用於調控激酶級聯的藥物組合物以其使用方法

2023-05-31 01:11:16 1

專利名稱：用於調控激酶級聯的藥物組合物以其使用方法
技術領域：
本發明涉及一種藥物組合物，該藥物組合物包括2- (5- (4- (2-嗎啉基乙氧基)苯 基)吡啶-2-基)-N-苯甲基-乙醯胺(化合物(I))以及它的藥學上可接受的鹽，例如，甲 磺酸鹽。本發明還涉及這種組合物的使用方法。
背景技術：
本發明涉及一種二芳基化合物及其藥學上可接受的鹽，包括甲磺酸鹽，所述二芳 基化合物及其藥學上可接受的鹽能夠有效的用於治療或者預防某些疾病或者紊亂。更具體 的，本發明涉及化合物2-(5-(4-(2_嗎啉基乙氧基)苯基)吡啶-2-基)-N-苯甲基-乙醯 胺，即，化合物(I)，或者其藥學上可接受的鹽，化合物(I)具有如下分子式(說明書第1頁 圖)(I)，其藥學上可接受的鹽包括一種甲磺酸鹽。美國專利第7，300，931號具體的公開並要求保護化合物(I)。該專利也公開了化 合物(I)在治療細胞增殖性紊亂方面的應用。化合物(I)及其藥學上可接受的鹽是有效地Src酪氨酸激酶抑制劑，可以用於治 療或者預防某些疾病或者紊亂，包括癌症、細胞增殖性紊亂、微生物感染、過度增殖性紊亂、 黃斑水腫、骨質疏鬆症、心血管疾病、眼部疾病、免疫系統機能失調、II型糖尿病、肥胖症、移 植排異、聽力喪失、中風、動脈硬化症、慢性神經性疼痛、B型肝炎和自身免疫性疾病。美國 專利第2007/0015752號、PCT/US2008/004847中描述了使用化合物(I)治療並預防這些疾 病或者紊亂的發生。本發明公開了某種藥物組合物，這種藥物組合物包括化合物(I)或者其藥學上可 接受的鹽。

發明內容
本發明提供了一種用於口服給藥、靜脈內給藥、肌肉內給藥或者皮下給藥的藥物 組合物，這種藥物組合物包括每劑量2毫克到400毫克的化合物(I)或者其藥學上可接受 的鹽和一種藥學上可接受的載體，每日給藥2次到3次。在一個方面，所述劑量是10毫克 到300毫克。在另一個方面，所述劑量是20毫克到250毫克。在另一個方面，所述劑量是 40毫克到200毫克。在另一個方面，所述劑量是60毫克到160毫克。在一個方面，所述劑 量每日給藥2次。在另一個方面，所述劑量每日給藥3次。本發明提供了一種用於口服給藥、靜脈內給藥、肌肉內給藥或者皮下給藥的藥物 組合物，這種藥物組合物包括每劑量4毫克到800毫克的化合物(I)或者其藥學上可接受 的鹽和一種藥學上可接受的載體，該組合物每日給藥一次。在一個方面，所述劑量是20毫克到600毫克。在另一個方面，所述劑量是40毫克到500毫克。在另一個方面，所述劑量 是80毫克到400毫克。在另一個方面，所述劑量是120毫克到320毫克。本發明提供了一種藥物組合物，其中，所述藥物組合物包括化合物(I)的甲磺酸
Trrt. ο本發明提供了一種藥物組合物，其中，所述組合物是被口服給藥的。在另一個方 面，本發明所述組合物是被靜脈內給藥的。在另一個方面，本發明所述組合物是被肌肉內給 藥的。在另一個方面，本發明所述組合物是被皮下給藥的。本發明提供了一種藥物組合物，其中，這種藥物組合物可以與一種或者一種以上 的抗癌治療劑或者抗癌試劑結合給藥。在一個方面，本發明的藥物組合物與抗癌試劑吉西 他濱結合給藥。在另一個方面，本發明的藥物組合物與抗癌試劑奧沙利鉬(oxaliplatin)
結合給藥。本發明提供了一種治療或者預防一種疾病或者紊亂的方法，該方法包括給藥這裡 所描述的藥物組合物，其中，所述疾病或者紊亂選自癌症、細胞增殖性紊亂、微生物感染、 過度增殖性紊亂、黃斑水腫、骨質疏鬆症、心血管疾病、眼部疾病、免疫系統機能失調、II型 糖尿病、肥胖症、移植排異、聽力喪失、中風、動脈硬化症、慢性神經性疼痛、B型肝炎和自身 免疫性疾病。在一個方面，所述疾病或者紊亂是癌症。在一個方面，所述癌症選自腎癌、前列 腺癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、腦癌、乳腺癌、結腸癌、白血病、卵巢癌、上皮細胞癌和食道癌。在 另一個方面，所述癌症選自惡性腫瘤、實性腫瘤、和惡性淋巴瘤。在一個方面，所述疾病或者 紊亂是一種細胞增殖性紊亂。在一個方面，所述細胞增殖性紊亂選自銀屑病、糖尿病性視網 膜病和黃斑變性。在一個方面，所述疾病或者紊亂是一種微生物感染。在一個方面，所述微 生物感染選自細菌感染、真菌感染、寄生蟲感染、和病毒感染。在一個方面，所述疾病和紊亂 選自過度增殖性紊亂、黃斑水腫、骨質疏鬆症、心血管疾病、眼部疾病、免疫系統機能失調、 II型糖尿病、肥胖症、移植排異、聽力喪失、中風、動脈硬化症、慢性神經性疼痛、B型肝炎和 自身免疫性疾病。本發明提供了一種調節免疫系統活性的方法，包括給藥這裡描述的藥物組合物。本發明提供了本發明所述藥物組合物在製備用於治療或者預防一種疾病或者紊 亂的藥物中的應用，所述疾病或者紊亂選自癌症、細胞增殖性紊亂、微生物感染、過度增殖 性紊亂、黃斑水腫、骨質疏鬆症、心血管疾病、眼部疾病、免疫系統機能失調、II型糖尿病、肥 胖症、移植排異、聽力喪失、中風、動脈硬化症、慢性神經性疼痛、B型肝炎和自身免疫性疾 病。在一個方面，所述疾病或者紊亂是癌症。在一個方面，所述癌症選自腎癌、前列腺癌、肝 癌、肺癌、胰腺癌、腦癌、乳腺癌、結腸癌、白血病、卵巢癌、上皮細胞癌和食道癌。在另一個方 面，所述癌症選自惡性腫瘤、實性腫瘤、和惡性淋巴瘤。在一個方面，所述疾病或者紊亂是一 種細胞增殖性紊亂。在一個方面，所述細胞增殖性紊亂選自銀屑病、糖尿病性視網膜病和黃 斑變性。在一個方面，所述疾病或者紊亂是一種微生物感染。在一個方面，所述微生物感染 選自細菌感染、真菌感染、寄生蟲感染、和病毒感染。在一個方面，所述疾病和紊亂選自過度 增殖性紊亂、黃斑水腫、骨質疏鬆症、心血管疾病、眼部疾病、免疫系統機能失調、II型糖尿 病、肥胖症、移植排異、聽力喪失、中風、動脈硬化症、慢性神經性疼痛、B型肝炎和自身免疫 性疾病。本發明提供了本發明所述藥物組合物在製備用於調節免疫系統活性的藥物中的應用。


圖IA—種圖表，指出了在c-Src/NIH-3T3細胞中AZ28和化合物(I)對Src自動 磷酸化作用的影響；圖IB—種圖表，指出了在HT-29細胞中AZ28和化合物(I)對Src自動 磷酸化作用的影響。圖2A —種圖表，指出了在c-Src/NIH-3T3細胞中AZ28和化合物(I)對黏著斑激 酶磷酸化作用的影響；圖2B—種圖表，指出在HT-29細胞中AZ28和化合物(I)對黏著斑激 酶磷酸化作用的影響。圖3A—種圖表，指出了在c-Src/NIH_3T3細胞中AZ28和化合物(I)對Shc磷酸 化作用的影響；圖3B—種圖表，指出了在HT-29細胞中AZ28和化合物⑴對Shc磷酸化作 用的影響。圖4 一種圖表，指出了在c-Src/NIH_3T3細胞中AZ28和化合物(I)對paxillin 磷酸化作用的影響。圖5A—種圖表，指出了在c-Src/NIH_3T3細胞中AZ28和化合物(I)對caspase-3 分裂的影響；圖5B—種圖表，指出了在HT-29細胞中AZ28和化合物⑴對caspase-3分裂 的影響。圖6A —種圖表，指出了在c-Src/NIH-3T3細胞中AZ28和化合物(I)對總磷酸化 酪氨酸水平的影響；圖6B—種圖表，指出了在HT-29細胞中AZ28和化合物⑴對總磷酸化 酪氨酸水平的影響。圖7是一種圖表，指出了在c-Src/NIH-3T3細胞中AZ28和化合物(I)對血小板衍 生生長因子受體(PDGFR)自動磷酸化作用的影響。圖8A是一種圖表，指出了在c-Src/NIH-3T3細胞中AZ28和化合物(I)對黏著斑 激酶自動磷酸化作用的影響；圖8B是一種圖表，指出了在HT-29細胞中AZ28和化合物⑴ 對黏著斑激酶自動磷酸化作用的影響。圖9A是一種圖表，指出了在c-Src/NIH-3T3細胞中AZ28和化合物(I)對表皮生 長因子受體(EGFR)自動磷酸化作用的影響；圖9B是一種圖表，指出了在HT-29細胞中AZ28 和化合物(I)對表皮生長因子受體(EGFR)自動磷酸化作用的影響。圖10A、圖10B、圖IOC和圖IOD是一系列圖表，描述了在全細胞中對Src激酶活性 的抑制作用。圖IOA顯示了化合物(I)在c-Src/NIH-3T3細胞中對Src自動磷酸化作用的 影響；圖IOB顯示了化合物(I)在HT-29細胞中對Src自動磷酸化作用的影響；圖IOC顯示 了在c-Src/NIH-3T3細胞中對Src轉磷酸化作用的影響；圖IOB顯示了化合物(I)在HT-29 細胞中對Src自動磷酸化作用的影響。