在高離子強度的溶液中形成DOPA黑素的製作方法
2023-06-04 10:57:50 2
本申請要求於2014年3月25日提交的美國臨時申請號61/969920的優先權，該文的全部內容通過引用納入本文用於所有目的。
關於聯邦資助研究或開發的聲明
本發明是在政府支持下由美國國立衛生研究院授予的基金號R37DE014193資助完成的。政府對本發明擁有某些權利。
發明領域
本發明總體上涉及聚合顆粒和塗層。更具體而言，本發明涉及作為表面塗層或不溶性顆粒在高離子強度的溶液中自發形成的DOPA黑素(DOPA-melanin)聚合物。
背景技術：
黑素在自然界中廣泛存在，提供著色、光保護、抗氧化、金屬粘合以及其它生物學性質。黑素的一種重要亞類是真黑素，其由酪氨酸經由一種涉及3,4-二羥基苯丙氨酸(DOPA)的氧化、分子內環化、低聚和聚集以形成不溶性和非均相固體的路徑形成。研究真黑素的動力部分來自於對於理解生物功能意義上的結構—性質關係的興趣，但也來自於日益增加的對於黑素薄膜的有趣的光、電性質和技術應用的興趣。
合成的和天然的黑素不溶於許多溶劑，該性質代表了將黑素處理成諸如薄膜這樣的有用形式中的挑戰。過去，類黑素的薄膜在基材上的沉積已通過溶液澆鑄、(電)噴塗、旋塗、電化學沉積以及脈衝雷射沉積實現。除了通常需要黑素在有機溶劑或水性NaOH或氨中能夠溶解以外，大部分已報告的方法都是視線法(line-of-sight)，它們需要精密的裝置，採用複雜多步方案，或者只能夠在導電基材上實施。由於這些限制，仍然非常需要用於黑素薄膜沉積的簡單而多用途的方法。不需要眾多基礎設施且能夠適應多種基材組合物、形狀和構造的用於形成黑素薄膜的方法會加快這種令人感興趣的仿生材料的實際應用的發展。
美國專利公開號2008/0149566(該文通過引用納入本文用於所有用途)公開了一種用類黑素塗層對表面進行改性的簡單而多用途的方法，該方法包括將基材浸塗入富含DOPA的貽貝黏著蛋白質的兒茶酚胺模擬物(例如多巴胺)的水溶液中。多巴胺在溫和的鹼性和充氣水溶液中經歷自發的自氧化，以在幾乎任意基材上形成粘附性聚多巴胺(PDA)膜。PDA也被稱為多巴胺-黑素，因其與真黑素的化學相似性而能作為導致諸如生物分子固定、表面能改性、生物礦化以及生物傳感這樣的多種應用的進一步改性的引物發揮作用。還可使感興趣的分子與多巴胺在一步反應中同時共沉積，以形成具有所需性質的表面。
多巴胺和其它兒茶酚胺的若干種衍生物以相似的方式聚合在種類廣泛的基材之上。例如，去甲腎上腺素顯示為聚合入粘附膜中，其具有因存在未在多巴胺中發現的羥基而引發ε-己內酯的開環聚合的附加能力。使DOPA黑素(DM)膜以與PDA相似的方式自發聚合在各種基材之上會令人感興趣，因為這會進一步加速類真黑素薄膜的技術應用。相比於PDA，會期望DM展現出更高濃度的可用於各種應用中的游離羧酸。
然而，以往的關於DOPA在水或低離子強度緩衝溶液中的鹼性自氧化的報告得到了一種類黑素產物，它是可溶的，或者是溶液穩定的超分子納米聚集體。本領域技術人員在使用為PDA膜的自發形成(緩衝的充氣H2O，pH為8～9)而開發的標準條件由DOPA形成粘附膜時遇到過困難。原位生長的DM膜在使用多巴胺的條件下顯示為只形成了10nm或更薄的厚度，而在該條件下通常會形成厚得多的膜。因此，相比於PDA，利用DOPA的自發性氧化使DM膜生長在基材上要困難得多。
所以，本領域需要用於生產用於各種應用中的DM膜和顆粒的改善的方法。
技術實現要素：
我們在本文中所要公開的是，DM膜在高離子強度下以簡單方式進行的自發性原位自氧化沉積。厚的粘附性DM膜在包括金屬氧化物、貴金屬和聚合物在內的種類廣泛的基材上形成。DM膜不但具有許多PDA膜的令人滿意的特徵，還具有一些優勢，即更高的親水性以及靜電結合和釋放陽離子的能力。上述性質中的後者可用於通過由DM膜負載和釋放陽離子型氨基糖苷來製造抗菌塗層。
我們在本文中還公開了高離子強度的鹼性緩衝溶液可被用於在不需要表面基材的條件下使DOPA自氧化，得到5,6-二羥基吲哚羧酸(DHIC)含量高的呈不溶性顆粒狀的DOPA黑素(DM)。這些顆粒具有對金屬離子的高結合能力，結合程度與溶液中所包含的鹽的種類和濃度相關。因此，所得到的DM顆粒還可被用於重金屬整治等。
所以，在第一個方面中，本發明包括一種合成DOPA黑素(DM)聚合物的方法。該方法包括在氧化條件下使具有下式的反應物與高濃度的鹽的水溶液接觸：
其中，R1、R3、R4和R5各自獨立地選自C1～3的烷基、伯胺、仲胺、滷化物、氫、羥基、羧酸、醛、羧酸酯或羧醯胺；其中，R1、R3、R4和R5中的至少一種為伯胺或仲胺；其中，x在0～3的範圍內，且y在0～3的範圍內，前提是x或y至少為1；其中，R2為羧酸。作為實施該方法的結果，形成了DOPA黑素(DM)聚合物。
在一些實施方式中，x和y各自為1，R2為-COOH，且R5為-NH2。在一些這樣的實施方式中，反應物為3,4-二羥基苯丙氨酸(DOPA)。
在一些實施方式中，鹽的水溶液中鹽的濃度大於100mM。可選地，鹽的濃度大於200mM或大於500mM。
在一些非限定性的示例性實施方式中，所使用的鹽為鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽或鈣鹽。在一些實施方式中，鹽的水溶液為鹼性溶液。
在一些實施方式中，該方法還包括使反應物和高濃度的鹽的水溶液與表面接觸的步驟。作為實施該步驟的結果，DM塗層或膜在該表面上形成。
在一些這樣的實施方式中，DM塗層自發地在表面上形成。在另一些這樣的實施方式中，DM塗層的厚度大於10nm。在另一些這樣的實施方式中，表面包括帶負電荷的基材。
在一些實施方式中，所形成的DM聚合物是不溶性顆粒的形式。
在第二個方面中，本發明包括通過實施上述方法而形成的DOPA黑素(DM)聚合物
在一些實施方式中，DM聚合物包含殘留的羧酸部分。
在一些實施方式中，DM聚合物是基材表面上的塗層的形式。在一些這樣的實施方式中，塗層的厚度大於10nm。在另一些這樣的實施方式中，基材表面是醫療裝置的表面。
在一些實施方式中，DM聚合物還包含在所述聚合物上捕獲的重金屬離子或陽離子型藥物。在一些這樣的實施方式中，陽離子型藥物為陽離子型氨基糖苷。
在一些實施方式中，DM聚合物是不溶性顆粒的形式。
在第三個方面中，本發明包括一種減少流體中金屬離子數量的方法。該方法包括使上述DOPA黑素(DM)聚合物與包含一種或多種金屬離子的流體接觸的步驟。結果是，DM聚合物結合至所述金屬離子中的至少一種，從而降低所述流體中金屬離子的數量。在一些實施方式中，所述一種或多種金屬離子可以是Pb2+、Cd2+、Cu2+和Hg2+。
在第四個方面中，本發明包括一種遞送陽離子型藥物的方法。該方法包括以下步驟：(a)使上述DOPA黑素(DM)聚合物與一種或多種陽離子型藥物接觸，以使所述陽離子型藥物可逆地結合至所述DM聚合物；和(b)從所述DM聚合物釋放所述陽離子型藥物。
在一些實施方式中，陽離子型藥物為陽離子型氨基糖苷。可使用的示例性氨基糖苷包括但不限於慶大黴素、卡那黴素、阿米卡星、妥布黴素、地貝卡星、阿貝卡星、西索米星、奈替米星、新黴素和鏈黴素。
在第五個方面中，本發明包括一種用於合成DOPA黑素(DM)聚合物的試劑盒。這種試劑盒包含：a)具有下式的反應物：
其中，R1、R3、R4和R5各自獨立地選自C1～3的烷基、伯胺、仲胺、滷化物、氫、羥基、羧酸、醛、羧酸酯或羧醯胺；其中，R1、R3、R4和R5中的至少一種為伯胺或仲胺；其中，x在0～3的範圍內，且y在0～3的範圍內，前提是x或y至少為1；其中，R2為羧酸；其中，x在0～10的範圍內，且y在0～10的範圍內，前提是x或y至少為1；b)金屬鹽；和c)用法說明。
在一些實施方式中，金屬鹽可以是鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽或鈣鹽。在一些實施方式中，該試劑盒還包含鹼性緩衝溶液。
在一些實施方式中，該試劑盒還包含待被DM聚合物塗布的基材表面。在一些這樣的實施方式中，基材表面是醫療裝置的表面。
在說明書和權利要求中，術語「包括」和「包含」是開放式的術語，應當被理解為表示「包括但不限於……」。這些術語包含限制性更強的術語「基本上由……組成」以及「由……組成」。
附圖說明
圖1是圖示通過在高離子強度下的鹼性DOPA溶液中進行簡單的浸塗來形成保形的DOPA黑素膜的示意圖。
圖2.在8.5的pH值下形成DM膜。(A)16小時後的NaCl濃度對DM膜厚度的影響。(B)DM膜(250mM的NaCl)隨時間的生長。多巴胺氧化的反應方案I(A)和II(B)。
圖3.由以下條件得到的PDA在16小時後的厚度：5mM的多巴胺在10mM的N,N-二羥乙基甘氨酸中，pH為8.5，含有0或250mM的NaCl。
圖4.由以下條件得到的PDA膜的生長隨時間的變化：5mM的多巴胺、250mM的NaCl、10mM的N,N-二羥乙基甘氨酸，pH為8.5。
圖5.用DM塗布了0～3次的PC基材的照片。各塗布循環為20小時，由以下條件得到：5mM的多巴胺、250mM的NaCl、10mM的N,N-二羥乙基甘氨酸，pH為8.5。指出了塗層的厚度。
圖6.塗布有DM(158nm厚，雙面)的PC基材的寬帶吸收光譜。
圖7.沉積在Au上的PDA和DM膜的衰減全反射-傅立葉變換紅外光譜，其顯示COO-(1600cm-1處的非對稱伸縮)和COOH(1700～1730cm-1處的C＝O伸縮)存在於DM而非PDA中。
圖8.DM膜的表面形貌和潤溼性質。(A)形成在TiO2上的23nm厚的DM經過16小時後的掃描電子顯微鏡(SEM)圖像。(B)形成在各種基材上的DM和PDA經過16小時後的前進水接觸角。*表示角度小於10°。(C)分別在原始PC、塗布有PDA的PC和塗布有DM的PC上的前進水滴的圖像。
圖9.基於目前對於黑素合成的理解而設想的DM膜的形成路徑，其中的最終產物由具有各種可能的鍵和氧化態的DHICA與DHI亞單位的混合物組成。
