可定向克隆啟動子並研究其活性的t載體及其構建方法
2023-06-04 03:49:26 1
專利名稱：可定向克隆啟動子並研究其活性的t載體及其構建方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域中一種載體構建的方法，特別是一種高通量可直接定向克隆啟 動子並研究啟動子功能的T載體構建方法。
背景技術：
T載體是用於直接克隆PCR產物的線性載體，A-T克隆技術被證明對PCR產物的克隆極 具價值。此方法的原理是利用7b《DNA聚合酶可向擴增產物的3'端多加一個非模板依賴的 dA鹼基，此dA剛與線性T載體3'突出端的dT配對，直接進行高效率的連接，而無需限制 性內切酶酶切的過程。
在啟動子研究領域中，啟動子的PCR擴增產物往往需要克隆到帶有報導基因如增強型綠 色螢光蛋白(EGFP)、螢光素酶(luciferase)或分泌型鹼性磷酸酶(SEAP)的載體中，常規 的方法是通過亞克隆完成，即首先將PCR產物克隆至傳統克隆型T載體，之後採用限制性內 切酶切割下目的基因片段，再將其亞克隆至無啟動子的報告基因載體。然而這種方法有兩個 缺點 一是亞克隆的效率受到酶切效果、目的基因回收質量、得率和連接效率等諸多因素的 制約；二是在啟動子的研究過程中，通常片段愈長，其含有的限制性內切酶位點就愈多，在 克隆過程中必然會受到酶切位點選擇的限制問題。這種矛盾在進行高通量篩選啟動子時顯得 尤其突出。它可以通過製備直接用於啟動子克隆和功能分析的T載體而得到解決。目前尚無 商品化的啟動子分析性T載體。
pEGFP-l是用於研究啟動子活性的載體，其中報告基因綠色螢光蛋白(EGFP)由於螢光 性質穩定，螢光強度高，對細胞無毒性，檢測方便，廣泛用於啟動子的研究中。該載體具有 原核和真核的複製起始點如pUC、 fl和SV40的複製起始點，同時具有卡那黴素(Kana)抗 性基因和新黴素(Neo)抗性基因作為篩選標記，EGFP基因序列位於其多克隆位點的下遊。 pGL3-basic和pSEAP2-basic是另2種常用的啟動子分析載體，分別以luciferase和SEAP作為 報告基因，都具有氨苄青黴素Ump)抗性基因作為篩選標記。
目前，經典的T載體的構建方法有2種。第一種方法是先將質粒通過SwaI或五coRV等 產生平端切點的內切酶線性化，然後利用末端轉移酶或具有末端轉移酶活性的T叫酶在dTTP 或ddTTP環境中實現T的添加(Papp T， Kirchner S， Diener U， Jafari, M， Golka A， Schiffinann D， 1995. Cloning of PCR fragments with a modified M13mpl8 T-vector. Trends Genet. 11， 169)。 第二種方法是限制性內切酶酶切的方法，首先製備前T載體，即在出發載體中引入2個串聯 的能產生3'突出單鹼基末端的限制性內切酶如ZcwI、 XMI (或它們的同裂酶)等的識別位點， 稱為義c/nl盒、J/w/I盒，這些酶切割特異性序列後產生的末端為3'突出單鹼基N(任意鹼基)， 如果將該鹼基設計為T,則可以通過酶切前T載體使其產生2個3'突出T鹼基而成為T載體 (Vries E.， 1998. .A vector for direct cloning of PCR products in a double Xcm I restriction site offering compatible single 3' overhanging T residues. Mol Biotechnol. 10, 273 )。