圖11是一種描繪全細胞中同達沙替尼相比化合物(I)對蛋白質酪氨酸激酶 (PTKs)選擇性的附圖。所述達沙替尼是目前在臨床試驗中廣泛使用的腺苷三磷酸-競爭性 的Src抑制劑。圖12是一種圖表，表示了達沙替尼對達沙替尼和伊馬替尼有抵抗性的白血病細 胞的影響。圖13是一種圖表，表示了化合物(I)對達沙替尼和伊馬替尼有抵抗性的白血病細胞的影響。圖14顯示了在HT-29細胞中，與達沙替尼(BMS354825)相比，化合物(I)的生長 抑制曲線和GI50值。圖15顯示了在SK0V-3細胞中，與達沙替尼(BMS354825)相比，化合物(I)的生長 抑制曲線和GI50值。圖16顯示了在A549細胞中，與達沙替尼(BMS354825)相比，化合物(I)的生長抑 制曲線和GI50值。圖17顯示了在K562細胞中，與達沙替尼(BMS354825)相比，化合物(I)的生長抑 制曲線和GI50值。圖18顯示了在MDA-MB-231細胞中，與達沙替尼(BMS354825)相比，化合物(I)的 生長抑制曲線和GI50值。圖19顯示了使用5-溴脫氧尿核苷試驗測定的Gemzar和化合物(I)的結合在 L3. 6pl細胞株中的生長抑制曲線和GI50值。圖20顯示了使用5-溴脫氧尿核苷試驗測定的Gemzar和化合物(I)在L3. 6pl細 胞株中的生長抑制曲線和GI50值。圖21顯示了在不同濃度的化合物(I)中從用於測定體內轉移的正位前列腺模型 中的得到的腫瘤重量。圖22顯示了在以2. 5毫克/ 一劑每日兩次、5. 0毫克/ 一劑每日兩次和達沙替尼 7. 5毫克/ 一劑每天二次治療之後，第二周IVIS跟蹤研究結果。圖23是一種棒狀圖，顯示了抗-HBV效力的篩選結果和細胞毒性。圖24是一種描繪化合物⑴在老鼠異種移植物中口服效力的圖表。在HT29( — 種人類結腸癌細胞株)老鼠細胞中，化合物(I)比達沙替尼顯示了較高的口服效力。圖25A-D顯示了每隻C57BL/6小鼠在不同的顱內GL261神經膠質瘤倖存者研究治 療組中的重量增加。圖26顯示了在不同的顱內GL261神經膠質瘤倖存者研究治療組中，經過40天時 間後每個治療組小鼠的平均體重。圖27顯示了枸櫞酸他莫昔芬(tamoxifen)和化合物(I)在MCF-7細胞中的協同 生長抑制效果。
具體實施例方式在下面隨後的描述中列出了本發明所述的一種或者多種實施方式的詳細內容。盡 管在本發明的實踐或者檢驗中可以使用與本發明中所描述的相類似或者等價的任意方法 以及物質，但下面描述的是優選的方法以及物質。通過下面的描述，本發明所述的其他特 徵、目的以及優點將是顯而易見的。在下述的具體說明中，除非文章中明確指示，否則所述 的單數形式也包括複數。除非特別定義，這裡使用到的所有的技術術語以及科技術語與發 明所屬領域的普通技術人員通常所理解的含義相同。如產生矛盾，將以本說明書為準。這 裡所提及的所有的出版物、專利申請、專利、以及其他參考文獻的全部內容在此引入作為參 考。化合物(I)是一種合成的，具有口服生物利用率和高選擇性的Src酪氨酸激酶抑制劑。化合物(I)靶向肽底物結合位點但不向其他已知的Src酪氨酸激酶抑制劑一樣靶向 三磷酸腺苷的結合位點，因此，在同種類中更為優選。在定義對腫瘤細胞生物活性中，化合 物(I)顯示出對黏著斑激酶(FAK)、She、樁蛋白(Paxillin)的Src-催化的轉磷酸化作用 和對Src激酶的自動磷酸化作用，具有的IC50在大約20nM。據顯示，化合物(I)能夠誘導 P53表達並刺激Caspase-3和PARP裂解，這些都能導致腫瘤細胞凋亡。化合物(I)可以有效的治療多種類型的實體腫瘤細胞型以及許多白血病，包括對 伊馬替尼和/或達沙替尼具有抵抗力的疾病。與目前正在發展中並且在市場上可以商業購 得的Src激酶抑制劑不同，化合物(I)不競爭結合三磷酸腺苷的結合位點。由於他不抑制 卩06 1 』6 1 、從1(1、從1(2、1^(^和24 70，因此化合物(I)具有極高的選擇性。化合物(I)在 抑制Bcr/Abl方面的效力比達沙替尼低10-100倍。由於達沙替尼和伊馬替尼甲磺酸鹽一 起的Bcr/Abl抑制作用以及被證明與心臟毒性有關，因此化合物(I)基本不會引起心臟中根據體內功效，在HT29細胞(人結腸癌細胞)異種移植鼠模型中，化合物⑴對 腫瘤細胞增殖作用的抑制作用比達沙替尼有效5倍。在PC3-MM2(人前列腺癌)原位抑制 鼠模型中，化合物(I)對原發瘤的生長和淋巴結的轉移顯示了強烈的抑制作用。由於激酶被包含於各式各樣正常細胞信號轉導途徑(例如，細胞生長、細胞鑑別、 細胞存活、細胞粘附、細胞遷徙，等等)的調節過程中，通常認為激酶在多種疾病和紊亂中 起作用。因此，激酶信號級聯的調控可能是一種重要的治療或者預防這些疾病的方法。這 樣的疾病和紊亂包括，例如，癌症、骨質疏鬆症、心血管疾病、免疫系統功能紊亂、II型糖尿 病、肥胖症和移植排異反應。化合物(I)或其藥學上可接受的鹽能夠有效的調控所述的激酶信號級聯中的一 個成員。許多蛋白激酶以及磷酸酶是已知的，並且它們是治療學的發展所針對的目標。參 見,例如,Hidaka 與 Kobayashi 於 1992 年的在 Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol《藥理學與毒 性學年鑑》32 377-397中發表的文獻；Davies等人於2000年在Biochem. J.《生物化學雜 志》351 95-105中發表的文獻，上述文獻通過引證在此全部併入本文。激酶中的一個家族一蛋白酪氨酸激酶，被劃分為兩個大的家族受體酪氨酸 激酶，或者表示為RTK(例如，胰島素受體激酶(IRK)，表皮生長因子受體(EGFR)，成纖維 細胞生長因子受體(FGFR)，血小板衍生生長因子受體(PDGFR)，血管內皮生長因子受體 (VEGFR-2或者Flk 1/KDR)，以及神經生長因子受體(NGFR))，以及非受體酪氨酸激酶，或者 表示為 NRTK(例如，Src 家族(Src, Fyn, Yes, Blk, Yrk, Fgr，Hck, Lck,以及 Lyn)，Fak, Jak, Abl 以及 Zap 70)。參見，例如，Parang 與 Sun 於 2005 年在 Expert Opin. Ther. Patents((^ 療學專利的專家觀點》15 :1183-1207中發表的文獻，上述文獻通過引證在此全部併入本文。由於Src激酶在各種癌症中所起到的作用，這些激酶成為許多研究的學科，這些 研究涉及Src抑制劑作為癌症治療劑的進展，包括高度轉移的癌症細胞的生長。尋找Src抑 製劑作為各種癌症的治療劑，這些癌症包括，例如，結腸癌，癌症前期的結腸病變，卵巢癌， 乳腺癌，上皮癌，食道癌，非小細胞肺癌，胰腺癌，以及其他癌症。參見，例如，Frame於2002 年在Biochim. Biophys. Acta《生物物理學報》1602 114-130中發表的文獻，以及Parang與 Sun於2005年在Expert Opin. Ther. Patents《治療學專利的專家觀點》15 1183-1207中 發表的文獻。
可以將對於其他激酶的抑制用於治療以及調控其他類型的疾病以及障礙。例如， 可以通過給藥血管內皮生長因子(VEGF)受體酪氨酸激酶抑制劑來抑制或者預防各種眼部 疾病。酪氨酸磷酸酶PTP-IB和/或糖原磷酸化酶的抑制劑能夠為II型糖尿病或者肥胖提 供治療。P561ck抑制劑能夠有效的治療免疫系統障礙。其他的靶位包括人類免疫缺陷病毒 (HIV)逆轉錄酶，血栓素合成酶，表皮生長因子受體酪氨酸激酶(EGFRTK)，p55fyn，等等。化合物(I)可以是在Src肽底物位點發生結合的Src信號抑制劑。在C-SrC(527F， 組成性激活及轉化)轉化的NIH3T3細胞以及人類結腸癌細胞(HT29)中對本發明化合物 (I)的活性進行了研究。例如，在這些細胞系中，化合物(I)表現出以一種劑量依賴的形式 降低了已知Src蛋白底物的磷酸化水平，並且與生長抑制效應建立了良好的關聯。儘管不希望受到理論的限制，但可以確信在細胞外的某些激酶(例如，Src)的構 象與細胞內的構象存在顯著的差別，因為在細胞內，許多激酶被包埋在多蛋白信號複合體 中。因此，由於在分離的激酶中不能很好的形成所述的肽底物結合位點(如SrcX-射線結 構所示)，可以確信肽底物結合抑制劑對於分離的激酶的活性而言應當是微弱的。在分離的 激酶檢測中，在這一位點上發生結合要求所述的抑制劑捕獲到非常少量的完整蛋白質，所 述的完整蛋白質在分離的酶檢測中在細胞內具有同樣的構象。為了能夠被探測到，需要大 量過量的抑制劑來消耗所述的大量的酶，其中所述的酶來自於所述檢測的催化性循環。