一種莽草酸生產用基因工程菌株的構建方法

2023-06-04 03:00:21 2

專利名稱：一種莽草酸生產用基因工程菌株的構建方法
技術領域：
本發明屬於基因工程領域，具體地說涉及一種莽草酸生產用基因工程菌株的構建方法，該菌株可用於發酵生產莽草酸。
背景技術：
莽草酸(Shikimicacid，Shikimate)，化學名[3R-(3 α，4 α，5 β ) ]-3，4，5-三羥基-ι-環己烯-ι-羧酸，是生物體內代謝過程的中間產物，也是合成許多生物鹼、芳香胺基酸與吲哚衍生物、手性藥物(如抗病毒藥)的原料，廣泛存在於植物及微生物中。莽草酸通過影響花生四烯酸代謝，抑制血小板聚集，抑制動、靜脈血栓及腦血栓的形成，莽草酸不僅具有抗炎、鎮痛作用，還可以作為抗病毒和抗癌藥物中間體。莽草酸的一些衍生物也具有一定的藥物作用。以莽草酸為原料合成的「達菲」是世界衛生組織推薦的防治高致病性禽流感藥物， 也是目前唯一證實有效治療禽流感藥物。禽流感暴發以來，世界對「達菲」的需求急劇擴大。 我國政府和企業都在分別加緊進行抗禽流感藥物的儲備和生產，但因生產「達菲」的主要原料一莽草酸產量的不足，嚴重限制了 「達菲」的生產。目前，莽草酸的製備方法主要有三種，分別是植物組織提取法、化學合成法和微生物發酵法。莽草酸大量存在於高等植物和微生物中，如八角果含莽草酸8% 13%，是各類已研究植物種類中莽草酸含量最高的，也是工業化生產莽草酸最常用的原料。但由於毒八角果內含有劇毒物質，其揮髮油會引起麻痺，提取莽草酸時需要經過嚴格處理才能夠達到環保要求，生產成本較高。雖然從植物中提取莽草酸具有簡單方便、技術限制較少等優點，而目前的莽草酸也多是從八角茴香等植物組織中提取而來，但是該方法受原料產量限制，無法大量生產。此外隨著八角茴香價格的提高，莽草酸成本也隨之上升。化學合成方法因較多使用有機和有毒試劑，不能被大量應用於莽草酸生產。微生物發酵法因較少受到原料來源的限制，容易持續工業化生產，對環境汙染較少，成本低廉，逐漸被應用於莽草酸生產。莽草酸循環廣泛存在於微生物中，通過微生物發酵也能夠提取莽草酸。在大腸桿菌中葡萄糖轉化為芳香族胺基酸(L-苯丙氨酸、L-賴氨酸和L-色氨酸)，而莽草酸為中間產物。普通大腸桿菌經過改造後可以積累莽草酸。羅氏公司2005年與德國一家生物技術中心合作，通過向一種無害的大腸桿菌超量補給葡萄糖，迫使細菌釋放莽草酸。目前，羅氏公司三分之二的莽草酸取自八角茴香，餘下三分之一由發酵法提供。在生物體的自身代謝中，莽草酸難以大量積累。莽草酸作為中間代謝物，一旦合成就被會被用於其它生物分子特別是芳香族分子的合成。因而生物的原生代謝必須被打破才可能積累莽草酸。與莽草酸合成相關的酶有3-脫氧-D-阿拉伯-庚酬-7-磷酸合成 (3-deoxy-7-phosphohep tulonate synthase,簡稱 DAHP 合成酶，催化 DAHP 的合成)、3_ 脫氫奎尼酸合成酶(3-dehydroq uinate synthase，催化由DAHP到3_脫氫奎尼酸的反應)、 3-脫氫奎尼酸脫水酶(3-dehydroquinate dehydratase，催化3_脫氫奎尼酸脫水生成脫氫莽草酸)、莽草酸脫氫酶(shikimate dehydrogenase，催化脫氫莽草酸向莽草酸的轉變，該反應可逆)和莽草酸激酶同工酶(shikimate kinase isozyme，催化莽草酸磷酸化為3_磷酸莽草酸)。它們在大腸桿菌中分別由aroF UroG,aroH),aroB,aroD,aroE,aroK Carol) 編碼，其中aroF、aroG和aro//均編碼DAHP合成酶UroF受酪氨酸反饋抑制，aroG受苯丙氨酸反饋抑制，aroV受色氨酸反饋抑制)，ar0f和aroZ都編碼莽草酸激酶同工酶，它將莽草酸轉化為3-磷酸莽草酸(shikimate-3-phosphate)。由於和莽草酸合成相關酶並不足以進行大量積累莽草酸的催化，莽草酸激酶催化莽草酸向其它化合物的轉化，因此生產菌株必須進行相關酶的改造以適合莽草酸的大量合成。目前，關於莽草酸的微生物發酵法生產在國內外已有相關報導。Yurgis等通過對枯草芽孢桿菌進行改造以生產莽草酸，該菌株通過失活莽草酸激酶基因UroI)或者5-烯醇丙酮醯莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS，可催化莽草酸-3-磷酸向分支酸的轉化)基因，導入莽草酸脫氫酶和DHAP合成酶等基因，可產莽草酸約20g/L。John W. Frost等通過對大腸桿菌進行基因改造以提高莽草酸產量，這些菌株包含和莽草酸合成相關的基因如aro八 aroE、serA、tktA、ppsA和aroD等，使得莽草酸產量達到70g/L左右。John W. Frost對 2-酮-3-脫氧半乳糖酸醛縮酶(KDPGal aldolase)基因進行分子進化獲得一種可以催化丙酮酸和E4P合成DAHP，同DAHP合成酶相比，可以為細胞節省大量PEP，進一步提高了莽草酸產量。汪莉將莽草酸合成相關基因aroAaroA和aroi 導入大腸桿菌基因組中，同時敲除莽草酸激酶基因(aroZ和arof)和 兒採用該菌株進行發酵，可產莽草酸8. 3g/L。此外，日本也有採用檸檬酸桿菌進行莽草酸發酵的報導。色氨酸啟動子可以高效率地起始轉錄。色氨酸啟動子受到阻遏蛋白TrpR(由trpR 基因編碼)的調控，當色氨酸足量時，TrpR同色氨酸結合為活性形式阻遏色氨酸啟動子的啟動；當色氨酸匱乏時，TrpR無色氨酸結合，為無活性形式，無法阻遏啟動子的啟動，受色氨酸啟動子控制的基因開始轉錄。由於上述的這種特點，色氨酸啟動子被廣泛應用於重組蛋白的表達和酶的合成。現有發明大多通過敲除基因來中斷莽草酸的代謝，並導入莽草酸合成代謝基因來實現莽草酸的有效積累，此類方法需要從宿主細胞中敲除較多的基因，操作起來相對繁瑣。