圖10.陽離子型抗菌化合物與DM膜的結合以及從DM膜上釋放。(A)DM或PDA暴露在H2O或GM溶液中16小時後的厚度改變百分比。(B)4小時中從PC/DM/GM上釋放的GM。(C)PC/DM/GM的4小時的GM釋放量隨DM膜厚度的變化關係。(D)塗布有DM/GM(上圖)或PDA/GM(下圖)的PC經過18小時的培養後的金黃色葡萄球菌抑制區。(E)顯示浮遊態金黃色葡萄球菌在塗布有PDA和DM的PC中暴露4小時之後的倖存率的死亡試驗。
圖11.利用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測得的從H2O、羥乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES，10mM，pH為7.4)、HEPES加NaCl(150mM)、HEPES加NaCl和MgCl2(0.814mM)、HEPES加NaCl和CaCl2(1.8mM)以及杜爾伯科極限必需培養基(DMEM，155mM的Na+、0.814mM的Mg2+、1.8mM的Ca2+)中的DM/GM塗層釋放的慶大黴素的釋放量。(*和**分別表示p＜0.05和p＜0.01。)
圖12.DM的形成與PDA的形成的比較，顯示DM含有DHICA和DHI亞單位，而PDA只含有DHI亞單位。
圖13.在pH為8.5的具有不同的NaCl濃度的10mM的N,N-二羥乙基甘氨酸緩衝溶液中的5mM的DOPA的光學顯微照片。
圖14.使用500mM的NaCl、N,N-二羥乙基甘氨酸緩衝溶液形成的PDA的SEM(上面一排圖)和DM的SEM(下面一排圖)。
圖15.黑素樣品在鹼性過氧化物降解試驗之後在269nm處進行檢測的高效液相色譜(HPLC)分析。所示標準含有在7.9分鐘時洗脫的1μg/mL的PDCA和在10.2分鐘時洗脫的1μg/mL的PTCA。各樣品的PTCA/PDCA比例被標註在其圖譜下方。
圖16.鹽的種類和濃度對DM的形成的影響。(A)PTCA/PDCA比例、(B)pH為4.8時的來源於1mM溶液的Pb(II)結合。
圖17.AC、PDA、DM(Na)DM(Mg)、SM和CM在1mM下對(A)Cu、(B)Pb、(C)Cd和(D)Hg的結合能力。
圖18.pH為4.8時的Pb(II)的結合等溫線(isotherm)。
圖19.接觸時間對來源於1mM溶液的Pb(II)結合的影響。
圖20.尋找DM的一種不溶形式，其能夠作為用於從水中除去有毒金屬的固體載體發揮良好的作用，我們使DOPA在具有不同濃度的NaCl的pH為8.5的緩衝溶液中自氧化16小時。這些懸濁液的顏色隨著鹽濃度增加而變深，直至NaCl濃度達到250mM，超過該值後利用光學顯微法觀察到沉澱。
圖21.掃描電子顯微法揭示出PDA和DM顆粒具有可變的尺寸且包含更小的亞微米顆粒的聚集體。
圖22A.雖然PDA的確切化學結構還有待充分闡明，但已知其主要含有DHI，[35]而由DOPA形成的合成黑素則會含有DHI和DHICA亞單位。我們還探索了一價鹽(NaCl、KCl)和二價鹽(MgCl2、CaCl2)的不同濃度對PTCA/PDCA比例、進而對Pb結合的影響。在存在125、250、500和1000mM的上述每一種鹽的條件下形成DM，以確定對PTCA/PDCA比例的影響。對於每一種鹽，我們發現一個明顯的趨勢(p＜0.01)，即PTCA/PDCA比例隨鹽濃度的上升而增大。
圖22B.我們在此圖中展示了我們發現使用MgCl2形成的DM結合了最多的Pb(II)，排第二的是CaCl2。使用NaCl和KCl形成的DM結合了最少的Pb(II)。對於每一種鹽，結合的Pb(II)的量也在DM的形成過程中隨鹽濃度的上升而增多。該趨勢與DM的PTCA/PDCA比例(Mg＞Ca＞Na～K)相關，並且暗示鹽的種類及其濃度都能夠通過增加形成過程中的DHICA含量而間接地增加DM結合Pb(II)的量。
圖23.發現PDA具有89.2mg/g的最大Pb(II)結合能力，大約是最大Pb(II)結合能力為18.2mg/g的AC的5倍。所有含DHICA的黑素都具有比PDA高得多的最大Pb(II)結合能力，排序為PDA＜SM＜DM(Na)＜CM＜DM(Mg)。
圖24.我們發現DM(Mg)、DM(Na)和CM在所研究的第一時間點(15分鐘)內就達到了它們的最大吸收，該時間點為我們的第一時間點。對於SM和PDA，結合增加直至約60分鐘。DM顆粒對Pb(II)的快速結合可使得它們適合作為用於在線水淨化的吸附劑。
圖25A.Cu(II)結合能力的排序為AC＜PDA＜SM＜DM(Na)＜CM＜DM(Mg)。
圖25B.由於Pb(II)與Cu(II)具有定性上相似的結合趨勢，我們推測Pb(II)類似地先結合至黑素的兒茶酚，然後在更高的濃度下結合至羧基。
圖25C.對於Cd(II)，我們發現富含DHICA-DM(Na)、DM(Mg)和CM的黑素結合的Cd(II)是PDA結合的9.6倍～13.2倍。
圖26.黑素樣品在鹼性過氧化物降解試驗之後在269nm處進行檢測的高效液相色譜(HPLC)分析。PDCA和PTCA的標準溶液(此處以1μg/mL顯示)分別在7.7分鐘和9.8分鐘時洗脫。
圖27.方案1
發明詳述
I.綜述
本發明提供一種新型的用於自發生成DOPA黑素聚合物的方法，該DOPA黑素聚合物為表面上的沉積膜或塗層形式或不溶性顆粒形式。本發明的界面和合成化學可用於包括醫療裝置的生物相容性塗層、藥物遞送載體和組織工程支架的表面改性、生物傳感器、抗生物淤積、工業和消費品塗層、半導體、金屬去除、表面催化劑以及下一代電子顯示在內的重要領域之中。以下對本發明的某些非限定性實施方式進行更詳細的描述。
II.自發性自氧化的反應物
本文所述的自發性自氧化過程中所使用的反應物在氧化條件下、在高離子強度、且優選在鹼性溶液中發生反應，以製造DOPA黑素(DM)聚合物。該反應物具有以下化學式：
其中，R1、R3、R4和R5各自獨立地選自C1～3的烷基、伯胺、仲胺、滷化物、氫、羥基、羧酸、醛、羧酸酯或羧醯胺；其中，R1、R3、R4和R5中的至少一種為伯胺或仲胺；其中，x在0～3的範圍內，且y在0～3的範圍內，前提是x或y至少為1；其中，R2為羧酸。
DOPA
在一種這樣的實施方式中，反應物為3,4-二羥基苯丙氨酸(DOPA)或其鹽：
III.用於自發性自氧化的高離子強度溶液
本發明中所使用的高離子強度溶液還可包含添加劑，例如填料、色素、潤溼劑、粘度調節劑、穩定劑、抗氧化劑或交聯劑。如果需要，可使反應物交聯。如果需要，鹽溶液可包含各種佐劑，例如小顆粒填料、表面活性劑、UV吸收劑、光引發劑、著色劑和指示劑。
「高離子強度」是指所使用的溶液中的鹽濃度高於100mM，另一些實施方式使用鹽濃度高於200mM、高於300mM、高於400mM或高於500mM的溶液。可使用的鹽濃度範圍包括100～5000mM、100～4000mM、100～3000mM、100～2000mM、100～1000mM、100～500mM、100～400mM、100～300mM、150～5000mM、150～4000mM、150～3000mM、150～2000mM、150～1000mM、150～500mM、150～400mM、150～300mM、200～5000mM、200～4000mM、200～3000mM、200～2000mM、200～1000mM、200～500mM、200～400mM以及200～300mM。
「鹼性」是指溶液的pH值在7.1～12的範圍內，優選pH在7.5～10的範圍內，進一步優選pH在7.5～8.5的範圍內。鹼性溶液引發了反應物在基材表面上的聚合。
「溶液」是指一種混合物，在該混合物中，至少有一種溶質溶解在含有水的溶劑中，但該溶劑也包括水與諸如丙酮、氯仿、二氯甲烷、甲醇、乙醇、異丙醇、二甲基甲醯胺、二甲基亞碸以及己烷這樣的有機溶劑的互混溶液。優選地，溶液在臨使用之前配置，雖然溶液也可在使用前保存至少一段不長的時間。
「在氧化條件下」是指具有溶解氧或諸如三乙胺這樣的有機鹼的水溶液和非水溶劑的鹼性pH。在替代性的實施方式中，包含諸如以下氧化劑的溶液可被用於通過反應物的氧化而引發聚合：過氧化氫，高碘酸鈉，叔丁基過氧化氫，有機過氧化物，包括苯醌、萘醌、蒽醌在內的醌類，硝基芳族化合物，包含Cu2+、Fe3+、Co3+和Mn3+的金屬氧化劑，苯酚，吲哚，苯胺等。
在一種實施方式中，基材被浸入或浸漬在反應物溶液中。下文中的實施方式例示了優選的接觸方法。然而，可使用各種技術使基材表面與反應物溶液接觸，所述技術包括但不限於刷塗、浸塗、旋塗、模塗(die coating)、噴墨塗布、噴塗、絲網印刷(例如輪轉絲網印刷)、凹版印刷、光刻印刷和柔版印刷、微接觸印刷、納米光刻。
通過接觸，DM膜在基材表面上形成。在一種優選的實施方式中，DM膜包含位於基材表面上的平滑而連續的聚合塗層，該聚合塗層具有基本上不變的厚度。作為一般指導，存在於基材表面上的聚合塗層的厚度大於10nm。在一些實施方式中，該厚度在約11～1000nm的範圍內，優選在約11～100nm的範圍內。
在一些實施方式中，合成是自發性的。「自發性」是指反應在熱力學上有利，且能夠在不繼續輸入功或力的條件下繼續進行。技術人員知曉非自發性反應的一個非限定性例子是電解，其需要外部施加的電流。
IV.基材
在一些實施方式中，該方法包括使基材的至少一部分與反應物接觸，如上所述。
「基材」是指任意無機或有機基材。例如，基材可以是提供用於接收粘附性聚合物的表面的有機固體、無機固體或有機和無機固體的組合。合適的有機或無機基材還可以是纖維狀、細絲狀、網狀、多孔或溶劑溶脹的(例如水凝膠或有機凝膠)物體。優選地，小心選擇基材，以使基材與反應物之間具有足夠程度的粘合。