然而，對於基於細胞的檢測而言，由於可以預期能夠形成所述的肽結合位點，因而 不需要大量過量的抑制劑。在基於細胞的Src檢測中，SH2&SH3結構域結合蛋白已經改變 了所述Src的構象，因而所述的肽底物結合位點已經完全形成。因此，低濃度的所述抑制劑 能夠除去來自於所述催化性循環的酶，因為所有的酶都呈現出緊密結合的構象。絕大多數的已知的激酶抑制劑都是ATP (三磷酸腺苷)競爭性的，並且在一組分離 的激酶檢測中表現出較差的選擇性。然而，本發明中所述的化合物(I)被認為是肽底物結 合抑制劑。因此，針對分離的酶例如Src的傳統的高生產量的化合物的篩選不會導致本發 明所述化合物(I)的發現。近來有相當多的文獻支持這樣的觀點以pp6(te_SM(SrC)為靶向，是一種具有廣 泛用途的癌症治療方法，且不會產生嚴重的毒性。例如，那些顯示出增強的表皮生長因子 (EGF)受體蛋白酪氨酸激酶(PTK)信號、或者過表達所述相關的Her-2/neu受體的腫瘤，具 有組成性激活的Src以及增強的腫瘤入侵性。對於這些細胞中的Src的抑制誘發生長停 滯，引發細胞凋亡，並且翻轉了轉化了的表型(參見Karni等人(於1999年)在Oncogene 《致癌基因》18 (33) :4654-4662中發表的文獻)。已知Src活性的異常升高使得轉化細胞以 錨定不依賴性的形式進行生長。這顯然是由於胞外基質信號以等同於有絲分裂信號的形式 增強了 FAK (黏著斑激酶)/Src途徑中的Src活性，並且從而阻礙了本應正常被激活的細胞 凋亡機制。因此在腫瘤細胞中進行FAK/Src的抑制能夠誘發細胞凋亡，因為本應在從所述 的胞外基質中被釋放出來之後才被正常激活的細胞凋亡機制被引發了(參見Hisano等人 (於 1997 年)在 Proc. Annu. Meet. Am. Assoc. CancerRes. 38 :A1925 中發表的文獻)。此夕卜， 在Src受到抑制時注意到血管內皮生長因子(VEGF)mRNA的表達減弱，並且來自於這些Src 抑制細胞系的腫瘤表現出向生成血管方向的發展的減弱(參見Ellis等人(於1998年)在 Journal of Biological Chemistry《生物化學雜誌》273 (2) 1052-1057 中發表的文獻)。例如，大鼠的Src基因的剔除僅會導致一種缺陷，即破骨細胞不能夠形成皺褶緣並且因此不能進行骨的再吸收。然而，通過在這些大鼠中插入激酶缺陷性Src基因，能夠 挽救所述破骨細胞的骨的再吸收功能(參見Schwartzberg等人(於1997年)在Genes & Development《基因的研究發展》11 :2835_2844中發表的文獻)。這表明可以在不引發 僅已知的毒性的前提下在體內對Src激酶的活性進行抑制，這是因為所述的Src蛋白的存 在顯然足以補充並且激活存在於以破骨細胞為主的信號複合體(osteoclast essential signaling complex)中的其他蛋白酪氨酸激酶(這些蛋白酪氨酸激酶對於維持破骨細胞 的功能而言是必不可少的)。由於已經發現在越來越多的人類腫瘤中存在Src的過度活化，已經提議將Src作 為癌症治療中的「通用」靶位(參見Levitzki (於1996年)在Current Opinion in Cell Biology《細胞生物學的現代主張》8，239-244中發表的文獻；Levitzki (於1996年)在 Anti-Cancer Drug Design《抗癌症藥物的設計》11，175-182中發表的文獻)。對於Src 的抑制在癌症治療方面所產生的可能的效益是由自分泌生長因子環作用所引發的對於不 受控制的細胞生長的抑制所產生的效益的四倍，是當從所述細胞基質中逃離後引發細胞凋 亡而導致的對於轉移的抑制所產生的效益的四倍，是經由降低的血管內皮生長因子(VEGF) 水平以及低毒性所形成的對於腫瘤的血管生成作用的抑制所產生的效益的四倍。據報導，前列腺癌細胞中同時含有過表達的樁蛋白以及pl30caS，並且是過度磷酸 化的(參見Tremblay等人於1996年在Int. J. Cancer《癌症研究雜誌》68，164-171中發表 的文獻)，其因此可以作為Src抑制劑的首要靶位。在某些實施方案中，所述癌症的類型包括實體腫瘤和非實體腫瘤。在特定的實施 方案中，所述實體腫瘤選自CNS(中樞神經系統)腫瘤、肝癌、大腸癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、 膀胱癌、宮頸癌、頭部和頸部腫瘤、外陰癌和皮膚贅生物包括惡性黑色素瘤、鱗狀細胞癌和 基底細胞癌。在其他的實施方案中，非實體瘤包括淋巴增殖性疾病，所述淋巴增殖性疾病包 括白血病和淋巴瘤。在其他的實施方案中，所述疾病是轉移性疾病。如下表所示，本發明化合物(I)表現了廣泛的實體腫瘤活性。 本發明的化合物(I)還可以與一種或者一種以上的抗癌療法和/或一種或一種以 上抗癌製劑結合使用用於治療癌症或者細胞增殖性疾病，所述抗癌療法例如放射療法，所 述一種或一種以上的抗癌製劑選自由抗增生性試劑、細胞毒劑、細胞生長抑制劑、和化學治 療劑及其鹽和衍生物所組成的組中。根據某些實施方案，本發明化合物(I)可以與任意一 種藥物相結合用於治療一種癌症或者細胞增殖紊亂，所述藥物選自由一種生物鹼、烷基化 劑、抗腫瘤抗生素、代謝拮抗劑、Bcr-Abl酪氨酸激酶抑制劑、核苷類似物、多藥抵抗性轉換 劑、DNA接合劑、微管結合藥物、毒素和一種DNA拮抗物所組成的組中。本發明所屬領域普 通技術人員可以識別如上所述被分為一種或一種以上特定化學治療劑種類的化學治療劑。根據優選的實施方案，本發明化合物(I)可以與一種或者一種以上試劑結合使 用用於治療一種癌症或者細胞增殖紊亂，所述試劑選自由代謝拮抗劑(例如，吉西他濱 (gemcitabine))、局部異構酶I和II的抑制劑、烷基化劑和微管抑制劑(例如，紅豆杉 醇)，以及酪氨酸激酶抑制劑(例如，surafenib)、表皮生長因子激酶抑制劑(例如，特羅凱 (tarceva)或者厄洛替尼(erlotinib)、鉬複合物(例如，奧沙利鉬(oxaliplatin))；和ABL 激酶抑制劑(例如，格列衛(Gleevec)或者甲磺酸伊馬替尼(Imatinib))所組成的組中。生物鹼包括，但是不局限於，多西他塞(docetaxel)、依託泊苷(etoposide)、伊立 替康(irinotecan)、紫杉醇(紫杉酚)、替尼泊苷(teniposide)、託泊替康(topotecan)、長 春花鹼(vinblastine)、長春花新鹼、去乙醯長春醯胺(vindesine)。烷基化劑包括，但是不局限於，白血福恩(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)、 哌醯硫烷(piposulfan)、苯佐替派(benzod印a)、5-雙乙撐亞胺3_6_甲對苯醌 (carboquone)、雙二甲磷醯胺乙酯(metured印a)、雙氮丙啶膦醯氨甲酸乙酯(ured印a)、 六甲蜜胺(altretamine)、三乙烯亞胺三嗪、三亞乙基磷醯胺、三乙基三磷酸胺、苯丁酸氮 芥、chloranaphazine、環磷酉先胺(cyclophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、異環磷酉先 胺(ifosfamide)、二氯甲二乙胺(mechlorethamine)、甲二氯二乙胺氧化物鹽酸鹽、苯丙 氨酸氮芥novemebichin、培磷醯胺膽留醇對苯乙酸氮芥、松龍苯芥(prednimustine)、氯 乙環磷醯胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)、亞硝脲氮芥(carmustine)、 吡葡亞硝脲(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、環己亞硝脲(Iomustine)、嘧啶 亞硝脲(nimustine)、甲基環己亞硝脲雷莫司汀、氮烯唑胺(dacarbazine)、甘露醇氮芥 (mannomustine)、二溴甘露酉享(mitobronitol)、二溴衛矛酉享(mitolactol)、雙溴丙基哌嗪 (pipobroman)、替莫唑胺(temozolomide)。抗生素及其類似物包括，但是不局限於，阿克拉黴素、放線菌素、氨茴黴素、重 氮乙醯絲氨酸、爭光黴素、放線菌素C、卡柔比星、嗜癌菌素、cromomycins、放線菌素、 道諾紅菌素、6-重氮基-5-氧-1-正亮氨酸、亞德裡亞黴素、表柔比星、伊達比星、美 i若 (menogaril)> ^.