一種復配多糖及其製備方法、應用與流程
2023-05-29 04:26:46 2
本發明涉及醫藥、保健
技術領域：
，具體而言，涉及一種復配多糖及其製備方法、應用。
背景技術：
：脾虛洩瀉相當於現代醫學的慢性腹瀉的範疇，小腸吸收不良症候群、慢性非特異性潰瘍性結腸炎、腸易激症候群等，如果出現洩瀉的症狀同時，並有脾虛的症狀，都可以按照中醫脾虛洩瀉來辨證論治。根據中醫學有關脾胃生理及病理的論述，提示了脾胃與免疫相關，「脾」的防衛功能與現代醫學免疫功能有許多相似之處，脾與免疫功能之間的關係非常密切。「脾為之衛」有兩重含義：一是指全身免疫狀態；另一指胃腸的屏障功能。在近代的研究中，通過臨床和動物實驗研究發現，脾虛證患者和脾虛證模型動物均可以見到納呆，消瘦，體重減輕，倦怠乏力，貧血，便溏或便結等症狀，同時還同樣存在不同程度的非特異性免疫能力下降，紅細胞免疫功能低下，體液免疫功能紊亂，消化道局部免疫功能下降等異常。對脾虛證病人和動物實驗研究表明，脾虛證是以消化吸收功能低下為主的多器官和多系統功能減弱的綜合病理變化。綜上，脾胃能夠影響人體免疫力，通過調理脾胃，就能夠促進人體免疫力的增強。現有技術中也有很多藥物可以用於調理人體脾胃，可是效果卻較差。技術實現要素：本發明的目的在於提供一種復配多糖的製備方法，此製備方法操作簡單，製備方便，能夠製得調理效果較好的復配多糖。本發明的另一目的在於提供一種復配多糖，是一種新的多糖，用於調理人體脾胃，效果較好。本發明的另一目的在於提供復配多糖的應用。本發明解決其技術問題是採用以下技術方案來實現的：一種復配多糖的製備方法，包括以下步驟：將白朮、茯苓用水煎煮2～3次，每次1～2h，然後把得到的所有煎煮液混合，得到浸提液；其中，白朮和茯苓的質量比為0.8～1.2:0.8～1.2，每次煎煮所用的水的質量為白朮、茯苓的總質量的8～11倍；濃縮浸提液，然後對浸提液進行分離，得到沉澱，再將沉澱進行乾燥。優選地，在本發明較佳實施例中，上述濃縮浸提液是將浸提液的質量濃縮至白朮、茯苓的總質量的0.8～1.2倍。優選地，在本發明較佳實施例中，上述分離浸提液包括：將體積濃度為92～98％的乙醇與浸提液混合，使浸提液中乙醇的體積濃度為65～75％，然後靜置，直至浸提液中不再析出沉澱。優選地，在本發明較佳實施例中，在得到沉澱之後，還包括：將沉澱置於3800～4200r/min的轉速下，離心處理8～12min。優選地，在本發明較佳實施例中，在乾燥沉澱之後，還包括純化步驟：將乾燥後的粗品溶於溶解水中，然後加入Sevage溶液，超聲震蕩8～12min，再進行二次分離乾燥；乾燥後的粗品、溶解水、Sevage溶液的用量比為1g：8～12ml：2～3ml，Sevage溶液為氯仿和正丁醇的混合液，氯仿與正丁醇的體積比為3.5～4.5:1。優選地，在本發明較佳實施例中，上述溶解水為45～55℃的熱水。優選地，在本發明較佳實施例中，上述二次分離乾燥包括：將超聲震蕩後的物質進行分液，得到液體，然後將體積濃度為92～98％的乙醇與液體混合，使液體中乙醇的體積濃度為75～85％，靜置22～26h，對得到的沉澱進行離心、乾燥。另外，一種復配多糖，通過上述復配多糖的製備方法製得。另外，上述復配多糖在藥物中的應用。另外，上述復配多糖在保健食物中的應用。相對於現有技術，本發明包括以下有益效果：本發明利用白朮、茯苓作為原料，來製備多糖。脾主運化，其性喜燥惡溼，脾失健運與水溼停滯是脾胃氣虛證的主要病理改變。白朮、茯苓均能益氣健脾，白朮味甘而補中益氣，苦而燥溼健脾，溼則暢達中氣，暖胃醒脾；茯苓淡而能滲溼利水，甘而能健脾益氣。二者按照特定的比例，配伍應用，在一定的條件下混合提取，製得的多糖實際上是白朮、茯苓的多糖復配物，也就是復配多糖，其具有益氣健脾、燥溼滲溼的功效，能夠針對脾的病理特點，來治療脾虛洩瀉，從而增強人體免疫力。本發明提供的製備方法操作簡單，製備方便，成本低，而且製得的復配多糖調理效果好。附圖說明為了更清楚的說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單的介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發明的一些實施例，對於本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其它的附圖。