發明內容
本發明的目的在於提供一種莽草酸生產用基因工程菌株的構建方法，該方法敲除基因少，構建的菌株能夠有效中斷莽草酸代謝和實現莽草酸的大量積累。為實現上述目的，本發明採用如下技術方案
一種莽草酸生產用基因工程菌株的構建方法，其包括以下步驟 ①構建arM基因敲除的大腸桿菌菌株；
利用Red系統構建arM基因敲除的大腸桿菌菌株W3110 (AaroA)0本發明方法使用大腸桿菌五cWi菌株W3110，但菌株不僅限於W3110—種。Red系統為新發展的用於基因操作的技術，利用重組技術可以方便地敲除、敲入或突變基因，目前多用於大腸桿菌。徹A 基因編碼EPSPS，催化莽草酸-3-磷酸和PEP反應生成5-烯醇丙酮莽草酸_3_磷酸。敲除 arM基因可導致細菌缺失5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶，代謝流中斷在莽草酸-3-磷酸，從而利於積累莽草酸和莽草酸-3-磷酸。②構建含有莽草酸代謝途徑中的關鍵酶基因aro(fM (該基因編碼的酶不受苯丙氨酸反饋抑制)、aro^\aroS、aro々、議M和的重組表達質粒pAR63，且這些基因均處於色氨酸啟動子/^p的轉錄控制下；
重組表達質粒PAR63是通過依次將基因ppsA、tktA ,aroB.aroD.aroE和aro(fM連接至 pAR質粒而獲得的。其中，基因aroG、aroE、aroD、aroB、tktA和ppsA均來源於大腸桿菌，重組表達質粒PAR63的出發質粒為pACYC184。③將重組表達質粒pAR63轉入已敲除arW基因的大腸桿菌菌株W3110 (MroA), 獲得表達莽草酸的生產菌株。生產菌株可以通過流加葡萄糖方式溶氧控制發酵來製備莽草酸。具體的，步驟①包括
a、通過PCR擴增獲得aroA同源替換序列DaroA；
b、將質粒pKD46導入大腸桿菌菌株W3110；
c、誘導步驟b所得陽性菌株產生同源重組所需的酶，收穫菌體製備感受態細胞；
d、通過電擊轉化將步驟a獲得的同源替換序列DaroA導入步驟c獲得的感受態細胞， 得到arM基因被替換的菌株；
e、使用pCP20質粒消除步驟d所得菌株的抗性基因片段，得到arM基因敲除菌株。具體的，步驟②包括
a、基於質粒pACYC184構建包含ir/77 基因的改造載體pAR，可以表達一定量TrpR，用於阻遏載體上的/^p啟動子；
b、構建抗反饋抑制的arof-基因，並在基因前加上色氨酸啟動子/^ C、克隆aroB和aroE基因，並為其添加核糖體結合位點RBS ；
d、克隆基因tktA、PPsA和aro々，並在tktA前加上色氨酸啟動子/^P，在你M後面加上轉錄終止子(轉錄終止子用Ter表示)；
e、將各基因按照Ptrp、aro(fB\aroE、aroB、aroD、Ptrp、tktA、ppsA和轉錄終止子的順序連接至PAR質粒，構成pAR63質粒。所述重組表達質粒pAR63中含有色氨酸啟動子阻遏蛋白基因trpR,且ir/7/P帶有自身啟動子，可以自主表達。所述重組表達質粒pAR63中所含的/基因下遊序列為轉錄終止子序列；所述重組表達質粒PAR63中所含的tktA基因上遊序列為色氨酸啟動子序列；所述重組表達質粒pAR63中所含的aroB和aroE基因上遊序列均含有核糖體結合位點(RBS)序列；所述重組表達質粒PAR63中所含的aro々基因帶有自身RBS序列；所述重組表達質粒pAR63中所含的aro(fM基因上遊序列為色氨酸啟動子序列，aroi^是由aroG基因的180位點定點突變為Phe而獲得。所述轉錄終止子序列為rrai 轉錄終止子序列。本發明敲除細菌中的EPSPS基因，同時構建導入含有色氨酸啟動子(Z^p)控制的限速酶基因的載體，減少莽草酸的分解代謝，在適當的生長時期自動開啟相關基因表達，增加前體含量，加速合成反應，從而促進原料高效轉化為莽草酸。和現有技術相比，本發明方法的創新點如下
(1)通過敲除arM單基因實現中斷莽草酸代謝的目的，需要敲除基因少，與雙基因 aroZ/f敲除方法相比操作難度減小，且莽草酸代謝流向莽草酸-3-磷酸，降低莽草酸對莽草酸脫氫酶等上遊酶的反饋抑制作用，降低莽草酸合成過程中的中間產物含量，提高莽草酸產量。反應最終產物主要為莽草酸和莽草酸-3-磷酸，通過酸化和加熱處理即可轉變為莽草酸。(2)導入了莽草酸合成相關基因，並處於/^>調控之下，發酵初期，培養基中含有豐富的胺基酸，基因表達處於阻遏狀態，有利於菌體積累。由於莽草酸無法進入芳香族胺基酸合成代謝，莽草酸合成菌株為色氨酸缺陷型，無法進行色氨酸的生產，待色氨酸消耗後濃度降低，各基因逐步開始表達，催化莽草酸的大量合成。(3)由於莽草酸無法進入芳香族胺基酸合成代謝，莽草酸合成菌株為色氨酸缺陷型，無法進行色氨酸的生產，基因表達通過/^p調控表達，和莽草酸合成菌的發酵過程中培養基中的色氨酸含量偶聯，自然控制基因表達具有時間差異性，簡化了生產工藝中的操作。(4)基因的表達處於自動開關狀態，在中後期自動啟動，無需誘導物的誘導，減少了向培養基中添加有毒物質的可能性。