目前就T載體的製備方法來講，存在著不足之處，主要表現在以下兩個方面 一、非重組背景較高，克隆效率低下。
末端轉移酶或化《酶製備T載體有時由於酶加T的效率低下，有些載體分子末端根本沒 被修飾從而導致兩端均未加T的平端線性質粒的存在，在連接過程中難以避免載體自身環 化，有時也存在線性質粒在加T尾過程中其兩端的序列被部分刪除的問題。
釆用Xc/wI、 ^4Ad等限制性內切酶製備T載體的方法也會因為酶切效率相對較低，經常 產生酶切不完全的現象，出現克隆過程中非重組背景過高的問題。目前解決這一問題最有效 的方法是在前T載體的兩個J&附I或兩個^^1酶切位點之間引入足夠長的間隔DNA，經瓊脂 糖電泳後將完全酶切的質粒和部分酶切的質粒分開。然而，引入間隔DNA帶來的一個新問 題是由於環型超螺旋質粒在瓊脂糖凝膠電泳中比分子量相當的線性質粒湧動快，因此完全 未被酶切的環型超螺旋前T載體往往與分子量小於它的T載體(完全切開)混雜，因此造成 非重組轉化子的本底較高，如果前T載體缺乏區別於T載體的篩選標記，就要面臨較繁瑣的 篩選工作。
二、無法實現定向克隆，篩選工作量大。
在使用商品化的傳統T載體進行目的基因的克隆時，目的基因會以不確定的方向插入載 體，兩個方向插入的機率相同。如果此T載體僅僅用來進行目的基因的克隆、擴增和保存， 並無妨礙；但如果是用於基因的表達或啟動子分析等，則需要進行較繁瑣的篩選工作篩選出 方向正確的克隆，耗時耗力，尤其不適合高通量篩選啟動子的研究。
發明內容
本發明的目的是提供一種高效率可定向克隆啟動子擴增產物的T載體製備方法，真正做 到高通量、直接、定向的克隆表達，此方法同樣適用於普通克隆型T載體和表達型T載體的 製備，將在基因工程領域中發揮重要作用。
本發明所提供的製備T載體的方法，包括以下步驟-
1) 製備含有Zc附I盒(或爿MI盒)的前T載體pEGFP-UC， pGL3-UC和pSEAP2-UC。 所述iTcmI盒包括間隔DNA序列，緊密連接於所述間隔DNA序列兩側的各一個XcmI酶切位 點序列；
其中前T載體pEGFP-UC間隔序列為質粒pUC18基因全序列，所述J&ml盒還包括連接 於所述各一個Xcm I酶切位點序列的酶切位點5g/H和^TwI，上遊引物的識別位點中尚 有稀有限制酶位點i^d位點的前半部分即"GTTT"，最後一個T將構成酶切割得到的3' 突出T。 Pmd位點的特徵是①不存在於出發載體pEGFP-l序列中；②識別序列中除兩端 以外的鹼基中含有T，由它構成3'突出T。其它符合該2個條件的位點如i^d、 Sg/I、 EcoRV 等的位點亦可引入至盒中。
前T載體pGL3-UC和pSEAP2-UC間隔序列為質粒pUC-K基因全序列，pUC-K為發明 人自行構建的質粒，其特徵為以卡那黴素抗性基因取代pUC18中的氨苄青黴素抗性基因，其 餘序列與pUC18相同。所述XcmI盒還包括連接於所述各一個義cwl位點的Mwl和屈ol酶切 位點，上遊引物的XowI切割位點前(包括潛在的3，突出T)尚有稀有限制酶位點Pwd位點 的前半部分即"GTTT"。
2) 用Zc/nl或Xcml同裂酶酶切步驟l)中的前T載體，得到T載體；
本發明具體實現過程如下
1. Xcwl盒的製備
根據質粒pUC18和pUC-K的序列，設計引物序列為 pUC誦F: 5，-CGAA^ECICC4GGniC4GrrGGAGACCAAGTTTACTCA-3，； pUC-R: 5，-CAACTCGAGCC^4CCGrGC4GrGGGACAGTTACCAATGCT隱3，: pUC國KF: 5，-CGAAQQ￡fiICC4GGIIIC4G7TGGAGACCAAGTTTACTCA-3，。