圖1是本發明實施例三提供的葡萄糖標準曲線。具體實施方式為使本發明實施例的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述。實施例中未註明具體條件者，按照常規條件或製造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未註明生產廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規產品。下面對本發明實施例的復配多糖及其製備方法、應用進行具體說明。復配多糖的製備方法包括步驟A：將白朮、茯苓用水煎煮2～3次，每次1～2h，然後把得到的所有煎煮液混合，得到浸提液；其中，白朮和茯苓的質量比為0.8～1.2:0.8～1.2，每次煎煮所用的水的質量為白朮、茯苓的總質量的8～11倍。其中，白朮優選菊科植物白朮(Atractylodesmacrocephalakoedz.)的乾燥根莖。茯苓優選為多孔菌科真菌茯苓PoriaCocos(Schw.)Wolf的乾燥菌核。煎煮的溫度以80～100℃為宜，是在標準大氣壓的條件下，當然，根據地區不同，煎煮溫度也會有所差異。每次煎煮所用的水的用量都是以白朮、茯苓的總質量來計算，也就是說，白朮用量、茯苓用量的加和為總質量，而每一次加水，水的用量都是總質量的8～11倍。而在煎煮之前，還可以利用用於第一次煎煮的水先將白朮、茯苓浸泡25～35min，也就是說，先用8～11倍量(相對於白朮、茯苓的總質量而言)的水浸泡白朮、茯苓，然後利用該浸泡水進行煎煮。第一次煎煮後，還可以利用200～300目的濾布過濾，得到藥渣和第一次的煎煮液，留用第一次的煎煮液，然後往藥渣中再次加入8～11倍量(相對於白朮、茯苓的總質量而言)的水，再次煎煮，過濾，如此反覆2～3次，以使白朮、茯苓完成2～3次煎煮，再把所有的煎煮液混合，得到浸提液，將浸提液靜置20～28h，過濾，濾除浸提液中的雜質。利用用於第一次煎煮的水浸泡白朮、茯苓，有助於藥材中的水溶性有效成分浸提出。復配多糖的製備方法還包括步驟B：濃縮浸提液。濃縮具體為：濃縮至浸提液的質量為白朮、茯苓的總質量的0.8～1.2倍。濃縮後可以靜置浸提液，使其冷卻。復配多糖的製備方法還包括步驟C：對浸提液進行分離，得到沉澱，再將沉澱進行乾燥。分離包括：將體積濃度為92～98％的乙醇與浸提液混合，使浸提液中乙醇的體積濃度為65～75％，然後靜置，直至浸提液中不再析出沉澱。乙醇的加入，能夠使浸提液中析出沉澱，而多糖就存在於這沉澱之中。靜置時間優選為22～26h。在得到沉澱之後，還包括：將沉澱置於3800～4200r/min的轉速下，離心處理8～12min。離心處理能夠實現固液分離，使沉澱與液體分開，以便得到沉澱。但若為了簡化操作，不將沉澱進行離心處理，而將靜置後的固液混合物進行離心處理也是可以的。在離心處理之後，還可以進行減壓過濾，進一步進行固液分離，然後依次利用體積濃度為92～97％的乙醇和丙酮衝洗得到的沉澱，去除雜質，再將沉澱進行乾燥。乾燥時，可以在真空環境的乾燥箱中，減壓乾燥22～24h，直至乾燥的沉澱達恆重，得到粗品。當然，乾燥方式並不作為限制，也可以選用其它的乾燥方法，如常壓乾燥、噴霧乾燥等。為了得到品質更好的復配多糖，在乾燥之後，還包括純化，純化的方法可以為Sevage法(沙維積法)、三氟三氯乙烷法、三氯醋酸法等，優選Sevage法。具體操作為：將乾燥後的粗品溶於溶解水中，然後加入Sevage溶液(沙維積溶液)，超聲震蕩8～12min，再進行二次分離乾燥；粗品、溶解水、Sevage溶液的用量比為1g：8～12ml：2～3ml，Sevage溶液為氯仿和正丁醇的混合液，氯仿與正丁醇的體積比為3.5～4.5:1。粗品中的蛋白質在氯仿中變性而不溶於水，蛋白質與氯仿-正丁醇生成凝膠物而被分離，利用該方法進行純化，純化度高。其中，溶解水為45～55℃的熱水。粗品在熱水中的溶解度高，有利於後續純化操作。超聲震蕩的頻率以35～45KHz為佳。二次分離乾燥包括：將超聲震蕩後的物質進行分液，得到液體，然後將體積濃度為92～98％的乙醇與液體混合，使液體中乙醇的體積濃度為75～85％，靜置22～26h，對得到的沉澱進行離心、乾燥。