標記試劑和測定方法

2023-06-07 12:29:26

專利名稱：標記試劑和測定方法
在生物和化學分析中，常規使用的是用報導基團標記的分析物分子。根據本發明提出的想法可提供試劑，它具有至少兩個與一個或多個報導基團相連接的分析物基團。可以下述方式使用這種試劑以便比簡單標記的分析物產生多得多的分析信息。可以編碼報導基團以使帶有多種分析物基團和多種報導基團的試劑能被組合合成並同時使用，而且報導基團可在分析階段被分辨出。
WO93/06121(Affymax)描述了合成的寡聚體庫，它含有多種不同的成員，每個成員所包含的寡聚體由一系列單體組成，單體與寡聚體中鑑定單體序列的一個或多個鑑定標記物相連接。寡聚體和鑑定標記物之間的連接優選包含固體顆粒，鑑定標記物優選為寡核苷酸。
本發明一方面提供了一種試劑，它含有a)分析物部分，該部分含有至少兩個分析物殘基，並連接於b)標記部分，此部分含有一個或多個適於通過質譜法檢測的報導基團。
其中報導基團標示出分析物殘基，選擇標記部分各個位置的報導基團用以標示在分析物部分的限定位置上的分析物殘基。
優選分析物部分與標記部分通過可裂解(如可光裂解)的鍵相連接。也可以提供接頭基團使分析物部分和標記部分部結合到接頭基團上。優選分析物部分是n個分析物殘基的鏈，標記部分是至多n個報導基團的鏈，選擇標記鏈的各個位置的報導基團用以標示分析物鏈的相應位置的分析物殘基。n是至少為2的整數，優選為3至20。
本發明可用於檢測所有感興趣的分析物，它們包括但不局限於蛋白質/肽鏈，從而分析物殘基是胺基酸殘基；核酸/寡核苷酸鏈，從而分析物殘基是核苷酸殘基；糖鏈，從而分析物殘基是糖殘基。另外，分析物也可以是具有生物學、藥物學或治療活性的一類小分子。例如，它可以是帶有質譜標記的核心分子，該分子具有這樣的能力，即可以組合的方式改變不同的取代基，如烷基、酯、胺、醚等。
標記部分和/或其中的報導基團或每個報導基團能被觀察/檢測/分析以便提供關於分析物部分和/或其中的分析物殘基的特徵的信息。
在一個實施方案中，試劑的化學式為A-L-R，其中A是構成分析物部分的n個分析物殘基的鏈，L是接頭，R是構成標記部分的至多n個報導基團的鏈，n是2-20，其中標記部分含有限定分析物部分的分析物殘基之定位的信息。
標記部分由一個或多個質量有所區別的報導基團組成，因此可通過質譜法分析之。報導基團的化學特性也可能不相同，因此可通過分子量互相區別。或者報導基團可以化學特性相同，但是通過含有不同的同位素(例如下文討論的12C/13C和1H/2H)可互相區別。標記部分和/或報導基團適於在例如通過光化學或其它方法從試劑中裂解出來後通過質譜法分析。
質譜法作為檢測系統的優點在於其高度敏感性——僅需要幾百個分子就可得到良好的信號；其廣泛的動力學範圍和高解析度——可分辨出質量範圍為100至200,000道爾頓的分子，分辨能力超過0.01；其通用性——可容易地分析出多種不同化學結構的分子；通過將質譜法和例如掃描雷射解析結合反映分析物的潛力；相對於僅定性測定而言，還具有定量測定的能力。
因此質量標記結合了放射性和螢光的優點，並且還對新的應用有貢獻。
在另一方面，本發明提供了上述試劑的庫，其中此庫由多種試劑構成，每種試劑含有不同的具有n個分析物殘基的分析物部分。例如，此庫可由4n種試劑構成，每種試劑含有不同的具有n個核苷酸殘基的寡核苷酸鏈。此庫中的試劑可混合存在於溶液中。
在另一方面，本發明提供了一種測定方法，它包括下述步驟提供靶物質；在導致至少一種試劑與靶物質結合的條件下，將靶物質與所說的試劑庫一起保溫；除去未結合的試劑；回收結合的試劑或每種結合的試劑的標記部分；分析回收的標記部分，以此作為與靶物質結合的分析物部分的特徵的指示。
可將靶物質固定，因為這麼做可提供一種便利的方法以將結合的和未結合的試劑分開。靶物質一方面可以是生物體或組織或細胞群體，可以進行測定以篩選候選藥物族。靶物質另一方面可以是核酸，這一方面將在下文中詳細討論。
參看附圖，其中圖1是根據本發明的試劑合成的一般性圖解。
圖2表示具有三個不同的含有報導基團的標記鏈體系的試劑。
圖3a是顯示編碼的寡核苷酸的合成的圖解，圖3b是顯示閱讀標記鏈密碼子的圖解。
圖4是顯示通過逐漸連接進行序列分析的圖解。
圖5是關於將通過雜交進行的序列閱讀擴展為寡核苷酸測定的圖解。
圖1和2的圖例包括在本說明書的末尾。
參照下述的實施例應用，它們描述了怎樣應用該方法分析核酸序列以及篩選候選藥物。
編碼標記物的合成用於同時標記多種分析物的方法的原理類似於Brenner和Lerner(1992)提出的以結合的核酸序列編碼肽類的方法原理。他們想法的意圖是加入標記物，此標記物可通過聚合酶鏈式反應來擴增。並通過測定產生的DNA分子的序列來閱讀。
通過考慮試劑是如何製成的可最好地闡明試劑的結構。合成是從二價或多價接頭開始的，此接頭可在一個方向上逐步延伸以在分析物上增加殘基，在另一方向上逐步延伸以增加殘基特異性的報導基團(圖1)。假設我們希望製備有機化合物的混合物，在合成的每個階段引入不同的殘基。例如，混合物可含有一組具有不同胺基酸序列的肽類或者一組具有不同鹼基序列的寡核苷酸，或者一組具有潛在的藥理活性的變異體，其核心結構上結合有不同的基團；在每種情況下，我們都希望用獨特標記物標記每種結構變異體，通過分開各步驟中的合成並給標記物增加相應的殘基可實現這一目的，在各步驟中不同的殘基被增加到感興趣的化合物上。
例如，假設我們希望製備4096種每種帶有獨特標記物的六核苷酸混合物，應將二價接頭的四個樣品與每種鹼基和鹼基的獨特報導基團相偶合(圖3a)，然後混合四種樣品，分成四份並重複此過程。結果可得到一組二核苷酸，其中每種具有獨特標記物，重複此過程直到完成六個偶合步驟。
接頭和報導基團接頭應具有一個適於分析物合成的基團-羥基、氨基或巰基都適於啟動寡核苷酸的合成，已發現類似的基團可啟動其它途徑，例如多肽類的合成。對於一些類型的化合物而言，可能需要從形成分析物的一部分的「核心」化合物開始。啟動加入報導基團的基團選擇取決於報導基團的特徵以及用來偶合它們的化學過程，這種化學過程不得不與用來合成分析物的化學過程相匹配。對於寡核苷酸合成的例子而言，有多種選擇。確定的方法使用苯甲醯基和異丙基以保護鹼基，用酸不穩定性的三苯甲基以在偶合過程中臨時保護5′-OH基團，使用β-氰基乙基以保護磷酸酯。用以偶合報導基團的方法不會進攻這些保護基團或寡核苷酸中的其它鍵，標記物的合成不會受到寡核苷酸的延伸中所用的偶合、氧化和脫保護的影響。
報導單體的偶合或鏈的加帽在各個步驟中都可能是不完全的(圖2的B和C)，所以分析物偶合於嵌套的一組報導基團結構。這可以使從標記的組成推導分析物的結構變得較容易(圖1；圖3)。為了使合成變得較容易，接頭需要通過連接，結合於固體支持物上，此連接可在不使分析物或報導基團降解的情況下被裂解。或者，此接頭可帶有能從試劑中分離中間體和終產物的基團，例如帶電基圖或親脂基團。
報導基團可以有多種形式，主要的考慮是需要通過質譜法閱讀此標記物的組成或序列。可能性包括具有不同原子或分子量的基團，例如不同長度或不同同位素組成的脂族鏈。使用同位素標記的亞甲基可以給四種不同報導基團中的每一種分配一組獨特的式量(表1)。
表1基於H和C同位素的報導基團的例子
以寡核苷酸為例，這些標記物可以成套，它允許從系列中的部分產物之增長的質量中讀出寡核苷酸中各個位置的鹼基(表2)。假如加入報導基團的最小增長比最小和最大報導基團之間的質量差異要大的話，那麼所有寡核苷酸序列都會給出獨特系列的標記物片段重量。
表2具有同位素報導基團的寡核苷酸的例子
對於質譜法而言，將需要有一簡單方法從分析物中裂解標記物鏈，有幾種可能性，在這些方法中適於寡核苷酸和肽分析物的是光不穩定性鍵的光引發裂解；酶裂解，如酯鍵的酶裂解；自由基引發的裂解。