三條引物的5'端分別引入限制性內切酶i5gni、 J^ol和M"I識別位點，用單線標示；Xc/nl 酶識別位點用斜體標示；在pUC-F和pUC-KF引物的Ami識別位點中尚包含稀有限制酶位 點i^d位點的前半部分即GTTT，最後一個T將構成7cml酶切割得到的3'突出T，用波線 標示，用於啟動子PCR產物的定向克隆分析。
pUC-F和pUC-R用於擴增pUC18; pUC-KF和pUC-R用於擴增pUC-K。將所得PCR產 物自身環化，塗布於帶有相應抗生素的平板並進行藍白斑篩選，確定其抗生素抗性和 篩選標記完整，同時酶切鑑定篩選盒正確引入的陽性克隆，分別命名為pUC-X和 pUC-KX。用J5g/H、 Wol雙酶切pUC-X，用Mwl和Wol雙酶切pUC-KX，製成Xcwl盒。
2. 在載體pEGFP-l、 pGL3-basic和pSEAP2-basic的多克隆位點中引入JfcmI盒構建前T
載體
pEGFP-1載體用Bg/II和酶切，由於內切酶JO/oI和Sa/I是同尾酶，所以pUC-X和 pEGFP-l在酶切回收後可以直接進行連接反應。pGL3-basic和pSEAP2-basic用Mwl和Wol 雙酶切，酶切產物與Mwl和^oI雙酶切的pUC-KX進行連接。義cwl盒的引入使三種重組子 均帶有^附p和雙抗性和丄acy篩選標記，因此將連接產物轉化、塗布於具有^ ; 和 雙抗生素的平板，大大減少非重組背景，提高克隆效率。經ArmHI酶切進一步鑑定，構建的 載體分別命名為pEGFP-UC、 pGL3-UC和pSEAP2-UC，即為前T載體(圖l， 2， 3)。
3. T載體的製備
用Xcml酶切前T載體pEGFP-UC、 pGL3-UC和pSEAP2-UC，經1%瓊脂糖凝膠電泳後 回收大片段。切膠回收的大片段即是T載體pEGFP-T、 pGL3-T和pSEAP2-T，可以用於PCR 產物的定向克隆。此時，該載體產生的粘性末端為
5，一 CCAGGTTT CGGTTGG-— 3'
3，一 GGTCAAA TGCCAACC— 5，
4. 啟動子PCR擴增產物與T載體的連接及定向克隆
啟動子擴增引物的設計必須遵循的原則是將稀有酶PweI (或引入的其它酶位點)識別 位點的後半部分"AAAC"作為下遊引物5'端起始鹼基，而上遊引物5'端不能^"AAAC"起始。 PCR產物採用T叫DNA擴增酶擴增，或者採用P/w、 iV/me^ar等高保真酶擴增後再通過Tfl《 擴增酶加A尾，得到的粘性末端為
5, NNN-------------NGTTTA3,
3,ANNN-------------NCAAA 5'
這樣當PCR擴增產物與上述T載體反向連接時，由下遊引物提供的5'端"AAAC"與T
載體義cwl盒提供的"GTTT"融合而形成完整的屍/wd位點(GTTTAAAC)，且pEGFP-T、pGL3-T 和pSEAP2-T載體本身並沒有此識別位點，因此可以通過屍md酶切連接產物而去除反向連接 克隆。酶切過程於轉化前完成，大大提高篩選得到PCR產物正向插入的陽性克隆的機 率。流程如圖4所示。
5.通過藍白斑篩選標記篩選陽性克隆。
考慮到T載體中可能混雜的未被義cml酶切的或僅在其單一位點酶切後自身環化的質粒， 它們帶有完整的丄flcZ'讀碼框，其轉化子在含有IPTG和X-Gal的固體培養基上生長為藍色菌 落，而T載體克隆產物呈白色菌落，因而可以通過藍白斑篩選的方法排除這些非重組轉化子， 挑取白色菌落進行鑑定，進一步提高陽性克隆效率。
本發明中構建T載體的方法具有如下優勢