此處離心也是優選將得到的沉澱置於3800～4200r/min下離心8～12min。另外，純化的操作重複2～3次為佳。在分液之後，可以利用玻沙漏鬥進行減壓過濾，然後再將得到的液體與乙醇混合。而因為多糖易溶於水，利用乙醇再與液體混合，能夠使得前面步驟中溶於水的多糖從液體中析出。而此時，其會存在於析出的沉澱中。再將沉澱減壓過濾，然後乾燥，即得到多糖成品。本發明還提供了通過上述復配多糖的製備方法製得的復配多糖。本發明還提供了復配多糖在藥物中的應用，也提供了復配多糖在保健食物中的應用。當復配多糖應用於藥物中時，其可以製成顆粒劑型、片劑、膠囊等各種劑型，也可以作為中間藥物進行應用。而食物包括了固態或液態的可食用物質，所以復配多糖在保健食物中的應用是包括了其在保健食品、保健飲品中的應用。以下結合實施例對本發明的特徵和性能作進一步的詳細描述：實施例一本實施例提供的復配多糖的製備方法，包括以下步驟：a.按照0.8:1.2的質量比取用白朮和茯苓，得到藥材總質量，然後將白朮和茯苓放入鍋中，加入藥材總質量的8倍的水，煎煮1h，然後濾出煎煮液，將過濾的藥渣保留在鍋中，再次加藥材總質量的8倍的水，煎煮1h，再次濾出煎煮液，將兩次得到的煎煮液混合，得到浸提液；b.對浸提液進行濃縮，直至浸提液的質量為藥材總質量的0.8倍；c.往步驟b得到的浸提液中加入體積濃度為92％的乙醇，直至浸提液的體積濃度為65％，然後靜置，直至浸提液中不再析出沉澱，分離出沉澱，並將沉澱乾燥至前後兩次稱重之差為0.05mg。本實施例還提供了上述製備方法製得的復配多糖。實施例二本實施例提供的復配多糖的製備方法，包括以下步驟：a.按照1.2:0.8的質量比取用白朮和茯苓，得到藥材總質量，然後將白朮和茯苓放入鍋中，加入藥材總質量的11倍的水，煎煮2h，然後濾出煎煮液，將過濾的藥渣保留在鍋中，再次加入藥材總質量的11倍的水，煎煮2h，再次濾出煎煮液，將兩次得到的煎煮液混合，得到浸提液；b.對浸提液進行濃縮，直至浸提液的質量為藥材總質量的1.2倍；c.往步驟b得到的浸提液中加入體積濃度為98％的乙醇，直至浸提液的體積濃度為75％，然後靜置，直至浸提液中不再析出沉澱，分離出沉澱，並將沉澱乾燥至前後兩次稱重之差為0.2mg；d.將乾燥後的粗品溶於55℃的熱水中，然後加入Sevage溶液，超聲震蕩12min，再進行分液，得到液體，然後將體積濃度為98％的乙醇與液體混合，使液體中乙醇的體積濃度為85％，靜置26h，對得到的沉澱再次乾燥；其中，粗品、溶解水、Sevage溶液的用量比為1g：12ml：3ml，Sevage溶液為氯仿和正丁醇的混合液，氯仿與正丁醇的體積比為4.5:1。本實施例還提供了上述製備方法製得的復配多糖。實施例三本實施例提供的復配多糖的製備方法，包括以下步驟：a.分別取用白朮、茯苓各100g，混合，用2000ml水浸泡30min，然後煎煮1h，再用250目的濾布過濾，得到濾渣和煎煮液，將煎煮液留待備用，將濾渣倒入容器中，加入2000ml水煎煮1h，再次過濾，得到煎煮液，將兩次得到的煎煮液混合，靜置24h，過濾，得到的濾液作為浸提液；b.將浸提液濃縮至200ml，靜置，冷卻至自然溫度；c.往浸提液中緩慢的加入體積濃度為95％的乙醇，並且邊添加邊攪拌，直至浸提液中乙醇的濃度為70％，接著靜置24h，然後在4000r/min的轉速下離心10min，減壓過濾，得到沉澱，再依次用體積濃度為95％的乙醇和丙酮衝洗沉澱，將沉澱置於真空乾燥箱中減壓乾燥24h，直至前後兩次稱重之差為0.15mg，得到復配多糖粗品。本實施例中，粗品收率參見表1：表1編號藥材量粗多糖含量粗多糖收率粗品200g28.52g14.26％本實施例中，還利用硫酸蒽酮法對復配多糖粗品進行了含量測定，其中，所使用的試劑包括蒽酮、無水葡萄糖對照品，所使用的儀器包括UV-1100型紫外可見分光光度計(上海天美科學儀器有限公司)、循環水真空泵、電子天平、水浴鍋，操作如下：1.供試品溶液的配製：取粗品(0.1000g)，於100ml容量瓶中，加蒸餾水溶解，振搖，並定容至100ml，水浴加熱2min，直至溶液澄清，待溶液冷卻至室溫後，再精密移取2.5ml於另外1個25ml容量瓶中，加蒸餾水定容至25ml，振搖。得到樣品溶液，備用。2.對照品溶液的配製：(1)取無水葡萄糖對照品於減壓乾燥箱中乾燥24h後，備用。