圖1為aroA同源替換序列DaroA PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳結果和aroA敲除菌株W3110 CAaroA)的PCR鑑定結果；其中DaroA長度為15%bp，W3110菌株PCR片段應為 1626bp，W3110 Oa/ZAarW)菌株PCR片段應為1838bp，卡那黴素抗性基因消除後的菌株 W3110 (AarW)PCR片段應為44^p。結果顯示DaroA長度正常且arW已經被敲除，抗性基因片段也已經消除。圖中泳道M :lkb Marker ；泳道1 :DaroA ；泳道2 菌株W3110 ；泳道3 菌株 W3110 (Aanjf AaroA)；泳道 4-5 菌株 W3110 (AaroA)；
圖2為pAR質粒構建過程中PCR產物和質粒酶切鑑定結果；其中泳道M Marker ； 泳道1 序列PCR產物；泳道2 :pACYC184質粒PCR產物；泳道3 質粒pAR飽Hin dill 單酶切圖譜；泳道4 質粒pAR的Hin dill和/ ^ I雙酶切圖譜；
圖3為質粒pAROl構建過程中PCR產物和酶切鑑定結果；圖中泳道M Marker ；泳道1 基因PCR產物；泳道2 終止子序列PCR產物；泳道3 ,ppsA與終止子序列連接PCR 產物；泳道4 質粒pAROl飽Bam HI單酶切結果；泳道5 質粒pAROl飽Bam HI和I雙酶切結果；
圖4為質粒pAR03構建過程中PCR產物和質粒pAR03酶切鑑定結果；圖中泳道Ml :100 bp Marker ；泳道 M2 :lkb Marker ；泳道 1 -.Ptrp 序列 PCR 產物；泳道 2 -.tktA 基因 PCR 產物； 泳道3 -.Ptrp與tktA基因連接PCR產物；泳道4 質粒pAR03飽Bam HI單酶切結果；泳道5 質粒pAR03飽Bam HI和/ OMI雙酶切結果；
圖5為質粒pAR17構建過程中PCR產物和質粒pAR17酶切鑑定結果；圖中泳道M Marker ；泳道1 ..aroB基因PCR產物；泳道2 -.aroD基因PCR產物；泳道3 ..aroB與aroD基因 PCR產物；泳道4 質粒pAR17飽Bam HI單酶切結果；泳道5 質粒pAR17飽Bam HI和fe^· I雙酶切結果；
圖6為質粒pAR31構建過程中PCR產物和質粒pAR31酶切鑑定結果；圖中泳道M Marker ；泳道1 -.aroE基因PCR產物；泳道2 添加RBS序列的aroE基因PCR產物；泳道3 質粒pAR31飽Bam HI單酶切結果；泳道4 質粒pAR31飽Bam HI和Sac I雙酶切結果；
圖7為質粒pAR63構建過程中PCR產物和質粒pAR63酶切鑑定結果；圖中泳道Ml IOObp Marker ；泳道1 -.Ptrp序列PCR產物；泳道2 -.aroG (前半部分)PCR產物；泳道3 -.aroG(後半部分)PCR產物；泳道4 -.Ptrp-aroG (前半部分)PCR產物；泳道5 -.Ptr~aro(fBR PCR產物； 泳道6 :pAR63飽Bam HI單酶切產物；泳道7 :pAR63飽Bam HI和Sph I雙酶切產物；泳道 M2 :lkb Marker ；
圖8為重組質粒pAR63的構建和結構示意圖9為實施例1中發酵法生產莽草酸的發酵過程中菌體濃度和莽草酸含量隨發酵時間的變化。
具體實施例方式以下通過實施例對本發明進行詳細說明，但本發明的保護範圍不限於此。實施例所用LB液體培養基組成為1%胰蛋白腖、1%氯化鈉和0. 5%酵母提取物；LB固體培養基組成為1%胰蛋白腖、1%氯化鈉、0. 5%酵母提取物和1. 5%瓊脂。實施例中所提到的製備或轉化等過程，如無特殊說明，則採用本領域的常規方法均可實現，故不再贅述。實施例1
一種莽草酸生產用基因工程菌株的構建方法，其包括以下步驟 一、構建arW基因敲除的大腸桿菌菌株W3110 (AaroA )；
Red重組技術的原理是將兩段含有目的基因同源序列的DNA片段導入宿主細菌，在重組酶的作用下，目的基因片段被其它片段替換從而完成目的基因的敲除工作。) a、通過PCR擴增獲得aroA同源替換序列DaroA ；
以質粒PKD4 (由中國科學院上海生命科學研究院提供)為模板，利用引物aroAF (見序列表中序列1)和aroAR (見序列表中序列2)，PCR擴增質粒pKD4中的h/Z基因。同源重組引物的5』端為目的基因兩側同源序列，3』端為抗性基因兩側序列，引物序列如下
AF 5' -atggaatccctgacgttacaacccatcgctcgtgtcgatggcactattaagtgtaggctggagctgc ttc-3，
AR 5' -tcaggctgcctggctaatccgcgccagctgctcgaaataatccggaaatgatgggaattagccatgg tcc-3，
PCR擴增條件為94°C預變性5min ；94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸2min，共循環30次。PCR結束後獲得長度為1596bp的DNA片段，瓊脂糖凝膠電泳回收該片段即為 DaroA，見圖1。所得PCR片段兩側為arM基因同源片段，中間部分為卡那抗性基因。PCR 片段進行瓊脂糖凝膠電泳純化後備用。) b、將質粒pKD46導入大腸桿菌菌株W3110 ；
