分解酶ded-hrv3c反應於de12-hrv3csite-nq01而從de12-hrv3csite-nq01切斷de12。向在實施例1中回收的級分el2混合其10分之1容量的在實施例13中回收的級分el3，於4℃下靜置。16小時後，向此反應溶液添加20mmtris-hcl(ph8.0)而稀釋至nacl濃度約250mm，加載到用20mmtris-hcl(ph8.0),150mmnacl平衡化的離子交換樹脂(hitrapqhp(1ml))上。對於將通過級分回收(fr.1-6(nacl濃度約250mm))、最後僅用緩衝液b(nacl濃度1000mm)溶出(fr.7-10)的級分分別進行回收。sds-page使用5-20％梯度凝膠及電泳裝置(aproscience公司)實施。將回收的各級分與trissdsβ-me樣品處理液(cosmo-bio公司)以1:1容量混合，100℃下、處理3分鐘之後，將5μl加載到凝膠。作為分子量標誌物，將bluestar(日本genetics公司)加載到2.5μl凝膠。將加載樣品的凝膠以電壓400v電泳14分鐘之後，用gelcodebluestainreagent(thermofisherscientific公司)染色，使額外的染色脫色之後，使用geldocxr+系統(bio-rad公司)對圖像進行攝影。結果示於圖16。在圖16中，m是分子量標誌物、泳道1是el2(實施例1,8)或el3(實施例2～7、11～12)、泳道2是實施例13的el3、泳道3是實施例1～12的el2或el3和實施例13的el3的混合反應液、泳道4～泳道8是離子交換樹脂的通過級分1～5，泳道9～13是由緩衝液b的溶出級分1～5的電泳結果。各泳道的說明在圖17～25中通用。【實施例15】除了代替實施例1的el2而使用實施例2的el2之外，與實施例14同樣地檢測目標蛋白質nq01。結果示於圖17。【實施例16】除了代替實施例1的el2而使用實施例3的el3之外，與實施例14同樣地檢測目標蛋白質nq01。結果示於圖18。【實施例17】除了代替實施例1的el2而使用實施例4的el3之外，與實施例14同樣地檢測目標蛋白質nq01。結果示於圖19。【實施例18】除了代替實施例1的el2而使用實施例5的el3之外，與實施例14同樣地檢測目標蛋白質nq01。結果示於圖20。【實施例19】除了代替實施例1的el2而使用實施例6的el3之外，與實施例14同樣地檢測目標蛋白質nq01。結果示於圖21。【實施例20】除了代替實施例1的el2而使用實施例7的el3之外，與實施例14同樣地檢測目標蛋白質nq01。結果示於圖22。【實施例21】除了代替實施例1的el2而使用實施例8的el2之外，與實施例14同樣地檢測目標蛋白質nq01。結果示於圖23。【實施例22】除了代替實施例1的el2而使用實施例11的el3之外，與實施例14同樣地檢測目標蛋白質螢光素酶。結果示於圖24。【實施例23】除了代替實施例1的el2而使用實施例12的el3之外，與實施例14同樣地檢測目標蛋白質螢光素酶。結果示於圖25。(對於實施例14～23的結果)從實施例14～23的結果顯示，通過使蛋白質分解酶作用於融合蛋白質，可在陰離子樹脂的通過級分中取得目標蛋白質nq01或螢光素酶。【實施例24[緩衝液的ph對分離的影響的評價]】與實施例6同樣地，構建phs01_ded_hrv3csite_nq01。向蠶培養細胞(bmn細胞)導入phs01_ded_hrv3csite_nq01和杆狀病毒dna，進行病毒的同源重組。將此培養細胞培養6天，回收重組病毒後，向蠶的蛹接種用milliq水稀釋50倍的病毒溶液，溫育6天。回收蠶的蛹，每1隻加50ml的緩衝液(20mmpipes(ph6.1),150mmnacl,1片完全無edta(1tabletcompleteedtafree)(roche),phenyltiourea)而勻漿，其對溶液進行離心(8,000g、10分鐘)後，將上清級分用0.8μm的濾劑過濾，回收濾液。將濾液加載到離子交換樹脂(hitrapqhp(1ml))，使用混合20mmpipes(ph6.1,150mmnacl，緩衝液c)和20mmpipes(ph6.1,1000mmnacl，緩衝液d)的溶液純化。各回收首先僅使緩衝液c(nacl濃度150mm)流過離子交換樹脂(el0)，用緩衝液c：緩衝液d的混合比3：1(nacl濃度363mm)的溶液溶出(el1)、用緩衝液c：緩衝液d的混合比1:1(nacl濃度575mm)的溶液溶出(el2)、用緩衝液c：緩衝液d的混合比1:3(nacl濃度788mm)的溶液溶出(el3)，最後僅用緩衝液d(nacl濃度1000mm)溶出(el4)的級分。與實施例1同樣地檢測ded-hrv3csite-nq01。結果示於圖26。