(2)取於105℃乾燥好的葡萄糖對照品0.0100g於100ml容量瓶中，加蒸餾水溶解，振搖，並定容至100ml。編號為標準葡萄糖對照品溶液。樣品溶液和對照品溶液數據如表2：表23.蒽酮試劑的配製：取蒽酮0.2g，加入100ml體積濃度為98％的硫酸中，現配現用。4.標準曲線的製備以及白朮茯苓總多糖的含量測定：(1)對照品溶液：用移液槍分別取標準葡萄糖對照品溶液0.5ml、0.6ml、0.8ml、0.9ml、1.0ml、1.1ml、1.2ml、1.3ml於8支試管中，各用蒸餾水補至2ml，分別向8支試管中加入8ml蒽酮試劑，振搖，混勻。編號為①，②，③，④，⑤，⑥，⑦，⑧號。(2)供試品溶液：用移液管取樣品溶液1.0ml於10ml試管中，用蒸餾水補至2ml，加入蒽酮8ml，振搖，混勻。為⑨號。(3)空白溶劑：精密移取2.0ml蒸餾水於10ml試管中，加入蒽酮8ml，振搖，混勻。為⑩號。(4)將上述10支試管至沸水浴中加熱10min，迅速移至冰水浴中，冷卻至室溫。(5)參照紫外-可見分光光度法(《中國藥典2010版》附錄VA)在400～800nm波長範圍進行掃描，選取最大吸收波長為測定波長。結果為：對照品溶液和供試品溶液的最大吸收波長分別為624.2nm和627.1nm，因此，綜合考慮之後確定測定的最佳波長為625nm。(6)在最佳吸收波長625nm下，分別測定①～⑧號的吸光度。結果參見表3：表3而葡萄糖標準曲線參見圖1，其中Y＝4.5651X，R2＝0.9983。(7)根據回歸方程計算純多糖含量表4編號粗多糖含量純化多糖含量收率⑨0.10mg0.06199mg61.99％為了得到品質更好、收率更高的復配多糖，本實施例還進行了純化實驗：1.TCA(三氯乙酸)-正丁醇法：取本實施例製得的粗品5g於50mL熱水中，得到液體，再加入液體體積2倍的TCA-正丁醇(體積比1:10)混合液中，攪拌50min，然後倒入分液漏鬥中靜置1.5h，分出下層清液，用玻沙漏鬥抽濾，再往清液中加入體積濃度為95％乙醇，配成體積濃度為80％的醇溶液，靜止24h，對沉澱進行抽濾，烘乾，稱重量，2.4g，記為1號。2.TCA法：取本實施例製得的粗品5g於50mL熱水中，再加入50mL體積濃度為10％的TCA溶液，攪拌30min，靜置過夜，然後在4000r/min下離心10min，取上清液，利用NaOH固體調pH值至7.0。再用玻沙漏鬥抽濾，往抽濾得到的液體中加入體積濃度為95％的乙醇，配成體積濃度為80％的醇溶液，靜止24h，對沉澱進行抽濾，烘乾，稱重量，無物質。為2號。3.TCA-Sevage法：取本實施例製得的粗品5g於50mL熱水中，然後加入50mL體積濃度為10％的TCA溶液和10mLSevage(氯仿：正丁醇＝4：1)溶液，攪拌1h，在4000r/min下離心10min，取上清液，用玻沙漏鬥抽濾，再加入體積濃度為95％的乙醇，配成體積濃度為80％的醇溶液，靜止24h，對沉澱進行抽濾，烘乾，稱重量，再稱取少量配成溶液，用硫酸蒽酮法測多糖含量。無物質，為3號。4.Sevage法：(1)取本實施例製得的粗品3.5g於35mL熱水中，再加入7mLSevage(氯仿：正丁醇＝4：1)溶液，攪拌20min，在4000r/min的轉速下離心10min，取水層。用玻沙漏鬥抽濾，再加入體積濃度為95％的乙醇，配成體積濃度為80％的醇溶液，靜止24h，對沉澱進行抽濾，烘乾，稱重量，2.51g，為4號。(2)取本實施例製得的粗品2g於20mL熱水中，再加入5mLSevage(氯仿：正丁醇＝4：1)溶液，充分震蕩15min，用分液漏鬥分離，取水層，重新加入5mlSevage(氯仿：正丁醇＝4：1)溶液，重複3次。用玻沙漏鬥抽濾，再加入體積濃度為95％的乙醇，配成體積濃度為80％的醇溶液，靜止24h，對沉澱進行抽濾，烘乾，稱重量，1.25g，為5號。(3)取本實施例製得的粗品2g於20mL熱水中，再加入5mLSevage(氯仿：正丁醇＝4：1)溶液，超聲10min，再用分液漏鬥分離，重複3次。用玻沙漏鬥抽濾，再加入體積濃度為95％的乙醇，配成體積濃度為80％的醇溶液，靜止24h，對沉澱進行抽濾，烘乾，稱重量，1.64g，為6號。