^iUM^^iWiM (mycopheno licac id) > nogalamycine> Il 黴素(olivomycins)、匹來黴素(peplomycin)、口比喃阿黴素(pirarubicin)、光輝黴素 (plicamycin)、甲基絲裂黴素(porfiromycin)、嘌呤黴素(puromycine)、鏈黑菌素、鏈脲黴 素、殺結核菌素(tubercidin)、淨司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)。代謝拮抗劑包括但是不局限於，二甲葉酸(denopterin)、依達曲沙(edatrexate)、 6巰基嘌呤(6-MP)、氨甲蝶呤、吡曲克辛(piritrexim)、蝶羅呤(pteropterin)、脫氧助間 型黴素(2' -DCF)、雷替曲塞(tomudex)、三甲曲沙(trimetrexate)、cladridine、氟達拉濱(fludarabine)、硝咪硫鳥嘌呤(thiamiprine)、環胞苷、阿扎胞苷、6_氮尿嘧啶核苷、 carmoftir、阿拉伯胞嘧啶糖苷、去氧氟尿苷(doxifluridine)、乙嘧替氟(emitefur)、5_氟 脫氧尿苷(floxuridine)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、吉西他濱(gemcitabine)、替加氟 (tegafur)、羥基尿素(hydroxyurea)和氨基甲酸乙酯(urethan)。鉬複合物包括但是不局限於，卡鉬(Caroplatin)、順鉬、米帕(miboplatin)、奧沙 利鉬。抗有絲分裂試劑或者微管接合劑包括但是不局限於，長春花新鹼(vincristine) 和長春花鹼(vinblastine)和紫杉酚。當與其他的抗增生試劑一起使用時，本發明化合物(I)可以提高(例如，協同增 效)這些製劑的活性。進一步地，這些協同增效作用能夠使本發明化合物(I)、其他的抗增 生試劑或者他們兩者都以比較低的劑量給藥，和/或可以顯著地提高任意給定的劑量下所 述化合物的抗增生性質。下表提供了使用本發明化合物(I)和其他的抗增生試劑聯合治療 的結果。
12 在一個實施方案中，化合物(I)或其藥學上可接受的鹽可以用於治療、預防或者 緩解宿主所患有的腦部癌症。在本發明的另一個方面，本發明包括本發明化合物(I)或其 藥學上可接受的鹽在製備用於治療或者預防或者防止主題患上腦部癌症的藥物中的應用。 為了預防或者防止患上腦部癌症，化合物(I)及其藥學上可接受的鹽在宿主發展成腦部癌 症之前給藥。作為選擇，本發明所述化合物可以用來在宿主中治療腦部癌症。用於治療、預 防或者緩解宿主所患有的腦部癌症的化合物(I)或其藥學上可接受的鹽可以被包括在激 酶信號級聯的調節過程中，例如，一種激酶抑制劑、一種非三磷酸腺苷競爭性抑制劑、一種 酪氨酸激酶抑制劑、一種蛋白激酶磷酸酶抑制劑或者一種蛋白質-酪氨酸磷酸鹽IB抑制 劑。術語「腦部癌症」包括多種癌症。可以使起源於腦本身的實體腦腫瘤，例如本領域 已知的幾種原發性腦癌。術語「腦部癌症」涉及惡性腫瘤，即，侵略性的生長並蔓延、通過佔 領健康細胞的空間或吸收健康細胞血液和養分而壓倒健康細胞的腫瘤。不會侵略性蔓延的 腫瘤叫做良性腫瘤。良性腫瘤的嚴重性通常要小於惡性腫瘤，但是良性腫瘤也會在腦部產 生問題。也可以是轉移性腦瘤，代表其他癌症傳播到腦部，例如，肺部腫瘤或者乳房腫瘤傳 播到腦部。通過形成腦部腫瘤的腦部細胞和在顯微鏡下腫瘤的外觀可以將腦部腫瘤進行分 類。原發性腦腫瘤起因於任意腦部腫瘤，或者腦部的特點結構。GHa細胞支持腦部神經元， 起源於這些細胞的腫瘤叫做神經膠質瘤。腦周圍的腦膜也可以發展成腫瘤，這些腫瘤叫做 腦膜瘤。包括在腦其他結構中的其他類型的腫瘤包括室管膜瘤。最常見的原發性腦腫瘤是 神經膠質瘤、腦膜瘤、垂體腺瘤、前庭神經鞘瘤和原發性神經外胚葉瘤(髓質母細胞瘤)。本發明提供了一種治療、預防或者緩解所患有的惡性膠質瘤的方法，惡性膠質瘤 是一種惡性的、快速生長的中樞神經系統星形細胞瘤，通常可以是大腦半球的星形細胞瘤。 惡性膠質瘤的同義詞包括多形性膠質母細胞瘤(GBM)、巨細胞惡性膠質瘤、和多形性惡性膠 質瘤。惡性膠質瘤是最常見的惡性原發性腦部腫瘤，並且已經證實很難被治療。這些腫瘤 常常侵略並滲透周圍的腦組織。惡性膠質瘤由膠質細胞而產生，膠質細胞存在於腦部和脊 髓中，是一種能夠形成包圍並保護其他神經細胞的組織的細胞。惡性膠質瘤主要由星形交 織細胞組成，星形的膠質細胞叫星形膠質細胞。術語「神經膠質瘤」包括任意類型的腦部腫 瘤，例如，星形細胞瘤、寡枝神經膠質細胞瘤、室管膜瘤和脈絡叢乳頭狀瘤。根據細胞複製速 度和滲透附近組織的可能性，星形細胞瘤可以被歸為四個等級。第一等級(等級I)或者第 二等級(等級II)的星形細胞瘤是非惡性細胞瘤，被認為是低等級的星形細胞瘤。第三等 級(等級III)和第四等級(等級IV)的星形細胞瘤是惡性的並且被認為是高等級的星形 細胞瘤。等級II的星形細胞瘤被稱為間變性星形細胞瘤。等級IV的星形細胞瘤被稱為多 形性膠質母細胞瘤。本發明提供了治療、預防或者緩解所患有的成神經管細胞瘤的方法。成神經管細 胞瘤是一種非常惡性的原發性腦部腫瘤，起源於小腦或者後顱窩。原來認為成神經管細 胞瘤是一種神經膠質瘤，但是現在已經知道，成神經管細胞瘤是頭部原發性神經外胚葉瘤 (PNET)家族的一種。由於存在於骨幕之下，發生於小腦的腫瘤被認為是幕下腫瘤，骨幕是將腦部的大 腦半球與小腦分離的厚膜。成神經管細胞瘤的另一個屬於是幕下原發性神經外胚葉瘤(PNET)。成神經管細胞瘤是發生於腦部的最常見的原發性神經外胚葉瘤(PNET)。腦部所有 的原發性神經外胚葉瘤(PNET)都是侵入性的且生長快速的腫瘤，與大部分腦部腫瘤不同， 腦部的原發性神經外胚葉瘤(PNET)通過腦脊髓液(CSF)傳播並且常常轉移到腦部和脊柱 不同的位置。最容易發生成神經管細胞瘤的年齡是7歲。百分之七十的成神經管細胞瘤發 生於16歲以下的少年。成人尤其容易患有促結締組織增生的成神經管細胞瘤，這類腫瘤很 少發生在50歲以上的人群中。本發明提供了用於治療、預防或者緩解所患有的成神經細胞瘤的方法，成神經細 胞瘤是在神經組織中形成的癌症。成神經細胞瘤細胞通常與胚胎或者胎兒中發現的最初發 展的神經細胞非常類似。屬於神經(neuro)表示「神經(nerves) 」，而術語「胚細胞瘤」是指 感染不成熟或者發展中細胞的癌症。神經元(神經細胞)是腦和脊髓的主要組成部分，也是 將腦和脊髓與身體其他部分連接在一起的神經的主要組成部分。成神經細胞瘤通常開始於 腎上腺，同時也可以開始於脊髓。成神經細胞瘤是兒童期最常見的顱外實體癌症。在2007 年，成神經細胞瘤是嬰兒期最常見的癌症，在美國每年的新增的發病率大約為650。接近百 分之五十的成神經細胞瘤病例發生在兩歲以下的孩子身上。成神經細胞瘤是一種神經內分 泌腫瘤，起源於交感神經系統或者SNS的任意神經脊原因。作為自主神經系統的一束，交感 神經系統(SNS)是一種利用腦及身體信息並負責戰逃反應(fight-or-flightresponse)」 的神經網絡，能夠產生腎上腺素(adrenaline)或者腎上腺素(印in印hrine)。本發明提供了用於治療、預防或者緩解所患有的神經上皮瘤的方法，所述神經上 皮瘤是神經上皮的惡性腫瘤。神經上皮瘤通常發現在孩子和年輕的成人中。神經上皮瘤最 經常發生在胸腔壁、骨盆中，或者比較少見的，發生在骨骼或者軟組織中。用於診斷的過程 可以包括血液檢查和尿液檢查，感染骨骼的X射線以及全身和肺部、骨髓吸引術、CT檢查和 螢光檢查。治療方法包括外科療法、放射療法和化學療法。尤因氏肉瘤是一類外周神經上 皮瘤的實施例。激酶已經顯示出對腦部癌症發生作用。多形性膠質母細胞瘤的基因表達曲線已經 顯示了酪氨酸激酶對神經膠質瘤的轉移/侵入所起到的作用。例如，PYK2是一種非受體酪 氨酸激酶的黏著斑族成員；他與成纖維細胞外圍發生的由Src-誘導增加的肌動蛋白的聚 合作用密切相關。根據在培養過程中PYK2誘導的惡性膠質瘤的細胞遷移作用的過表達， PYK2對神經膠質瘤轉移/侵入的作用變得更加清楚。PYK2的活化水平與四種惡性膠質瘤細 胞系(SF767、G1 12、T98G和Ul 18)的轉移表型正向相關。對多形性膠質母細胞瘤(GBM) 原地侵入過程中活化的PYK2的分析顯示了在滲透性多形性膠質母細胞瘤(GBM)細胞中的 強烈染色(參見 Hoelzinger et al, Neoplasia, vol. 7 (1) 7-16) 因此，使用化合物(I) 或其藥學上可接受的鹽對激酶受體進行調節可以有效用於治療、預防或者防止患有腦部癌 症，例如多形性膠質母細胞瘤。