參照分子克隆實驗指南第三版，製備W3110的化學感受態細胞，並以質粒pKD46 (由中國科學院上海生命科學研究院提供)轉化W3110菌株感受態細胞，30°C培養池後塗布於含 100 yg/mL氨苄青黴素(Amp)的LB固體培養基平板上，30°C過夜培養，能夠生長的轉化子即為含有PKD46質粒的大腸桿菌W3110菌株，挑選陽性轉化子保存備用。) C、誘導步驟b所得陽性菌株產生同源重組所需的酶，收穫菌體製備感受態細胞； 將步驟b獲得的陽性菌株接種於5mL氨苄抗性LB液體培養基(含100 μ g/mL Amp)中
於3(TC、200r/min過夜培養，次日接種ImL至IOOmL氨苄抗性LB液體培養基(含IOOyg/ mL Amp)中，30°C、200r/min培養至菌體濃度OD6tltl=O. 25時，加入L-阿拉伯糖至終濃度為 30mmol/L，誘導至OD6tltl=O. 6，參照分子克隆實驗指南第三版，收穫細胞製備電擊轉化感受態細胞。) d、通過電擊轉化將步驟a獲得的同源替換序列DaroA導入步驟c獲得的感受態細胞，得到arM基因被替換的菌株；
取5 μ L步驟a所得的PCR產物DaroA加至50 μ L步驟c製得的感受態細胞中，冰上放置5分鐘後轉入2mm的電擊杯中，進行電擊(電擊條件為200 Ω，25 μ F，電壓2. 5kV，電擊時間4-5ms)。電擊後加入950 μ L LB液體培養基中，150r/min，37°C培養濁，12000 X g離心 lmin，棄去上層800 μ L上清液，剩餘細胞輕輕重懸後塗於卡那抗性LB固體培養基平板(含 10 yg/mL卡那黴素)上37°C過夜培養。能夠生長的轉化子即為敲除arW基因的菌株，挑選陽性轉化子保存備用，記為W3110 ikarf AarW)菌株。) e、使用pCP20質粒消除步驟d所得菌株的抗性基因片段，得到arM基因敲除菌株。將質粒pCP20 (由中國科學院上海生命科學研究院提供)轉入上述步驟d獲得的陽性克隆中，30°C培養，挑出同時具有卡那抗性和氨苄抗性的克隆，接種於LB液體培養基中， 300C，200r/min培養8h，然後將溫度提高到42°C，此時FLP重組酶(F1 ipase recombination enzyme，翻轉酶重組酶)開始表達，催化FRT (Flp recombination target，翻轉酶重組位點) 位點之間抗性基因片段的消除，質粒PCP20由於停止複製而逐漸丟失。將菌液稀釋後塗布於LB固體培養基平板，挑選單菌落接種於卡那抗性LB固體培養基平板(含10 μ g/mL卡那黴素)上，無法生長的菌落為抗性基因消除的菌株。arM基因敲除菌株以W3110 (AaroA) 表不。所得菌株(包括W3110 OazZzlarf^ )和W3110 (ZlaroJ ))分別以DF (見序列表中序列3)和DR (見序列表中序列4)為引物進行PCR鑑定，W3110菌株為對照。引物序列如下 DF :5，-tcatggttgagttcgaacgccgtc-3，；DR :5，-gtgggtattttgacaccctgtcag-3，；
PCR擴增條件為95°C預變性5min ；94°C變性30s，50°C退火30s，72°C延伸2min，共循環30次。以不同菌株為模板所獲得的DNA片段長度是不同的，由此可判斷是否從基因組中敲除arW基因，結果見圖1，因此判定最後獲得的菌株即為五coli W3110 (zlarW)，保存二、構建含有莽草酸代謝途徑中的關鍵酶基因arof-(該基因不受苯丙氨酸反饋抑制)^^^^^^^、^^々、^「和的重組表達質粒pAR63，其構建和結構示意圖見圖8 ；
2. 1 pAR質粒的構建
以trpRF (序列表中序列5)和trpRR (序列表中序列6)為引物，菌株W3110基因組為模板進行PCR擴增ir/7/P完整序列，凝膠回收後備用，引物序列如下 trpRF 5' -gcgctgcaggtcggatccacgtcgttactgatccgcac-3'； trpRR :5，-gggaagcttccacgtcttatcaggcctac-3，；
PCR擴增條件為94°C預變性^iin ；94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，共循環 30次。PCR結束後獲得長度為480bp的DNA片段，結果見圖2。以pAF (序列表中序列7)和pAR (序列表中序列8)為引物，質粒pACYC184 (由中國科學院上海生命科學研究院提供)為模板進行PCR擴增質粒片段，凝膠回收後備用。引物序列如下
ρAF 5' -gcgctgcagggcctcaggcatttgagaag-3'；
8pAR 5' -ttaaagcttatcgatgataagctgtc-3『；