5.TCA直溶法(1)取本實施例製得的粗品5g於50mLTCA溶液(體積濃度為10％)中，攪拌30min，靜置過夜，在4000r/min的轉速下離心10min，取上清液，用NaOH固體調pH值至7.0。用玻沙漏鬥抽濾，再加入體積濃度為95％的乙醇配成體積濃度為80％的醇溶液，靜止24h，對沉澱進行抽濾，烘乾，稱重量，為0.2g，為7號。(2)取本實施例製得的粗品5g於50mLTCA溶液(體積濃度為20％)中，攪拌30min，靜置過夜，在4000r/min的轉速下離心10min，取上清液，用NaOH固體調pH值至7.0。用玻沙漏鬥抽濾，再加入體積濃度為95％的乙醇配成體積濃度為80％的醇溶液，靜止24h，對沉澱進行抽濾，烘乾，稱重量，為0.2g，為8號。(3)取本實施例製得的粗品5g於50mLTCA溶液(體積濃度為40％)中，攪拌30min，靜置過夜，在4000r/min的轉速下離心10min，取上清液，用NaOH固體調pH值至7.0。用玻沙漏鬥抽濾，再加入體積濃度為95％的乙醇配成體積濃度為80％的醇溶液，靜止24h，對沉澱進行抽濾，烘乾，稱重量，為0.38g，為9號。將上述1～9號復配多糖的回收率進行比較，結果參見表5：表5編號樣品量純化量回收率15g2.4g48.00％25g0035g0043.5g2.51g71.71％52g1.2562.50％62g1.64g82.00％75g0.2g4.00％85g0.2g4.00％95g0.38g4.00％由上可知，1、4、5、6四個樣品具有測試價值，將這四個樣品按照以下方法進行紫外可見光檢測。分別稱量1、4、5、6四個樣品0.1000g於80ml蒸餾水中，溶解後加入蒸餾水定容至100ml，水浴中加熱2min至溶液澄清，待溶液冷卻至室溫後，再各精密移取2.5ml於另外1個25ml容量瓶中，加蒸餾水定容至25ml，振搖，分別標號為樣品1號、樣品4號、樣品5號、樣品6號。蒽酮試劑的配製：取蒽酮0.2g，加入100ml體積濃度為98％的硫酸，現配現用。樣品試劑用移液管取溶液，樣品1號、樣品4號、樣品5號、樣品6號分別移取1.0ml於10ml的試管中，用蒸餾水補至2ml，加入蒽酮8ml，振搖，混勻。分別為溶液1號、溶液4號、溶液5號、溶液6號。空白溶劑：精密移取2.0ml蒸餾水於10ml容量瓶中，加入蒽酮8ml，振搖，混勻。為⑩號。測試結果參見表6：表6編號吸光度粗多糖含量溶液1號0.2870.10mg溶液4號0.2980.10mg溶液5號0..2990.10mg溶液6號0.2680.10mg溶液1號、溶液4號、溶液5號、溶液6號所用的配製原料的性質參見表7：表7標號樣品量純多糖量收率樣品1號0.10mg0.06283mg62.83％樣品4號0.10mg0.06528mg65.28％樣品5號0.10mg0.06550mg65.60％樣品6號0,10mg0.05871mg58.71％綜合比較幾種方法，Sevage法更具有實用提取價值，那麼再分別試驗離心1次、2次、3次多糖純度的大小。1.取粗品兩份，每份2g，分別溶於20ml蒸餾水中，標為S2、S3，再分別加入4mLSevage(氯仿：正丁醇＝4：1)溶液，攪拌20min，超聲震蕩後再在4000r/min的轉速下離心10min，取水層。S2重複上述操作(加入Sevage溶液～取水層)2次，S3重複上述操作(加入Sevage溶液～取水層)3次，然後分別用玻沙漏鬥抽濾，再加入體積濃度為95％的乙醇，配成體積濃度為80％的醇溶液，靜止24h，對沉澱進行抽濾，烘乾，稱重量，S2為1.4g，標為10號，S3為1.1768g，標為11號。2.取粗品2g於16mL熱水中，再加入3mLSevage(氯仿：正丁醇＝4：1)溶液，攪拌20min，超聲震蕩後再在4000r/min的轉速下離心10min，取水層。繼續重複上述操作3次，然後用玻沙漏鬥抽濾，再加入體積濃度為95％的乙醇，配成體積濃度為80％的醇溶液，靜止24h，對沉澱進行抽濾，烘乾，稱重量，1.2g，標為12號。3.取粗品2g於26mL熱水中，再加入5mLSevage(氯仿：正丁醇＝4：1)溶液，攪拌20min，超聲震蕩後再在4000r/min的轉速下離心10min，取水層。繼續重複上述操作3次，然後用玻沙漏鬥抽濾，再加入體積濃度為95％的乙醇，配成體積濃度為80％的醇溶液，靜止24h，對沉澱進行抽濾，烘乾，稱重量，1.39g，標為13號。