竹葉菜組織培養的方法
2023-05-28 19:22:26 1
專利名稱：竹葉菜組織培養的方法
技術領域：
本發明涉及一種野生竹葉菜的組織培養方法，屬於生物技術領域，具體地說是屬於植物組織培養範疇。
背景技術：
植物體要繁衍後代，在適合的條件下延續生長，自然方法多用種子(包括果實)，孢子等方式，要傳播又借各種媒體，常見的傳播媒體有；流水、鳥、風、動物等，還有部份植物利用地下各種形態的莖完成自身繁衍。
科學技術不斷發展，由於人們在生活上的需要，科學研究的深入，植物體的繁殖方式、方法多種多樣。充分利用植物的種子，植物的果實、營養器官、繁殖孢子。組織培養技術產生後，開擴人們繁殖體的思路。用芽、葉、根、花粉、花葯等都已繁殖成植株。
竹葉菜為百合科鹿藥屬(Maianthemum)可食種的別名，該屬為多年生草本，根狀莖短或伸長，直立或匐匍。莖單生，直立，基部有膜質鞘(鱗葉)；葉互生，2-4枚或多數，長圓形或橢圓形，具柄或無柄。總狀花序或圓錐花序頂生；花小，兩性或單性，如為單性則雌雄異株；花被片6，4，離生或作不同程度的合生，有的合生成高腳碟狀；雄蕊6，4，花絲常不同程度地貼生於花被片上，分離部份長或極短；花葯球形或橢圓形，基著，內向縱裂；子房3室或2室，每室有胚珠1-3顆，著生於中軸胎座上；花柱長或短，柱頭3-2淺裂或深裂。漿果近球形，具1至數顆種子。
竹葉菜營養豐富，新鮮竹葉菜含有90.0％的水分，4.1％的蛋白質，以及人體必須的17種胺基酸，且富含人體不能合成的賴氨酸等，其碳水化合物和脂肪含量較低，是理想的減肥保健食品。
竹葉菜是稀有的野生資源，又可做蔬菜食用，又可做藥用。營養成份極其豐富，蛋白質含量高於其它蔬菜72％左右，礦物元素Fe的含量為其它蔬菜的200多倍。胺基酸和維生素C的含量也很豐富，但碳水化合物含量很低，是當今最理想的保健食品。
經研究發現竹葉菜含有豐富的核苷類成份，其中核甘和脫氧核甘具有抗腫瘤，抗病毒等作用，另一種腺嘌吟核甘是治療室上性心動過速的新藥，能在1秒鐘內使心跳恢復正常，並抑制血小板凝集防止血栓形成。
竹葉菜是高寒山區居民的一大宗蔬菜，僅靠野生資源無法滿足蔬菜市場的需求，更無法為醫藥業等相關行業所利用。同時，長期以來人們盲目的採集竹葉菜，也造成某些鹿藥屬種面臨滅絕。
野生竹葉菜植株是靠自身根莖上產生不定芽，在適合的環境條件下生長繁衍，而根莖的生長又限制在特殊的環境條件下，而且還要有較長的休眠期。一般在採集地上莖以後，很難有不定芽再萌發生長成另一地上莖，繼續維持地下莖的生長。所以在被採摘地上莖以後，若本株根莖再不能萌發新的芽即會自行枯竭，長期被採摘以後此類物種逐漸被滅絕。
就目前而言，竹葉菜主要採自野外，尚未栽培成功，因此野生竹葉菜的開發和利用，必須在保護自然資源的前提下進行。
發明內容
本發明克服了竹葉菜現今無人工繁育的方法，提供了一種快速、可行、成本低、成活率高的人工繁育的方法。
本發明的技術方案，其步驟為1、竹葉菜組培材料選擇無病蟲害、生長健壯的外植體休眠芽，並帶有部份根莖。
2、外植體滅菌處理首先採用常規法，用洗衣粉溶液洗淨，再用70％酒精浸泡30-60s，再用0.2％升汞浸泡16-20min，然後用無菌水衝洗5-6次，在無菌的條件下切下莖、芽等外植體接種。
3、愈傷組織及芽的誘導切取的外植體接種在誘導培養基上，培養基選用的MS培養基，補充IBA1.5-3mg/L，PH值為6-7，3周後芽開始萌動，8-10周後芽即長成一個新梢，3-5芽叢生。控制溫度20-26℃，光照2000-4000Lux。