進一步的需要是標記物應適合分析中所用的化學和生化過程對於分子雜交中所用的寡核苷酸的例子或所提出的測序方法之一而言，它們必須是可溶的，必須不抑制分析中可能使用的某種酶解反應。經驗表明，類似於表1中所示的亞甲基類似物的低聚乙二醇連接適於寡核苷酸的分子重締合。另外這種連接至少適於一些酶解反應，正如我們已經表明的那樣，通過六乙二醇接頭束縛到玻璃上的寡核苷酸經用多聚核苷酸激酶和ATP處理可轉變成5′-磷酸單酯。
接頭的所需特徵為了設想的應用，接頭分子具有下列特徵是必需的應可以將之與固體支持物相連接以允許進行可產生分析物和相應標記物的合成循環，而無需煩瑣的中間體純化。合成循環之後，應在保持分析物和標記物完整的條件下從固體支持物上除去接頭。標記物合成的功能基團應是那些允許標記物的快速合成的基團，標記物可通過質譜法相互區別。
接頭應具有被保護的功能基團，它分別允許分析物和標記物的延伸，所用條件是其中一個的化學過程不會幹涉另一個的化學過程。
接頭應優選帶有帶電的基團以使在沒有基質時可進行質譜分析。除了這一目的外，還要求標記物應含有揮發性足夠好的化合物以便能在質譜儀中蒸發，而不需求助於複雜的技術，如電噴射。標記物應產生穩定的離子，或產生斷裂為可被用於鑑定相應分析物的特徵模式的離子。
標記物和分析物之間的接頭應優選可被光裂解，以使標記物可通過雷射照射在質譜儀中直接裂解，通過暴露於燈下可方便地進行進一步的裂解以完全除去它們從而允許諸如連接之類的生化步驟。
連接產物應優選可溶於含水溶劑中以使它們可用於生化反應中。
本文所述的實施例中顯示了具有這些所需特性的接頭。
可光裂解的基團光裂解的基團根據的是已知的光不穩定性鄰硝基苄基。此基團在寡核苷酸合成[見Pillai Synthesis1(1980)的綜述]中已被用作磷酸酯基團和2′-羥基基團這兩者的保護基團。對於標記物和分析物之間接頭的隨後的結合而言，鄰硝基苄基自身缺乏進一步的功能化。可購得的是化合物5-羥基-2-硝基苄醇。已知可在5，4位加上OMe基團，而不會顯著降低光不穩定性特性(見Pillai的綜述)，因此，可將5-羥基-2-硝基苄醇用作起始點，目的是從苄醇處延伸DNA合成，來自醚的標記物與接頭鏈在5-羥基處偶合。
對於存在的功能性基團而言，需要允許分析物和標記物的組合合成，因此對於標記物的合成而言，從可光裂解的基團至所需的功能基團部需要接頭臂。還優選在固體支持物上進行組合合成，因此接頭臂在功能基團中必須是二價的，並具有鄰位的保護基團以允許選擇性合成轉化。優選的標記試劑含有二醇連鍵/醚連鍵。為了合成的目的，通常可通過3′-羥基和琥珀酸酯連鍵將寡核苷酸與長鏈氨基CPG支持物相連接。因此相信所需的功能基團是醇。
已合成了下列中間體化合物 它包含芳香族的接頭，此接頭帶有用於分析物合成的甲氧基三苯甲基(-CH2ODMT)；
用於光裂解的鄰硝基；用於標記物合成的O-叔丁基二苯基甲矽烷基(OTBDPS)；用於轉變成帶正電基團以用於質譜分析的叔胺基團；用於與支持物結合的N-羥基琥珀醯亞氨基。
當分析物為肽時，需考慮的條件變化很小。在肽合成的大多數條件下，2-硝基苄基是穩定的，此基團和相關的類似物在肽合成(見Pillai的綜述和其中包含的參考文獻)中已被用作光不穩定性基團。已有幾種樹脂適於具有不同裂解模式的肽合成。分析物和標記物合成的鄰位保護基團可以叔丁氧羰基和2-甲氧基乙氧基甲基為基礎。可使用叔丁氧羰基保護胺基酸中的氨基，通過用三氟乙酸處理將其裂解。可使用2-甲氧基乙氧基甲基保護如前所述的以1，n烷基二醇衍生物的質量差異為基礎的標記基團和標記物。已經表明叔丁氧羰基的裂解與2-甲氧基乙氧基甲基保護基團可以匹配。可用溶於二氯甲烷中的溴化鋅選擇性地裂解2-甲氧基乙氧基甲基保護基團。儘管上文闡明了步驟，但本領域技術人員應認識到這組鄰位保護基團不會以任何方式限制本發明，它只是作為代表性的例子。
報導基團的檢測和分析光裂解是從分析物中釋放標記物的理想方法；它快速，可以在幹態下進行，可使用掃描雷射在很小的範圍內反映，範圍小到足以反映細胞內的特徵(de Vries等人，1992)，從而可使用提出的方法檢測定特定分析物的位置，此分析物已被用於「染色」細胞或組織切片中的不同細胞的表面或內部，如可能需要它們來反映配位體(如候選藥物)和它們的受體之間的相互作用。
光敏保護基團對於很寬範圍的化學殘基都適用[Pillai的綜述，1980]。可用作廣泛範圍的化合物之保護基團的光不穩定性鄰硝基苄基形成了可設想出的許多分析物的理想的接頭起始點，其中包括肽類和寡核苷酸。以寡核苷酸為例，它提供了光敏連鍵，此連鍵可定量斷裂產生羥基。如在下文測序方法中所述，它可允許在連接延伸中產生脫保護的寡核苷酸。另外已知此基團在寡核苷酸合成過程中是穩定的。有必要修飾苄基環以提供可用以啟動標記物合成的基團；諸如上述低聚乙二醇系列的報導基團不會幹涉鄰硝基苯甲醯基的光化學裂解反應(Pillai op.cit.)。在增強裂解的芳香環中可加入其它基團；可利用這種基團中加入帶電基團以簡化質譜儀中的分析。現代質譜儀可測定幾百個分子，分辨能力超過0.01道爾頓，至高可達總質量200kD。因此優選的光不穩定性接頭可表示為其中帶正電的基團R可與芳香環直接結合或存在於其中一個接頭臂中 儀器的使用可通過幾種質譜法形式中的一種分析提出的分子標記物。對於多種目的而言，儘管需要從分析物中裂解標記物，卻不需要使標記物成為片段，事實上因為它會導致模稜兩可而不合要求。質譜法的最新進展使得可以測定很大的分子而無需太多斷裂；由於可以設計接頭以使它在其餘標記物穩定的條件下易於裂解，測定過程中應能夠避免標記物的斷裂。在大多數情況下分析物基團的揮發性比標記物要差，在許多應用中分析物基團會與固體底物結合，因此可防止它對質譜的幹涉。
在不會導致絕大多數共價化學鍵斷裂的條件下，光子照射使上述接頭很不穩定。適當的儀器已被描述[de Vries等人，1992]，它使用雷射，該雷射可聚焦成小於1μm的點。通過移動可定位至0.1μm的鏡臺可掃描出至多250mm的象。
此儀器還可使待測物種離子化，此離子化是通過將離子化雷射掃過鏡臺表面照射以使它與解吸附雷射所破碎的物種相互作用。如果它不可能包括標記物中的帶電殘基，或者如果對於讀出標記物來說斷裂是必需的，那麼此儀器可用於本方法。
本發明另一方面提供了測定靶核酸序列的方法，此方法包括下列步驟a)提供固定於支持物上的寡核苷酸，b)使靶核酸與固定化的寡核苷酸雜交，c)將來自b)的雜交體與如上定義的試劑庫一起溫育，庫中的試劑都混合於溶液中，溫育可使庫中第一試劑的寡核苷酸鏈與相鄰於固定化寡核苷酸的靶核酸雜交。
d)連接相鄰的寡核苷酸，從而形成連接的第一試劑，e)除去其它未連接的試劑，和f)回收並分析連接的第一試劑的標記部分以作為靶核酸的第一部分的序列的指示。
實施例應用通過參考將編碼寡核苷酸用於核酸分析的方法，我們闡明了本發明可能的應用。
1.通過逐漸連接確定核酸序列(圖4)在步驟b)中需確定的序列首先與結合於固體支持物上的寡核苷酸雜交。如果需測序的DNA已被克隆進如噬菌體M13的單鏈載體中，則可將固體支持物上的「引物」寡核苷酸選擇成載體序列的一部分。在步驟c)中，將攜有來自步驟b)的雜交體的固體支持物與編碼的寡核苷酸試劑的溶液一起溫育，例如與上述文庫一起溫育，此文庫含有所有給定長度的序列，比如4096六核苷酸(通常為4nn聚體)。在步驟d)中，引入連接酶以使互補於靶DNA的開始六個鹼基的六核苷酸與固定化的引物寡核苷酸相連接，通過此步驟通過將其寡核苷酸鏈與固定化的引物寡核苷酸相連接可使來自庫中的第一編碼的寡核苷酸試劑連接起來，這裡指的是連接的第一試劑。
在步驟e)中，例如通過洗滌可除去未連接的試劑。在步驟f)中，連接的第一試劑之接頭被斷裂以解除標記鏈，回收並分析之以作為靶DNA的第一部分的序列的指示。