做為選擇，化合物(I)或其藥學上可接受的鹽可以用於治療、預防或者防止宿主 患有腎臟癌症。本發明的另一個方面包括本發明所述化合物(I)或其藥學上可接受的鹽在 製備用於治療、預防或者緩解所患有的腎臟癌症的藥物中的應用。為了預防或者防止患有 腎臟癌症，化合物(I)或者其藥學上可接受的鹽可以在宿主發展成腎臟癌症之前被給藥。 作為選擇，化合物(I)或其藥學上可接受的鹽可以用來治療宿主患有的腎臟癌症。腎臟可以發生幾種類型的癌症。腎細胞癌(RCC)是最常見的形式，大約85%的腎臟癌症是腎細胞癌(RCC)。本發明提供了預防或者治療腎細胞癌(RCC)的方法。本發明也 提供了預防或者治療其他類型的腎臟癌症的方法，其他類型的腎臟癌症包括，例如，腎盂癌 (在腎臟中收集尿液的位置中心處形成的癌症)；腎胚細胞瘤，腎胚細胞瘤是通常在5歲以 下兒童體內發生的腎臟癌症；明細胞癌，也叫做明細胞腺癌和中腎瘤(通常發生在女性生 殖道的一種腫瘤類型，在顯微鏡下觀察這種腫瘤的細胞時，可以清楚的看到這些細胞的內 部)；腎腺癌(一種腎臟腫瘤的類型，其特點為在至少一些腫瘤上發生指狀投影)；和腎橫 紋肌肉瘤，腎橫紋肌肉瘤是一種罕見的高侵略性的腫瘤，常常發生在成年群體中。在腎細胞癌(RCC)中，癌(惡性)細胞在腎小管線中生長並發展成腫瘤塊。雖然 在一個和兩個腎臟內部可以產生一個以上腫瘤，但在大多數情況下，只有單一的腫瘤產生。 腎細胞癌(RCC)的特點在於缺乏早期危險體徵、具有多變的臨床表現、對放射物和化學療 法有抵抗力、並且是罕見的而且對於免疫治療試劑，例如幹擾素α和白細胞間介素(IL)_2 是可再生的。在過去，腎細胞癌(RCC)腫瘤被認為衍生自腎上腺體；因此，也經常使用術語 「腎上腺樣瘤」。腎細胞癌的組織起源是最接近的腎小管上皮組織。腎臟癌症或者是間歇性(非遺 傳性)形式或者是遺傳性形式，這兩種形式都與染色體3短臂(3p)的結構變化有關。對高 風險患有腎臟癌症的家族進行遺傳研究，克隆其變種會導致腫瘤形成的基因。這些基因既 是腫瘤抑制基因(VHL，TSC)也是致癌基因(MET)。已經識別出至少4種遺傳性綜合症與腎 細胞癌有關(1)馮希佩爾一林道綜合症(von Hippel-Lindau(VHL)), (2)遺傳性的乳頭 狀腎臟癌(HPRC)，(3)與Birt-Hogg-Dube綜合症(BHDS)有關的家族性腎嗜酸粒細胞腺瘤 (FRO)和(4)遺傳性腎臟癌(HRC)。腎細胞癌(RCC)很難預測，主要因為，在將近30%的具有局部疾病的病人中，40% 的病人在除去原發性腫瘤後腫瘤發生遠距離的轉移。腎細胞癌的發病年齡每年上漲3%。 根據美國癌症學會的數據顯示，在2007年，美國診斷出大約51，500例腎臟惡性腫瘤病例， 其中，大約12，500例死亡；腎細胞癌佔這些發病率和死亡率的80%。根治性腎切除術是局 部腎細胞癌(RCC)的主要治療方法。然後放射治療和可利用的化學治療劑對惡化並轉移的 腎細胞癌(RCC)無效。使用幹擾素-α和白細胞介素(interluckin) _2進行免疫治療只對小部分患有轉 移性腎細胞癌(RCC)的病人有效，並且毒性是非常大的。最近，已經開發了很多激酶抑制劑 用於治療腎臟癌症，例如格列衛(Gleevec)及其他新型試劑，例如，索拉非尼(sorafenib) 和舒尼替尼(simitinib)，這些激酶抑制劑通過靶向多重受體激酶起到抗血管生成作用，對 免疫治療不起作用的病人顯示活性。但是，這些治療方法並不是沒有限制的。例如，已經發 現，格列衛(Gleevec)的作用僅限於某種類型的腫瘤並且也可以發展出抗藥性。同時，有人 建議病人在服用舒尼替尼(simitinib)時應當注意監視心血管的副作用，例如，高血壓。同 時，對治療並預防腎臟癌症的方法存在改進的需要。作為選擇，本發明化合物(I)或其藥學上可接受的鹽可以用於治療、預防或者防 止宿主患有肝臟癌症。本發明的另一個方面包括本發明所述化合物(I)或其藥學上可接受 的鹽在製備用於治療、預防或者緩解所患有的肝臟癌症的藥物中的應用。為了預防或者防 止患有肝臟癌症，化合物(I)或者其藥學上可接受的鹽可以在宿主發展成肝臟癌症之前被 給藥。作為選擇，化合物(I)或其藥學上可接受的鹽可以用來治療宿主患有的肝臟癌症。
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在肝臟中可以發展出幾種類型的癌症。肝細胞性肝癌(HCC)佔所有肝臟癌症的 80-90%。本發明提供了一種治療或者預防肝細胞性肝癌的方法肝細胞性肝癌(HCC)開始 於肝細胞中，肝細胞是肝臟細胞的主要類型。大約四分之三的原發性肝癌屬於這種類型。肝 細胞性肝癌(HCC)具有不同的生長方式。其中一些開始於逐漸長大的單一腫瘤。只在疾病 末期的時候波及到肝臟的其他部分。肝細胞性肝癌(HCC)還可以同時在肝臟的許多位點開 始，並且不會只生成單一腫瘤。本發明還提供了用於治療其他種類的肝臟癌症的方法，其他種類的肝臟癌症包 括，例如，肝膽管型肝癌，肝膽管型肝癌開始於膽的膽管中；血管肉瘤和血管內皮瘤也是兩 種其他類型的癌症，開始於肝臟的血管中。這些腫瘤生長十分快速。通常在發現他們的時 候，他們已經開始散布，手術切除和治療並不會產生很大幫助；肝胚細胞瘤是一種產生在孩 子身上的癌症，通產發生於四歲以下的兒童身上。已經顯示出激酶在肝臟癌症中發揮作用。例如，已知存在在人類肝細胞性 肝癌(HCC)中的變化是原癌基因致癌基因(MET)的過表達、擴增或者突變，致癌基 因(MET)編碼酪氨酸激酶致癌基因(MET)的受體蛋白(參見，Tward et al. , PNAS, vol. 104(37) 14771-14776)。同時，已經顯示在體外和體內的液體流動條件下，FAK被包含 於整合素調節的癌細胞粘附和循環的早期事件中。人們認為激酶可能參與固定的粘附相互 作用的建立過程中，所述固定的粘附相互作用能夠使附著的腫瘤細胞抵抗剪切力(參見， Sengbusch et al. ,American Journal of Pathology，vol166 (2)585—595)。在2007 年，月幹 髒癌症是世界範圍內由癌症導致死亡的第三大主要原因，是世界上第六大最常見的癌症。 世界範圍內每年有600，000人唄確診患上肝臟癌症，且此發病率呈上升趨勢。因此，對於治 療、預防或者防止肝臟癌症發生的方法存在改進的需要。根據本發明另一個實施方案，本發明提供了一種用於治療、預防或者防止宿主患 有白血病的方法，所述方法包括對病人給藥本發明所述化合物(I)。在其他的實施方案中， 本發明提供了一種治療白血病的方法，包括向宿主給藥一種治療有效量的本發明化合物 ⑴和至少一種其他的治療劑，所述治療劑選自由抗增生試劑、細胞毒劑、細胞生長抑制劑 和化學治療劑及其鹽或者衍生物所組成的組中。根據某些實施方案，本發明化合物可以與 一種或一種以上藥物聯合使用，用於治療宿主白血病，所述藥物選自由生物鹼、烷基化劑、 抗腫瘤抗生素、代謝拮抗劑、Bcr-Abl酪氨酸激酶抑制劑、一種核苷類似物、一種多藥抵抗性 轉換劑、一種DNA接合劑、微管結合藥物、一種毒素和一種DNA拮抗物所組成的組中。本發 明所屬領域普通技術人員可以識別如上所述被分為一種或一種以上特定化學治療劑種類 的化學治療劑。白血病是一種骨髓和血液的惡性腫瘤，其以不受控制的血細胞生長為特點。白血 病通常被分為四種類型急性或慢性髓細胞性白血病和急性或慢性淋巴細胞性白血病，其 中急性或慢性髓細胞性白血病包括骨髓髓元素(白細胞，紅細胞，巨核細胞)的白血病，急 性或慢性淋巴細胞性白血病包括淋巴腺細胞白血病。白血病的治療一般取決於白血病的類 型。白血病的標準治療方法通常涉及化療和/或骨髓移植和/或放射治療。見例如，美國 專利號6645972的公開，該專利在此通過引證全部併入本文。白血病的化學療法可以包括兩個或兩個以上的抗癌藥物的結合使用。目前大約40 種不同的藥物用於治療白血病，這些藥物可以單獨使用，也可以結合使用。其他治療白血病的方法還包括多藥耐藥性的轉換，該方法包括使用一種試劑，這種試劑能夠降低惡性細胞 所受到的化療藥物的破壞性影響(並導致難治或復發)的機制；和生物治療法，包括使用 單克隆抗體，在單克隆抗體中，毒素附著在一種抗體上，這種抗體與惡性細胞所攜帶的互補 抗原發生反應；和細胞因子(例如，幹擾素、白細胞介素、細胞集落刺激因子(CSFs))，細胞 因子是一種自然產生的化學物質，能夠刺激血細胞的生成並幫助治療後快速恢復血細胞計 數。