4、增殖培養將叢生芽在無菌操作的條件下轉入繼代增殖培養。增殖培養基採用MS培養基，補充6BA 1-2.5mg/L，NAA1-1.5mg/L，PH值為6-7，控制溫度20-26℃、光照2000-4000Lux。
5、生根培養在無菌操作的條件下，將叢生芽從增殖培養基上轉接到生根培養基上。生根培養基採用MS培養基，補充NAA 0.6-1.2mg/L，6BA0.2-1.5mg/L，IAA0.3-0.8mg/L，PH值為6-7，溫度25℃；光照2000-4000Lux，培養二周即生根。
本發明的有益效果是利用組培技術快速繁殖竹葉菜，人們再不受自然條件限制，能在任何地區，利用保護設施，大量栽培竹葉菜。既保護自然資源，維持自然生態平衡，又為人類所利用，為此進行該項目的研究。第一，用組培的方式繁殖竹葉菜，是當前人工繁殖竹葉菜的唯一方法。大量繁殖以後再進行人工栽培，可避免人為亂採野生資源而帶來該種滅絕的後果。第二，擴大了種植地區，生長在海撥3300M以上的竹葉菜，移栽在低海撥地區栽培尚未成功。採用組培繁殖以後，該竹葉菜可以在海撥800-3500米地區種植。第三，縮短了竹葉菜生長的時間，野生竹葉菜可食部份每株繁殖生長的時間約為365天，而本發明(實用新型)所需要的時間約為100天，比野生竹葉菜繁殖生長縮短了265天。第四，按每株增殖率計算，組培苗增殖比野生增殖提高三倍以上。
第五，利用組培苗可進行集約化栽培，不但可以節約大量的物力、財力，還能充分有效的開發利用竹葉菜野生資源。
具體實施例方式
實例一取生長健壯、無病蟲害竹葉菜的休眠芽，並帶有部份根莖，先用清水洗淨再用洗衣粉洗，洗後用自來水衝洗15min，在無菌的條件下切取休眠芽，用70％的酒精浸泡35s，再用0.2％升汞浸泡16min，浸泡後隨即用無菌水衝洗5次，然後接種到備好的培養基上，進行誘導芽。
芽的誘導培養基為MS培養基，配製方法採用常規配製法，瓊脂用優質瓊脂。MS培養基中補充6BA0.5mg/l，PH值為6，溫度20℃，光照2000lux。21天後芽開始萌動，56天長成新梢，叢生芽3個。在無菌的條件下切取芽轉接到增殖培養基上進行增殖培養。
增殖培養基為MS培養基，其中補充6BA1mg/l，NAA1mg/l，配製採用常規配製法，優質瓊脂適量，PH值6，溫度20℃，光照2000lux，約6周後芽開始分化，分化芽2個。7周後在無菌的條件下接種到生根培養基上。
生根培養基為MS培養基，其中補充6BA0.1mg/l，NAA0.6mg/l，IAA0.3mg/l，PH值為6，溫度25℃，光照2000lux。21天後開始生根，速度較快。生根後30天揭開瓶蓋，2天後取出瓶苗開始過渡栽培。
從瓶中取出幼苗浸泡在0.5％kMnO4溶液中20s，取出後栽到高溫滅菌的珍珠巖中10天成活以後，再栽到配製營養土袋中，營養土的配製，沙壤土與珍珠巖的比例為4∶1。3天後正常生長成活率87％左右。
實例二選用生長健壯、無病蟲害的竹葉菜休眠芽，並帶有部份根莖，先用清水洗淨再用洗衣粉洗，洗後用自來水衝洗20min，在無菌的條件下切取休眠芽，用70％酒精浸泡65s，用0.2％升汞浸泡20min，再用無菌水衝洗6次，然後接種到備好的培養基上進行誘導芽。
芽的誘導培養基為MS培養基，配製方法採用常規配製法。選用優質瓊脂，MS培養基中補充6BA3mg/l，PH值為7，溫度26℃，光照4000lux。25天後芽開始萌動，70天後長成新梢，叢生芽有5個。在無菌的條件下切取芽轉接到增殖培養基上進行增殖培養。