優選的，接頭的除去也暴露了第一寡核苷酸鏈末端的羥基或磷酸基團，以使它適於與第二試劑的寡核苷酸鏈相連接。包括光化學、酶促和化學水解的幾種斷裂接頭的方法可以被用以產生進一步的連接所需的3′-羥基或5′-磷酸基團。然後重複步驟c)、d)、e)和f)。這些步驟包括庫中第二試劑的雜交，連接的第二試劑的標記鏈的連接回收和分析以及進一步連接所需的另一個3′-羥基或5′-磷酸基團的產生。重複此步驟直至所有DNA序列被讀出或者直至反應產率很低以致毫無用處。
圖4所示為此序列的四個時相。第一示圖相應於第一輪循環中步驟e)末期的狀況，第二示圖相應於步驟f)末期的狀況，第三示圖相應於第二輪循環中步驟c)末期的狀況，第四示圖相應於第二輪循環中步驟d)末期的狀況，此技術的循環特徵已經顯示出。2.通過相繼的連接測定多種模板的核酸序列作為第一個例子的擴展，可設想能夠同時分析多個序列，例如，可將需測序的DNA的各個克隆固定化a)使用一系列針狀物，將相同的載體寡核苷酸固定於每個針狀物的末端，使靶DNA的單個克隆與固定於每個單個針狀物上的寡核苷酸雜交。然後將攜有這些雜交體的一系列針狀物與溶液中的編碼的寡核苷酸試劑的試劑庫一起溫育，此溶液中還含有直接成分。這一步驟的結果是每個針狀物攜有不同的連接的試劑，最後，如前所述回收和分析每種連接的試劑的標記鏈。如果將此系列針狀物適當地間隔開，就可以將它們浸入微量滴定板的孔中，第一塊板含有需測序的模板，第二塊板含有試劑庫和連接溶液，第三塊板含有裂解來自針狀物的標記鏈的試劑。
b)或者，用引物寡核苷酸包被表面，優選通過其5′末端或在其它的一些位點共價結合於表面。需測序的DNA的單個克隆位於被包被的支持物上的間隔位置，從而靶DNA的各個單獨的克隆與固定於支持物上單個間隔位置的寡核苷酸雜交，然後將支持物與含有試劑庫和連接成分的溶液一起溫育，除去未連接的試劑，再裂解處於每個間隔位置的連接的試劑的接頭並回收和分析標記物。優選通過例如雷射解吸的方法來導致裂解，此方法能定位於表面上很小的區域。此方法的優點是可同時分析大量DNA序列。
3.通過與寡核苷酸雜交擴展序列測定法a)方法I已成功建立了以高密度將DNA點樣於膜上的方法[Hoheisel等人，1992；Ross等人，1992]。為了測定指紋和序列，必須或單個地或以小套使用寡核苷酸，以便雜交模式不會太複雜以致於不能解釋；結果，在分析的各輪循環中只有小部分的模板可產生信號。如果每次雜交的信號含有編碼的信息，此信息使得其序列可被測定，可使用更複雜的混合物，在雜交的各輪循環中可搜集到更多的信息。混合物的複雜度依據DNA模板的長度以及分辨混合的寡核苷酸序列的分析方法的能力。
由這些質譜標記物或報導基團編碼的核酸探針非常有用，其中使用多種探針是有利的，例如在DNA指紋或突變分析中。質譜標記物可提供多用性的優點。
在典型的核酸雜交測定中，可同時使用大量不同的探針，每個探針標記有其自身獨有且適當的質譜標記物。由於質譜中標記物的分離和分辨，在其它探針的存在下，可獨特地測出每個進行雜交的單個探針的序列。
本發明在此方面提供了測定靶核酸序列的方法，此方法包括下列步驟i)提供固定於支持物上的靶核酸，優選將靶核酸的單個克隆間隔地固定於支持物上。
ii)將來自i)的固定化的靶核酸與多種上述編碼的寡核苷酸試劑一起溫育，以使不同試劑的寡核苷酸鏈與支持物上的靶核酸雜交。
iii)除去未雜交的試劑，和iv)回收並分析每種試劑的標記部分以作為部分靶核酸序列的指示。
下文優選使用試劑庫，循環地重複雜交、連接、裂解和分析步驟以提供靶核酸序列的其它有關信息。
b)方法II當核酸與一系列寡核苷酸雜交時，可從所形成的雙螺旋模式測出核酸序列。可被測定的序列長度大約為系列大小的平方根如果使用所有65，536八核苷酸的系列，則待測定的序列應為200bp左右[Southern等人，1992]。通過將需測定序列中連續出現八個鹼基的頻率限制為不超過一次即可強加對大小的限制。國際專利申請WO89/10977中描述了序列測定中的系列及其用途；國際申請WO90/03382中描述了提供一系列通過例如其5′-末端或3′-末端固定於表面的寡核苷酸的方法。
通過本發明的方法，能大大延伸可被測定的序列長度。在本發明的此方面，此方法包括下列步驟a)提供固定於支持物上間隔位置上的一系列寡核苷酸，在某一位置上的寡核苷酸與在其它位置的寡核苷酸不同。優選該序列為通過共價鍵固定於支持物上的各個間隔位置的寡核苷酸的序列，b)將靶核酸與一系列固定化的寡核苷酸一起溫育以便在支持物上的一個或多個間隔位置上形成雜交體，c)將來自b)的雜交體與編碼的寡核苷酸試劑庫一起溫育以使庫中試劑的寡核苷酸鏈與相鄰於每個固定化寡核苷酸的靶核酸雜交，d)連接相鄰的寡核苷酸，從而在支持物上的一個或多個間隔位置上形成連接的試劑，e)除去其它未連接的試劑，和f)回收並分析每種連接的試劑的標記部分以作為部分靶核酸序列的指示。
優選使用雷射以通過光化學產生每個間隔位置上的標記鏈的裂解。優選通過質譜法分析標記鏈。優選如上所述循環重複雜交、連接、裂解和分析步驟以得到靶核酸序列的其它有關信息。
構成圖5的四個示圖中顯示了優選的操作順序，第一示圖表示步驟b)開始時的狀況，第二示圖表示步驟b)結束時的狀況，此時靶核酸的一部分已經與形成系列一部分的被束縛的寡核苷酸雜交。第三示圖表示步驟c)結束時的狀況。第四示圖表示步驟d)結束時的狀況；庫中的試劑已經與靶核酸雜交並連接於固定化的寡核苷酸上。
已知方法的這種擴展的結果是顯著的，假如用於讀出標記物的方法能分辨混合物，那麼以相等於系列中寡核苷酸長度的長度延伸一次即可平方可讀出的全長。在這種情況下可從由8個鹼基延伸的一系列八核苷酸讀出的長度大約為60,000個鹼基。雜交分析和標記寡核苷酸的比較a)以凝膠為基礎的方法最先進的自動化序列分析儀器每天可讀出大約40000個鹼基，這不包括提供凝膠上的反應所需的生物學和生物化學過程的時間。如果我們假定表面所用模板的密度為每平方毫米1個[Hoheisel等人，1992；Ross等人，1992]，那麼100×100mm的面積之上可使用10000個模板。雜交後每個孔中可能有幾個fmol的標記寡核苷酸，因此單次2nsec脈衝的雷射即可釋放出足夠的標記物以便閱讀，但是即使我們假定需要100次脈衝，則讀出一個孔的總時間是幾毫秒，那麼所有10000個孔可以在幾分鐘之內讀出。如果寡核苷酸是六聚物，則所得的原始數據為60000個鹼基。對於序列測定而言，由於從凝膠上可讀出更長的連續長度，它就不會象凝膠上相同原始數據那樣更有信息。如果可通過分析的再次循環延伸從系列中讀出的序列，凝膠的優點當然會失去，然而以系列物為基礎的方法的主要優點在於它能使數以千計的模板同時被分析的平行性；凝膠的寬度將可在凝膠上分析的模板數目限制為少於50。
b)本發明的以系列物為基礎的方法現存的以系列物為基礎之方法的主要缺點是a)從大小為N的系列物中讀出的序列僅約等於 ，以致系列物的大多數孔無法讀出，通過加入標記寡核苷酸，系列物的佔有率接近完全，以致大多數孔的信息都可得到，原因是來自標記物的其它信息有助於除去由於靶系列中短系列的大量出現而導致的模梭兩可(表3)。
b)通過雜交從每個與寡核苷酸的相互作用中讀出的序列長度必須受寡核苷酸長度的限制，這會導致閱讀重複序列如連續的單個鹼基的困難，通過連接的延長閱讀只要可由重複連接所橫越，則可允許多次的閱讀。
c)在本測定方法中，放射性的敏感性高但分辨能力差，螢光的敏感性差但分辨能力高；這兩種方法都相對較慢。使用質譜法的建議可改善分辨能力、速度和敏感性，並可提高讀出標記物序列的潛力。
表3.通常，可由分布於空間節段系列上的模板測定的序列約為 ，即2L，其中L是通過寡核苷酸讀出的連續長度的總和。它包括實施例3b而不是實施例2中的固體支持物上的寡核苷酸的長度。