合適的無機基材包括但不限於以下無機基材，例如石英、玻璃、二氧化矽和其它氧化物或陶瓷，例如氧化鋁、銦錫氧化物、鉭酸鋰(LiTaO3)、鈮酸鋰(LiNbO3)、砷化鎵(GaAs)、碳化矽(SiC)、矽酸鎵鑭(LGS)、氧化鋅(ZnO)、氮化鋁(AlN)、氧化鋁(Al2O3)、矽(Si)、氮化矽(Si3N4)和鈦酸鋯鉛(「PZT」)、氧化鈦(TiO2)、氧化鈮(Nb2O5)；以及金屬或合金，例如鋁、銅、金、銀和鋼。其它合適的無機基材包括但不限於雲母、金剛石和鎳鈦(NiTi)。
合適的有機基材包括但不限於以下有機基材，例如熱塑性塑料，包括聚酯(例如聚對苯二甲酸乙二醇酯或聚萘二甲酸乙二醇酯)、聚丙烯酸酯(例如聚甲基丙烯酸甲酯或「PMMA」)、聚(乙酸乙烯酯)(「PVAC」)、聚(乙烯丁縮醛)(「PVB」)、聚(丙烯酸乙酯)(「PEA」)、聚(二苯氧基磷腈)(「PDPP」)、聚碳酸酯(「PC」)、聚丙烯(「PP」)、高密度聚乙烯(「HDPE」)、低密度聚乙烯(「LDPE」)、聚碸(「PS」)、聚醚碸(「PES」)、聚氨酯(「PUR」)、聚醯胺(「PA」)、聚(二甲基矽氧烷)(「PDMS」)、聚氯乙烯(「PVC」)、聚偏二氟乙烯(「PVdF」)、聚苯乙烯(「PSy」)和聚硫化乙烯；以及熱固性塑料，例如纖維素衍生物、聚醯亞胺、聚醯亞胺苯並惡唑和聚苯並惡唑。其它合適的有機基材包括但不限於石墨、納米碳管、富勒烯、石墨烯、聚(乙醇酸)、聚(乳酸)和聚(乳酸-乙醇酸)和
未處理的基材
本發明的方法可在任何條件下在基材上使用。例如，可在無任何額外預處理或清潔的條件下使用存在諸如油漆、油、油脂、保護劑等塗層的基材。
經過預處理的基材
在另一種實施方式中，可替代地或附加地對基材進行預處理，以促進膜的形成。優選的預處理包括但不限於在存在合適的反應性或非反應性氣氛(例如等離子體、輝光放電、電暈放電、電介質阻擋放電或大氣壓放電)的條件下進行電子和離子束輻射、放電；化學預處理(例如用聚偏二氯乙烯的低固含溶液或用聚酯樹脂與氮雜環丙烷交聯劑的溶劑基混合物)；火焰預處理；有或沒有臭氧預處理條件下的紫外光預處理；以及當使用聚合物基材時，將功能聚合物引入基材中。在一種替代性的實施方式中，本發明提供一種用於受到人工或天然損傷/改變的基材上的塗層的強化方法。
V.用途
經過反應物處理的基材的當前應用有許多，包括但不限於：抗生物淤積和抗氧化表面的應用；用於導尿管、支架、人工骨骼、牙齒和透析管的醫療裝置；用於生物微電子機械系統(bio-MEMS)和傳感器的半導體；以及用於傳感器、診斷和細胞成像的金屬納米顆粒和量子點。
抗菌和抗淤積表面。在該實施方式中，塗覆有DM聚合物的基材表面可展現出抗微生物性，或者可包含結合在表面上的具備這些性質的抗生素。對於非限制性例子，參見以下的實施例1。
經過反應物處理的基材可被用於提供抗生物淤積基材，用於醫療和牙科裝置和植入物，具有人造或天然組成的船體殼、離岸和在岸結構，水處理設施，諸如管線這樣的液體處理或移動結構，化學處理設施，食品加工設施，以及建築和房屋材料。
「生物淤積」是指大分子、細胞、蛋白質、細菌、藻類和其它生物體及它們的副產物在固-液或固-氣界面的非特異性吸附，這經常對例如醫療裝置和傳感器的性能、安全和壽命產生不利的影響。「抗」是指對基材進行改性，以防止大分子、細胞、蛋白質、細菌、藻類和其它生物體及它們的副產物在固-液或固-氣界面處發生與生物淤積有關的非特異性吸附。目前，聚乙二醇的表面固定(PEG或PEG化)是最為流行的用於非淤積表面製備的方法，但以不受表面約束的方式錨固PEG分子仍然是一大挑戰。
防止氧化。在該實施方式中，DM聚合物可展現出抗氧化性，或者可保護下方的表面不受氧化。
藥物遞送。DM聚合物可以可逆地結合至某些陽離子型藥物。因此，其可被用於藥物遞送。對於非限制性例子，參見以下的實施例1。
無電鍍金屬化。在該實施方式中，可優選地如上所述在高離子強度溶液中用反應物來處理表面，然後使經過處理的表面暴露在金屬溶液中以形成粘合性金屬膜。
附加親核試劑。在該實施方式中，可優選地如上所述使基材與反應物在高離子強度溶液中接觸，然後使經過反應物處理的基材暴露於親核試劑中。「親核試劑」是指具有被貧電子物質、親電試劑吸引的傾向的富電子物質。重要的親核試劑主要包括伯胺和仲胺、硫醇、疊氮化合物、腈、醛、咪唑、疊氮化合物、聚六亞甲基二硫代碳酸酯、氫、羥基、羧酸、醛、羧酸酯或羧醯胺等。
表1.重要的親核試劑的部分列表
*R可以任意設定。
合適的親核試劑可包含部分更加複雜的分子，例如蛋白質或核酸。
聚合物接枝。在該實施方式中，可優選地如上所述使基材與反應物在高離子強度溶液中接觸，然後使經過反應物處理的基材暴露於聚合物，包括含有如上所述的親核試劑的任何合成聚合物。例如，在聚(乙二醇)(PEG)的情況中，NH2-PEG-NH2、甲氧基-PEG-NH2、甲氧基-PEG-SH、SH-PEG-SH、支化-PEG-NH2和支化-PEG-SH是反應到經過SMA處理的表面上的聚合物結構。還可預期聚合接枝的替代性方式，包括自由基接枝聚合、原子轉移自由基聚合、等離子體聚合/沉積、等離子體處理和表面輻射，以及陽離子和陰離子單體或低聚物加成。
金屬清除。在該實施方式中，可通過結合至該方法製得的經過反應物處理的基材或不溶性DM顆粒來降低流體中金屬離子的量。「降低」是指溶液中金屬離子的量的任何降低，優選低於所有金屬的最大汙染物水平(MCL)或其它已建立的標準。可將由該方法製得的呈基材上的膜的不溶性顆粒形式的DM聚合物置於具有金屬離子的溶液中，以使經過表面改性的基材降低該溶液中金屬離子的量。該方法可在流通或批處理的模式下實施。對於非限制性例子，參見以下的實施例2和3。
VI.試劑盒
在本發明的一種替代性的實施方式中，提供一種用於自發性合成DM聚合物的試劑盒。在一種實施方式中，試劑盒包含用於製造高離子強度溶液的鹽、按照如上所述的方式被稀釋的反應物、可選的待改性的基材或緩衝溶液，以及用法說明。
「用法說明」是指用於傳達本發明對於上述目的之一的有效性的出版物、記錄、圖表或任何表達介質。例如，可將試劑盒的指導材料粘附至含有本發明的容器中，或與含有本發明的容器一起運輸。或者，指導材料可與容器分開運輸，或以網際網路網站上的可電子獲取形式提供，旨在使指導材料和SMA溶液以及基材被接受者協作地使用。
VII.實施例
以下實施例描述了本發明的各種新穎且有用的實施方式。雖然這些實施方式涉及特定的由DOPA製得的塗層、膜和顆粒以及使用該DOPA的方法，但本發明並不受這些實施例中所展示的實施方式所限。
實施例1：用於負載和釋放抗微生物化合物的DOPA黑素塗層的高離子強度製劑
通過高離子強度下在鹼性DOPA溶液中進行簡單的浸塗來在各種基材上形成保形的DOPA黑素膜(圖1)。相比於聚多巴胺，DOPA黑素塗層具有高親水性的優勢以及結合和釋放陽離子的能力。我們通過使用塗布有DOPA黑素的聚碳酸酯來形成抑制和殺滅金黃色葡萄球菌的抗菌表面來對後者進行展示。
黑素在自然界中廣泛存在，提供著色、光保護、抗氧化、結合金屬以及其它生物學性質。[1]黑素的一種重要亞類是真黑素，其由酪氨酸經由一種涉及3,4-二羥基苯丙氨酸(DOPA)的氧化、分子內環化、低聚和聚集以形成不溶性和非均相固體的路徑形成。[2,3]研究真黑素的動力部分來自於對於理解生物功能意義上的結構—性質關係的興趣，[4]但也來自於日益增加的對於黑素薄膜的有趣的光、電性質和技術應用的興趣。[5-7]
合成的和天然的黑素不溶於許多溶劑，該性質代表了將黑素處理成諸如薄膜這樣的有用形式中的挑戰。過去，類黑素的薄膜在基材上的沉積已通過溶液澆鑄[8,9]、(電)噴塗[10,11]、旋塗[12-14]、電化學沉積[7,9,15]以及脈衝雷射沉積實現。[16]除了通常需要黑素在有機溶劑或水性NaOH或氨中能夠溶解以外，大部分已報告的方法都是視線法，它們需要精密的裝置，採用複雜多步方案，或者只能夠在導電基材上實施。由於這些限制，仍然非常需要用於黑素薄膜沉積的簡單而多用途的方法。不需要眾多基礎設施且能夠適應多種基材組合物、形狀和構造的用於形成黑素薄膜的方法會加快這種令人感興趣的仿生材料的實際應用的發展。
最近報告了一種用類黑素塗層對表面進行改性的簡單而多用途的方法，該方法包括將基材浸塗入富含DOPA的貽貝黏著蛋白質的兒茶酚胺模擬物的水溶液中。[17,18]本領域的文獻中最常使用的典型的兒茶酚胺是多巴胺，其在溫和的鹼性和充氣水溶液中經歷自氧化，以在幾乎任意基材上形成粘附性聚多巴胺(PDA)膜。[17]PDA因其與真黑素的化學相似性而也被稱為多巴胺-黑素，能作為導致諸如生物分子固定、表面能改性、生物礦化以及生物傳感這樣的多種應用的進一步改性的引物發揮作用[19,20]。還可使感興趣的分子與多巴胺在一步反應中同時共沉積，以形成具有所需性質的表面。[21]
多巴胺和其它兒茶酚胺的若干種衍生物以相似的方式聚合在各種基材之上。例如，去甲腎上腺素顯示為聚合入粘附膜中，其具有因存在未在多巴胺中發現的羥基而引發ε-己內酯的開環聚合的附加能力。[22]其它含有兒茶酚和胺官能團的分子已被用於塗布各種表面以使得能夠進行DNA的固定[23]和抗淤積刷的表面聚合。[24]
使DOPA黑素(DM)膜以與PDA相似的方式自發聚合在各種基材之上會令人感興趣，因為這會進一步加速類真黑素薄膜的技術應用。相比於PDA，會期望DM膜展現出更高濃度的可用於各種應用中的游離羧酸。然而，以往的關於DOPA在水或低離子強度緩衝溶液中的鹼性自氧化的報告得到了一種類黑素產物，它是可溶的[25-27]，或者是溶液穩定的超分子納米聚集體。[28]與這種行為相一致，我們與其他人都在使用為PDA膜的自發形成而開發的標準條件(緩衝的充氣H2O，pH為8～9)由DOPA形成粘附膜時遇到過困難，特別是形成在諸如TiO2和SiO2這樣的帶負電荷的基材時。[29]
Greco等人報導了利用DOPA在存在半胱氨醯基-DOPA黑素(CDM)的條件下的自氧化來自發形成核-殼黑素顆粒。[30]該CDM顆粒似乎對DOPA的氧化和DM殼體的外延沉積起到了關鍵作用，因此不清楚該方法是否能夠提供在其它基材上形成DM薄膜的通用方法。一些報導顯示了將DOPA黑素(DM)薄塗層形成在聚合膜上以改善潤溼性[31,32]，以及作為分子共價固定的引物發揮作用，[33-35]然而，原位生長的DM膜在使用多巴胺的條件下顯示為只形成了10nm或更薄的厚度，而在該條件下通常會形成厚得多的膜。因此，相比於PDA，文獻證明利用DOPA的自發性氧化使DM膜生長在基材上要困難得多。