在圖26中，m是分子量標誌物、泳道1是勻漿物溶液、泳道2是離心後的上清級分、泳道3是離心後的沉澱級分、泳道4～泳道7是離子交換樹脂的通過級分1～4、泳道8是由緩衝液c(nacl濃度150mm)的溶出級分(el0)、泳道9是由緩衝液c：緩衝液d的3:1混合溶液(nacl濃度363mm)的溶出級分(el1)、泳道10是由緩衝液c：緩衝液d的1:1混合溶液(nacl濃度575mm)的溶出級分(el2)、泳道11是由緩衝液c：緩衝液d的1:3混合溶液(nacl濃度788mm)的溶液級分(el3)、泳道12是由緩衝液d(nacl濃度1000mm)的溶出級分(el4)的電泳結果。各泳道的說明在圖27～28中通用。【實施例25】與實施例7同樣地構建phs01_des_hrv3csite_nq01。再與實施例24同樣地將des-hrv3csite-nq01表達、純化及檢測。結果示於圖27。【實施例26】與實施例11同樣地構建phs01_ded_hrv3csite_螢光素酶。再與實施例24同樣地將ded-hrv3csite-螢光素酶表達、純化及檢測。結果示於圖28。【實施例27】與實施例7同樣地構建phs01_des_hrv3csite_nq01。使用phs01_des_hrv3csite_nq01轉化大腸桿菌，將含氨苄西林的1.5l的lb培養基於37℃培養，在濁度od＝0.6附近冷卻到15℃後，添加iptg而誘導蛋白質的表達。16小時後，用離心(8,000g15分鐘)集菌，於-80℃下冷凍。向冷凍的大腸桿菌添加120ml緩衝液(20mmpipes(ph6.1),150mmnacl,1片完全無edta(1tabletcompleteedtafree)(roche))，用超聲波破碎。破碎的對溶液進行離心(15,000g×30分鐘)後，將上清級分用0.8μm的濾劑過濾，回收濾液。將濾液加載到離子交換樹脂(hitrapqhp(1ml))，使用混合20mmpipes(ph6.1,150mmnacl，緩衝液c)和20mmpipes(ph6.1,1000mmnacl，緩衝液d)的溶液純化。各回收首先僅使緩衝液c(nacl濃度150mm)流過離子交換樹脂(el0)、用緩衝液c：緩衝液d的3:1混合溶液(nacl濃度363mm)溶出(el1)、用緩衝液c：緩衝液d的1:1混合溶液(nacl濃度575mm)溶出(el2)、用緩衝液c：緩衝液d的1:3混合溶液(nacl濃度788mm)溶出(el3)，最後僅用緩衝液d(nacl濃度1000mm)溶出(el4)的級分。與實施例1同樣地檢測ded-hrv3csite-nq01。結果示於圖29。在圖29中，m是分子量標誌物、泳道1是勻漿物溶液、泳道2是離心後的上清級分、泳道3是離心後的沉澱級分、泳道4～泳道7是離子交換樹脂的通過級分1～4，泳道8是由緩衝液c(nacl濃度150mm)的溶出級分(el0)、泳道9是由緩衝液c：緩衝液d的3:1混合溶液(nacl濃度363mm)的溶出級分(el1)、泳道10是由緩衝液c：緩衝液d的1:1混合溶液(nacl濃度575mm)的溶出級分(el2)、泳道11是由緩衝液c：緩衝液d的1:3混合溶液(nacl濃度788mm)的溶液級分(el3)、泳道12是由緩衝液d(nacl濃度1000mm，el4)的溶出級分的電泳結果。【實施例28】向實施例24的el3混合10分之1容量的實施例27的el3，於4℃下靜置。16小時後，向反應溶液添加20mmpipes(ph6.1)而稀釋至nacl濃度約250mm，加載到用20mmpipes(ph6.1,150mmnacl)平衡化的離子交換樹脂(hitrapqhp(1ml))上。對於將通過級分回收(fr.1-6(nacl濃度約250mm))、最後僅用緩衝液d(nacl濃度1000mm)溶出(fr.7-10)的級分分別進行回收。與實施例1同樣地檢測目標蛋白質eq01。結果示於圖30。在圖30中，m是分子量標誌物、泳道1是實施例24的el3、泳道2是實施例27的el3、泳道3是實施例24的el3和實施例27的el3混合反應液、泳道4～泳道8是離子交換樹脂的通過級分1～5，泳道9～13是由緩衝液d的溶出級分1～5的電泳結果。(對於實施例24～28的結果)從實施例24～28的結果顯示，在融合蛋白質的表達－純化及目標蛋白質的純化中，即使使緩衝液的ph變低，也得到了良好的分離。【符號的說明】10：離子交換樹脂20：融合蛋白質20a：目標蛋白質20b：肽標籤20c：蛋白質分解酶的切斷位點21：混雜蛋白質22：融合肽標籤的蛋白質分解酶22a：蛋白質分解酶22b：肽標籤序列表sysmexcorporation目標蛋白質的純化方法15-065cn67patentinversion3.5112prt人工序列de121glugluglugluglugluaspaspaspaspaspasp1510218prt人工序列de182gluglugluglugluglugluglugluaspaspaspaspaspaspasp151015aspasp324prt人工序列de243glugluglugluglugluglugluglugluglugluaspaspaspasp151015aspaspaspaspaspaspaspasp20430prt人工序列de304gluglugluglugluglugluglugluglugluglugluglugluasp151015aspaspaspaspaspaspaspaspaspaspaspaspaspasp202530536prt人工序列de365gluglugluglugluglugluglugluglugluglugluglugluglu151015glugluaspaspaspaspaspaspaspaspaspaspaspaspaspasp202530aspaspaspasp35688prt人工序列ded6asnvalgluglylysthrglyasnalathraspglugluglugluglu151015gluglugluglugluglugluaspaspaspaspaspaspaspaspasp202530aspaspaspgluaspserglyalagluileglnaspaspaspgluglu354045glypheaspaspglugluglupheaspaspaspaspaspaspgluhis505560aspaspaspaspleugluasnglugluasngluleuglugluleuglu65707580gluargvalglualaarglyslys85744prt人工序列des7aspleuserasnvalgluglylysthrglyasnalathraspgluglu151015glugluglugluglugluglugluglugluaspaspaspaspaspasp202530aspaspaspaspaspaspgluaspserglyalaglu3540824prt人工序列eo248gluglugluglugluglugluglugluglugluglugluglugluglu151015gluglugluglugluglugluglu209274prt人工序列nq019metvalglyargargalaleuilevalleualahissergluargthr151015serpheasntyralametlysglualaalaalaalaalaleulyslys202530lysglytrpgluvalvalgluseraspleutyralametasnpheasn354045proileileserarglysaspilethrglylysleulysaspproala505560asnpheglntyrproalagluservalleualatyrlysgluglyhis65707580leuserproaspilevalalagluglnlyslysleuglualaalaasp859095leuvalilepheglnpheproleuglntrppheglyvalproalaile100105110leulysglytrpphegluargvalpheileglygluphealatyrthr115120125tyralaalamettyrasplysglypropheargserlyslysalaval130135140leuserilethrthrglyglyserglysermettyrserleuglngly145150155160ilehisglyaspmetasnvalileleutrpproileglnserglyile165170175leuhisphecysglypheglnvalleugluproglnleuthrtyrser180185190ileglyhisthrproalaaspalaargileglnileleugluglytrp195200205lyslysargleugluasniletrpaspgluthrproleutyrpheala210215220proserserleupheaspleuasnpheglnalaglypheleumetlys225230235240lysgluvalglnaspgluglulysasnlyslyspheglyleuserval245250255glyhishisleuglylysserileprothraspasnglnilelysala260265270arglys10546prt人工序列螢光素酶10gluaspalalysasnilelyslysglyproalaprophetyrproleu151015gluaspglythralaglygluglnleuhislysalametlysargtyr202530alaleuvalproglythrilealaphethraspalahisilegluval354045asnilethrtyralaglutyrpheglumetservalargleualaglu505560alametlysargtyrglyleuasnthrasnhisargilevalvalcys65707580sergluasnserleuglnphephemetprovalleuglyalaleuphe859095ileglyvalalavalalaproalaasnaspiletyrasngluargglu100105110leuleuasnsermetasnileserglnprothrvalvalphevalser115120125lyslysglyleuglnlysileleuasnvalglnlyslysleuproile130135140ileglnlysileileilemetaspserlysthrasptyrglnglyphe145150155160glnsermettyrthrphevalthrserhisleuproproglypheasn165170175glutyraspphevalprogluserpheaspargasplysthrileala180185190leuilemetasnserserglyserthrglyleuprolysglyvalala195200205leuprohisargthralacysvalargpheserhisalaargasppro210215220ilepheglyasnglnileileproaspthralaileleuservalval225230235240prophehishisglypheglymetphethrthrleuglytyrleuile245250255cysglypheargvalvalleumettyrargphegluglugluleuphe260265270leuargserleuglnasptyrlysileglnseralaleuleuvalpro275280285thrleupheserphephealalysserthrleuileasplystyrasp290295300leuserasnleuhisgluilealaserglyglyalaproleuserlys305310315320gluvalglyglualavalalalysargphehisleuproglyilearg325330335glnglytyrglyleuthrgluthrthrseralaileleuilethrpro340345350gluglyaspasplysproglyalavalglylysvalvalprophephe355360365glualalysvalvalaspleuaspthrglylysthrleuglyvalasn370375380glnargglygluleucysvalargglyprometilemetserglytyr385390395400valasnasnproglualathrasnalaleuileasplysaspglytrp405410415leuhisserglyaspilealatyrtrpaspgluaspgluhisphephe420425430ilevalaspargleulysserleuilelystyrlysglytyrglnval435440445alaproalagluleugluserileleuleuglnhisproasnilephe450455460aspalaglyvalalaglyleuproaspaspaspalaglygluleupro465470475480alaalavalvalvalleugluhisglylysthrmetthrglulysglu485490495ilevalasptyrvalalaserglnvalthrthralalyslysleuarg500505510glyglyvalvalphevalaspgluvalprolysglyleuthrglylys515520525leuaspalaarglysilearggluileleuilelysalalyslysgly530535540glylys54511202prt人工序列hrv3c11aspleuvalproargglyserproglupheproglyargleugluarg151015prohisargaspglyproasnthrgluphealaleuserleuleuarg202530lysasnilemetthrilethrthrserlysglygluphethrglyleu354045glyilehisaspargvalcysvalileprothrhisalaglnprogly505560aspaspvalleuvalasnglyglnlysileargvallysasplystyr65707580lysleuvalaspprogluasnileasnleugluleuthrvalleuthr859095leuaspargasnglulyspheargaspileargglypheileserglu100105110aspleugluglyvalaspalathrleuvalvalhisserasnasnphe115120125thrasnthrileleugluvalg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