L 2L12 409614 1638416 6553618 2262144具有潛在的藥理活性的分析物很多藥物是組織特異性的。它們的作用經常依賴於與細胞表面受體的相互作用。有些藥物家族根據的是核心結構；例如有幾個含有短肽。跟蹤候選藥物以觀察它們所瞄準的細胞或組織是有用的，同時跟蹤許多不同的候選藥物也是有用的。使用經編碼的質量標記物標記的分析物庫可在質譜儀中通過檢查細胞或組織來跟蹤相互作用。如果用光不穩定性保護基團結合標記物，即可使用掃描雷射裂解，經質譜法偶合以反映整個動物或組織切片。
下列實施例將進一步闡明本發明。
根據下列反應圖解1，實施例1至6顯示了合成含有芳香族接頭的化合物(8)的步驟，此接頭帶有用於分析物合成的甲氧基三苯甲基(-OH2ODMT)；用於光裂解的鄰硝基；用於標記物合成的O-叔丁基二苯基甲矽烷基(OTBDPS)；用於轉變為帶正電基團以供質譜法分析的叔氨基；以及用於結合至支持物上的N-羥基琥珀醯亞氨基。
實施例7和8表示根據下列反應圖解2的隨後的步驟。
實施例9和10表示根據下列反應圖解3製備基於丙烷-1，3-二醇的報導基團(13)的步驟。
實施例11至13表示根據下列反應圖解4，涉及將保護的丙烷-1，3-二醇殘基作為報導基團結合至化合物(6)的步驟。
實施例14至19描述了根據本發明的各種試劑的製備、鑑定和使用。
一般細節5-羥基-2-硝基苄醇購自Aldrich長鏈烷氨基可控孔度玻璃購自Sigma。無水溶劑指氮氣氛下包裝的Aldrich Sure Seal級物質。三乙胺用氫化鈣預蒸餾並在使用前在氮氣中存放。其它溶劑和試劑可從市場購買。
1H-NMR在Jeol 270MHz機上得到，用指定的溶劑並用四甲基甲矽烷作參照物。
紅外在Nicolet 5DXC F.T.IR儀上得到，如指明的那樣要麼為溴化鉀片要麼為氯仿溶液。
熔點在Gallenkamp熔點儀上得到且未經校正。
Tlc在Kieselgel 60F254鋁負載的Tlc板上用指明的溶劑體系進行。該板用紫外光顯色和/或浸於3％w/v磷鉬酸的乙醇溶液中然後用熱氣槍加熱而顯色。含三苯甲基的物質顯示為亮橙色斑點，醇類為藍色斑點。
矽膠色譜法採用閃級矽膠，粒度40-63μm進行。
用於反應圖解和文本中的縮寫DMT -4，4′-二甲氧基三苯甲基THF -四氫呋喃TBDPS -叔丁基二苯基甲矽烷DMAD-4-二甲氨基吡啶DCCI-二環己基二碳化二亞胺CH2Cl2-二氯甲烷CPG -可控孔度玻璃MeI -碘代甲烷Tresyl -2，2，2-三氟乙磺醯基實施例15-羥基-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-2-硝基苄醇(化合物2，圖解1)的合成往溶於無水吡啶(40ml)中的5-羥基-2-硝基苄醇(5.11g，30.2mmol)中加入4，4′-二甲氧基三苯甲基氯(10.25g，30.2mmol)並將燒瓶塞好。然後在室溫下攪拌反應混合物共72小時。T.l.c.分析(乙醚/石油醚40-60℃，65％/35％)顯示新的含三苯甲基的物質(RF0.27)存在且原料醇消失。然後將吡啶旋轉蒸發除去，最後一點通過與甲苯(×2)共蒸除去。將產生的膠狀物溶於乙酸乙酯中，溶液用水(×1)和鹽水(×1)洗滌。乙酸乙酯溶液然後用無水硫酸鎂乾燥並蒸發得到紅棕色膠狀物。將此膠狀物溶於CH2Cl2(20ml)然後加至矽膠柱(14cm×6.5cm)上，用乙醚/石油醚40-60℃，65％/35％洗脫。將產物級分合併，旋轉蒸發除去溶劑得到灰白色固體(13.49g，95％，mpt.80-82℃，分解)。分析樣品通過用氯仿/石油醚40-60℃重結晶製備，mpt.134-7℃，分解。1H NMR(270MHz.CDCl3δ)3.79(s，6H，DMT-OCH3)，4.63(s，2H，CH2-ODMT)，6.77-6.85(m，5H，芳基)，7.22-7.49(m，9H芳基)，7.63(s，1H芳基)，8.06(d，1H，J＝9.06Hz，芳基).IR(KBr片)，1610，1509，1447，1334，1248，1090，1060，1033，828cm-1.
實施例2O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-5-[1-(3-溴-1-氧基丙基)]-2-硝基苄醇(化合物3，圖解1)的合成往溶於丙酮(150ml)中的化合物2(10.18g，21.6mmol)中加入1，3-二溴丙烷(11ml，108mmol)和碳酸鉀(4.47g，32.3mmol)然後在30℃下加熱反應混合物共3小時，然後在室溫再攪拌16小時。T.l.c.分析(乙醚/石油醚40-60℃，60％/40％)顯示原料完全消失，而形成兩種新的含三苯甲基的物質；RF0.48佔多數，RF0.23佔少數。然後通過旋轉蒸發除去丙酮，將所得殘餘物分配在水和二氯甲烷中。分出二氯甲烷溶液並用鹽水洗滌。然後將二氯甲烷溶液用無水硫酸鎂乾燥並蒸發成膠狀物。將膠狀物溶於20ml二氯甲烷中，然後加至矽膠柱(6.5cm×14cm)上，用乙醚/石油醚40-60℃，60％/40％洗脫。將純產品級分合併，旋轉蒸發除去溶劑，得到化合物3，為白色固體(8.18g，64％，mpt.132-4℃，RF0.48乙醚/石油醚40-60℃，60％/40％)。小量樣品用乙酸乙酯/石油醚重結晶用於分析，mpt.132-4℃。1H NMR(270MHz CDCl3，δ)2.40(m，2H，-CH2-CH2-CH2-).3.64(t，2H，J＝6.32Hz.CH2Br)，3.79(s，6H，OCH3).4.27(t，2H，J＝6.04Hz，-OCH2CH2)，4.66(s，2H，ArCH2ODMT)，6.84(d，4H，J＝8.79Hz，DMT芳基)，7.20-7.50(m，10H，9DMT芳基，1芳基)7.68(s，1H芳基)，8.1(d，1H，J＝9.06Hz，芳基).IR(KBr片)1608，1577，1511，1289，1253，1230，1174，1065，1030cm-1.
實施例3N-[O-(叔丁基二苯基甲矽烷基)-2-氧基乙基)]-N-(2-羥乙基)胺(化合物5，圖解1)的合成在N2氣氛下，往氫化鈉(0.76g，60％的油分散體，19mmol)中加入無水THF(15ml)，接著以允許的氫生成速度加入二乙醇胺(2g，19mmol)在THF(30ml)中的漿狀物。然後在N2氣氛下於室溫下攪拌反應混合物30分鐘，在此期間形成灰色沉澱。產生的烷氧化物用加入叔丁基氯二苯基甲矽烷(4.95ml，19mmol)處理，接著在N2氣氛下，將反應混合物在室溫下攪拌2小時。T.l.c.分析(乙酸乙酯)顯示產生了兩個相對於原料為新的UV正性斑點，較多的為RF0.05較少的為RF0.60。通過旋轉蒸發除去THF，將殘餘物溶於0.1M碳酸鈉溶液中。然後用乙酸乙酯(×2)萃取產物。再將乙酸乙酯萃取液合併，用鹽水(×1)洗滌。然後將乙酸乙酯溶液用無水硫酸鎂乾燥，蒸發成油狀物。將此油狀物加至矽膠柱上，用氯仿/甲醇，90％/10％洗脫，合併RF0.33的級分並旋轉蒸發得到化合物5，為白色晶狀固體(3.93g，60％，mpt.73-75℃)。少量樣品用乙酸乙酯/石油醚40-60℃重結晶用於分析，mpt.76-77℃。1H NMR(270MHz，CDCl3，δ)1.06(s，9H，tBu)，2.13(brs，1H，OH，D2O可交換的)，2.78(m，4H，CH2NHCH-2)，3.63(t，2H，J＝5.22Hz，-CH2OSi-)，3.78(t，2H，J＝5.22Hz，CH2OH)，7.40(m，6H，芳基)，7.66(m，4H，芳基).IR(KBr片)3100，1430，1114，1080，969，749，738，707 cm-1.