在本實施例中，我們所要報告的未料想到的發現為，DM膜能夠在高離子強度下以簡單方式進行自發性原位自氧化沉積。厚的粘附性DM膜在包括金屬氧化物、貴金屬和聚合物在內的各種基材上形成。DM膜不但具有許多PDA膜的令人滿意的特徵，還具有一些優勢，即更高的親水性以及靜電結合和釋放陽離子的能力。上述性質中的後者可用於通過由DM膜負載和釋放陽離子型氨基糖苷來製造抗菌塗層。
DM膜的形成對於離子強度的依賴性通過以下方法來揭示：使貴金屬的典型例子(Au)、氧化物的典型例子(TiO2)和聚合物的典型例子(聚碳酸酯，PC)在0～1M的NaCl濃度下暴露於N,N-二羥乙基甘氨酸緩衝溶液(10mM，pH為8.5)中的DOPA水溶液(5mM)中，並使用橢圓偏振光譜法測量16小時後所形成的DM膜的厚度(圖2A)。在PC和TiO2基材上，在沒有NaCl的情況下未檢測到DM膜，DM膜的厚度隨離子強度的上升而增加，並且在NaCl濃度為250mM或更高時分別穩定在約80nm和40nm。該表現與PDA塗層的表現完全不同，發現後者的厚度與NaCl濃度無關(圖3)。在Au上形成DM的不尋常之處在於，在沒有NaCl的條件下形成20nm的薄膜，膜厚在250mM的NaCl下增加至140nm，然後在進一步升高NaCl濃度後降至約80nm。雖然這種反常行為的緣由目前還不得而知，但是該觀察結果是可以重複的，且我們推測該現象可能與帶負電荷的DM膜對Au基材的靜電感應有關。不過，在NaCl為500mM及更高時，Au上的DM厚度與PC上的相似(～80nm)。
基於這些初步結果，緩衝溶液A(10mM的N,N-二羥乙基甘氨酸，pH為8.5，250mM的NaCl)被選為形成DM的最佳緩衝溶液，並被用於動力學研究，以觀察暴露於5mM的DOPA時DM膜在基材上的生長。膜的生長展現出S形，且膜厚度在8～24小時之內增加得最快(圖2B)。這些DM塗層是保形的且粘附至所有測試基材，雖然當用H2O進行潤洗時，用長於36小時的時間在TiO2上生長的DM出現了斑點狀的脫層，這可能是由於DM與帶負電荷的TiO2表面的靜電排斥導致的(相同的膜未在用150mM的NaCl進行潤洗時脫層)。而緩衝溶液A中所形成的PDA未顯示出S形生長曲線(圖4)。與PDA類似，DM膜表現為深色塗層，這取決於沉積時間和厚度(圖5)，因為其寬帶吸收(圖6)與真黑素的寬帶吸收相似。[36]
使用衰減全反射模式下的傅立葉變換紅外光譜(ATR-FTIR)來比較沉積在Au上的DM和PDA膜之間在官能團方面的差異。DM與PDA之間的一個主要差異在於在1600cm-1處存在的峰以及在1700～1730cm-1處的峰肩，它們分別對應於COO-(不對稱伸縮)和COOH(伸縮)(圖7)。[37]這些數據暗示DM中存在羧酸基團，且該羧酸基團以質子化和羧酸鹽形式存在。
使用X射線光電子能譜分析(XPS)來進一步表徵16小時後所形成的DM塗層。相比於原始基材，經過DM改性的基材展現出N含量的增加，達到了與DOPA的理論N/C比0.11相似的N/C比(表2)。發現O/C比小於或等於DOPA的理論O/C比0.44。重要的是，基材的特徵信號，例如Au和Ti消失或大幅降低，這暗示形成了一種比典型的XPS分析深度(～10nm)更厚的DM外膜。我們還注意到所有DM膜中都存在約3％的Na，這很可能是由於存在FTIR數據所暗示的羧酸Na鹽的緣故。
表2：改性前、DM塗布(pH為8.5，在5mM的DOPA、250mM的NaCl、10mM的N,N-二羥乙基甘氨酸中進行16小時)後以及GM負載後利用XPS測得的基材的原子組成。破折號表示元素存在於檢測極限以下。
DM塗布的TiO2的掃描電子顯微法揭露出DM膜遮蓋了其下方的基材，且具有粗糙或多孔的表面(圖8A)。三種DM改性的基材都幾乎完全溼潤(＜10°)，我們將其歸因於存在高密度的離子化羧酸根基團。而PDA改性的基材的前進接觸角約為35°(圖8B～C)，這與文獻所述相一致。[17]
與PDA相似，DM膜粘附至不同種類基材的能力很可能與兒茶酚官能團的存在有關，因為兒茶酚官能團能夠參與各種相互作用，例如金屬配位、氫鍵結合和π-堆積。[38]若干份最近的報導都以PDA的結構作為主題。[39-41]一種假說認為PDA具有與真黑素有關的結構，通常認為真黑素由作為亞單位的5,6-二羥基吲哚(DHI)和5,6-二羥基吲哚羧酸(DHICA)組成。[36]Vecchia等人最近的研究成果提出多巴胺先在高pH下氧化成其醌，該醌通過多種路徑發生反應，得到一種含有未成環多巴胺、由多巴胺成環得到的DHI和吡咯羧酸部分的亞單位的複合產物。[40]
由於DOPA是真黑素的前體，因此預期DM的形成(圖9)能夠更加接近地模擬生物學上的黑素合成，所述生物學上的黑素合成包括以酶為中介使DOPA氧化呈多巴醌，環化成環多巴，轉化成多巴色素，利用多巴色素互變異構酶(DCT)重組成DHICA和DHI，其隨後氧化聚合成真黑素。[42]在沒有DCT的情況下，大部分多巴色素經歷脫羧化而形成DHI而非DHICA。[43]而我們的FTIR和XPS數據暗示在形成於高鹽緩衝溶液中的DM膜中仍然明顯存在羧酸。DOPA及其衍生物的去質子化的羧酸鹽的高離子強度下的電荷屏蔽可能導致聚集和表面結合的增加。DM膜的確切組成、未成環的DOPA亞單位的存在、亞單位之間的連接方式以及它們的氧化態仍然不得而知，需要進一步研究。
為了說明DM中的殘留羧酸所提供的相比於PDA的功能優勢，將DM膜用於陽離子型氨基糖苷慶大黴素(GM)的結合與釋放。GM對包括耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(MRSA)在內的多種細菌有效[44]，MRSA是導致高發病率和死亡率的醫院感染的最大的原因之一。[45]用DM或PDA塗布基材，然後將其在H2O或GM溶液(5mg/mL在H2O中)中浸泡16小時。厚度測試揭示出H2O中的所有基材上的DM和PDA膜的厚度都減少了約1～5％，我們推測這可能是由於鬆散結合的DM和PDA減少所致(圖10A)。在GM溶液中，PDA膜的厚度減少了相似的量(1～3％)，而所有三種基材上的DM膜都膨脹了約10～15％。XPS揭示出將GM載入DM塗布的基材中導致N/C比上升和O/C比下降，這與將GM引入DM膜時的情況(表1)相一致。另外，Na信號的實際損失暗示GM已通過對最初與DM膜中的羧酸鹽相關聯的Na+離子的陽離子取代而被引入。這些結果暗示GM被載入了DM但未被明顯載入PDA。
通過將經過塗布的PC基材(PC/DM/GM)浸入杜氏培養基(DMEM)中，並且利用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測量GM的釋放來研究GM從DM上的釋放。如圖10B所示，56nm厚的DM膜在4小時內釋放了0.95μg/cm2的GM。可通過改變DM厚度輕易地調節DM膜上負載和釋放的GM的總量(圖10C)，這種調節反過來受到塗布時間或在步驟間進行清洗和乾燥的多個塗布循環的控制，這種方法在之前已展示，用於形成更厚的PDA膜。[46]發現釋放介質中的無機鹽的組成會影響GM的釋放(圖11)，暗示DMEM中發現的Na+、Mg2+和Ca2+在GM的釋放中能夠發揮作用。
實施Kirby-Bauer紙片擴散法以評價負載有GM的DM膜抑制金黃色葡萄球菌生長的能力。將經過塗布和未經塗布的PC基材置於接種了金黃色葡萄球菌並培養了18小時的瓊脂盤上。如圖10D所示，DM/GM的培養導致16.7mm的抑制區，表明GM從塗層上釋放而抑制了細菌在基材上的生長。而用裸露PC、GM處理的PC(PC/GM)、PDA、PDA/GM和DM未展現出任何抑制區(表3)。
表3：具有各種塗層的基材的基材直徑和接種有金黃色葡萄球菌的瓊脂盤在培養18小時後的抑制區。N/D＝未檢測到。
為了展示負載有GM的DM不僅是抑菌的，而且是殺菌的，我們實施了死亡試驗，其中，用基材對浮遊金黃色葡萄球菌進行4小時的培養，然後計算存活細菌的數量。暴露於負載有GM的DM中的細菌展現出很高的殺菌性，而其它所有塗層都具有與裸露PC在統計學上相似的存活率(圖10E)。綜合來看，這些實驗證明只有DM膜能夠負載和釋放足夠的GM以抑制和殺滅金黃色葡萄球菌，說明DM相對於PDA具有很大的優勢，該優勢很可能與DM中存在羧酸根基團有關。
總之，我們開發了一種簡單的可用於多種基材的表面改性技術，該技術利用高離子強度在水性、弱鹼性條件下，將DOPA聚合入厚的粘附性DM膜中。利用浸塗的DM膜自發性沉積相比於以往使用的DM塗布方法表現出明顯的簡單化，使可負載DM膜的基材的範圍和構造得以擴展。相比於被更廣泛研究的PDA膜，DM膜展現出提高的潤溼能力，並且可負載陽離子型客體分子。這通過展示DM膜上負載和釋放GM以殺滅金黃色葡萄球菌來例示，並且預期會對各種其它陽離子型氨基糖苷有效。DM膜的易形成性和可逆的陽離子結合性質可導致兒茶酚胺塗層用於防止表面的細菌定植的新應用。
實驗。DOPA和多巴胺的聚合：先將L-DOPA(10mM)溶於H2O中，然後將其以相等的量與2倍的緩衝溶液A(10mM的N,N-二羥乙基甘氨酸，pH為8.5，250mM的NaCl)混合。將多巴胺.HCl(5mM)直接溶於緩衝溶液A中。將基材置於24孔盤中，並將其浸入DOPA或多巴胺溶液中，保持一段所需的時間，然後用H2O徹底清洗並用N2吹乾。使PC樣品藉由表面張力漂浮，面朝下。
GM的負載和釋放：使塗布有PDA或DM的基材徹夜(16小時)暴露於5mg/mL的GM在H2O中的溶液中，然後用H2O清洗並用N2吹乾。將負載了GM的載體置於含有1mL的DMEM的24孔盤中。使用ELISA(Bioo科技公司(Bioo Scientific)，德克薩斯州)測量釋放溶液中的GM濃度。