1. 盒中的長間隔序列選用質粒pUC18或pUC-K基因的全序列或其它符合條件(帶 有與出發載體不同的篩選標記)的序列，以質粒作為模板進行PCR擴增，擴增效率高。
2. Zcml盒中的質粒pUC18或pUC-K基因全序列為前T載體增加了篩選標記，使前T 載體可以具備卡那黴素和氨苄青黴素雙重抗性，同時又具有藍白斑篩選標記，可以簡便、高 效地篩選帶有間隔基因序列的前T載體。
3. 在採用XcmI切割前T載體而製備T載體的過程中，長間隔序列有助於將ZonI完全 酶切產生的T載體和部分酶切的質粒分離開。但在酶活性較低的情況下，存在較多的完全未 被酶切的環型超螺旋前T載體，它們往往與分子量小於它的T載體(完全切開者)混雜，因 此造成非重組轉化子的本底較高，也影響了T載體的得率。解決此問題的備擇方案是再選 用位於長間隔序列中間的一個常用內切酶如五coRI進行酶切，將未被XctmI酶切的環型質粒 線性化，從而使其易於與T載體進行分離，選擇這個酶的原則是在T載體的序列中不應出現 該酶的識別位點。
4. 實現PCR產物定向克隆於T載體。
Xcml盒設計精密，前一個XcwI切割位點前(包括潛在的3'突出T)尚有稀有限制酶位 點屍wd位點的前半部分即"GTTT"。為實現目的基因的定向克隆，擴增啟動子的引物也需要 特殊設計，必須遵循的原則是將屍md位點的後半部分即"AAAC"作為下遊引物5'端起始鹼 基，而上遊引物5'端不能以"AAAC"起始。PCR產物採用Ta《DNA擴增酶擴增，或者採用 iyM、/V/me^ar等高保真酶擴增後再通過r叫擴增酶加A尾。這樣當PCR擴增產物與上述T載 體皮向連接時，由下遊引物提供的5'端"AAAC"與T載體IcmI盒提供的"GTTT"融合而形成 完整的屍md位點(GTTTAAAC)，因此可以通過屍附d酶切連接產物而去除反向連接克隆， 大大提高篩選到正向克隆的機率。
5. 藍白斑篩選進一步排除T載體中可能混雜的未被酶切的或單酶切後自身環化的非重 組轉化子，大大提高陽性克隆效率。
6. 本方法同樣適用於普通克隆型T載體和表達型T載體的製備。
圖1為前T載體pEGFP-UC的結構示意圖
圖2為前T載體pGL3-UC的結構示意圖 圖3為前T載體pSEAP2-UC的結構示意圖 圖4為利用T載體定向克隆啟動子PCR產物的流程圖
具體實施例方式
實施例一T載體pEGFP-T、 pGL3-T和pSEAP2-T的製備
1. Xcwl盒的製備
根據質粒pUC 18和pUC-K的序列，設計引物序列為 pUC-F: 5，-CGAAGATCTCC4GG7TrC4G7TGGAGACCAAGTTTACTCA-3，: pUC-R: 5，-CAACTCGAGCC^4CCGrGC4GrGGGACAGTTACCAATGCT-3，: pUC隱KF: 5,-CGAACGCGTCC4GGnTC4G7TGGAGACCAAGTTTACTCA-3'。 三條引物的5'端分別插入的限制性內切酶Sg/H、 Wol和Mwl識別位點，用單線標示；義c7nl 酶識別位點用斜體標示；在pUC-F和pUC-KF引物的Xcwl識別位點中尚包含稀有限制酶位 點屍/nel位點的前半部分即GTTT，最後一個T將構成Jfc附I酶切割得到的3'突出T，用波線 標示，用於啟動子PCR產物的定向克隆分析。