實施例4N-[O-(叔丁基二苯基甲矽烷基)-2-氧基乙基]-N-[O-(3-(O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-1-氧基甲基)-4-硝基苯基)-3-氧基丙基]-N-(2-羥基乙基)胺(化合物6，圖解1)的合成往溶於1-甲基-2-吡咯烷酮(65ml)的化合物3(7.46g，12.6mmol)中加入化合物5(8.63g，25.2mmol)。然後將反應混合物在80℃加熱5小時，冷卻後在室溫再攪拌16小時。T.l.c.分析(乙酸乙酯)顯示形成了含三苯甲基的新物質，即RF0.51和殘量的兩種原料。將反應混合物倒入水(600ml)和鹽水(100ml)的混合物中，產物用乙酸乙酯(3×200ml)萃取。然後合併乙酸乙酯萃取液，並用無水硫酸鎂乾燥。旋轉蒸發除去乙酸乙酯得到棕色膠狀物，它緩慢形成晶狀產物。加入最小量的乙酸乙酯溶解殘留的膠狀物以使晶狀產物可被濾出，化合物5的氫溴酸鹽。然後將乙酸乙酯溶液置於矽膠柱(13cm×6.5cm)上，用乙酸乙酯洗脫。從此柱得到不充分地分離的殘留的化合物3和所需的產物，將產物級分合併，蒸發成膠狀物。將此膠狀物溶於所需的最小量乙酸乙酯中，並置於另一矽膠柱(14cm×6.5cm)上，用梯度洗脫液洗脫，先用乙酸乙酯/石油醚40-60℃，50％/50％，接著用乙酸乙酯。合併產物級分，旋轉蒸發除去溶劑得到膠狀化合物6。最後的微量溶劑通過將膠狀物放在高真空中1小時而除去。產物的產量為7.64g，71％。1H NMR(270MHz，CDCl3，δ)1.04(s，9H，tBu)，1.97(m，2H，-CH2CH2CH2-)，2.7(m，6H，NCH2)，3.56(m，2H，CH2OH)，3.75(m，2H，CH2OSi)，3.78(s，6H，DMT-OCH2)，4.12(m，2H，ArOCH2CH2)，4.64(s，2H，ArCH2ODMT)，6.74-6.85(m，5H，芳基)7.2-7.65(m，20H，芳基)，8.05(d，1H，芳基).IR (KBr片)，1608，1579，1509，1287，1251，1232，1112，1092，1064，1035，826，754，703，613cm-1.
實施例5N-[O-(叔丁基二苯基甲矽烷基)-2-氧基乙基]-N-[O-(3-(O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-1-氧基甲基)-4-硝基苯基)-3-氧基丙基]-N-[O-(3-羧基丙醯基)-2-氧基乙基]胺(化合物7，圖解1)的合成往溶於無水二氯甲烷(40ml)和無水吡啶(50ml)中的化合物6(5.64g，6.59mmol)中加入琥珀酸酐(2.06g，20.6mmol)和二甲氨基吡啶(2l0mg，1.72mmol)，將燒瓶塞住。然後將反應在室溫攪拌共72小時。T.l.c.分析(甲醇/乙酸乙酯，10％/90％)顯示形成了含三苯甲基的新物質RF0.45，且原料消失。旋轉蒸發除去溶劑，最後的微量吡啶通過與甲苯(×2)共蒸發除去。然後將所得膠狀物分配在氯仿和水中。分出有機相，水相再用氯仿(×1)萃取。然後合併有機相併用鹽水(×1)洗滌。氯仿溶液用無水硫酸鎂乾燥並蒸發成膠狀物。最後的微量溶劑通過將膠狀物放置在高真空中1小時而除去，得到化合物7，6.75g。該產物不需進一步純化即可用於下一步。1H NMR(270MHz，CDCl3，δ)1.0(s，9H，tBu)，1.9(m，2H，CH2CH2CH2)，2.5(m，4H，COCH2CH2COOH)，2.7(m，6H，N-CH2)，3.7(m，2H，CH2OSi)，3.75(s，6H，DMT-OCH3)，4.1(m，4H，CH2OCO和Ar-OCH2CH2，5.6(s，2H，ArCH2ODMT)，6.7(d，1H，芳基)，6.8(d，4H，芳基)7.2→7.7(m，20H，芳基)，8.02(d，1H，芳基).IR(CHCl3溶液)1736，1608，1579，1509，1288，1251，1232，1175，1158，1112，1093，1065，1035，755，703cm-1.
實施例6N[O-(叔丁基二苯基甲矽烷基)-2-氧基乙基]-N-[O-(3-(O-(4，4-二甲氧基三苯甲基)-1-氧基甲基)-4-硝基苯基)-3-氧基丙基]-N-[(O-(琥珀醯基-(3-羧基丙醯基)))-2-氧基乙基]胺(化合物8，圖解1)的合成往溶於無水二氯甲烷(30ml)中的化合物7(2.99g，3.13mmol)中加入二環己基碳化二亞胺(0.710g，3.45mmol)和N-羥基琥珀醯亞胺(0.396g，3.44mmol)，將燒瓶塞住。然後將反應混合物在室溫拌18小時，在此期間形成白色沉澱。將白色沉澱濾出，用水(×1)和鹽水(×1)洗滌二氯甲烷溶液。然後將二氯甲烷溶液用無水硫酸鎂乾燥，將溶劑旋轉蒸發，得到泡沫體3.26g(99％)。T.l.c.分析(乙酸乙酯)顯示只有一種含三苯甲基的物質RF0.74，沒有明顯的抑制。通過將少量物質流過矽膠柱提供分析樣品的企圖導致活性酯分解回到酸(化合物7)。此物不需進一步純化而用於所有的後續裝置中。1H NMR(270MHz，CDCl3，δ)1.04(s，9H，tBu)，1.97(m，2H，CH2CH3CH2)，2.50→2.75(m，6H，琥珀醯基CH2+-OCCH2)，2.76-2.86(m，6H，NCH2)，3.08(m，2H，CH2CO2琥珀醯基).3.77(s，6H，DMTOCH3)，3.86(m，2H，CH2OSi)，4.1→4.2(m，4H，ArOCH2+CH2O2C)，4.63(s，2H，ArCH2ODMT，6.7→6.9(m，5H芳基)，7.01→7.7(m.20H，芳基)8.05(d，1H，芳基).IR(KBr片)，1742，1713，1509，1288，1251，1211，1175，1090，1067cm-1.
圖解1
圖解1(續)
實施例7衍生的長鏈烷氨基可控孔度玻璃(化合物9，圖解2)長鏈烷氨基可控孔度玻璃(Sigma Chemical Co，3.5g)用溶於二氯甲烷(50ml)的三氯乙酸(1.5g)預處理2.5小時，用等份的二氯甲烷(共100ml)和無水乙醚(共100ml)洗滌，真空乾燥。然後往CPG支持物中加入無水吡啶(35ml)，二甲氨基吡啶(42mg，344μmol)，三乙胺(280μl，201mmol)和化合物(8)(見圖解1)(736mg，700μmol)。然後將混合物輕輕攪拌18小時，之後，用吡啶(7×10ml)，甲醇(5×15ml)和氯仿(5×15ml)多次洗滌玻璃珠，然後真空乾燥。
實施例8結合到CPG支持物上的叔氨基的甲基化(化合物10，圖解2)往衍生的長鏈烷氨基可控孔度玻璃(化合物9，圖解2)(1.01g)中加入無水THF(10ml)和碘代甲烷(0.5ml，8mmol)。然後將混合物輕輕攪拌18小時，用無水THF(5×10ml)多次洗滌玻璃珠並真空乾燥。
圖解2
實施例9一保護的1，3-丙二醇衍生物(化合物12a和化合物12b，圖解3)的合成-一般工藝在N2氣氛下往氫化鈉(1.05g 60％的油分散體，26.3mmol)中加入無水THF(10ml)，接著滴加溶於無水THF(20ml)中的1，3-丙二醇衍生物(26.3mmol)。在N2氣氛下再攪拌30分鐘以確保生成烷氧化物，其標誌為生成灰色沉澱。產生的烷氧化物通過滴加溶於無水THF(20ml)中的叔丁基氯二苯基甲矽烷(7.24g，26.3mmol)處理，接著在N2氣氛下再攪拌反應40分鐘。然後旋轉蒸發除去THF，將殘餘物分配在二氯甲烷和0.1M碳酸氫鈉溶液中。分出二氯甲烷溶液並用鹽水(×1)洗滌。然後將二氯甲烷溶液用硫酸鎂乾燥並蒸發成油狀物。將此油狀物置於矽膠柱(16cm×5cm)上，用乙醚/石油醚40-60℃，30％/70％混合物洗脫。將產物級分合併並旋轉蒸發得到所需的1，3-丙二醇衍生物。
化合物的各自詳情見下面。
12a 1-O-叔丁基二苯基甲矽烷基-1，3-丙二醇，白色晶狀固體，RF0.21；乙醚/石油醚40-60℃，30％/70％，7.61g，92％，mpt40-42℃。IR(KBr片)3400，1448，1112.822，734，702，689，506，488cm-1.1H NMR(270MHz，CDCl3，δ)1.06(s，9H，tBu)，1.80(m，2H，CH2CH2CH2)，2.45(t，1H，OH)，3.84(m，4H，OCH2CH2CH2O-)，7.40(m，6H，芳基)，7.68(m，4H，芳基).
12b 2-甲基-1-O-叔丁基二苯基甲矽烷基-1，3-丙二醇，無色油狀物，RF0.21乙醚/石油醚40-60℃，30％/70％，6.60g，77％。IR(薄膜)3400，1472，1428，1087，1040，823，740，702cm-1.1H NMR(270MHz，CDCl3，δ)0.82(d，3H，J＝6.87Hz，CH3)，1.06(s，9H，tBu)，2.0(m，1H，CH-CH3)，2.68(t，1H，OH)，3.64(m，4H，CH2CH(CH3)CH2)，7.40(m，6H，芳基)，7.68(m，4H，芳基).