表徵：使用ESM-300橢圓偏振光譜儀(J.A.Woollam公司(J.A.Woollam)，林肯市，內布拉斯加州)，採用400～1000nm的波長，以多種入射角測量所有膜的厚度。將PDA和DM層擬合至具有初始固定係數(An＝1.45，Bn＝0.01)的柯西模型的折射率和厚度。使用日立公司(Hitachi)的SU8030在10kV下對5nm Os塗布的樣品進行SEM。
抑菌和死亡試驗：用DM(～90nm)或PDA(～80nm)對PC基材進行兩次20小時的塗布，然後如上所述負載GM。使金黃色葡萄球菌(ATCC 29213)在胰蛋白酶大豆培養基(30g/L)中徹夜增殖，然後在4000rcf下進行兩次5分鐘的離心並用生理鹽水衝洗。對於Kirby-Bauer試驗，使細菌在150mM的生理鹽水中重新懸浮成108CFU/mL，將其中的100μL分布在4mm厚的經過陽離子調整的Müller-Hinton(CAMH)瓊脂上。將這些測試樣品(12mm直徑的圓形PC)置於用於培養(18小時，35℃)的瓊脂上，然後測量抑制區。將GM紙片(10μg的GM，6mm直徑，BD，NJ)用於正對照。對於死亡試驗，使細菌重新懸浮在具有10％小牛血清(ATCC)的DMEM(ATCC)中，濃度為107CFU/mL，使其中的100μL暴露於24孔盤中的各基材。正對照為具有50μg/mL的GM的相同細菌溶液。經過4小時的培養(37℃，5％的CO2)之後，對帶孔盤進行2分鐘的超聲處理，以釋放任何粘附的細菌，連續稀釋細菌溶液並將它們鋪置在CAMH瓊脂上。培養(37℃，5％的CO2)24小時後計算數量。
除非另有說明，否則所有試劑均購自西格瑪奧德裡奇公司(Sigma-Aldrich)。使用Barnstead Nanopure(賽默飛科技公司(Thermo Scientific))對H2O進行純化(≥18MΩ)。利用熱蒸鍍(Lesker Nano-38)將Au塗布到Si晶片上，或者通過電子束蒸鍍(Edwards Auto 500)將TiO2塗布到Si晶片上。PC(Makrolon GP)基材購自McMaster-Carr(Elmhurst，IL)。將所有基材切割成1×1cm，並且通過依次在5％的Contrad-70、H2O和IPA中進行10分鐘的超聲處理來進行清洗。
在ESCALab 250Xi(賽默飛科技公司)上進行XPS，波譜用C(1s)峰(284.6eV)進行校準。使用配備有ZnSe ATR晶體的Thermo Nicolet Nexus 870收集ATR-FTIR數據。在西北大學的Nuance Keck-II設施中進行XPS和ATR-FTIR分析。
實施例2：用於除去有毒重金屬的富含DHICA的DOPA黑素顆粒的高離子強度形成。
在本實施例中，我們研究了使用高離子強度緩衝溶液來形成不溶性DM顆粒，將它們用於結合重金屬，並且將它們的結合性能與AC、PDA顆粒以及黑素的其它形式的結合性能進行了比較。我們展示了聚合溶液中所使用的鹽的種類和濃度對於DM的DHICA亞單位與DHI亞單位的比例具有顯著影響，這與DM結合重金屬的能力相關。
飲用水的重金屬汙染在發展中國家和發達國家中都是重大問題。具體而言，鉛汙染是一個嚴重的問題，因為其對兒童和未出生的胎兒具有毒性作用。真黑素，一種普遍存在的生物色素，因其對重金屬離子的高結合親和力而受到關注。然而，還未將合成真黑素用作除去重金屬離子的試劑，部分因為它是可溶的。在本實施例中，我們展示了高離子強度的鹼性緩衝溶液可被用於使DOPA自氧化，導致形成DHICA含量高的DOPA黑素的不溶性顆粒。我們隨後展示了黑素的DHICA含量與其對Pb(II)、Cd(II)、Cu(II)和Hg(II)的結合能力的關係。具體而言，發現使用MgCl2鹼性緩衝溶液形成的DOPA黑素具有比天然烏賊墨黑素更高的對上述重金屬離子的結合能力。這些發現顯示在高離子強度下形成的合成DOPA黑素可成為一種優異的重金屬整治用材料。
全世界數以百萬計的人無法獲得清潔的飲用水，儘管這是一項基本人權。(1)在法規不完善的發展中國家，含有諸如鉛、鎘、汞這樣的重金屬的工業廢料持續汙染著供水。(2)即便是在發達國家，鉛管的持續使用有時也會導致自來水中的鉛達到危險水平。(3)即使是低血鉛水平，也會對兒童的智力發育產生不利影響(4)，而且慢性暴露與諸如肌肉震顫和虛弱、高血壓、神經性行為紊亂和腎病這樣的各種健康問題相關。(5,6)最近發生的華盛頓特區自來水中的鉛汙染已經導致當地兒童的血鉛達到危險水平(7)並且還與死胎的增加有關。(8)
黑素是廣泛存在於動植物中的深色色素，其具有各種功能，例如光保護、抗氧化和金屬結合。(9)黑素的主要種類是真黑素、褐黑素和神經黑素。真黑素是一種黑色或棕色聚合物，其由5,6-二羥基吲哚(DHI)和5,6-二羥基吲哚羧酸(DHICA)亞單位組成，並且是人類皮膚、毛髮和眼睛中發現的主要色素。在生物學上的黑素合成中，酪氨酸被酪氨酸酶氧化成多巴醌，然後成環並轉化成多巴色素，多巴色素自發地脫羧成DHI或者通過多巴色素互變異構酶酶促重組成DHICA。然後，DHI和DHICA經歷進一步的氧化聚合和聚集而形成真黑素。(10)褐黑素，一種使紅髮具有紅色的黃色或紅色色素，由苯並噻嗪和苯並噻唑亞單位組成。褐黑素的形成是真黑素的形成中形成多巴醌之後的分支，其包括與半胱氨酸反應而形成半胱氨醯多巴，半胱氨醯多巴經歷進一步的反應而形成褐黑素亞單位。(10)神經黑素分布在黑質中，其與真黑素的區別在於其由多巴胺通過自氧化形成，而非通過酶的活性，因此會主要含有DHI而不是DHICA亞單位。(11)
黑素因其具有以高親和性結合重金屬離子的能力而受到關注，對於一些金屬，所述能力甚至強於螯合劑EDTA。(12-14)具體而言，推測神經黑素能夠通過螯合重金屬來起到保護神經的作用。(15,16)事實上，帕金森氏病就與神經黑素的缺失有關。(11)通過多巴胺在鹼性pH下的自氧化而形成的多巴胺黑素已被用作神經黑素的合成模型。(17,18)我們最近發現多巴胺黑素還能夠簡單地通過在多巴胺的鹼性水溶液中進行浸塗而在幾乎任意基材上形成為保形的塗層。(19)該塗層作為聚多巴胺(PDA)而變得廣為人知，且被證明可用於多種領域中的無數應用中。(19)PDA的一種應用是重金屬整治。發現塗布有PDA的玻璃珠粒結合重金屬的能力是活性炭(AC)的若干倍，後者已成為重金屬去除的工業標準。(20)PDA顆粒和經過PDA功能化的石墨水凝膠也被用作相同的目的。(21,22)
由於PDA由多巴胺形成，其主要含有DHI，而缺乏只能使用DOPA作為起始分子而形成的DHICA。(23)據認為PDA通過DHI亞單位的兒茶酚和胺來結合至重金屬。(20)而由DOPA形成的合成黑素會含有DHI和DHICA亞單位(圖12)。由於DHICA相比於DHI含有額外的羧酸，會期望合成DOPA黑素(DM)以提高了的容量和親和性來結合重金屬。然而，關於將DM用於重金屬整治中的報導很少，我們認為這是由於通過DOPA在鹼性緩衝溶液中的自氧化而形成的DM在pH大於3時保持可溶所導致的。(17,24)相比之下，在相同緩衝溶液中形成的PDA能夠輕易沉澱，因此適於在重金屬結合後進行物理分離。(17)另外，DM不會像PDA那樣形成塗層，特別是在像金屬氧化物這樣的帶負電荷的基材上。(25)我們推測這是由於形成過程中DHICA的羧基的負電荷的排斥限制了聚合和/或聚集所致，並且通過使用高離子強度的緩衝溶液來展現，這些電荷可被屏蔽以允許DM膜形成在各種基材上，其還具有通過靜電結合負載和釋放陽離子型藥物的能力(參見上述實施例1)
材料。Pb(II)、Cu(II)、Cd(II)和Hg(II)的10000ppm溶液購自Inorganic Ventures(克裡斯琴斯堡，維吉尼亞州)。L-DOPA、多巴胺HCl以及所使用的所有其它化學試劑都購自西格瑪公司(Sigma，聖路易斯市，密蘇裡州)。
黑素的合成。將DOPA或多巴胺(10mM)溶於緩衝溶液(20mM的N,N-二羥乙基甘氨酸，500mM的NaCl，pH為8.5)中。使該溶液在室溫下在通過震蕩而與空氣接觸的敞口瓶中徹夜反應(20小時)。然後在4500rcf下離心5分鐘，輕輕倒出上層清液，並使顆粒在H2O中重新懸浮。該清洗步驟重複進行約10次，直至上層清液澄清。然後是顆粒重新懸浮在5mL的H2O中，用液氮冰凍，凍幹3天，用一天時間使其與大氣溼度平衡。DM也在添加鹽之後，在pH被調節至8.5的條件下，在含有125～1000mM的NaCl、KCl、MgCl2或CaCl2的N,N-二羥乙基甘氨酸緩衝溶液中形成。
鹼性過氧化物降解試驗。使用已建立的方案(26)在最小的調整下使黑素降解。簡而言之，使0.1mg的黑素懸浮於100μL的H2O中，將其與375μL的1M的K2CO2和25μL的30％的H2O2混合，並在室溫下震蕩20小時。然後，通過添加50μL的10％的Na2SO3使殘留的H2O2分解，並用140μL的6M的HCl酸化該混合物。使用採用C18柱的RP-HPLC在50℃和0.7毫升/分鐘的流率下對80μL的樣品進行分析，檢測269nm處的吸收，並將其用於定量。使用各種濃度的PTCA和PDCA溶液進行標定。
金屬離子的結合。所有金屬離子溶液都由10000ppm的庫存液配製成它們所需的濃度，並且對於Pb、Cu和Cd，將pH調整為4.8，對於Hg，將pH調整至3.6。在15mL不含金屬的離心管中，將5mg的各樣品與10mL的金屬離子溶液混合。然後在室溫下在搖勻機(rocker)上進行3小時的平衡，在4500rcf下使這些試管離心5分鐘。然後使上層清液通過0.22μm的過濾器，並使用電感耦合等離子體質譜((ICP-MS)在已知的稀釋下進行分析以測定其金屬濃度。然後通過上層清液中金屬濃度的降低推斷出被黑素結合的金屬。
掃描電子顯微法。使PDA和DM顆粒懸浮在H2O中，將其滴在1×1cm的矽晶片上並使其乾燥。然後對這些樣品塗布5nm的鋨並使用日立SU8030掃描電子顯微鏡在10kV下獲取圖像。