這些藥物的例子包括多藥耐藥性轉向劑PSC833、單克隆抗體美羅華(Rituxan)和以下 細胞因子促紅細胞生長素(Erythropoetin)和紅細胞生成素，這些細胞因子能夠刺激生 產紅細胞；G-CSF、GM-CSF、非格司亭(filgrastim)和重組人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因 子(Sargramostim)，和重組人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子能夠刺激生產白色細胞；和 刺激生產的血小板的血小板生成素。已經發現許多核苷類似物都具有抗癌活性。核苷類似物的例子包括阿拉伯胞嘧啶 糖苷、氟達拉濱(Fludarabine)、吉西他濱(Gemcitabine)和克拉曲濱(Cladribine)，這些 核苷類似物是目前在治療白血病白血病過程中使用的重要藥物。β -L-OddC ((-) - β -L- 二 氧戊環-胞嘧啶核苷、曲沙他濱(Troxatyl )(購自Shire生物化學股份有限公司)也 是一種核苷類似物，這種核苷類似物首先是有Belleau等人作為一種抗病毒劑而公開的 (歐洲專利第337713號，該專利通過引證在此全部併入本文)並且能夠表現出具有有效 的抗癌活性(參見文獻K. L. Grove etal.，Cancer Res.(癌症研究)，55 (14)，3008-11， 1995 ；K. L. Grove et al.，Cancer Res.(癌症研究)，56 (18)，4187-4191，1996，K. L. Grove et al. ,Nucleosides Nucleotides (核苷核苷酸)，16 :1229_33，1997 ；S. A Kadhim et al.， Can. Cancer Res.，57 (21)，4803-10，1997)。在臨床研究中，已經有報導證明 β-L-OddC 對 白血病病人具有顯著的活性(參見 Giles et al. ,J. Clin. Oncology, Vol 19，No 3，2001)。Bcr-AbI酪氨酸激酶抑制劑，例如sti-571 (格列衛(Gleevec )，伊馬替尼甲 磺酸鹽，購自諾華(NovartiS)製藥有限公司)，已經顯示出重要的抗白血病活性且尤其適 用於慢性粒細胞白血病。例如STI-571已經成為靶向Bcr-Abl酪氨酸激酶抑制作用的病人 的一種很有前途的治療方法。然而，雖然具有重要的血液學和細胞發生反應，但仍然會產生 對Bcr-Abl酪氨酸激酶抑制劑的抵抗性，尤其在慢性粒性白血病發展階段。對於Bcr-Abl 酪氨酸激酶抑制劑伊馬替尼(Imatinib)、達沙替尼(Dasatinib)、AZD0530。因此，對用於治療之前已經用Bcr-Abl酪氨酸抑制劑治療過並對Bcr-Abl酪氨酸 激酶抑制劑產生抗藥性的白血病病人的藥物的發展還存在很大的需要。因此，在本發明的 另一個實施方案中，本發明提供了一種用於治療宿主白血病的方法，該方法包括對之前已 經用Bcr-Abl酪氨酸抑制劑治療過並對Bcr-Abl酪氨酸激酶抑制劑產生抗藥性的白血病病 人給藥一種治療有效量的本發明所述化合物(I)。進一步地，本發明提供了一種用於聯合給 藥治療宿主體內白血病的方法，該方法包括對病人聯合給藥Bcr-Abl酪氨酸激酶抑制劑和 治療有效量的本發明所述化合物(I)。在一種優選的實施方案中，所述聯合給藥是向已經用 Bcr-Abl酪氨酸抑制劑治療過並對Bcr-Abl酪氨酸激酶抑制劑治療方法產生抗藥性的白血 病病人給藥。如下表所示與現有的治療劑相比，本發明化合物(I)顯示抗白血病活性。 本發明所述化合物(I)及其藥學上可接受的鹽可以用來治療其他與細胞增殖有 關的疾病，例如，銀屑病(psoriases)。如這裡所述，本發明化合物(I)及其藥學上可接受的鹽可能用來治療、預防或者 緩解宿主所患有的聽力喪失。本發明的另一個方面包括本發明化合物(I)及其藥學上可接 受的鹽在製備用於治療、預防或者緩解宿主所患有的聽力喪失的藥物中的應用。為了預防 或者防止患上聽力喪失，所述化合物可以在噪聲接觸之前給藥或者在接觸到導致聽力喪失 的藥物之前給藥。這樣的藥物包括化學治療藥物(例如，靶向毛細胞的以鉬為基礎的藥物) 和氨基糖苷類抗生素。本發明化合物(I)及其藥學上可接受的鹽可以與某些抗癌藥物一起 提供一種協同效應(增效效應)。例如，可以通過主要人類腫瘤組織試驗可以篩選到促進抑 製劑，尤其可以尋找到與其他已知的抗癌藥物具有的協同作用。另外，所述蛋白激酶抑制劑 還可以減少某些抗癌藥物的毒性(例如，對耳蝸和腎臟有毒的以鉬為基礎的藥物)，從而允 許劑量增加。做為選擇，本發明的化合物(I)及其藥學上可接受的鹽可能用來治療宿主的聽力 喪失。在這個實施方案中，在開始出現聽力喪失之後給藥本發明化合物，從而減少聽力喪失水平。本發明的化合物(I)及其藥學上可接受的鹽還可能涉及激酶級聯的調控，例如一 種激酶抑制劑、一種非腺苷三磷酸競爭性抑制劑、一種酪氨酸激酶抑制劑、一種Src抑制劑 或者一種黏著斑激酶(FAK)調節劑。雖然不希望局限於任何理論，但是普遍相信，給藥激酶 抑制劑能夠預防耳蝸毛細胞的細胞凋亡，從而預防聽力喪失。在一個實施方案中，對患有聽 力喪失的宿主給藥本發明化合物(I)及其藥學上可接受的鹽從而預防進一步的聽力喪失。 在另一個實施方案中，對患有聽力喪失的宿主給藥本發明化合物(I)及其藥學上可接受的 鹽，從而恢復損失的聽力。尤其是，在噪聲接觸之後，耳蝸毛細胞之間緊密的細胞結合點以 及細胞_細胞外基質的相互作用被破壞並處於緊張狀態。這些緊密的細胞接合點的緊張狀 態通過一種複雜的信號導致細胞中的細胞凋亡，在所述複雜的信號途徑中，酪氨酸激酶作 為分子開關，對黏著斑激酶有影響，從而將細胞基質分裂信號傳遞到細胞核。普遍相信，給 藥激酶抑制劑能夠預防在這些級聯中發生的細胞凋亡。對於暴露於噪聲中的耳蝸中發生的細胞凋亡的識別，為噪聲誘發的聽力喪失 (NIHL)的預防提供了許多種新的可能(參見Hu等人於2000年在Acta. Otolaryngol. 120， 19-24中發表的文獻)。例如，在耳朵的圓窗處給藥抗氧化藥物，能夠保護耳朵免受噪聲誘 發的聽力喪失(NIHL)(參見Hight等人於2003年在Hear. Res.《耳朵研究》179，21-32中發 表的文獻；Hu等人在Hear. Res.《耳朵研究》113，198-206中發表的文獻)。具體的，在南美 慄鼠體內給藥FDA(食品及藥品管理局)認可的抗氧化化合物(N-L-乙醯半胱氨酸(L-NAC) 以及水楊酸鹽)能夠減輕噪聲誘發的聽力喪失(參見Kopke等人於2000年在Hear. Res. 《耳朵研究》149，138-146中發表的文獻)。此外，Harris等人近期描述了利用Src-蛋白 酪氨酸激酶抑制劑預防噪聲誘發的聽力喪失(NIHL)(參見Harris等人於2005年在Hear. Res.《耳朵研究》208，14-25中發表的文獻)。因此，可以設想，給藥本發明所述的調控激酶 活性的化合物能夠有效的治療聽力喪失。細胞粘著或者細胞壓力的改變能夠通過整聯蛋白的激活以及蛋白酪氨酸激酶的 磷酸化作用激活各種信號，其中所述的蛋白酪氨酸激酶包括Src家族酪氨酸激酶。Src的 相互作用與修飾細胞骨架的信號途徑發生關聯，並且激活了各種蛋白激酶級聯，這些蛋白 激酶級聯控制細胞的存活以及基因的轉錄(參見Giancotti與Ruoslahti於1999年在 Science《科學》285，1028-1032中發表的文獻)。事實上，近來的研究結果已經表明，耳蝸 外毛細胞(OHC)在被暴露於強烈的噪聲中之後在所述的細胞底部發生分離，經受凋亡細胞 的死亡。具體的，已經認為在代謝作用誘發的以及機械作用誘發的耳蝸感官細胞的細胞凋 亡的發生中均涉及到所述的Src蛋白酪氨酸激酶信號級聯。在一項最近的研究中，Src抑 製劑為免受4小時、106dB的4kHz的倍頻帶噪聲的影響提供了防護，這表明在被暴露於噪聲 中之後，耳蝸外毛細胞中的Src蛋白酪氨酸激酶可能被激活了(參見Harris等人於2005 年在Hear. Res.《耳朵研究》208，14-25中發表的文獻)。因此，本發明所述的能夠調控Src 活性的化合物能夠有效的用於治療聽力喪失。本發明涉及治療、預防或者緩解宿主所患有的骨質疏鬆症的方法。本發明的另一 個方面包括本發明化合物(I)及其藥學上可接受的鹽在製備用於治療、預防或者緩解宿主 所患有的骨質疏鬆症的藥物中的應用。所述方法包括向宿主給藥有效量的本發明化合物 (I)及其藥學上可接受的鹽，從而治療、預防或者緩解宿主所患有的骨質疏鬆症。為了治療、 預防或者緩解宿主所患有的骨質疏鬆症，本發明化合物(I)及其藥學上可接受的鹽在發展