增殖培養基為MS培養基，其中補充6BA2.5mg/l，NAA1.5mg/l，配製採用常規配製法，優質瓊脂適量，PH值為7，溫度26℃，光照4000lux，約6周後芽開始分化，分化芽有3個，7周以後在無菌的條件下接種到生根培養基上。
生根培養基為MS培養基，其中補充6BA1.5mg/l，NAA1.2mg/l，IAA1.0mg/l，PH值為7，溫度25℃，光照4000lux，30天開始生根，生根40天後揭開瓶蓋，2天後取出瓶苗開始過渡栽培。
從瓶中取出幼苗浸泡在0.5％kMnO4溶液中20s，取出後栽到高溫滅菌的珍珠巖中11天，成活以後，再栽到配製的營養土袋中，培養土的配製，沙壤土與珍珠巖的比例為4∶1。4天後正常生長成活率97％左右。
實例三選用生長健壯、無病蟲害的竹葉菜的休眠芽，帶有部份地下根莖，先用清水洗淨再用洗衣粉洗，洗後用自來水衝洗16min，在無菌的條件下切取休眠芽，用70％的酒精浸泡40s，用0.2％升汞浸泡17min，再用無菌水衝洗6次，隨後接種到備好的培養基上進行誘導芽。
芽的誘導培養基為MS培養基，其中補充6BA1.5mg/l，選用優質瓊脂，配製方法採用常規配製法。PH值為6.5，溫度22℃，光照3000lux。22天以後芽開始萌動，60天後長成新梢，叢生芽有4個。在無菌的條件下切取芽轉接到增殖培養基上進行增殖培養。
增殖培養基為MS培養基，其中補充6BA1.5mg/l，NAA1.2mg/l，選用優質瓊脂，採用常規方法配製。PH值為6.5，溫度24℃，光照3000lux，約6周後芽開始分化，分化芽有2個。7周以後在無菌的條件下接種到生根培養基上。
生根培養基為MS培養基，其中補充6BA0.5mg/l，NAA0.7mg/l，IAA0.4mg/l，PH值為6.3，溫度25℃，光照3000lux。25天後開始生根，根系較多，植株較壯，生根後32天揭開瓶蓋，2天後取出瓶苗開始過渡栽培。
從瓶中取出幼苗浸泡在0.5％kMnO4溶液中20s，取出後栽到高溫滅菌的珍貴巖中12天成活以後，再栽到配製的營養土袋中，營養土的配製，沙壤土與珍珠巖的比例為4∶1。5天後正常生長成活率95％左右。
實例四選用生長健壯、無病蟲害的竹葉菜的休眠芽，先用清水洗淨再用洗衣粉洗，洗後用自來水衝洗17min，在無菌的條件下切取休眠芽，用70％的酒精浸泡45s，用0.2％升汞浸泡18min，再用無菌水衝洗6次，隨後接種到備好的培養基上進行誘導芽。
芽的誘導培養基為MS培養基，其中補充6BA2mg/l，選用優質瓊脂，配製方法採用常規配製法。PH值為6.7，溫度22℃，光照3500lux。23天以後芽開始萌動，64天後長成新梢，叢生芽有4個。在無菌的條件下切取芽轉接到增殖培養基上進行增殖培養。
增殖培養基為MS培養基，其中補充6BA1.7mg/l，NAA1.3mg/l，選用優質瓊脂，採用常規方法配製。PH值為6.7，溫度24℃，光照3500lux，約6周後芽開始分化，分化芽有2個。7周以後在無菌的條件下接種到生根培養基上。
生根培養基為MS培養基，其中補充6BA0.8mg/l，NAA0.8mg/l+IAA0.5mg/l，PH值為6.5，溫度25℃，光照3500lux。23天後開始生根，根系較多，植株較壯，生根後33天揭開瓶蓋，2天後取出瓶苗開始過渡栽培。
從瓶中取出幼苗浸泡在0.5％kMnO4溶液中20s，取出後栽到高溫滅菌的珍貴巖中12天成活以後，再栽到配製的營養土袋中，營養土的配製，沙壤土與珍珠巖的比例為4∶1。5天後正常生長成活率94％。