PDA和DM的合成。PDA顆粒通過將多巴胺(10mM)溶解在pH為8.5的N,N-二羥乙基甘氨酸緩衝溶液(20mM)中並攪拌20小時來合成。所形成的PDA顆粒可通過離心來簡單獲得，且對於H2O潤洗穩定。而當試圖在相同緩衝溶液中由DOPA來合成DM顆粒時，所形成的DM保持可溶而無法離心分離。Chio等人之前對該現象進行過描述，並且注意到為了使DM在形成後沉澱，需要將pH降至低於3(以使羧基質子化)，或者需要使用諸如氯化鈉或硫酸銨這樣的鹽。(24)然而，我們發現形成DM並在之後利用酸化或鹽來沉澱而形成的DM顆粒會在用純H2O潤洗時重新溶解。
代替只使用鹽來在DM形成後使其沉澱，我們研究了使鹽存在於DM形成過程中的緩衝溶液中所帶來的效果。在NaCl的各種濃度下使DOPA在pH為8.5的緩衝溶液中進行徹夜(20小時)自氧化，使用光學顯微法對這些溶液進行觀察。如圖13所示，含有不超過125mM的NaCl的緩衝溶液中未形成可見的顆粒，雖然這些溶液的顏色確實變得越來越深。從250mM的NaCl開始出現小顆粒，而在500mM～1000mM的NaCl之間沉澱出更大的顆粒。500～1000mN的NaCl緩衝溶液所形成DM可通過離心以及在純H2O中清洗來收集而無需進行酸化。這暗示使鹽在DM的形成過程中存在很可能通過降低DHICA的靜電排斥而能夠增加DM的聚合或聚集，得到更大的顆粒。
掃描電子顯微法揭示出PDA顆粒的直徑約為5μm，且似乎由直徑約為500nm的更小的顆粒融合在一起而成。DM顆粒要大得多，測得其橫跨40μm，且也在其表面具有亞微米特徵(圖14)。
PTCA/PDCA比。我們推測Na+陽離子在形成過程中屏蔽了DHICA的帶負電荷的羧基，降低了靜電排斥，從而通過引入更多的DHICA使得聚合增加，形成更大的DM顆粒。為了對此進行研究，進行了鹼性過氧化物降解試驗，以將PDA和DM破碎成PTCA和PDCA，它們分別是DHICA和DHI的降解產物。如圖15所示，隨後使用RP-HPLC對這些產物進行量化，給予我們能夠指示DHICA/DHI的比例的PTCA/PDCA比。(27)為了進行對比，我們還對PDA、黑素的兩種市售可得的形式、通過酪氨酸的過氧化物氧化製得的合成黑素(SM)以及從烏賊上分離得到的烏賊黑素(CM)進行了該試驗。
PDA的PTCA/PDCA比最低，為0.426±0.02，這是意料之中的，因為PDA中沒有形成DHICA。然而，仍然存在可測量水平的來自於PDA的PTCA，這很可能是因為通過2號位與相鄰分子共軛的DHI所致。(23)而使用500mM的NaCl緩衝溶液合成的DM具有1.96±0.19的PTCA/PDCA比，這明顯高於PDA的PTCA/PDCA比。該結果與我們之前的發現相符，即利用FTIR確定，與PDA形成對比的是，DM含有羧酸(參見實施例1)。DM的PTCA/PDCA比也比SM的PTCA/PDCA比(0.533±0.01)高得多，這表明使用NaCl鹼性緩衝溶液形成黑素的方法相比於酪氨酸的過氧化物氧化(該方法用於形成商業SM)會導致更高的DHICA含量。我們的試驗還顯示CM還具有23.3±0.9的更高的比例，這與文獻中所發現的數值相一致。(28)這並不令人吃驚，因為已知天然黑素由於會使多巴色素重排成DHICA的多巴色素互變異構酶的酶促作用而含有約50％的DHICA，而在沒有酶的條件下形成的合成黑素由於多巴色素的自發性脫羧而只含有約10％的DHICA。(29)
提高黑素的DHICA含量。為了提高我們的合成黑素的DHICA含量，我們探索了在DM的形成過程中在pH為8.5的緩衝溶液中在各種濃度下使用不同的一價和二價鹽，即Na、K、Mg和Ca的氯化物。對於各鹽，使用125、250、500和1000mM以形成DM，以確定種類和濃度對PTCA/PDCA比的影響。我們觀察到需要至少500mM的NaCl或KCl以在不進行酸化的條件下形成不溶性DM，但只需要125mM的MgCl2或CaCl2就可辦到。如圖16A所示，通過使用鹼性過氧化物降解試驗，我們發現當緩衝溶液中存在更高濃度的鹽時，所形成的DM的PTCA/PDCA比有升高的趨勢。使用二價鹽比使用一價鹽導致了高得多的DM的PTCA/PDCA比。這暗示DM形成過程中緩衝溶液的離子強度會對所形成的DM的DHICA/DHI比產生重要影響。當將Na與K、Mg與Ca進行比較時，使用離子半徑更小的金屬導致了更高的PTCA/PDCA比。這可能是因為電荷密度更高的金屬離子具有更強的電荷屏蔽作用。我們的合成黑素中實現最高PTCA/PDCA比的是使用1000mM的MgCl2所形成的DM，其PTCA/PDCA比20.3幾乎與CM的比例23.3相當。
然後，我們使用在鉛結合試驗中使用四種不同鹽所形成的DM來確定這些鹽對所形成的DM的鉛結合容量的影響。在該試驗中，將這些樣品與1mM的Pb(II)溶液混合3小時，離心，並使用ICP-MS分析上層清液以確定Pb濃度的改變。如圖16B所示，我們發現被DM結合的Pb的量的排序與DM的PTCA/PDCA比的排序相同(Mg＞Ca＞Na～K)，這顯示DHICA的增加會導致金屬結合的增加。
重金屬結合。我們使用在含20mM的N,N-二羥乙基甘氨酸、pH為8.5、具有500mM的NaCl或500mM的MgCl2的緩衝溶液中形成的DM(下文中分別記為DM(Na)和DM(Mg))來繼續研究金屬結合。將這兩種DM與活性炭(AC)、PDA、SM和CM進行關於鉛、銅、鎘和汞的結合容量的比較。
如圖17A所示，Cu(II)結合容量的排序為DM(Mg)＞CM＞DM(Na)＞SM＞PDA。該排序與它們的PTCA/PDCA比的排序相匹配，只有DM(Mg)例外，它具有比CM更低的PTCA/PDCA比，但其具有比CM更高的Cu(II)結合容量。性能最佳的材料是DM(Mg)，其結合了可結合的Cu(II)的95.6％，實現了124.3mg/g的結合容量。CM緊隨其後，結合了可結合的Cu(II)的76.5％，相當於99.5mg/g的結合能力。Hong等人的研究發現新鮮的烏賊墨黑素結合了不超過70mg/g的Cu(II)，接近我們自己得出的結果。(30)相同的研究表明，黑素中的CU(II)結合位點是兒茶酚基團而非羧基。然而，Froncisz和Sarna早先使用電子順磁共振譜法提出當pH小於6時，Cu(II)結合至黑素的羧基。(31,32)Hong和Simon之後總結道，Cu(II)首先結合至兒茶酚位點，然後在更高的Cu(II)濃度下在羧基上結合。(33)我們的結果顯示，DHICA含量更高的黑素具有對Cu(II)更多的結合，支持了羧基確實在4.8的pH下會參與Cu(II)的結合這一觀點。
對於Pb(II)結合，PDA結合的Pb(II)是AC的約7倍，這與之前的研究相一致(圖17B)。(20)這些含有DHICA的黑素都具有比PDA高得多的Pb(II)結合容量，其排序為DM(Mg)＞CM＞DM(Na)＞SM。由於具有與Cu(II)結合相似的定性趨勢，我們推測Pb(II)類似地先結合至兒茶酚，然後在更高的濃度下結合至羧基。應當注意的是，DM(Mg)除去了超過99％的所有可除去的Pb(II)，相當於412.4mg/g的結合容量。
我們目前在我們的結果中所觀察到的趨勢為DM(Mg)可比CM結合更多的金屬離子，儘管其具有更低的PTCA/PDCA比，這可歸因於多種因素的組合。首先，所使用的CM是由約5～7％的基質蛋白組成的對金屬離子沒有明顯結合作用的黑素顆粒。(13)第二個可能的因素可能是DM(Mg)中殘餘的未氧化的DOPA減少了溶液中的金屬離子。
對於Cd(II)結合，含有DHICA的黑素具有相比於PDA至少8倍的結合容量(圖17C)。這一巨大的差異可能是由於Cd(II)在DHICA的羧基上的結合比在兒茶酚上的結合更多所致。Chen等人的研究發現相比於Pb(II)，結合至烏賊墨黑素的Cd(II)因與大鹽(macrosalt)競爭而減少得更多，這支持了對羧基的靜電吸引對Cd(II)結合具有更重要的作用這一觀點。(14)
對於Hg(II)結合，DM(Na)、DM(Mg)和CM的表現地同樣好，除去了所有可除去的Hg(II)的約99％(圖17D)。PDA和SM分別除去了可除去的Hg(II)的80％和88％。PDA和含有DHICA的黑素之間在Hg(II)結合容量上的反差比前述三種金屬離子的情況要小得多。然而，DM(Na)、DM(Mg)和CM除去的Hg(II)仍然是AC的7倍。這暗示相比於羧基，兒茶酚結合位點是更好的Hg(II)螯合劑。
Pb(II)結合親和性和接觸時間的影響。我們進一步研究了在0.2mM～2mM範圍內各種初始濃度下的Pb(II)對我們樣品的結合，以確定等溫線(圖18)。我們注意到金屬離子對黑素的結合發生在多於一種單一種類的結合位點上，且未顯示為表面吸附事件，因此不適用朗繆爾吸附方程的假設。然而，現有文獻使用了朗繆爾吸附模型來描述金屬離子對黑素的聚集結合親和性和容量(34,35)，因此我們為了進行對比也採用相同的方法。如表4所示，我們樣品的結合親和力和最大容量都遵循相同的排序：DM(Mg)＞CM＞DM(Na)＞SM＞PDA＞AC。DM(Mg)的最大Pb(II)結合容量為420.7mg/g，結合親和性為405mM-1。相比之下，發現AC具有19.2mg/g的結合容量和3.5mM-1的結合親和性。
表4：通過Pb(II)結合等溫線的線性化的朗繆爾回歸而得到的朗繆爾最大結合容量、朗繆爾親和常數和R2值。
Demirbas等人發現市售可得的磺化離子交換樹脂具有84mg/g的結合容量和12.3mM-1的結合親和性。(36)Sono等人確認了通過DOPA的酪氨酸酶自氧化塗布到PVDF上的合成真黑素具有92mg/g的Pb(II)結合容量和17.4mM-1的結合親和性。(34)我們的DM顆粒的高得多的結合容量和親和性可歸因於其在高離子強度緩衝溶液中形成的更高的DHICA含量，雖然我們注意到這些差異也可能部分由於採用不同的方法所致。