PCR擴增條件為94°C預變性^iin ；94°C變性30s，52°C退火30s，72°C延伸aninl5s，共循環30次。PCR結束後獲得長度為2197bp的DNA片段，結果見圖2。將上述兩種DNA片段分別用歷dill和I雙酶切後進行凝膠回收，然後使用 T4 DNA連接酶連接兩片段。連接產物轉化ToplO感受態細胞(購自南京賽泓瑞生物科技有限公司)，在含20 μ g/mL氯黴素的LB固體培養基平板上篩選陽性菌株，所得質粒即為pAR 質粒。所得pAR質粒採用單酶切(Mn dill)和雙酶切(Mn dill和Ai I)鑑定，瓊脂糖凝膠電泳圖見圖2。將ppsA基因導入pAR質粒
採用ppsAF (見序列表序列9)和ppsAR (見序列表序列10)為引物，菌株W3110基因組為模板進行PCR擴增得到片段1，回收備用。引物序列如下
ppsAF 5' -catggatccctcgggcccatgtgtttctcaaaccgttc-3'； ppsAR 5' -gccgccaggcaaattctgtttttatttcttcagttcagcc-3'； PCR擴增條件為94°C預變性^iin ；94°C變性30s，62°C退火30s，72°C延伸anin30s，共循環30次。PCR結束後獲得長度為M60bp的DNA片段，結果見圖3。採用TerF (見序列表序列11)和TerR (見序列表序列12)為引物，W3110基因組為模板進行PCR擴增得到片段2，回收備用。引物序列如下
TerF 5' -ggctgaactgaagaaataaaaacagaatttgcctggcggc-3'； TerR 5' -gcgctgcagaagagtttgtagaaacgcaaaaaggccatc-3'；
PCR擴增條件為94°C預變性^iin ；94°C變性30s，62°C退火30s，72°C延伸40s，共循環 30次。PCR結束後獲得長度為382bp的DNA片段，結果見圖3。在20 μ L PCR反應體系(反應體系含有0. 5U Taq DNA聚合酶，1 X Taq DNA聚合酶緩衝液，lmmol dNTPs)中，不加入引物，加入上述得到的片段1和片段2各2μ L，進行10次循環反應。然後加入引物PPsAF和TerR至濃度為0. 5 μ mol，進行30次循環反應，得到DNA 片段3，回收備用。PCR 擴增條件為94°C預變性 ^iin ；94°C變性 30s，62°C退火 45s，72°C延伸 3min， 共循環10次；94°C變性30s，62°C退火30s，72°C延伸3min，共循環30次。PCR結束後獲得長度為^03bp的DNA片段，結果見圖3。用3m HI和Ai I雙酶切質粒pAR和DNA片段3，然後用T4 DNA連接酶連接兩片段，轉化ToplO感受態細胞，篩選到陽性克隆，所得質粒為pAROl。所得質粒pAROl分別進行單酶切(Mam HI)和雙酶切鑑定(Mm HI和Pst I),鑑定結果見圖3。將tktA基因導入pAROl質粒
採用PtrpF (見序列表序列13)和PtrpR (見序列表序列14)為引物，菌株W3110基因組為模板進行PCR擴增得到片段1，回收備用。引物序列如下 PtrpF :5，-catggatccctccggccgcggttctggcaaatattc-3，； PtrpR -gcaagctctttacgtgaggacattgtcgataccctttttacg-S'； PCR擴增條件為94°C預變性^iin ；94°C變性30s，61°C退火30s，72°C延伸30s，共循環30次。PCR結束後獲得長度為132bp的DNA片段，結果見圖4。採用tktAF (見序列表序列15)和tktAR (見序列表序列16)為引物，W3110基因組為模板進行PCR擴增得到片段2，回收備用。引物序列如下
tktAF 5' -cgtaaaaagggtatcgacaatgtcctcacgtaaagagcttgc-3'； tktAR 5' -ctcgggcccttacagcagttcttttgctttcgcaac-3'；
PCR擴增條件為94°C預變性^iin ；94°C變性30s，61°C退火30s，72°C延伸2min，共循環30次。PCR結束後獲得長度為2019bp的DNA片段，結果見圖4。在20 μ L PCR反應體系(反應體系含有0. 5U Taq DNA聚合酶，1 X Taq DNA聚合酶緩衝液，lmmol dNTPs)中，不加入引物，加入上述兩種片段1和片段2各2μ L，進行10次循環反應。然後加入引物PtrpF和tktAR，進行30次循環反應，得到DNA片段3，回收備用。PCR 擴增條件為94°C預變性 ^iin ；94°C變性 30s，62°C退火 30s，72°C延伸 2min， 共循環10次；94°C變性308，611退火308，721延伸anin30s，共循環30次。PCR結束後獲得長度為2110bp的DNA片段，結果見圖4。以Bam HI和/ OMI雙酶切質粒pAROl和DNA片段3，然後用T4 DNA連接酶連接兩片段，連接產物轉化ToplO感受態細胞，篩選到陽性克隆，所得質粒為pAR03。所得pAR03質粒分別採用單酶切(Mm HI)和雙酶切(Main HI和Psp OMI)進行鑑定，結果見圖4。將aroB和aroD基因導入pAR03質粒
以aroBF (見序列表序列17)和aroBR (見序列表序列18)為引物，W3110基因組為模板進行PCR，得到片段1，凝膠回收後備用。引物序列如下 aroBF :5，-gcgccatggagaggattgtcgttact-3，； aroBR :5，-tgcgctagcttgttgttacgctgattgac-3，；