參見PGMcDougal等人，JOC，51，3388(1986)中不對稱1，n-二醇的單甲矽烷基化的一般工藝。
實施例102，2，2-三氟乙磺酸酯衍生物(化合物13a和13b，圖解3)的合成-一般工藝在N2氣氛下往冷卻至-15℃--30℃的溶於無水二氯甲烷(10ml)和無水三乙胺(0.84ml，6.03mmol)中的醇衍生物(4.94mmol)中在20-40分鐘內滴加溶於無水二氯甲烷(5ml)中的2，2，2-三氟乙磺醯氯(1g，5.48mmol)。在N2氣氛下於-15℃--30℃再攪拌30分鐘完成反應。然後將反應混合物轉移至分液漏鬥中並用冰冷卻的1.0M鹽酸(×1)、冰冷卻的水(×1)和冰冷卻的鹽水(×1)洗滌。然後將二氯甲烷溶液用硫酸鎂乾燥，旋轉蒸發掉溶劑得到2，2，2-三氟乙磺酸酯。使用前將此2，2，2-三氟乙磺酸酯在-20℃於N2氣氛下存放。
化合物的各自詳情見下面。
13a 1-O-叔丁基二苯基甲矽烷基-3-O-2，2，2-三氟乙磺醯基-1，3-丙二醇，白色晶體狀固體，1.74g，77％，mpt.34-35℃。在處理反應之前取出3ml反應混合物用於加到其它反應中。1H NMR(270MHz，CDCl3，δ)1.06(s，9H，tBu)，1.97，(m，2H，CH2CH2CH2)，3.77(t，2H，J＝5.49Hz，CH2-O)-Si)，3.84(q，2H，J＝8.79Hz，CF3-CH2-O)，4.54(t，2H，J＝6.05Hz，Tresyl O-CH2)，7.42(m，6H芳基)，7.64(m，4H，芳基).IR(KBr片)1386，1329，1274，1258，1185，1164，1137，1094，941，763，506cm-1.
13b 2-甲基-1-O-叔丁基二苯基甲矽烷基-3-O-2，2，2-三氟乙磺醯基-1，3-丙二醇，無色油狀物，2.57g，99％。1H NMR(270MHz，CDCl3，δ)0.97(d，3H，J＝6.87Hz，CH3)，1.06(s，9H，tBu)，2.10(m，1H，CHCH3)，3.6(m，2H，CH2OSi)，3.8(q，2H，J＝8.79Hz，CF3CH2)，4.40(m，2H.Tresyl-O-CH2)，7.40(m，6H，芳基)，7.64(m，4H，芳基).
2，2，2-三氟乙磺酸酯的一般情況見R K Crossland等人，JACS，93，4217(1971)。
圖解3
實施例11N-[乙醯氧基-2-氧基乙基]-N-[O-(3-(O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-1-氧基甲基)-4-硝基苯基)-3-氧基丙基]-N-2-羥基乙基]胺(化合物15，圖解4)的合成往溶於無水THF(20ml)中的化合物11(1.72g，1.92mmol)中加入氟化四丁基銨(0.55ml 1MTHF溶液，1.92mmol)。然後在室溫攪拌反應共兩小時。將反應混合物用水(50ml)稀釋，旋轉蒸發除去THF。水溶液然後用氯仿(×1)萃取。有機溶液用無水硫酸鈉乾燥，蒸發成膠狀物。產物通過矽膠色譜法純化，用乙酸乙酯洗脫柱子。合併產物級分並旋轉蒸發得到化合物12，為無色膠狀物，放置後緩慢結晶；0.73g，58％，mpt.95-97℃，RF0.26乙酸乙酯。1H NMR(270MHz，CDCl3，δ)1.75(brs，1H，OH)，2.0→2.1(m，5H，O2CCH3+CH2CH2CH2)，2.70→2.81(m，6H，CH2N)，3.58(m，2H，CH2OSi)，3.79(s，6H，DMT-OCH3)，4.17(m，4H，CH2O)，4.64(s，2H，ArCH2ODMT)，6.83(d，4H，DMT-芳基)7.2→7.5(m，10H，芳基)，7.69(s，1H，芳基)，8.10(d，1H，芳基).IR(KBr片)，3459，1738，1608，1577，1506，1444，313，1288，1250，1230，1175，1154，1070，1035，984cm-1.
實施例12N-[O-(叔丁基二苯基甲矽烷基)-2-氧基乙基]-N-[O-(3-(O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-1-氧基甲基)-4-硝基苯基)-3-氧基丙基]-N-[乙醯氧基-2-氧基乙基]胺(化合物14，圖解4)的合成往溶於無水吡啶(10ml)中的化合物6(1.73g，2.02mmol)中加入乙酐(0.5ml，4.54mmol)和4-二甲氨基吡啶(55mg，0.45mmol)，將燒瓶塞住。然後將反應混合物在室溫攪拌共16小時，T.l.c.分析(甲醇/乙酸乙酯5％/95％)顯示原料完全消失，形成了新的含三苯甲基的斑點RF0.80。旋轉蒸發除去吡啶，最後微量通過與甲苯(×2)共蒸發除去。將所得膠狀物分配在氯仿和水中。分出氯仿溶液並用鹽水(×1)洗滌。然後將氯仿溶液用無水硫酸鎂乾燥，旋轉蒸發掉溶劑得到1.94g無色膠狀物。此物有足夠的純度用於下一步反應而不需進一步純化。1H NMR(270MHz，CDCl3，δ)1.04(s，9H，tBu)，1.9(m，2H，CH2CH2CH2)，2.01(s，3H，-O2CCH3)，2.74(m，6H，CH2N)，3.7(m，2H，CH2OSi)，3.8(s，6H，DMT-OCH3)，4.1(m，4，CH2O)，4.63(s，2H，ArCH2ODMT)，6.78(d，1H，芳基)6.83(d，4H，DMT芳基)，7.2→7.8(m2OH芳基)，8.05(d，2H，芳基)實施例13N-[乙醯氧基-2-氧基乙基]-N-[O-(3-(O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-1-氧基甲基)-4-硝基苯基)-3-氧基丙基]-N-[O-(叔丁基二苯基甲矽烷基)-3-氧代-6-氧基己基]胺(化合物16，圖解4)的合成往溶於無水乙腈(5ml)中的化合物12(66mg，0.10mmol)中加入碳酸鉀(55mg，0.4mmol)和化合物13a(1ml反應混合物，約0.30mmol)，然後用氯化鈣乾燥管塞住燒瓶。將反應混合物在室溫攪拌共22小時後濾出碳酸鉀，旋轉蒸發除去溶劑。然後將所得油狀物置於矽膠柱(14cm×1cm)上，產物用乙醚/石油醚40-60℃，75％/25％混合物洗脫。合併純產物級分並蒸發成透明的膠狀物，6mg，6％，在乙醚/石油醚40-60℃，80％/20％中RF0.47。1H NMR(270MHz，CDCl3，δ)1.05(s，9H，tBu)，1.8(m，2H，CH2CHCH2OSi)，1.9(m，5H，O2CCH3+ArOCH3-)，2.76-2.92(m，6H，CH2N)，3.51(t，2H，J＝6.6Hz，OCH2CH2CH2OSi)，3.79(s，6H，DMT-OCH3)3.85(m，2H，CH2OSi)，4.12→4.23(m，4H，ArOCH2CH2+NCH2CH2OCOCH3)，4.64(s，2H，ArCH2ODMT)，6.83(m，5H，1芳基+DMT-基)，7.23→7.50(m，16H，芳基)，7.68(m，4H，芳基)，8.10(d，1H，J＝9.06Hz，芳基).
以類似於上面的反應條件，用2，2，2-三氟乙磺酸酯13b合成下列化合物。
N-[乙醯氧基-2-氧基乙基]-N-[O-(3-(O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-1-氧基甲基)-4-硝基苯基)-3-氧基丙基]-N-[O-(叔丁基二苯基甲矽烷基)-5-甲基-3-氧代-6-氧基己基]胺。此化合物為透明的膠狀物，在乙醚/石油醚40-60℃，80％/20％中RF0.53。1H NMR(270MHz，CDCl3，δ)0.88(d，3H，CH-CH2)，1.00(s，9H，tBu)，1.9→2.1(m，6H，O2CCH3+CH-CH3+CH2CH2CH2)，2.7→3.0(m，6H，CH2N)，3.4→3.7(m，4H，CH2O-)，3.79(s，6H，DMT-OCH3)，4.0→4.4(m，6H，CH2O-)，4.64(s，2H，ArCH2ODMT)，6.83(m，5H，芳基)，7.2→7.7(m，20H，芳基)，8.01(d，1H，芳基).