Pb(II)結合對接觸時間的依賴性通過對與黑素混合了不同時間的1mM的Pb(II)進行取樣來確定。如圖19所示，我們發現DM(Mg)、DM(Na)和CM在10分鐘內就達到了它們的最大吸收，該時間點為我們的第一時間點。對於SM，結合增加直至約240分鐘，而PDA在60分鐘時到達其結合峰值。DM顆粒對Pb(II)的快速結合使得它們適合作為用於在線水淨化的材料。
表面積。AC吸附重金屬的能力歸因於其高表面積。如表5所示，我們使用布朗諾爾-埃米特-泰勒(BET)表面分析來確定我們樣品的表面積。發現AC具有792.2m2/g的表面積。相比之下，發現我們研究中的所有黑素具有小於8m2/g的表面積，可被認為是無孔的。DM(Na)和DM(Mg)都具有比其它黑素小得多的表面積，這可被歸因於其較大的粒度。利用BET表面積分析和巴雷特-喬伊納-哈蘭達(BJH)孔容分析，Liu和Simon還確定了烏賊墨黑素是一種無孔材料(37)，這與我們的發現相一致。考慮到DM和CM的高結合容量，金屬結合很可能不僅發生在黑素顆粒的表面上，還通過金屬離子的內擴散而在整個材料中發生。Liu等人還推測在烏賊墨黑素中存在離子擴散通道。(13)
表5：AC和各種黑素的BET表面積。
收率。在凍幹三天以後，與大氣溼度平衡一天，隨後計算1克規模中PDA和DM形成的收率(平衡收率)。結果與推測的含水量一起示於表6中。
表6：PDA和DM形成的收率和推測的含水量。
結論。總之，我們通過在高離子強度下使用鹼性緩衝溶液合成了具有高DHICA含量的DM顆粒。我們展示了隨著DHICA含量的增加，黑素對諸如Pb(II)、Cd(II)、Cu(II)和Hg(II)這樣的重金屬具有更高的結合容量。DM顆粒被顯示為對Pb(II)具有高結合親和性和快速結合。綜上所述，本研究證明了高DHICA的合成黑素可在有毒重金屬去除的用途中具有前景。使用高離子強度的緩衝溶液使黑素自氧化，其DHICA/DHI比接近天然真黑素的DHICA/DHI比，這也可能是使用真黑素合成模型的研究者所感興趣的。
實施例3.用於重金屬捕獲的富含DHICA的DOPA黑素的簡單的製備。
在本實施例中，我們研究了使用高離子強度緩衝溶液來形成不溶性DM顆粒，將它們用於重金屬的捕獲，並且將它們的性能與AC、PDA顆粒以及黑素的其它形式的結合性能進行了比較。我們展示了聚合溶液中所使用的鹽的種類和濃度對於DM的DHICA亞單位與DHI亞單位的比例具有顯著影響，這反過來與DM結合重金屬的能力相關。
從水中除去高濃度重金屬的常規方法包括化學沉澱、膜過濾、離子交換樹脂、氧化-還原和溶劑萃取。[9]然而，這些方法常常不足以將重金屬的濃度降低至低於嚴格的法規要求。[10]對於痕量重金屬離子的去除，諸如活性炭、殼聚糖、沸石和黏土這樣的基於吸附劑的技術已被廣泛探索。[11]不幸的是，這些吸附劑中的許多遭受對於重金屬離子相對較低的結合容量和弱結合親和力之苦。[12]雖然在試圖通過現有吸附劑的化學改性來增加容量和親和性上取得了一些進展，[12-15]但仍然需要開發替代性的吸附劑。
雖然PDA的確切化學結構還有待充分闡明，但已知其主要含有DHI,[35]，而由DOPA形成的合成黑素則會含有DHI和DHICA亞單位(圖27)。由於DHICA含有可作為第二金屬結合位點發揮作用的羧酸，會期望合成DOPA黑素(DM)以相比於PDA更高的容量和親和性來結合重金屬。然而，相比於天然真黑素中發現的50％的DHICA，已顯示合成DM只含有約10％的DHICA。[36]迄今，關於將合成DM用於重金屬整治中的報導很少，我們認為這部分由於通過DOPA在鹼性緩衝溶液中的自氧化而形成的DM在pH大於3時保持可溶所致。[24,37]
相比之下，在相同緩衝溶液中形成的PDA容易沉澱且因此適於在重金屬結合後進行物理分離。[24]另外，DM的自氧化不會像PDA那樣容易生成塗層，特別是在諸如金屬氧化物這樣的帶負電荷的基材上。[38]推測這是由於形成過程中DHICA的羧基的負電荷的排斥限制了聚合和/或聚集所致，我們最近展示了使用高離子強度的緩衝溶液使DM膜能夠在各種基材上形成，給予其以通過靜電結合負載和釋放陽離子型藥物的能力。[39]
材料和方法。Pb(II)、Cu(II)、Cd(II)和Hg(II)的10000ppm標準溶液購自Inorganic Ventures(克裡斯琴斯堡，維吉尼亞州)。多巴胺.HCl、l-DOPA、烏賊黑素(CM，目錄號M2649)、合成黑素(SM，目錄號M8631)和所有其它化學試劑都購自西格瑪公司(聖路易斯市，密蘇裡州)。使用購自Thermolyne公司(迪比克市，艾奧瓦州)的NANOpure Infinity System將所有H2O純化至電阻≥18.2MΩ-cm。PDCA和PTCA由Kazumasa Wakamatsu博士友情提供。
黑素的合成。通過在室溫下使置於搖勻機上的敞口瓶中的N,N-二羥乙基甘氨酸緩衝溶液(20mM，pH為8.5)中的多巴胺.HCl(10mM)自氧化來形成PDA。然後在4500rcf下將溶液離心5分鐘，輕輕倒出上層清液，並使顆粒在H2O中重新懸浮。該清洗步驟重複進行10次，直至上層清液澄清。然後使顆粒在5mL的H2O中重新懸浮，凍幹，並在使用前儲存在乾燥器中。除了將l-DOPA(10mM)溶解在含有0～1000mM的NaCl、KCl、MgCl2或CaCl2的N,N-二羥乙基甘氨酸緩衝溶液(20mM，pH為8.5)中以外，按照相似的程序製備DM。如上所述進行DM的清洗和分離。
鹼性過氧化物降解試驗。使用已建立的方案[40]在最小的調整下查明天然和合成黑素的DHI和DHICA含量。簡而言之，使0.1mg的黑素懸浮於100μL的H2O中，將其與375μL的1M的K2CO2和25μL的30％的H2O2混合，並在室溫下震蕩20小時。然後，通過添加50μL的10％的Na2SO3使殘留的H2O2分解，並用140μL的6M的HCl酸化該混合物。使用RP-HPLC對80μL的該混合物進行分析，RP-HPLC採用C18柱，移動相為0.1M的磷酸鉀緩衝溶液(pH為2.1)/甲醇，比例為98:2(體積/體積)，保持在50℃，流率為0.7毫升/分鐘，檢測269nm處的吸收。為了進行定量，通過在我們的條件下對各種濃度的PDCA和PTCA標準溶液(發現它們分別在7.7和9.8分鐘時洗脫)進行取樣來確定標註曲線(圖26)。
金屬離子的結合。所有的金屬結合實驗都使用批處理技術來進行。金屬離子溶液通過用H2O將10000ppm的庫存溶液稀釋至2mM(Pb、Cu和Cd)或4mM(Hg)來製備。使用NH4OH和HNO3將pH調整至4.8(Pb、Cu和Cd)或3.6(Hg)。在典型的實驗中，在15mL不含金屬的離心管中，將5mg的黑素固體與10mL的金屬離子溶液混合。然後在室溫下，在搖勻機(rocker)上進行4小時的攪動，在15000rcf下使這些試管離心5分鐘。然後分離上層清液，並將其稀釋至金屬含量範圍為10～100ppb之間，然後使用電感耦合等離子體質譜(ICP-MS)進行分析。使用下式通過上層清液金屬離子濃度的下降來推測結合的金屬的量，其中，qe是每克吸附劑結合的金屬的質量，C0和Ce是溶液中金屬離子的初始濃度和最終濃度，V是體積，W是吸附劑的質量。
掃描電子顯微法。使PDA和DM顆粒懸浮在H2O中，將其吸取到1×1cm的矽晶片上並使其乾燥。然後對這些樣品塗布5nm的鋨並使用日立SU8030掃描電子顯微鏡在10kV下獲取圖像。
光學顯微法。DM顆粒如上所述由具有各種NaCl濃度的pH為8.5的N,N-二羥乙基甘氨酸緩衝溶液中的5mM的DOPA形成。經過16小時的形成之後，將1mL的各溶液吸取入聚苯乙烯24孔板中，並用明視場光學顯微法取得圖像。
PDA和DM的合成。N,N-二羥乙基甘氨酸緩衝溶液(20mM，pH為8.5)中的多巴胺溶液的顏色經過一段若干小時的時間因PDA形成且開始沉澱而變深。16小時之後，PDA顆粒可通過4500rcf下的離心而容易地被收集，且不溶於H2O。而使用該方法由l-DOPA合成的DM保持可溶，並且無法通過離心分離。Chio等人之前觀察到了相似的情況，並且注意到DM的沉澱和分離需要酸化至pH＜3或添加諸如氯化鈉或硫酸銨這樣的鹽。[37]然而，在我們的嘗試中，當使用本方法形成和分離的DM懸浮在純H2O中時，它們再次溶解。
為了尋找DM的一種不溶形式，其能夠作為用於從水中除去有毒金屬的固體載體發揮良好的作用，我們使DOPA在具有不同濃度的NaCl的pH為8.5的緩衝溶液中自氧化16小時。這些懸濁液的顏色隨著鹽濃度上升而變深，直至NaCl的濃度達到250mM，超過該值的沉澱可利用光學顯微法觀察到(圖20)。在500～1000mM的NaCl的條件下形成的DM固體可通過4500rcf下的離心並在純H2O中清洗來分離，而無需酸化，這暗示通過在高濃度NaCl的存在下自氧化而形成的DM與在低鹽濃度下形成的DM在生理化學上有所不同。我們推測Na+陽離子在形成過程中屏蔽了DHICA的帶負電荷的羧基，降低了靜電排斥，從而使得形成更大的DM顆粒的聚合增加。對於其它鹽的有限調查表明不溶性DM也可在含有KCl(500mM)、MgCl2(125mM)或CaCl2(125mM)的緩衝溶液中形成。掃描電子顯微法揭示出PDA和DM顆粒具有可變的尺寸且包含更小的亞微米顆粒的聚集體(圖21)。
DM的合成條件對PTCA/PDCA比的影響。為了確定黑素固體的DHI和DHICA含量，進行了鹼性過氧化物試驗，其中，使黑素的DHICA和DHI亞單位分別降解成吡咯-2,3,5-三羧酸(PTCA)和吡咯-2,3-二羧酸(PDCA)。因此，PTCA/PDCA比被認為是DHICA/DHI比的代表。[41]為了進行比較，我們還對PDA和通過酪氨酸的過氧化物氧化製得的合成黑素(SM)以及從烏賊上分離得到的烏賊黑素(CM)進行了該試驗。該試驗顯示SM和CM具有0.63±0.1和26.4±1.3的PTCA/PDCA比(表7)，這與文獻所述相一致。[42]天然黑素的高得多的DHICA含量是由於會使多巴色素重排成DHICA的多巴色素互變異構酶的酶促作用所致，而在沒有酶的條件下形成的合成黑素由於多巴色素的自發性脫羧而含有更低的DHICA含量。[36]