將4號、10～13號復配多糖進行比較，結果如表8：表8編號樣品量純化量回收率43.5g2.51g71.71％102g1.4g70.00％112g1.1765g56.83％122g1.2g60.00％132g1.39562.98％再按照以下操作進行紫外可見光測試。分別稱量10號、11號、12號、13號四個樣品0.1000g於80ml蒸餾水中，溶解後加入蒸餾水定容至100ml，水浴中加熱2min至溶液澄清，待溶液冷卻至室溫後，再各精密移取2.5ml於另外1個25ml容量瓶中，加蒸餾水定容至25ml，振搖，分別標號為樣品10號、樣品11號、樣品12號、樣品13號。蒽酮試劑的配製：取蒽酮0.2g，加入100ml體積濃度為98％的硫酸，現配現用。樣品試劑用移液管取溶液，分別移取樣品10號、樣品11號、樣品12號、樣品13號的1.0ml於10ml試管中，用蒸餾水補至2ml，加入蒽酮8ml，振搖，混勻。分別為溶液10號、溶液11號、溶液12號、溶液13號。空白溶劑：精密移取2.0ml蒸餾水於10ml容量瓶中，加入蒽酮8ml，振搖，混勻。為⑩號。測試結果參見表9：表9編號吸光度A粗多糖含量溶液10號0.3070.10mg溶液11號0.3310.10mg溶液12號0..3210.10mg溶液13號0.3850.10mg溶液4號、溶液10號、溶液11號、溶液12號、溶液13號所用的配製原料的性質參見表10：表10由上表可知，復配多糖的純化含量能夠達到84％以上。實施例四本實施例提供的復配多糖的製備方法，包括以下步驟：a.取用白朮、茯苓各1000克，用水煎煮2次，每次1.5h，每次的水的用量為白朮、茯苓總質量的10倍，煎煮完成後，將所有得到的煎煮液混合，得到浸提液；b.將浸提液濃縮至2000ml；c.往濃縮後的浸提液中加入體積濃度為95％的乙醇，使浸提液中的乙醇濃度為70％，靜置，直至浸提液中不再析出沉澱，然後在4000r/min的轉速下離心10min，乾燥，得到粗品290g；d.取粗品290g於2900mL溫度為50℃的熱水中，再加入725mLSevage(氯仿：正丁醇＝4：1)溶液，超聲震蕩10min，再利用分液漏鬥進行分液，用玻沙漏鬥抽濾，再加入體積濃度為95％的乙醇，配成體積濃度為80％的醇溶液，靜止24h，對沉澱進行抽濾，烘乾，稱重量，得到238g復配多糖。本實施例中，利用上述製得的復配多糖進行以下試驗：1.小鼠碳粒廓清試驗實驗藥物：復配多糖，棕黃色粉末，無特殊氣味。臨用前用蒸餾水分別配置成0.4mg/ml、0.2mg/ml、0.1mg/ml備用；人參總皂苷，陽性藥物，為黃色粉末，有特殊氣味，用前用蒸餾水配置成0.25g/ml備用。實驗動物：昆明種小鼠，SPF級，雌雄各半，體重18～22g，由四川省中醫藥科學院實驗動物中心提供，質量合格證號SCXK(川)2013-19。實驗試劑和儀器：墨汁(使用前用生理鹽水稀釋4倍)、Na2CO3(使用前用蒸餾水配成0.1％)、1ml注射器、計時器、電子天平、紫外分光光度計。實驗方法：取健康合格昆明小鼠50隻，雌雄各半，待適應環境後，按體重隨機分為陽性對照組、正常對照組和復配多糖高、中、低劑量組(N＝10)。首次給藥前禁食不禁水12h，然後各組開始灌胃給藥，其中陽性對照組灌胃人參總皂苷，正常對照組灌胃蒸餾水，實驗組灌胃相應計量的受試藥物，給藥體積均為10ml/kg，每日1次，連續4周。每周稱體重、飲食進水量1次。末次給藥前進行稱重，給藥後1h，各組小鼠尾靜脈注射稀釋的墨汁10ml/kg，注射完後立即計時。注入墨汁後2min、10min時，分別從內眥靜脈叢取血20μL，並立即將其加到裝有2mL0.1％Na2CO3溶液的離心管中混勻。將小鼠處死，取肝臟、脾臟用濾紙吸乾臟器表面血汙，稱重，計算臟器係數。分別吸取得到的血液樣品200ul置於96孔板中，利用全自動酶標儀在600nm波長處測光密度值(OD)。以吞噬指數表示小鼠碳粒廓清的能力。按下式計算吞噬指數a：(註：t1、t2分別指2min、10min)實驗結果：與空白組比較，復配多糖高、中、低劑量組和人參總皂苷組小鼠體重與空白組無明顯差異；同時，各給藥組的吞噬係數K和吞噬指數a增較空白組升高，其中復配多糖高、中劑量組K值和高劑量組a值顯著高於空白組(P<0.05)，人參總皂苷組K值、a值較空白組有升高趨勢。結果詳見表11。