以質粒pUC18為模板，pUC-F和pUC-R為引物進行PCR擴增；以質粒pUC-K為模板， pUC-KF和pUC-R為引物進行PCR擴增。50 擴增體系中含2 U iV/weWw DNA聚合酶， 0.2 mmol/L dNTP， lx/v細ewar buffer,引物各0.4 pmol/L，模板5ng左右；PCR擴增的循環程 序為94°C預變性5min， (94 。C 30 s; 59 °C 30s; 72 。C 2 min) x25, 72 。C最後延伸10分 鍾。經P/。瓊脂糖凝膠電泳後切膠回收PCR擴增產物，然後T4DNA激酶37'C作用60min， 70。C10min將該酶滅活。之後，建立如下自環化連接反應10 ^L，連接體系中含1U連接酶 (MBI)， lx連接Buffer,約100ngPCR產物。4'C連接16小時。將連接產物轉化大腸桿菌 (JM109)後，經藍白斑及抗生素抗性篩選後得到陽性克隆，限制性內切酶酶切進一步鑑定 Zcml盒是否正確引入，將構建的兩載體分別命名為pUC-X和pUC-KX。
2. 在pEGFP-l、 pGL3-basic和pSEAP2-basic的多克隆位點中引入義cml盒構建前T載體 已構建的載體pUC-X用5gm、 J^oI酶切，37 。C作用2小時，50 pL酶切體系為5嗎
pUC-X， 5g/II、 iT oI內切酶各20 U， 10 mM Tris-HCl (pH 8.5)， 10 mM MgCl2， 100 mM KCl， 0.1 mg/ml BSA。同時，pEGFP-l載體用Bg/II和Sa/I酶切，50酶切體系如下5pEGFP-l ，
和Sa/I內切酶各20 U， 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl2， 100 mM NaCl， 0.1 mM BSA。由於內切酶J^oI和Sa/I是同尾酶，所以pUC-X和pEGFP-l在酶切回收後可以直接進 行連接反應。10 nL連接體系為1 U連接酶(MBI)， lx連接Buffer,約50 ng酶切後純化 的pUC-X， 50 ng酶切後純化的pEGFP-l 。連接產物按常規方法轉化JM109菌株，經(50 mg/ml)和《a"fl (25 mg/ml)雙抗性篩選得到陽性菌落，經S"mHI酶切進一步鑑定，構建的 載體命名為pEGFP-UC，即為前pEGFP-l的T載體。
將載體pUC-KX用MmI和屈ol雙酶切，反應buffer和條件與pUC-X相同，回收大片段 質粒；同時，pGL3-basic和pSEAP2-basic也分別採用相同的限制酶處理，回收大片段質粒後 分別與相同酶切處理的pUC-KX建立連接反應，反應體系、條件及陽性克隆篩選條件均與上
段敘述相同。構建的載體分別命名為pGL3-UC和pSEAP2-UC。 3. T載體的製備
用Xc附I分別酶切前T載體pEGFP-UC、 pGL3陽UC和pSEAP2-UC， 50 pL酶切反應體系 如下20 UXcwI內切酶，10 mMTris-Cl (pH 7.9), 10 mM MgCl2, 50 mMNaCl， 1 mM DTT， 5 ng質粒。37。C酶切3小時後，經1%瓊脂糖凝膠電泳後分別回收大片段。切膠回收的大片 段即是T載體pEGFP-T、 pGL3-T和pSEAP2-T，可以用於PCR產物的定向克隆。
實施例二 T載體pEGFP-T的正向克隆的篩選及效率檢測
用7i^DNA聚合酶擴增趨化因子受體CXCR4最小啟動子，引物設計遵循以下原則即 在下遊引物的5'端以"ACCC"為起始鹼基，而上遊引物不以"ACCC"起始。這樣僅當PCR擴 增產物與上述T載體反向連接時，完整的內切酶i^d的識別位點形成(GTTTAAAC)，而 且pEGFP-T、 pGL3-T和pSEAP2-T載體本身並沒有此識別位點。因此可以通過戶附d酶切來 去除反向連接克隆。具體步驟如下
CXCR4啟動子引物設計如下
CXCR4-F: 5 ， - TACCGACCACCCGCAAACAG -3 ，