表7.PDA和DM形成的收率，由1克多巴胺.HCl或L-DOPA起始。
PDA的PTCA/PDCA比最低，為0.48±0.03，預計是因為多巴胺前體缺乏羧酸所致。然而，在PDA中測得了少量但可檢測水平的PTCA，這很可能是由於通過2號位共軛的DHI亞單位所致。[35]有趣的是，在500mM的NaCl緩衝溶液中合成DM這種簡單的調整使PTCA/PDCA比上升至1.80±0.02，這比PDA和SM的PTCA/PDCA比(p＜0.001)要高得多。該結果與我們之前的發現相符，即利用FTIR確定在高離子強度下形成的DM塗層含有羧酸。[39]DM的高PTCA/PDCA比表明使DM在鹼性的緩衝生理鹽水中自氧化的方法導致相比於用於形成市售SM的酪氨酸的過氧化物氧化這種方法更高的DHICA含量。
我們還探索了一價鹽(NaCl、KCl)和二價鹽(MgCl2、CaCl2)的不同濃度對PTCA/PDCA比、進而對Pb結合的影響。在存在125、250、500和1000mM的上述每一種鹽的條件下形成DM，以確定對PTCA/PDCA比的影響。對於每一種鹽，我們發現一個明顯的趨勢(p＜0.01)，即PTCA/PDCA比隨鹽濃度的上升而增大(圖22A)。NaCl的PTCA/PDCA比與KCl的相似，數值在1.6～2.1之間。在DM的形成過程中使用二價鹽比使用一價鹽導致了高得多的PTCA/PDCA比。除了二價陽離子提供的更高的離子強度以外，該結果還可能與兒茶酚鹽氧化增多有關，兒茶酚鹽氧化增多是因為兒茶酚在與鹼土金屬陽離子絡合過程中發生額外的去質子化。[43]使用1000mM的MgCl2形成的DM的PTCA/PDCA比最高，為20.3，這幾乎與天然CM(26.4)相當。這些數據表明DM形成過程中的緩衝溶液中所使用的鹽的濃度和電荷都會強烈影響DHICA/DHI含量。
Pb(II)結合。為了確定DM合成過程中的鹽對其金屬結合性質的影響，將黑素粉末與1mM的Pb(II)溶液混合3小時，離心，並且使用ICP-MS分析上層清液以確定殘餘的Pb(II)濃度。如圖22B所示，我們發現使用MgCl2形成的DM結合了最多的Pb(II)，排第二的是CaCl2。使用NaCl和KCl形成的DM結合了最少的Pb(II)。對於每一種鹽，結合的Pb(II)的量也在DM的形成過程中隨鹽濃度的上升而增多。該趨勢與DM的PTCA/PDCA比(Mg＞Ca＞Na～K)相關，並且暗示鹽的種類及其濃度都能夠通過在形成過程中增加DHICA含量而間接地增加DM結合Pb(II)的量。
隨後，我們對在500mM的NaCl或500mM的MgCl2的存在下形成的DM(下文中分別稱為DM(Na)和DM(Mg))、活性炭(AC)、PDA、SM和CM的Pb(II)結合性質進行了比較。在0.2mM～2mM的Pb(II)中對這些固體進行4小時的培養，並利用ICP-MS測定未結合的Pb(II)。使用朗繆爾吸附等式來擬合這些數據，雖然我們注意到金屬離子對黑素的結合可能在多於一種類型的結合位點上發生。然而，現有文獻使用了朗繆爾吸附模型來描述金屬離子對黑素的聚集結合容量和親和性[44,45]，因此我們為了進行對比也採用相同的方法。
如表7和圖23所示，發現PDA具有89.2mg/g的最大Pb(II)結合容量，大約是最大Pb(II)結合容量為18.2mg/g的AC的5倍。所有含DHICA的黑素都具有比PDA高得多的最大Pb(II)結合容量，排序為PDA＜SM＜DM(Na)＜CM＜DM(Mg)。與圖22中所見的趨勢相似，黑素的Pb(II)結合容量遵循與它們的PTCA/PDCA比的排序相同的排序，只有DM(Mg)例外，它具有比CM更高的容量，儘管其具有比CM更低的PTCA/PDCA比。引人注目的是，DM(Mg)具有494.1mg/g的最大Pb(II)容量和170.5mM-1的結合親和性。該結合容量高於許多其它種類的吸附劑(例如沸石、黏土和殼聚糖)的結合容量[11]，甚至高於市售可得的磺化離子交換樹脂的結合容量，Demirbas等人測定這種市售可得的磺化離子交換樹脂具有84mg/g的Pb(II)結合容量和12.3mM-1的結合親和性。[46]
在最近的研究成果中，Sono等人測定通過DOPA的酪氨酸酶氧化而塗布在PVDF上的合成黑素具有92mg/g的最大Pb(II)結合容量和17.4mM-1的結合親和性。[44]我們的DM顆粒的更高的結合容量和親和性可歸因於其更高的DHICA含量，所述更高的DHICA含量是在高離子強度溶液中進行製備的結果，雖然我們提醒這兩種研究之間存在方法上的差異。
Pb(II)結合對接觸時間的依賴性通過在黑素粉末中對2mM的Pb(II)進行一段8小時的培養來確定。如圖24所示，我們發現DM(Mg)、DM(Na)和CM在所研究的第一時間點(15分鐘)內就達到了它們的最大吸收，該時間點為我們的第一時間點。對於SM和PDA，結合增加直至約60分鐘。DM顆粒對Pb(II)的快速結合可使得它們適合作為用於在線水淨化的吸附劑。
對其它重金屬的結合容量。使用相似的方法，確定AC和各種黑素對Cu(II)、Cd(II)和Hg(II)的結合容量。如圖25A所示，Cu(II)結合能力的排序為AC＜PDA＜SM＜DM(Na)＜CM＜DM(Mg)。該排序與Pb(II)結合的排序相似，且匹配它們各自的PTCA/PDCA比的排序，只有DM(Mg)例外，它具有148.4mg/g的更高的Cu(II)結合容量，儘管其具有更低的PTCA/PDCA比。我們發現CM結合了117.2mg/g的Cu(II)。相比之下，Hong等人發現新鮮的烏賊墨黑素結合了不超過70mg/g的Cu(II)。該差異可能是由於Hong等人在測量金屬離子濃度之前用0.1mM的HCl清洗了Cu(II)飽和的CM顆粒所致，這麼做可能導致已結合的Cu(II)部分脫附。[47]
在同一研究中，提出了黑素中的Cu(II)結合位點是兒茶酚基團而非羧基。然而，Froncisz和Sarna早先使用電子順磁共振譜法提出當pH小於6時，Cu(II)結合至黑素的羧基。[48,49]Hong和Simon之後總結道，Cu(II)首先結合至兒茶酚位點，然後在更高的Cu(II)濃度下結合至羧基。[50]由於Pb(II)與Cu(II)具有定性上相似的結合趨勢(圖25B)，我們推測Pb(II)類似地先結合至黑素的兒茶酚，然後在更高的濃度下結合至羧基。
對於Cd(II)，我們發現富含DHICA-DM(Na)、DM(Mg)和CM的黑素結合的Cd(II)是PDA結合的9.6倍～13.2倍(圖25C)。該反差比Pb(II)和Cu(II)的情況大得多，後兩者分別為4.3倍～6.2倍和6.2倍～8.8倍。這可能暗示Cd(II)主要結合在DHICA的羧基上而非結合在兒茶酚上。Chen等人的研究發現相比於Pb(II)，結合至烏賊黑素的Cd(II)因與鹽競爭而減少得更多，這支持了對羧基的靜電吸引對Cd(II)結合具有更重要的作用這一觀點。[21]
對於Hg(II)，DM(Na)、DM(Mg)和CM出人意料地結合了1128～1244mg/g的Hg(II)(圖25D)。相比於結合了622mg/g的Hg(II)的PDA，富含DHICA的黑素的結合量是其兩倍。考慮到已知神經黑素具有對Hg(II)離子的高親和性，該結果可能並不令人吃驚。[22]對於黑素中的Hg(II)結合，兒茶酚結合位點可能至少與羧酸位點一樣重要。另外，可通過利用兒茶酚的氧化還原反應將Hg(II)還原為Hg(0)。
對於所有四種重金屬離子，我們觀察到，DM(Mg)比CM結合得更多，儘管其具有更低的PTCA/PDCA比。這可歸因於多種因素的組合。首先，所使用的CM是包含約5～7％的基質蛋白的黑素顆粒，該基質蛋白不被期望展現出對金屬離子具有明顯結合作用。[51]第二個因素可能是CM已經含有少量在海水中發現的內源性金屬離子，這減少了表觀的結合容量。[20]
表面積。使用布朗諾爾-埃米特-泰勒(BET)表面分析來確定我們的吸附劑的表面積(表7)。發現AC具有792.2m2/g的表面積，而發現我們研究中的所有黑素具有小於8m2/g的表面積，可被認為是無孔的。DM(Na)和DM(Mg)都具有比其它黑素小得多的表面積，這可能與其是在高離子強度下形成的有關。利用BET表面積分析和巴雷特-喬伊納-哈蘭達(BJH)孔容分析，Liu和Simon還確定了CM是一種無孔材料[52]，這與我們的發現相一致。AC吸附重金屬的能力歸因於其高表面積。然而，考慮到DM和CM的高結合容量和低表面積，金屬結合很可能不僅發生在黑素顆粒的表面上，還通過金屬離子的內擴散而在整個材料中發生。該假說也受到Liu等人的支持，他們根據烏賊墨黑素對Fe(III)的高結合容量提出烏賊墨黑素中存在離子擴散通道。[20]
總之，我們通過高離子強度的鹼性緩衝溶液中的自氧化合成出了不溶性的DM顆粒。使用二價鹽和高鹽濃度導致DM中的更高的DHICA含量。具體而言，在MgCl2中形成的DM具有最高的DHICA含量，幾乎與天然黑素的相媲美。DM中DHICA含量的增加與Pb(II)結合的增加相關聯。橫向比較了AC、PDA、SM、DM(Na)、DM(Mg)和CM的對Pb(II)的朗繆爾最大結合容量和結合親和性，發現DM(Mg)具有最高的容量和親和性。還測量了對Cd(II)、Cu(II)和Hg(II)的結合容量，相似地，發現DM(Mg)具有比AC、PDA、SM、DM(Na)和CM高得多的結合容量。綜上所述，本研究證明了富含DHICA的合成黑素能夠在高離子強度下輕易製得並發揮能夠將重金屬從水溶液中隔離的優異的吸附劑的作用。在高離子強度下形成的合成DM還可能作為真黑素的合成模型引起研究者的興趣，因為它們的DHICA含量非常接近天然真黑素的DHICA含量。
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