PCR擴增條件為94°C預變性^iin ；94°C變性30s，53°C退火30s，72°C延伸lminl5s，共循環30次。PCR結束後獲得長度為IlOSbp的DNA片段，結果見圖5。以Afco I^WNhe I分別酶切片段1和pED8a+質粒(購自Novagen公司)，以T4 DNA 連接酶連接兩片段，得到質粒pET28a-ari^。以aroDF (見序列表序列19)和aroDR (見序列表序列20)為引物，W3110基因組為模板進行PCR，得到片段2，凝膠回收後備用。引物序列如下
aroDF :5，-cgggctagcgtaacagggtgatcatgag-3，； aroDR :5，-catcggccgcctgatgcttcgtatttacg-3，；
PCR擴增條件為94°C預變性^iin ；94°C變性30s，退火30s，72°C延伸lmin30s，共循環30次。PCR結束後獲得長度為1260bp的DNA片段，結果見圖5。以Nhe I和Eag I分別酶切片段2和質粒pEI^8a_aroB，用T4 DNA連接酶連接兩片段，得到質粒pET28a-aroB-aroD。以aroBFL (見序列表序列21)和aroDR (見序列表序列20)為弓丨物， PET28a-aroB-aroD為模板進行PCR，得到片段3，凝膠回收備用。引物序列如下
aroBFL -Ctgggatcccatgagctcttaactttaagaaggag-S'； aroDR -catcggccgcctgatgcttcgtatttacg-S'；
PCR擴增條件為94°C預變性^iin ；94°C變性30s，56°C退火30s，72°C延伸anin30s，共
10循環30次。PCR結束後獲得長度為M06bp的DNA片段，結果見圖5。以Bam HI和Eag I分別酶切片段3和質粒pAR03，以"Γ4 DNA連接酶連接兩片段， 得到質粒質粒PAR17。所得質粒分別採用單酶切(Meim HI)和雙酶切(Mm HI和Eeig I)進行鑑定，結果見圖5。將aroE基因導入pAR17質粒
以aroEF (見序列表序列22)和aroER (見序列表序列23)為引物，W3110基因組為模板，進行PCR得到片段1，凝膠回收備用。引物序列如下 aroEF :5，-ctggccatggaaacctatgctg-3，； aroER :5，-cgcgagctcacgcggacaattcctc-3，；
PCR擴增條件為94°C預變性^iin ；94°C變性30s，49°C退火30s，72°C延伸lmin，共循環30次。PCR結束後獲得長度為831bp的DNA片段，結果見圖6。以Afco I和I分別酶切片段1和pEI^8a+質粒，以"Γ4 DNA連接酶連接兩片段， 得到質粒pET28a-arof。WaroEFL (見序列表序列Μ)和aroERR (見序列表序列25)為引物，pET28a_aro萬為模板進行PCR，得到片段2，凝膠回收備用。引物序列如下
aroEFL 5' -ctgggatcccatgcatgcttaactttaagaaggag-3'； aroERR :5，-acggagctcacgcggacaattcctcctgcaattgc-3，；
PCR擴增條件為94°C預變性^iin ；94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸lmin，共循環30次。PCR結束後獲得長度為867bp的DNA片段，結果見圖6。以Bam HI和Sac I分別酶切片段2和質粒pAR17，以"Γ4 DNA連接酶連接兩片段， 得到質粒PAR31。 所得質粒pAR31分別採用單酶切(Mam HI)和雙酶切(Mm HI和Sac I)進行鑑定， 結果見圖6。構建aro(fM基因並導入pAR31質粒
以PtrpFl (見序列表序列26)和PtrpRl (見序列表序列27)為引物，W3110基因組為模板，進行PCR得到片段1，凝膠回收備用。引物序列如下
PtrpFl 5' -catggatcccggttctggcaaatattctgaaatgag-3'； PtrpRl 5' -cgtcgttctgataattcattgtcgataccctttttac-3'；
PCR擴增條件為94°C預變性^iin ；94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸30s，共循環 30次。PCR結束後獲得長度為119bp的DNA片段，結果見圖7。以aroGLF (見序列表序列28)和aroGLR (見序列表序列29)為引物，W3110基因組為模板，進行PCR得到片段2，凝膠回收備用。引物序列如下
aroGLF 5' -gtaaaaagggtatcgacaatgaattatcagaacgacg-3'； aroGLR :5，-atttttgaagccgaccggacaaaaaagccctgatgccagttcg-3，； PCR擴增條件為94°C預變性^iin ；94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸lmin，共循環30次。PCR結束後獲得長度為581bp的DNA片段，結果見圖7。以aroGRF (見序列表序列30)和aroGRR (見序列表序列31)為引物，W3110基因組為模板，進行PCR得到片段3，凝膠回收備用。引物序列如下aroGRF 5' -cgaactggcatcagggcttttttgtccggtcggcttcaaaaat-3'； aroGRR :5，-cgcgcatgcttacccgcgacgcgcttttactgcat-3，；