20為骨質疏鬆症之前給藥。做為選擇，所述化合物(I)及其藥學上可接受的鹽可能用來治療 宿主的骨質疏鬆症。在這個實施方案中，本發明化合物(I)及其藥學上可接受的鹽在骨質 疏鬆症開始之後被給藥給宿主，從而減少骨質疏鬆程度。已經證明，Src的缺陷與大鼠的骨質疏鬆症相關，這是由於破骨細胞的功能缺失導 致的(參見Soriano等人於1991年在Cell《細胞》64，693-702中發表的文獻)。已知缺乏 白細胞介素-1受體相關性激酶M(IRAK-M)的大鼠發展成為嚴重的骨質疏鬆症，這與破骨細 胞的加速分化、破骨細胞的半衰期的增大、以及它們的活化相關(參見Hongmei等人於2005 年在J. Exp. Med.《藥學專家雜誌》201，1169-1177中發表的文獻)。多核破骨細胞來自於單核噬菌細胞的融合，並且在骨的形成以及重塑中起到重要 的作用，這種作用是通過骨的再吸收來實現的。破骨細胞是多核的、末端分化的細胞，能夠 降解礦化的基質。在正常的骨組織中，在由成骨細胞引起的骨的形成與由破骨細胞引發的 骨的再吸收之間存在一種平衡。當這種動態的並且高度規則的過程中的平衡被破壞時，骨 的再吸收會超過骨的形成，從而導致定量的骨損失。由於破骨細胞對於骨的形成以及重塑 是必不可少的，增加其數量和/或活性會導致與全身的骨損失相關的疾病的產生(例如，骨 質疏鬆症)，也會導致其他與局部的骨損失相關的疾病的產生(例如，風溼性關節炎，牙周 疾病)。破骨細胞以及成骨細胞均支配涉及蛋白激酶的多數的細胞信號途徑。破骨細胞 活化是由於骨質粘附作用、細胞骨架重排、連接區域的形成、以及極性波緣膜的形成所引發 的。可以確信，蛋白酪氨酸激酶2(PYK2)參與了信號從所述的細胞表面至所述的細胞骨架 的傳遞，因為在破骨細胞中由粘著所引發的信號使其發生了酪氨酸的磷酸化以及活化(參 見Duong等人於1998年在J. Clin. Invest《臨床研究雜誌》.102,881-892中發表的文獻)。 近來的證據已經表明，蛋白酪氨酸激酶2(PYK2)蛋白水平的降低導致了對於體外破骨細胞 的形成以及骨的再吸收的抑制(參見Duong等人於2001年在J. Biol. Chem.《生物化學雜 志》276，7484-7492中發表的文獻)。因此，對於蛋白酪氨酸激酶2 (PYK2)或者其他蛋白 酪氨酸激酶的抑制可能通過減少破骨細胞的形成以及骨的再吸收，從而降低骨質疏鬆的程 度。因此，儘管不希望受到理論的限制，但可以設想，給藥本發明所述的化合物將能夠調控 激酶(例如，蛋白酪氨酸激酶)的活性並且因此導致對於破骨細胞的形成和/或骨的再吸 收的抑制，從而治療骨質疏鬆症。Src酪氨酸激酶作為用於骨疾病的有希望的治療靶向，其作用已經被Src剔除小 鼠的研究以及體外細胞試驗所證實，這表明Src在破骨細胞(陽性)以及造骨細胞(陰性) 中起到有規則的作用。在破骨細胞中，Src在運動性、極性、存活性、活化(皺褶緣的形成)以 及粘著中起到關鍵的作用，這種作用是通過介導各種信號轉導途徑，特別是細胞因子以及 整聯蛋白信號來實現的(參見Parang與Sun於2005年在Expert Opin. Ther. Patents《治 療學專利的專家觀點》15，1183-1207中發表的文獻)。此外，大鼠的Src基因的靶向破壞誘 發了骨質疏鬆症，並且在其他的組織或者細胞中不表現出任何明顯的形態學異常或者功能 異常，其中所述的骨質疏鬆症是一種以骨的再吸收的減少為特徵的障礙(參見Soriano等 人於1991年在Cell《細胞》64，693-702中發表的文獻)。所述的骨質疏鬆性顯型src-/-大 鼠是細胞自治的，並且其成因是成熟破骨細胞的缺失，其通常表達高水平的Src蛋白(參見 Home等人於1991年在Cell《細胞》119，1003-1013中發表的文獻)。通過限制Src酪氨酸激酶的有效性，Src抑制劑被認為能夠減輕骨的分解並且促進骨的形成，其中所述的Src 酪氨酸激酶能夠激發破骨細胞的活性並且抑制造骨細胞。由於破骨細胞通常表達高水平的 Src，對於Src激酶活性的抑制對於骨質疏鬆症的治療而言可能是有效的(參見Missbach 等人於1999年在Bone《骨》24，437-449中發表的文獻)。如這裡所述，本發明化合物(I)及其藥學上可接受的鹽可能用來治療、預防或者 緩解宿主所患有的肥胖症。本發明的另一個方面包括本發明化合物(I)及其藥學上可接受 的鹽在製備用於預治療、預防或者緩解宿主所患有的肥胖症的藥物中的應用。為了預防肥 胖症，所述化合物可以在宿主發展成肥胖症開始之前給藥。做為選擇，所述化合物(I)及其 藥學上可接受的鹽可以用來治療宿主體內的肥胖症。肥胖症與糖尿病以及在胰島素應答組織中出現的胰島素抗性的增強有關聯，其中 所述的胰島素應答組織是例如骨骼肌，肝臟，以及白色脂肪組織(參見Klaman等人於2000 年在Mol. Cell. Biol.《分子細胞生物學》20，5479-5489中發表的文獻)。胰島素在葡萄糖 穩態、脂質代謝、以及能量平衡的調節中起到至關重要的作用。胰島素信號是由於胰島素與 所述的胰島素受體(IR)發生結合而引發的，所述的胰島素受體是一種受體酪氨酸激酶。胰 島素的結合喚起了磷酸化事件的級聯，其開始於所述的胰島素受體(IR)在多發性酪氨醯 殘基上的自動磷酸化作用。自動磷酸化作用增強了胰島素受體(IR)的激酶活性並且激發 了下遊的信號事件。蛋白酪氨酸激酶的刺激效應以及蛋白酪氨酸磷酸酶的抑制效應很大程 度上定義了所述胰島素的作用。適當的胰島素信號將血糖濃度的大幅度波動降低到最小， 並且確保將足夠的葡萄糖運送至細胞。由於胰島素的刺激導致了多發性酪氨醯磷酸化事件 的發生，因而增強一種或者多種蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)的活性能夠導致胰島素抗性的產 生，其可以導致肥胖症。事實上，已經報導在包括肥胖症在內的幾種胰島素抗性狀態中存在 增強的蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)活性(參見Ahmad等人於1997年在Metabolism《代謝學》 46，1140-1145中發表的文獻)。因此，儘管不希望收到理論的限制，但給藥本發明所述的化 合物能夠調控激酶(例如，蛋白酪氨酸磷酸酶)的活性，從而治療宿主的肥胖症。胰島素信號開始於經由酪氨酸的磷酸化作用而發生的胰島素受體(IR)的活化， 並且在由葡萄糖轉運蛋白GLUT4將葡萄糖吸收至細胞中時達到頂點(參見Saltiel與Kahn 於2001年在Nature《自然》414，799-806中發表的文獻)。隨後必須對上述活化的胰島素受 體進行滅活，並且返回到基態，可以確信這一過程中涉及到蛋白酪氨酸磷酸酶-IB(PTP-IB) (參見Ahmad等人於1997年在J. Biol. Chem.《生物化學雜誌》270，20503-20508中發表的 文獻)。對大鼠體內編碼蛋白酪氨酸磷酸酶-IB(PTP-IB)的基因進行破壞，會導致胰島素敏 感並且增加對由膳食誘發的肥胖症的抗性(參見Elchebly等人於1999年在Science《科 學》283，1544-1548中發表的文獻；Klaman等人於2000年在Mol. Cell. Biol.《分子細胞生 物學》20，5479-5489中發表的文獻)。蛋白酪氨酸磷酸酶-IB缺陷型大鼠的肥胖程度的減 輕的原因是脂肪細胞群的顯著減少，而不是脂肪細胞數量的減少(參見Klaman等人於2000 年在Mol. Cell. Biol.《分子細胞生物學》20，5479-5489中發表的文獻)。此外，蛋白酪氨 酸磷酸酶-IB缺陷型大鼠的消瘦伴隨著基礎代謝率以及總能量消耗的增加，而解耦聯蛋白 mRNA的表達沒有發生顯著的改變。對於蛋白酪氨酸磷酸酶-IB基因的破壞證明，改變蛋白 酪氨酸磷酸酶-IB的活性能夠調控體內的胰島素信號以及由膳食誘發的肥胖症。因此，盡 管不希望受到理論的限制，但給藥本發明所述的能夠調控胰島素信號(例如，蛋白酪氨酸