實例五選用生長健壯、無病蟲害的竹葉菜休眠芽，並帶有部份根莖，先用清水洗淨再用洗衣粉洗，洗後用自來水衝洗18min，在無菌的條件下切取休眠芽，用70％酒精浸泡60s，用0.2％升汞浸泡19min，再用無菌水衝洗6次，然後接種到備好的培養基上進行誘導芽。
芽的誘導培養基為MS培養基，配製方法採用常規配製法。選用優質瓊脂，MS培養基中補充6BA2.8mg/l，PH值為6.9，溫度25℃，光照2500lux。24天後芽開始萌動，68天後長成新梢，叢生芽有3個。在無菌的條件下切取芽轉接到增殖培養基上進行增殖培養。
增殖培養基為MS培養基，其中補充6BA2.3mg/l，NAA1.4mg/l，配製採用常規配製法，優質瓊脂適量，PH值為6.9，溫度25℃，光照2500lux，約6周後芽開始分化，分化芽有2個，7周以後在無菌的條件下接種到生根培養基上。
生根培養基為MS培養基，其中補充6BA1.3mg/l，NAA1.1mg/l，IAA0.8mg/l，PH值為6.2，溫度25℃，光照2800lux，24天開始生根，生根36天後揭開瓶蓋，2天後取出瓶苗開始過渡栽培。
從瓶中取出幼苗浸泡在0.5％kMnO4溶液中20s，取出後栽到高溫滅菌的珍珠巖中15天，成活以後，再栽到配製的營養土袋中，培養土的配製，沙壤土與珍珠巖的比例為4∶1。5天後正常生長成活率93％左右。
權利要求
1.一種竹葉菜組織培養的方法，其步驟為(1)竹葉菜組培材料的選擇選擇無病蟲害、生長健壯的外植體休眠芽，並帶部份根莖；(2)外植體滅菌處理首先採用常規法，用洗衣粉溶液洗淨，再用70％酒精浸泡35-65s，再用0.2％升汞浸泡16-20min，然後用無菌水衝洗5-6次，在無菌的條件下切下莖、芽等外植體接種；(3)愈傷組織及芽的誘導切取的外植體接種在誘導培養基上，培養基選用的MS培養基，補充6BA0.5-3mg/L，PH值為6-7，3周後芽開始萌動，8-10周後芽即長成一個新梢，3-5芽叢生；控制溫度20-26℃，光照2000-4000Lux；(4)增殖培養將叢生芽在無菌操作的條件下轉入繼代增殖培養，增殖培養基採用MS培養基，補充6BA 1-2.5mg/L、NAA1-1.5mg/L，PH值為6-7，控制溫度20-26℃、光照2000-4000Lux；(5)生根培養在無菌操作的條件下，將叢生芽從增殖培養基上轉接到生根培養基上，生根培養基採用MS培養基，補充NAA 0.6-1.2mg/L，6BA0.1-1.5mg/L，IAA0.3-1.0mg/L，PH值為6-7，溫度25℃，光照2000-4000Lux，培養二周即生根。
全文摘要
本發明是一種野生竹葉菜的組織培養方法，屬於植物組織培養領域。本發明的技術方案，其步驟為(1)選擇適合的外植體；(2)外植體的消毒處理；(3)愈傷組織及芽的誘導；(4)增殖培養；(5)生根培養；(6)瓶苗過渡。本發明用組織培養的方式繁殖竹葉菜，是當今人工繁殖竹葉菜的唯一途徑；其擴大了種植地區，從原海撥3300米的生長區域擴大到海撥800－3500米地區的種植；比野生竹葉菜生長發育(從休眠到形成商品菜)時間縮短了265天；比野生竹葉菜每株的繁殖率提高三倍以上；可發展集約化栽培，避免人為亂採野生資源而帶來該種滅絕的後果；充分有效的開發利用竹葉菜野生資源，保護自然資源，維持自然生態平衡。
文檔編號C12N5/04GK1973618SQ20061016382
公開日2007年6月6日 申請日期2006年12月21日 優先權日2006年12月21日
發明者桂明英, 郭永紅, 朱萍 申請人:中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所