CXCR4-R: 5 ，-ACCCTAACCGCTGGTTCTCCAGA-3 ，
CXCR4 PCR產物分別與pEGFP-T、 pGL3-T和pSEAP2-T載體進行連接反應，10nL連 接體系如下25ngPCR產物，50ngT載體，3UT4DNA連接酶，16。C連接16小時。這個 反應Buffer不僅適用於T4 DNA連接酶，同時適用於Pmd酶和鹼性磷酸酶(CIAP)。反應 Buffer的組成為10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl2, 0.1 mg/ml BSA和0.5 mM ATP。連 接產物經70 °C lOmin滅活T4 DNA連接酶後，加入10 U Pmel酶和1 U鹼性磷酸酶。鹼性磯 酸酶的作用是去除酶切產物的5，磷酸以防止自身環化。再經85 。C滅活15min，將經過以上處 理的連接產物轉化JM109菌株，並進行藍白斑篩選。提取質粒後建立酶切反應鑑定插入片段 存在與否，PCR反應鑑定克隆方向(兩條引物分別位於載體和插入片段上)。結果表明，3種 T載體轉化效率均不低於5 x 105 cfii/mg， 90%以上菌落為白色，且正向插入者均為卯％以上。 重組載體分別命名為pEGFP-T/CXCR4、 pGL3/CXCR4和pSEAP2/CXCR4。
實施例三重組T載體的功能檢測
乳腺癌細胞MCF-7分別用含10%FBS的RPMI 1640培養液於37 °C 、 5% C02條件下培 養。轉染前1天，取生長良好的細胞，胰酶消化計數，將細胞濃度調至2x1051111，在24孔培 養板中加入上述細胞的RPMI1640培養液，使每孔細胞數為lx105。在Lipofectamine 2000的 介導下分別轉染前述3種克隆有CXCR4啟動子的重組T載體，以pEGFP -1 、 pGL3-basic和 pSEAP2-basic質粒作為陰性對照。每種質粒的轉染量為lpg/孔，脂質體用量為每孔2pl。培 養5小時後更換新鮮培養液，在37'C、 5% C02條件下繼續培養，24h後於倒置螢光顯微鏡 觀察重組pEGFP-T/CXCR4轉染的細胞，可見大部分MCF-7細胞呈現很強的綠色螢光(圖5)。 採用luciferase和SEAP檢測試劑盒分別測定pGL3/CXCR4和pSEAP2/CXCR4轉染的細胞中 各自酶活性(化學發光檢測)，較陰性對照者分別提高50倍以上，證明我們構建的T載體是
有功能的，可以用於啟動子的克隆和功能研究。
權利要求
1、一種用於克隆啟動子的T載體pEGFP-T、pGL3-T和pSEAP2-T的製備方法，包括以下步驟1)製備含有XcmI盒(或AhdI盒)的前T載體pEGFP-UC、pGL3-UC和pSEAP2-UC，所述XcmI盒包括間隔DNA序列，緊密連接於所述間隔DNA序列兩側的各一個XcmI酶切位點序列；2)用XcmI酶或XcmI酶的同裂酶酶切步驟1)中的前T載體，得到T載體；其特徵在於所述步驟1)中的間隔DNA序列為帶有與出發載體具有不同抗性基因或其它選擇標記的序列，如構建前T載體pEGFP-UC時所採用的質粒pUC18全序列和構建前T載體pGL3-UC與pSEAP2-UC時所採用的pUC-K序列，pUC-K為發明人自行構建的質粒，其特徵為以卡那黴素抗性基因取代pUC18中的氨苄青黴素抗性基因，其餘序列與pUC18相同。
2、 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述Xcml盒還包括連接於所述各一個J^附I位 點的酶切位點序列，即用於前T載體pEGFP-UC製備的Bg/II和Wol識別位點或用於前T載 體pGL3-UC與pSEAP2-UC製備的Mwl和Ji7wl位點。