PCR擴增條件為94°C預變性^iin ；94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸lmin，共循環30次。PCR結束後獲得長度為的DNA片段，結果見圖7。在20 μ L PCR反應體系(反應體系含有0. 5U Taq DNA聚合酶，1 X Taq DNA聚合酶緩衝液，lmmol dNTPs)中，不加入引物，加入上述片段1和片段2各2μ L，進行10次循環反應。然後加入引物PtrpFl和aroGLR至終濃度為0. 5 μ mol，進行30次循環反應，得到DNA 片段4，回收備用。PCR 擴增條件為94°C預變性 ^iin ；94°C變性 30s，63°C退火 30s，72°C延伸 lmin， 共循環10次；94°c變性30s，6(TC退火30s，72°C延伸lmin，共循環30次。PCR結束後獲得長度為661bp的DNA片段，結果見圖7。在20 μ L PCR反應體系(反應體系含有0. 5U Taq DNA聚合酶，1 X Taq DNA聚合酶緩衝液，lmmol dNTPs)中，不加入引物，加入上述片段3和片段4各2 μ L，進行10次循環反應。然後加入引物PtrpFl和aroGRR至終濃度為0. 5 μ mol，進行30次循環反應，得到DNA 片段5，回收備用。PCR 擴增條件為94°C預變性 ^iin ；94°C變性 30s，64°C退火 30s，72°C延伸 lmin， 共循環10次；94°c變性30s，60°C退火30s，72°C延伸90s，共循環30次。PCR結束後獲得長度為1162bp的DNA片段，結果見圖7。用Bern HI和Sph I分別酶切片段5和質粒pAR31，用T4 DNA連接酶連接兩片段， 得到質粒PAR63。質粒pAR63即為最終構建成功的載體。所得質粒pAR63分別採用單酶切(Mam HI)和雙酶切(Mm HI和Sph I)鑑定，結果見圖7。三、將重組表達質粒pAR63轉入已敲除arW基因的大腸桿菌菌株W3110(AarW)， 獲得表達莽草酸的生產菌株。生產菌株可以通過流加葡萄糖方式溶氧控制發酵來製備莽草酸。(1)構建目的工程菌株
參考分子克隆實驗指南第三版化學法製備大腸桿菌感受態和轉化外源基因的方法將質粒pAR63轉入菌株￡. coli W3110 (AaroA )，得到目的工程菌株￡. coli W3110 (AaroA ) pAR63。(2)發酵法生產莽草酸
將構建成功的目的工程菌株五coli W3110 (A3rW)pAR63進行斜面活化，接種於LB 液體培養基中，370C，220r/min培養至OD6tltl ^ 2時，接種於5L發酵罐中，發酵罐裝料2. 4L。 發酵培養基組成為葡萄糖15g，酵母提取物lg，K2HPO4 8g，一水檸檬酸2. 5g, L-Phe 0. 7g， L-Tyr 0. 7g, L-Trp 0. 7g, MgSO4 0. 24g, H3BO3 0. 0247g, ZnSO4 · 7H20 0. 0029g, CuSO4 · 5H20 0. 0025g，MnCl ·4Η20 0. 0158g，對羥基苯甲酸0. 010g，對氨基苯甲酸0. 010g，2，3-二羥基苯甲酸0.010g。發酵溫度37°C，初始攪拌轉速50r/min，初始通氣量1:0. 1 (即發酵液體積 每分鐘通入的無菌空氣量=10)。開始先通過控制轉速將溶氧控制在30%，當轉速達到最高 800r/min時，通過調整通氣量控制溶氧在20%，當通氣量達到1 1時，通過流加60%葡萄糖控制溶氧在10%-15%。
發酵過程中每隔池取樣，檢測發酵液中的莽草酸含量和菌體濃度。莽草酸含量檢測方法將發酵液用硫酸調至PH值為2. 0後於80°C加熱20min，然後按照分光光度法檢測莽草酸含量，具體為取少量前述處理過的發酵液離心，將離心所得上清液適當稀釋後，取 ImL稀釋過的上清液，加入ImL含0. 5%高碘酸和0. 5%偏高碘酸鈉的水溶液，於37°C反應 30min後，加入2mL含3g/L亞硫酸鈉和0. 6mol/L氫氧化鈉的水溶液終止反應，在Ih內讀取反應液在382nm處的吸光值。同時利用莽草酸標準品製作標準曲線，對照標準曲線即可得到吸光值所對應的莽草酸含量。菌體濃度採用比濁法在600nm波長處測定吸光值來檢測。發酵5 時，發酵液中莽草酸含量達到43g/L。發酵過程中菌體濃度和莽草酸含量隨發酵時間的變化見圖9。實施例2發酵法生產莽草酸