圖解4
實施例14固體支持物上的寡核苷酸的合成將帶有接頭9和10(圖解2中的化合物9和10)的可控孔度玻璃被裝入寡核苷酸自動合成儀(ABI 381A)所用的柱內；所用的量供0.2或1μmol規模合成。將該柱插入自動合成儀內，然後安排為適當的循環。使用兩個不同種類的核苷酸前體正常氨基磷酸化物(phosphoramidites)，在5′羥基上有二甲氧基三苯甲基保護基；在3′羥基上帶5′氨基磷酸基和二甲氧基三苯甲基保護基的「逆合成子」。在這些支持物上合成的寡核苷酸列於表4中，其中R9和R10分別從化合物9和10衍生而來。產率根據每個偶聯所釋放的二甲氧基三苯甲基的量計算。這些產率相應於在常規寡核苷酸合成所用的CPG支持物上得到的產率。
表4端基 序列正常方向 反方向R9 T5 R10T5 R10，DMT T5 R9，DMTT5 R10，DMT T5 R10A10 實施例15在保持分析物完整的條件下合成標記物在支持物9上合成5′R9T5之後，將固體支持物分開，部分用5mM THF中的氟化四丁基銨在室溫下處理10分鐘以除去叔丁基二苯基甲矽烷基保護基。兩個樣品都用29％氨在室溫下處理過夜以從固體支持物上除下產物。真空除去氨，將固體殘餘物溶於水中。HPLC顯示甲矽烷基保護基被成功地除去，而保留了DMT基。此實施例顯示兩個保護基可在保留另一個的條件下除去；而且，保護基的除去並未破壞寡該苷酸鏈。
實施例16標記的分析物的生化反應16a.標記的寡核苷酸的酶催化磷酸化為了許多目的，在5′末端有磷酸基的寡核苷酸是有用的。如果寡核苷酸被用作連接反應的供體，這類基團是必須的；而引入放射性基團以測試生化性質是一個有用的途徑。
寡核苷酸A5、A10和T5由結合在3′末端的標記物R9和R10產生，或已除去或沒有除去甲矽烷基保護基(這通過用5mM氟化四丁基銨的乙腈溶液室溫下處理正在固體支持物上的寡核苷酸15分鐘而實現)。這些寡核苷酸用T4多聚核苷酸激酶的γ-33P-ATP用供應者推薦的標準方案磷酸化。產物在浸過纖維素的聚乙烯亞胺(PEI)上的薄層色譜法(用0.5M碳酸氫銨展開)顯示出在每種情況下被標記的磷幾乎完全轉移到寡核苷酸上。
16b.標記寡核苷酸的酶催化連接對於標記寡核苷酸的一些應用而言，將它們與受體連接是有用的。我們已闡明通過下列試驗的酶催化連接可產生經標記的寡核苷酸(1)在5′末端標記寡核苷酸在此試驗中，模板是5′-ATCAAGTCAGAAAAATATATA(SEQ IDNO.1 )將它與供體3′-TAGTTCAGTC(SEQ ID NO.2)雜交，此供體5′末端已先用放射性磷磷酸化。進行了四個連接反應，每個反應中的序列T5部經過修飾，當它與模板中的5個A循環雜交後，可與供體的5′磷酸化末端連接。反應中所用的四個寡T的5′末端的特徵有所不同，一個通過羥基結合有二甲氧基三苯甲基，第二和第三個通過磷酸二酯鍵在其5′末端結合有標記物R9和R10，第四個是陽性對照，具有正常的5′OH，陰性對照缺乏任何寡T。根據供貨商的指示，使用T4連接酶進行連接反應。通過TLC在PEI-纖維素上分析反應，在0.75M的碳酸氫銨溶液中展開。所有四個反應在層析譜上都顯示出多餘的斑點，其遷移率比供體的低，陰性對照正如所期望的那樣沒有顯示出多餘的斑點，這闡明了具有不同標記物的寡核苷酸是如何能參與序列特異性的連接反應的。
Cozzarelli等人(1967)已闡明在互補模板存在時，結合於固體支持物上的多聚核苷酸可與受體連接。
實施例17經標記的寡核苷酸與束縛於固體支持物上的寡核苷酸的雜交實施例16b表明經標記的寡核苷酸可參與連接反應，這意味著它們也可參與溶液中雙螺旋的形成，因為連接依賴於此過程。下列實驗表明它們也可與束縛於固體支持物上的寡核苷酸形成雙螺旋。根據製造商的指示，在胺化的聚丙烯膜的表面合成T10，已知此過程每mm2可產生大約10pmol寡核苷酸。用33P標記A10於3.5M氯化四甲胺中的溶液(65pmol/μl)的5′末端，用R10標記其3′末端，將此溶液塗在衍生的聚丙烯的表面，在4℃下放置過夜。在雜交溶劑中洗過後，發現大約三分之一的探針已和經束縛的寡·dT雜交。這接近於雜交的理論極限，表明經標記的寡核苷酸可高效地參與雜交反應。
實施例18標記物的光解通過光解除去標記物的潛力大大加強了其用途它可允許在質譜儀中通過雷射解吸直接分析；它可提供一除去標記物的簡單方法以使其它生化或化學過程得以進行。
18a.整體光解已知硝基苄基在305nm的照射下不穩定。在已知不會導致核酸的可見損傷的條件下，以透照儀2cm的光照射R10A10和R10T5的水溶液達20分鐘。HPLC分析顯示出光解的預想產物。無可檢測的殘餘原始化合物。
18b.質譜儀中雷射誘導的光解將R10T5和T5R10樣品在不加基質的條件下沉積在一次飛行質譜儀(Finnigan Lasermat)的金屬靶上。譜圖顯示在質量243附近以正的方式有一單個飽和峰，在其它樣品中不存在。
實施例19通過結合到不同分析物上的不同標記物的質譜的鑑定通過常規固相法，但用「逆合成子」合成。一系列帶有二甲氧基三苯甲基作為標記物連接在3′末端的五個胸苷殘基。在質譜儀中，此化合物在質量304處以正離子形式給出大且獨特的峰。相比之下，一系列帶有前面記為R10的標記物的十個腺苷殘基在質量243處以正離子形式給出大且獨特的峰。在兩種情況下，雷射解吸在沒有基質存在下進行。在兩種情況下，沒有標記物的寡核苷酸不存在所述峰。這些例子表明從分析物合成期間摻雜的標記物衍生的質譜示蹤中峰的存在很容易鑑定分析物序列，而特徵標記物很容易通過其不同質量鑑別。


圖1.帶有特定標記物的分子合成的一般圖解合成從接頭(L)開始，至少一個位點用於加入基團以合成分析物，一個位點用於合成標記物。在合成期間接頭也可可逆地結合到固體支持物上，並可具有生成諸如可幫助分析的帶電基團的位點。Pa和Pr分別是分析物前體和報導分子的臨時保護基；它們可通過不同的處理脫去。例如，Pa可以是酸或鹼不穩定基團，如三苯甲基、F-MOC或t-BOC，而Pr是可用氟化物處理脫去的基團，如甲矽烷基殘基。基團U-Z也可有保護基，該保護基必須對除去Pa和Pr所用的試劑穩定。偶合化學對不同類型的分析物是不同的；標準方法對寡核苷酸和肽合成是有效的。
三種不同類型的標記物描述於附圖2中。對於第一個圖解，標記物的每個延伸由對加到分析物上的殘基的位置和類型均為特異性的報導分子進行。加帽對於此圖解是不重要的。
在第二和第三圖解中，當殘基被加到分析物上時，位置由報導分子在合成中的所述階段達到的總質量限定。在這種情況下，通過封端一部分分子而終止標記物的部分延伸是重要的。第二和第三圖解在加入報導分子的方式上是不同的。在第二圖解中，它們在延伸劑中；在第三圖解中，它們在帽子(封端劑)中。
圖2.分子特異性標記物的三種類型A.舉例說明由報導分子(E)組成的標記物，此報導分子確定了分析物(U-Z)中基團的位置(下標)和特性(上標)。這樣的安排可包括一系列式量增加的脂族鏈以確定位置例如，亞甲基對位置1，亞乙基對2，亞丙基對3等。這些可以被碳和氫的不同的同位素組成區分為特定類型基團例如，有六種不同的CH2同位素組成，如前面表1中所示。其中四個相差一個質量單位並可容易地通過質譜法區分。可以設想其它區分標記方式。例如，無論位置還是基團都可被帶不同電荷的報導基團標記。這些基團可通過包括質譜法的多種方法分離和識別。B.顯示通過部分合成製得的標記物使得分析物的任何結構被連接到系列標記物上；系列的第一成員具有一個對分析物的第一個基團特異性的報導基團；第二個具有第一個報導基團加上對分析物的第二個基團特異性的第二個報導基團等等。這類系列可通過使用用於延伸標記物的兩種前體容易地製備一個被可逆的保護基保護而另一個防止進一步延伸。例如，RX和P-(CH2)nX的混合物，其中R是非反應性脂族基如甲基或乙基，P是可逆保護基，X是一可與被P保護的基團反應的活化殘基。被非反應性脂族基「加帽」的那些分子不會參與下一輪的去保護和延伸。
在B中，基團特異性信息含在用於擴大合成的殘基中。如在A中所示，可用質量同位素提供信息。例如，每加入一個用C和H同位素標記的CH2殘基到P-(CH2)nX中，就加入又一個可為報導分子提供不同的質量的位點。(CH2)n的質量範圍為14n到17n且該範圍中有4＋3(n－1)種不同的質量。因此對於亞乙基，在範圍28至34內有七種不同的質量，對於亞丙基，在範圍42至51內有十種不同的質量。C.顯示如何以不同方式加入基團特異性信息；在此情況下，它含在鏈的末端即例B的「帽子」中。而且，不同的質量可通過標記脂族殘基提供。位置信息通過加入末端的延伸長度提供。假設E是(CH2)2-O而末端是式量為15至19的同位素標記的甲基。每次延伸將增加44個質量單位到報導分子中。最短的報導分子的質量範圍將為44＋15＝59至44＋19＝63。第二個位置的質量範圍將為88＋15＝103至83＋19＝107，等等直至第六個，其質量範圍為284＋15＝299至284＋19＝303。在此範圍內沒有重疊，可以看出，報導分子的數目和範圍可通過利用末端或用更多原子延伸而擴大和延伸。