3、 根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於，所述構建前T載體的Xc/nl盒由PCR擴增 得到，根據pUC18和pUC-K的序列設計的PCR引物，序列如下pUC-F: 5，-CGAAGATCTCC4GGnTC4GTrGGAGACCAAGTTTACTCA-3，;pUC國R: 5，陽CAACTCGAGCC^4CCGrGC4GrGGGACAGTTACCAATGCT-3':pUC-KF: 5，-CGAACGCGTCC4GG7TrC4G7TGGAGACCAAGTTTACTCA-3,。pUC-F和pUC-R用於擴增pUC18; pUC-KF和pUC-R用於擴增pUC-K。三條引物的5'端分別引入限制性內切酶5gm、 J^oI和MwI的識別位點，用單線標示；Xcwl酶識別位點用斜體標示；在pUC-F和pUC-KF引物的義cwl識別位點中尚包含稀有限制酶位點位點的前半部分即GTTT，最後一個T將構成XcmI酶切割得到的3'突出T，用波線標示，用於啟動子PCR產物的定向克隆分析。
4、 根據權利要求3所述的方法，其特徵在於，啟動子擴增引物的設計必須遵循如下原則將 稀有酶Pmel識別位點的後半部分"AAAC"作為下遊引物5'端起始鹼基，而上遊引物5'端不 能以"AAAC"起始。PCR產物採用r叫DNA擴增酶擴增，或者採用戶/w、 /V7'WMtor等高保 真酶擴增後再通過化《擴增酶加A尾。
5、 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於在所述出發載體為pEGFP-l的多克隆位點的 5g/n位點和5WI位點引入所述的Xcwl盒！或在所述出發載體pGL3-basic和pSEAP2-basic 的多克隆位點的MM位點和^TwI位點引入所述的Zcwl盒。
6、 根據權利要求3或4所述的方法，其特徵在於用XcwI酶或XcmI酶的同裂酶酶切步驟l 中的前T載體，得到T載體，啟動子PCR產物與T載體的連接物可在轉化之前用屍wd酶切 來減少反向連接克隆，提高PCR產物正向克隆效率。
7、 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於XcwI盒中作為間隔DNA序列的質粒pUC18 或pUC-K全基因序列，具有完整的Z"cZ'讀碼框架，通過藍白斑篩選進一步排除T載體中可 能混雜的未被酶切的或單酶切後自身環化的非重組轉化子，提高陽性克隆效率。
全文摘要
本發明公開了一種可直接定向克隆啟動子並研究啟動子活性的T載體及其構建方法，包括以下步驟1)製備含有XcmI盒(或AhdI盒)的前T載體，包括間隔DNA序列即帶有與出發載體具有不同抗性基因或其它選擇標記的序列，緊密連接於此間隔DNA序列兩側的各一個XcmI酶切位點序列；2)用XcmI酶或XcmI酶同裂酶酶切步驟1)中的前T載體，得到T載體；其中所述步驟1)中的XcmI盒通過PCR擴增得到，在上遊引物XcmI酶識別位點中尚包含稀有限制酶PmeI識別位點的前半部分，用於啟動子PCR產物的定向克隆分析。本發明中的方法同樣適用於普通克隆型T載體和表達型T載體的製備，將在基因工程領域中發揮重要作用。
文檔編號C12N15/66GK101177690SQ20061012930
公開日2008年5月14日 申請日期2006年11月9日 優先權日2006年11月9日
發明者蓓 孫, 左愛軍, 瑞 張, 張鏡宇, 李曉霞, 梁東春, 王寶利, 剛 郭 申請人:天津醫科大學