表11表11復配多糖對小鼠碳粒廓清吞噬指數的影響註：與空白組比較，*P<0.05。2.小鼠臟器稱重試驗實驗藥物：復配多糖，棕黃色粉末，無特殊氣味。臨用前用蒸餾水分別配置成0.4mg/ml、0.2mg/ml、0.1mg/ml備用；人參總皂苷，陽性藥物，為黃色粉末，有特殊氣味，用前用蒸餾水配置成0.25g/ml備用。實驗動物：昆明種小鼠，SPF級，雌雄各半，體重15-18g，由四川省中醫藥科學院實驗動物中心提供，質量合格證號SCXK(川)2013-19。實驗試劑和儀器：電子天平(Mettlertoledo，AL104型)，手術器械。實驗方法：取健康合格昆明小鼠50隻，雌雄各半，待適應環境後，按體重隨機分為陽性對照組、正常對照組和復配多糖高、中、低劑量組(N＝10)。首次給藥前禁食不禁水12h，然後各組開始灌胃給藥，其中陽性對照組灌胃人參總皂苷，正常對照組灌胃蒸餾水，實驗組灌胃相應計量的受試藥物，給藥體積均為10ml/kg，每日1次，連續4周。每周稱體重、飲食進水量1次。末次給藥後1h，處死小鼠，取其肝臟和脾臟，用濾紙吸乾臟器表面血汙，稱重，計算臟器係數。實驗結果：與空白組比較，復配多糖高、中、低劑量組對幼年小鼠的肝臟、脾臟指數無明顯影響，人參總皂苷可明顯升高肝臟指數(P<0.05)，對脾臟指數無明顯影響。結果見表12。表12復配多糖對幼年小鼠臟器指數的影響註：與空白組比較，*P<0.05。3.小鼠環磷醯胺致免疫低下試驗實驗動物：昆明種小鼠，SPF級，體重18～22g，雌雄各半，由四川省中醫藥科學院實驗動物研究中心提供，質量合格證號：SCXK(川)2013-19。實驗藥物：復配多糖，棕黃色粉末，無特殊氣味。臨用前用蒸餾水分別配置成0.4mg/ml、0.2mg/ml、0.1mg/ml備用；人參總皂苷，陽性藥物，為黃色粉末，有特殊氣味，用前用蒸餾水配置成0.25g/ml備用。環磷醯胺，造模藥物，sigma生產國內分裝，以生理鹽水配成4mg/kg備用。主要試劑和儀器：血細胞分析儀溶血劑，由上海東湖生物醫學有限公司生產，批號為20140318；MEK-6318K血細胞分析儀，日本光電生產。實驗方法：取正常、合格昆明種小鼠，按體重隨機分為正常對照組、模型對照組、人參總皂苷組、復配多糖高劑量組、復配多糖中劑量組、復配多糖低劑量組(N＝10)。待適應環境後，各組小鼠灌胃相應藥液，10ml/kg，每日1次，連續10天。於灌胃第1、3、5、7、9天，在灌胃前給予皮下注射環磷醯胺50mg/kg。隔日稱重1次。末次給藥後24h，稱重後，各組小鼠摘眼球取血，採用血細胞分析儀測定外周血中WBC、RBC、HGB、PLT數量；然後處死小鼠，剖取胸腺、脾臟和肝臟，稱重，計算臟器係數。實驗結果(1)對外周血WBC、RBC、HGB、PLT數量的影響：與正常對照組比較，經給予環磷醯胺後，模型對照組小鼠外周血RBC、HGB數量明顯下降，PLT數量則明顯升高，有統計學意義(P<0.05)，WBC數亦明顯下降，但無統計學意義；各給藥組小鼠RBC、HGB數量也明顯低於正常對照組；與模型對照組比較，復配多糖中、低劑量組RBC、HGB有升高趨勢，且對PLT的升高作用有統計學意義(P<0.05)，人參總皂苷和復配多糖高劑量組對上述各指標無明顯影響，與模型對照組比較無顯著性差異。結果見表13。表13復配多糖對環磷醯胺致免疫低下小鼠血細胞的影響注:與正常對照組比較,*P<0.05，**P<0.01；與模型對照組比較，##P<0.01。△因取血液標本失敗或檢測時試劑缺失，正常對照組2隻無檢測數據，高劑量組3隻無檢測數據。實驗結果(2)對胸腺、肝臟、脾臟係數的影響：與正常對照組比較，模型對照組小鼠胸腺指數和脾臟指數均顯著下降(P<0.01)，肝臟指數則呈升高趨勢；各給藥組的胸腺指數和脾臟指數亦明顯低於正常對照組(P<0.01)。與模型對照組比較，復配多糖高、中、低劑量組及人參總皂苷組小鼠的胸腺指數、脾臟指數和肝臟指數均無明顯變化，其中復配多糖高、中、低劑量組肝臟指數略有降低，接近正常對照組。結果見下表14。表14復配多糖對環磷醯胺致免疫低下小鼠胸腺指數的影響註：與正常對照組比較，**P<0.01。4.脾淋巴細胞增殖試驗實驗藥物：復配多糖，棕黃色粉末，無特殊氣味。