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序列表(1)一般資料(i)申請人(A)姓名ISIS INNOVATION LIMITED(B)街道2 South Parks Road(C)城市Oxford(E)國家英國(F)郵編OX1 3UB(A)姓名SOUTHERN，EDWIN(B)街道30 Staverton Road(C)城市Oxford(E)國家英國(F)郵編OX2 6XJ(A)姓名CUMMINS，WILLIAM JONATHAN(B)街道5 Thorntree Drive(C)城市Tring(D)州Herts(E)國家英國(F)郵編HP23 4JE(ii)發明名稱標記試劑和測定方法(iii)序列數目2(iv)計算機可讀形式
(A)介質類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容(C)作業系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟體PatentIn Release#1.0，Version#1.25(EPO)(vi)已有的申請資料(A)申請號GB9315847.5(B)申請日30-7-1993(2)SEQ ID NO1的資料(i)序列特徵(A)長度21個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO1ATCAAGTCAG AAAAATATAT A(2)SEQ ID NO2的資料(i)序列特徵(A)長度10個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO2CTGACTTGAT
權利要求
1.一種試劑，它含有a)分析物部分，該部分含有至少兩個分析物殘基，並連接於b)標記部分，它含有一個或多個適於通過質譜法檢測的報導基團，其中報導基團標示出分析物殘基，選擇標記部分各個位置的報導基團用以標示在分析物部分的限定位置上的分析物殘基。
2.如權利要求1所要求的試劑，其中提供了接頭基團以使分析物部分和標記部分結合於其上。
3.如權利要求1或2所要求的試劑，其中分析物部分是n個分析物殘基的鏈，標記部分是至多n個報導基團的鏈，選擇標記鏈各個位置的報導基團用以標示分析物鏈的相應位置的分析物殘基。
4.如權利要求1至3中任一項所要求的試劑，其中分析物部分通過可光裂解的鍵與標記部分相連接。
5.如權利要求1至4中任一項所要求的試劑，它具有式A-L-R，其中A是構成分析物部分的n個分析物殘基的鏈，L是接頭，R是構成標記部分的至多n個報導基團的鏈，n是2-20，其中標記部分含有限定分析物部分的分析物殘基之定位的信息。
6.如權利要求2至5中任一項所要求的試劑，其中接頭含有帶有羥基、氨基或巰基以用於合成分析物部分的芳香基團，以及用於合成標記部分的活性基團。
7.如權利要求6所要求的試劑，其中帶有羥基、氨基或巰基以用於合成分析物部分的芳香基團還帶有用於光裂解的鄰硝基基團。
8.如權利要求1至7中任一項所要求的試劑，其中存在帶電基團以供質譜法分析。
9.如權利要求1至8中任一項所要求的試劑，其中分析物部分是肽鏈。
10.如權利要求1至8中任一項所要求的試劑，其中分析物部分是寡核苷酸鏈。
11.如權利要求1至10中任一項所要求的試劑的試劑庫，其中所述的庫由多種試劑構成，每種含有不同的分析物部分。
12.如權利要求11所要求的試劑庫，其中該庫由4n種試劑構成，每種試劑含有不同的分析物部分，它是n個核苷酸的不同的寡核苷酸鏈。
13.如權利要求12所要求的試劑庫，其中試劑混合於溶液中。
14.測定方法，它包括下列步驟提供靶物質；在導致至少一種試劑與靶物質結合的條件下將靶物質與權利要求11至13中任一項所要求的試劑庫一起溫育；除去未結合的試劑；回收此種或每種結合的試劑的標記部分；分析回收的標記部分以作為結合於靶物質上的分析物部分之特徵的指示。
15.如權利要求14所要求的測定方法，其中靶物質是生物體或組織或細胞群體。
16.測定靶核酸序列的方法，此方法包括下列步驟a)提供固定於支持物上的寡核苷酸，b)將靶核酸與固定化的寡核苷酸雜交，c)將來自b)的雜交體與權利要求13所要求的試劑庫一起溫育，以使庫中的第一試劑的寡核苷酸鏈能與相鄰於固定化寡核苷酸的靶核酸雜交，d)連接相鄰的寡核苷酸，從而形成連接的第一試劑，e)除去其它未連接的試劑，和f)回收並分析連接的第一試劑的標記部分以作為靶核酸的第一部分的序列的指示。
17.如權利要求16所要求的方法，它還包括下列步驟ci)將來自f)的雜交體與權利要求13所要求的試劑庫一起溫育，以使庫中的第二試劑的寡核苷酸鏈與相鄰於第一試劑的寡核苷酸鏈的靶核酸雜交，di)連接相鄰的寡核苷酸，從而形成連接的第二試劑，ei)除去其它未連接的試劑，和fi)回收並分析連接的第二試劑的標記部分以作為靶核酸的第二部分的序列的指示。
18.如權利要求16或17所要求的方法，其中步驟a)中寡核苷酸固定於作為支持物的一系列針狀物的末端；步驟b)中靶DNA的單個克隆與固定於每個單個針狀物上的寡核苷酸雜交；步驟c)和d)中形成了一系列連接的試劑，不同的針狀物攜有不同的連接的試劑；步驟f)中回收每種連接的試劑的標記部分並分析之以作為部分靶DNA序列的指示。
19.如權利要求16或17所要求的方法，其中步驟b)中靶DNA的每個單個克隆與固定於支持物的各個間隔位置上的寡核苷酸雜交；步驟c)和d)中提供了一系列連接的試劑，支持物的不同的間隔位置攜有不同的連接的試劑；步驟f)中回收每種連接的試劑的標記部分並分析之以作為部分靶DNA序列的指示。
20.如權利要求16或17所要求的方法，其中此方法包括下列步驟a)提供一系列寡核苷酸，它們被相間隔地固定於支持物上，各個位置上的寡核苷酸互不相同，b)將靶核酸與一系列固定化的寡核苷酸一起溫育，以在支持物上的一個或多個間隔位置上形成雜交體，c)將來自b)的雜交體與權利要求13所要求的試劑庫一起溫育以使庫中試劑的寡核苷酸鏈與相鄰於每個固定化寡核苷酸的靶核酸雜交，d)連接相鄰的寡核苷酸，從而在支持物上的一個或多個間隔位置上形成連接的試劑，e)除去其它未連接的試劑，和f)回收並分析每個連接的試劑的標記部分以作為部分靶核酸序列的指示。
21.如權利要求20所要求的方法，其中所述序列為通過共價鍵固定於支持物上的每個間隔位置上的寡核苷酸的序列。
22.分析靶DNA的方法，此方法包括下列步驟i)提供固定於支持物上的靶DNA，ii)將來自i)的固定化靶DNA與權利要求10所要求的多種試劑一起溫育以使不同試劑的寡核苷酸鏈與支持物上的靶DNA雜交，iii)除去未雜交的試劑，和iv)回收並分析每種試劑的標記部分以作為部分靶DNA序列的指示。
23.如權利要求22所要求的方法，還包括下列步驟iia)將來自iv)的雜交體與權利要求13所要求的試劑庫一起溫育，以使不同試劑的寡核苷酸鏈與靶DNA雜交，iiia)連接與靶DNA雜交的相鄰寡核苷酸，除去未連接的試劑，和iva)回收並分析每種連接的試劑的標記部分以作為部分靶DNA序列的指示。
24.如權利要求22或23所要求的方法，其中靶核酸的各個克隆固定於支持物上的間隔位置，而在步驟ii)中，不同試劑的寡核苷酸鏈與位於支持物上不同的間隔位置的靶核酸雜交。
25.如權利要求14至24中任一項所要求的方法，其中通過光裂解從其相關試劑中回收每種標記部分。
26.如權利要求14至25中任一項所要求的方法，其中通過質譜法分析標記部分。
27.測定裝置，它包括其上具有兩個或更多個間隔位置的支持物；固定於支持物上間隔位置的靶核酸的單個克隆；與支持物上間隔位置上的靶核酸的各個克隆雜交的根據權利要求10的不同試劑。
全文摘要
一種試劑，它含有a)含有至少兩個分析物殘基的分析物部分，它連接於b)含有一個或多個適於質譜法檢測的報導基團的標記部分，其中報導基團標示出分析物殘基，選擇標記部分各個位置的報導基團用以標示分析物部分限定位置的分析物殘基。多種各含有不同的分析物部分的這類試劑可提供試劑庫，此庫可用於包括靶物質的測定方法中。對標記部分的分析可闡明與靶物質結合的分析物部分之特徵。測定核酸序列的方法使用了試劑庫以測定靶核酸的序列。
文檔編號G01N33/58GK1131440SQ9419344
公開日1996年9月18日 申請日期1994年8月1日 優先權日1993年7月30日
發明者E·肖思滕, W·J·庫明斯 申請人:埃西斯創新有限公司