將構建成功的目的工程菌株五coli W3110 (A3rW)pAR63進行斜面活化，接種於LB 培養基中，37°C，220r/min培養至OD600 ^ 2時，接種於5L發酵罐中，發酵罐裝料2. 4L，發酵培養基為葡萄糖15g，酵母提取物lg, K2HPO4 8g，一水檸檬酸2. 5g，L-Phe 0. 7g，L-Tyr 0. 7g, L-Trp 0. 7g,MgSO4 0. 24g,H3BO3 0. 0247g，ZnSO4 ·7Η20 0. 0029g，CuSO4 ·5Η20 0. 0025g, MnCl · 4H20 0. 0158g，對羥基苯甲酸 0. 010g，對氨基苯甲酸0. 010g，2，3-二羥基苯甲酸 0.010go發酵溫度37°C，初始攪拌轉速50r/min，初始通氣量1:0. 1。開始通過控制轉速將溶氧控制在30%，當轉速達到最高800r/min時，通過調整通氣量控制溶氧在20%，當通氣量達到1:1時，通過流加60%葡萄糖控制同樣在10%-15%。每隔池取樣檢測莽草酸含量和菌體濃度(檢測方法同上)。發酵60h時，發酵液中莽草酸含量達到Mg/L。實施例3發酵法生產莽草酸
將構建成功的目的工程菌株五coli W3110 (A3rW)pAR63進行斜面活化，接種於LB 培養基中，37°C，220r/min培養至OD600 ^ 2時，接種於5L發酵罐中，發酵罐裝料2. 4L，發酵培養基為葡萄糖15g，酵母提取物lg, K2HPO4 8g，一水檸檬酸2. 5g，L-Phe 0. 7g，L-Tyr 0. 7g, L-Trp 0. 7g,MgSO4 0. 24g,H3BO3 0. 0247g，ZnSO4 ·7Η20 0. 0029g，CuSO4 ·5Η20 0. 0025g, MnCl · 4H20 0. 0158g，對羥基苯甲酸 0. 010g，對氨基苯甲酸0. 010g，2，3-二羥基苯甲酸 0.010go發酵溫度37°C，初始攪拌轉速50r/min，初始通氣量1:0. 1。開始通過控制轉速將溶氧控制在30%，當轉速達到最高800r/min時，通過調整通氣量控制溶氧在20%，當通氣量達到1:1時，通過流加60%葡萄糖控制同樣在10%-15%。每隔池取樣檢測莽草酸含量和菌體濃度(檢測方法同上)。發酵4 時，發酵液中莽草酸含量達到36g/L。
權利要求
1.一種莽草酸生產用基因工程菌株的構建方法，其特徵在於，包括以下步驟 ①構建arM基因敲除的大腸桿菌菌株；②構建含有莽草酸代謝途徑中的關鍵酶基因aro(fB\ aroE、aroB、aroD、tktA和的重組表達質粒pAR63 ；③將重組表達質粒pAR63 轉入已敲除arM基因的大腸桿菌菌株，獲得表達莽草酸的生產菌株。
2.如權利要求1所述莽草酸生產用基因工程菌株的構建方法，其特徵在於，步驟①包括a、通過PCR擴增獲得aroA同源替換序列DaroA ；b、將質粒pKD46導入大腸桿菌菌株W3110；c、誘導步驟b所得陽性菌株產生同源重組所需的酶，收穫菌體製備感受態細胞；d、通過電擊轉化將步驟a獲得的同源替換序列DaroA導入步驟c獲得的感受態細胞， 得到arM基因被替換的菌株；e、使用pCP20質粒消除步驟d所得菌株的抗性基因片段，得到arM基因敲除菌株。
3.如權利要求1所述莽草酸生產用基因工程菌株的構建方法，其特徵在於，步驟②包括a、基於質粒pACYC184構建包含ir/77 基因的改造載體pAR；b、構建抗反饋抑制的arof-基因，並在基因前加上色氨酸啟動子/^ C、克隆aroB和aroE基因，並為其添加核糖體結合位點RBS ；d、克隆基因tktA、PPsA和aro々，並在tktA前加上色氨酸啟動子/^P，在你M後面加上轉錄終止子；e、將各基因按照Ptrp、aro(fB\aroE、aroB、aroD、Ptrp、tktA、ppsA和轉錄終止子的順序連接至PAR質粒，構成pAR63質粒。
4.如權利要求3所述莽草酸生產用基因工程菌株的構建方法，其特徵在於，所述重組表達質粒PAR63中含有色氨酸啟動子阻遏蛋白基因ir/77 ，且ir/7/P帶有自身啟動子。
5.如權利要求3所述莽草酸生產用基因工程菌株的構建方法，其特徵在於，所述重組表達質粒PAR63中所含的/基因下遊序列為轉錄終止子序列；所述重組表達質粒PAR63 中所含的tktA基因上遊序列為色氨酸啟動子序列；所述重組表達質粒pAR63中所含的 aroB和aroE基因上遊序列均含有RBS序列；所述重組表達質粒pAR63中所含的aroD基因帶有自身RBS序列；所述重組表達質粒pAR63中所含的aroi1^基因上遊序列為色氨酸啟動子序列，aroi/^是由aroG基因的180位點定點突變為Phe而獲得。
6.如權利要求5所述莽草酸生產用基因工程菌株的構建方法，其特徵在於，所述轉錄終止子序列為rraS轉錄終止子序列。
全文摘要
本發明公開了一種莽草酸生產用基因工程菌株的構建方法，其包括以下步驟①構建aroA基因敲除的大腸桿菌菌株；②構建含有莽草酸代謝途徑中的關鍵酶基因aroGFBR、aroE、aroB、aroD、tktA和ppsA的重組表達質粒pAR63，且這些基因均處於色氨酸啟動子Ptrp的轉錄控制下；③將重組表達質粒pAR63轉入已敲除aroA基因的大腸桿菌菌株，獲得表達莽草酸的生產菌株。本發明方法通過敲除aroA單基因實現中斷莽草酸代謝的目的，敲除基因少，操作難度小，基因的表達處於自動開關狀態，在中後期自動啟動，無需誘導物的誘導，減少了向培養基中添加有毒物質的可能性，莽草酸產量高。
文檔編號C12N15/70GK102304539SQ20111024867
公開日2012年1月4日 申請日期2011年8月26日 優先權日2011年8月26日
發明者喬娟平, 任存邦, 葉曉衝, 孟軍虎, 張蘊才, 李曉霞, 武廣君, 王娜, 王春陽, 石玲瓏, 董建輝 申請人:河南孟成生物藥業股份有限公司