臨用前用蒸餾水分別配置成0.4mg/ml、0.2mg/ml、0.1mg/ml備用；人參總皂苷，陽性藥物，為黃色粉末，有特殊氣味，用前用蒸餾水配置成0.25g/ml備用。實驗動物：昆明種小鼠，SPF級，雌雄各半，體重18-22g，由四川省中醫藥科學院實驗動物中心提供，質量合格證號SCXK(川)2013-19。實驗試劑和儀器：多功能酶標儀，美國Thermo公司，型號VARIOSKANFLASH2.4.3；RPMI1640細胞培養液，由賽默飛世爾生物化學製品(北京)有限公司生產，批號NZM1289；胎牛血清，由呼和浩特市草原綠野生物工程材料有限公司生產，批號141103；青黴素，由華北製藥股份有限公司生產，批號F3107204；鏈黴素，由華北製藥股份有限公司生產，批號20141102；刀豆蛋白A(ConA)，Sigma分裝，批號11028-71-0；鹽酸，由四川西隴化工有限公司生產，批號140818；MTT，Sigma分裝，批號M-2128；PBS緩衝液(pH7.2-7.4)，由無錫傲銳東源生物科技有限公司生產，批號140511；紗布，由江蘇米沙瓦醫療用品有限公司生產，批號14040；200目篩網；24孔培養板，96孔培養板，均由costar生產；超淨工作檯，由蘇淨集團蘇州安泰空氣技術有限公司生產，批號SW-CJ-2FD；HVE-50高壓滅菌器，HIRAYAMA生產。實驗方法(1)灌胃復配多糖小鼠脾淋巴細胞增殖試驗：取健康合格昆明小鼠20隻，雌雄各半，待適應環境後，按體重隨機分為正常對照組、陽性對照組和復配多糖高、中、低劑量組(N＝4)。首次給藥前禁食不禁水12h，然後各組開始灌胃給藥，其中陽性對照組灌胃人參總皂苷，正常對照組灌胃蒸餾水，實驗組灌胃相應計量的受試藥物，給藥體積均為10ml/kg，每日1次，連續4周。每周稱體重、飲食進水量1次。末次給藥後1h，各組小鼠取兩隻用於無菌取脾，置於盛有5ml無菌Hank's液平皿中，並在脾上面放置一塊紗布，用大號注射器內芯輕輕將脾磨碎，製成單個細胞懸液。經200目篩網過濾，用Hank's液洗2次，每次離心10min(1000r/min)。然後將細胞懸浮於2mL的完全培養液中，用全自動細胞計數儀計數脾細胞，或用臺酚蘭染色計數活細胞數(應在95％以上)，調整細胞濃度為3×106個/mL。然後將細胞懸液分兩孔加入24孔培養板中，每孔1mL，一孔加75μLConA液(相當於7.5μg/mL)，另一孔作為對照，置5％CO2、37℃CO2孵箱中培養72h。培養結束前4h，每孔輕輕吸去上清液0.7mL，加入0.7mL不含小牛血清的RPMI1640培養液，同時加入MTT(5mg/mL)50μl/孔，繼續培養4h。培養結束後，每孔加入1mL酸性異丙醇，超聲震蕩(2秒)或人工吹打混勻，使紫色結晶完全溶解。然後分裝到96孔培養板中，每個孔分裝2孔作為平行樣，在570nm波長測定光密度值。同時，取脾之前，各組在末次給藥後1h，4隻小鼠均無菌條件下摘眼球採血，3500rpm心離心10min，取血清，於56℃滅活30min，分裝，用於試驗。另取正常未給藥小鼠2隻，無菌取脾，按上述方法培養脾淋巴細胞，給予刀豆蛋白的同時，給予各含藥血清，使血清終濃度為10％，繼續培養4h，按上述方法測定吸光值。實驗結果(1)對灌胃復配多糖小鼠脾淋巴細胞增殖率的影響：與空白組比較，人參總皂苷組和復配多糖中劑量組脾淋巴細胞活力下降，但復配多糖低劑量組細胞OD值明顯升高，均有顯著性差異(P<0.01)，復配多糖高劑量組作用不明顯。結果見下表15。表15復配多糖對刀豆蛋白誘導的脾細胞轉化的影響注:與空白組相比較,**P<0.01，差異有極顯著性。實驗結果(2)復配多糖含藥血清對小鼠脾淋巴細胞增殖率的影響：從表16可見，經刀豆蛋白誘導後，脾淋巴細胞活力增加，但給予不同藥物濃度的含藥血清和人參總皂苷含藥血清，其對脾淋巴細胞活力均無明顯影響，重複試驗1次，結果一致。表16復配多糖含藥血清對刀豆蛋白誘導的脾細胞轉化的影響(第一批)本領域的技術人員根據上述體外細胞實驗、動物模型實驗結合現有技術能夠預期製得的復配多糖具有較好的調理效果，能夠增強人體免疫力。以上所述僅為本發明的優選實施例而已，並不用於限制本發明，對於本領域的技術人員來說，本發明可以有各種更改和變化。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。當前第1頁1 2 3