22磷酸酶-IB活性)的化合物，能夠有效的治療宿主的肥胖症。如這裡所述，本發明化合物(I)及其藥學上可接受的鹽可能用來治療、預防或者 緩解宿主所患有的糖尿病。本發明的另一個方面包括本發明化合物(I)及其藥學上可接受 的鹽在製備用於預治療、預防或者緩解宿主所患有的糖尿病的藥物中的應用。為了預防糖 尿病，所述化合物(I)及其藥學上可接受的鹽可以在宿主發展成糖尿病開始之前給藥。做 為選擇，所述化合物(I)及其藥學上可接受的鹽可以用來治療宿主體內的糖尿病。II型糖尿病(T2DM)是一種錯配(dysregulated)能量代謝障礙。能量代謝很大 程度上受到激素胰島素的控制，激素胰島素是一種有效的合成代謝製劑，其促進蛋白質、 碳水化合物以及脂質的合成以及存儲，並且抑制它們的分解以及釋放回所述的循環當中。 胰島素的作用是在其與酪氨酸激酶受體發生結合時被激發的，其導致了自動磷酸化作用 並且增強了所述激酶的催化活性(參見Patti等人於1998年在J. Basic Clin. Physiol. Pharmacol.《基礎臨床生理學與藥理學雜誌》9，89-109中發表的文獻)。酪氨酸的磷酸化 作用導致胰島素受體底物(IRS)蛋白與磷脂醯肌醇3-激酶(PI3K)的p85調節亞基發生 相互作用，從而導致所述酶的活化並且使其命中一個特異的亞細胞位置，這取決於所述細 胞的類型。所述的酶生成所述的脂質產物3，4，5-三磷酸磷脂醯肌醇(PtdIns (3，4，5) P3)， 其調節許多蛋白質的定位以及活性(參見Kido等人於2001年在J.Clin. Endocrinol. Metab.86，972-979中發表的文獻)。磷脂醯肌醇3-激酶(PI3K)在胰島素刺激的葡萄糖 吸收以及存儲、脂解作用的抑制以及肝臟基因表達的調節方面起到至關重要的作用(參見 Saltiel等人於2001年在Nature《自然》414，799-806中發表的文獻)。顯性幹擾型磷脂 醯肌醇3-激酶的過表達能夠阻止葡萄糖的吸收以及穀氨酸轉運蛋白4GLUT4向質膜的轉移 (參見Quon等人於1995年Mol. Cell. Biol.《分子細胞生物學》15，5403-5411中發表的文 獻)。因此，給藥本發明所述的能夠調控激酶(例如，磷脂醯肌醇3-激酶)活性、並且因此 導致葡萄糖吸收的增加的化合物，能夠有效的治療糖尿病。第10號染色體缺失的磷酸酶與張力蛋白同源物(PTEN)是許多細胞類型中的磷 脂醯肌醇3-激酶信號的主要調節劑，並且由於其對於磷脂醯肌醇3-激酶途徑的抗細胞凋 亡、增殖性以及肥大性活性具有對抗性，因而具有腫瘤抑制劑的功能(參見Goberdhan等人 於2003年在Hum. Mol. Genet.《人類分子遺傳學》12，R239-R248中發表的文獻)。儘管不 希望受到理論的限制，但可以確信第10號染色體缺失的磷酸酶與張力蛋白同源物(PTEN) 通過所述3，4，5-三磷酸磷脂醯肌醇(PtdIns (3，4，5)P3)分子的去磷酸化作用削弱了所述 的磷脂醯肌醇3-激酶途徑，將這種重要的脂質第二信使降解為二磷酸_4，5-磷脂醯肌醇 (PtdIns (4，5)P2)。在最近的一項研究中，利用小幹擾RNA(siRNA)減少50%的內源性第10 號染色體缺失的磷酸酶與張力蛋白同源物(PTEN)蛋白，能夠增強3，4，5_三磷酸磷脂醯肌 醇水平的胰島素依賴性增加，並且增強葡萄糖的吸收(參見Tang等人於2005年在J. Biol. Chem.《生物化學雜誌》280，22523-22529中發表的文獻)。因此，儘管不希望受到理論的限 制，但可以設想，給藥本發明所述的能夠調控第10號染色體缺失的磷酸酶與張力蛋白同源 物(PTEN)的活性、並且因此導致葡萄糖吸收的增加的化合物(I)及其藥學上可接受的鹽， 能夠有效的治療糖尿病。3，4，5-三磷酸磷脂醯肌醇(PtdIns (3，4，5) P3)水平同樣受到含SRC同源(SH2)結 構域的II型肌醇5』磷酸酶(SHIP)蛋白家族一SHIP1以及SHIP2的控制(參見Lazar與
23Saltiel於2006年在Nature Reviews 5，333-342中發表的文獻)。含SH2結構域的II型 肌醇5』磷酸酶(SHIP 2)在骨骼肌中進行表達，在其他胰島素敏感性組織中催化3，4，5-三 磷酸磷脂醯肌醇(PtdIns (3，4，5) P3)轉化成二磷酸_4，5-磷脂醯肌醇(PtdIns (4, 5) P2) (參見Pesesse等人於1997年在Biochem Biophys. Res. Commun.《生物化學與生物物理學 研究通訊》239，697-700中發表的文獻；Backers等人於2003年在Adv. Enzyme Regul.《酶 調節進展》43，15-28中發表的文獻；Chi等人於2004年在J. Biol. Chem.《生物化學雜誌》 279,44987-44995中發表的文獻；Sleeman等人於2005年在Nature Med.《自然藥學》11， 199-205中發表的文獻)。含SH2結構域的II型肌醇5』磷酸酶(SHIP 2)的過表達顯著的 降低了胰島素刺激性3，4，5_三磷酸磷脂醯肌醇(PtdIns (3，4，5)P3)水平，這與被提議的含 SH2結構域的II型肌醇5』磷酸酶對於磷脂醯肌醇3-激酶下遊效應物質的活化的削弱能力 相一致(參見Ishihara等人於1999年在Biochem. Biophys. Res. Commun.《生物化學與生 物物理學研究通訊》260，265-272中發表的文獻)。如這裡所述，本發明化合物(I)及其藥學上可接受的鹽可能用來治療、預防或者 緩解宿主所患有的眼部疾病。本發明的另一個方面包括本發明化合物(I)及其藥學上可接 受的鹽在製備用於預治療、預防或者緩解宿主所患有的眼部疾病的藥物中的應用。為了預 防眼部疾病，所述化合物(I)及其藥學上可接受的鹽可以在宿主發展成眼部疾病開始之前 給藥。做為選擇，所述化合物(I)及其藥學上可接受的鹽可以用來治療宿主體內的眼部疾 病，例如，視網膜黃斑病變，視網膜病，以及黃斑水腫。生理學上無血管的角膜可能發生威脅視力的新血管形成反應。所述的增生性視網 膜病變，主要是糖尿病性視網膜病變以及與年齡相關的視網膜黃斑變性的特徵是血管的滲 透性增強，從而導致視網膜水腫和視網膜下液聚集，以及易於出血的新血管的增殖。血管的 生成，從先前存在的毛細血管中形成新的血管的過程，是正常的生長過程以及諸多的病理 過程中很重要的一部分。血管內皮生長因子(VEGF)，作為血管生成作用的複雜級聯中的一 種重要介導體以及一種有效的滲透因素，對於新的治療劑而言是一個有吸引力的靶向。血 管內皮生長因子是兩種膜結合酪氨酸激酶受體的配位體，所述的兩種膜結合酪氨酸激酶受 體是血管內皮生長因子受體-I(VEGFR-I)以及血管內皮生長因子受體-2(VEGFR-2)。配位 體的結合觸發了血管內皮生長因子受體的二聚作用以及轉磷酸化作用，並且隨後伴隨著胞 內酪氨酸激酶結構域的活化。繼而發生的胞內信號軸導致了血管內皮細胞的增殖、遷移、以 及存活。因此，儘管不希望受到理論的限制，但可以設想，給藥本發明中所述的化合物能夠 有效的治療眼部疾病，例如，視網膜黃斑病變，視網膜病變和/或黃斑水腫，其中，所述的化 合物能夠調控激酶活性，例如，酪氨酸激酶的活性，並且引起對於血管生成和/或新血管形 成的抑制。視網膜黃斑病變的特徵是血管內皮生長因子介導的視網膜滲漏(血管滲透性的 增強)以及眼底小血管的異常生長(血管生成)。已經在糖尿病性視網膜病變以及與年 齡相關的視網膜黃斑變性中的新血管膜中識別出了血管內皮生長因子，並且在糖尿病性視 網膜病變中，新血管形成的嚴重程度與上述因子的眼內水平存在關聯(參見Kvanta等人 於1996年在Invest. Ophthal. Vis. Sci.《調查性眼科學與視覺科學》37，1929-1934中發 表的文獻；Aiello等人於1994年在N. Engl. J. Med.《新英格蘭醫學雜誌》331，1480-1487 中發表的文獻)。血管內皮生長因子在這些模型中的治療對抗性導致視網膜新血管形成以及脈絡膜新血管形成被顯著的抑制，同時也導致了血管滲透性的降低(參見Aiello等人 於1995年在Proc. Natl. Acad. Sci.《美國科學院院刊》，美國，92，10457-10461中發表的 文獻；Krzystolik等人於2002年在Arch. Ophthal.《眼科學檔案》120，338-346中發表的 文獻；Qaum等人於2001年在Invest. Ophthal. Vis. Sci.《調查性眼科學與視覺科學》42， 2408-2413中發表的文獻)。因此，儘管不希望受到理論的限制，但可以設想，給藥本發明中 所述的化合物(I)及其藥學上可接受的鹽能夠有效的治療眼部疾病，例如，視網膜黃斑病 變，視網膜病變和/或黃斑水腫，其中，所述的化合物化合物(I)及其藥學上可接受的鹽能 夠調控血管內皮生長因子的活性，並且引起對於血管生成和/或新血管形成的抑制。如這裡所述，本發明化合物(I)及其藥學上可接受的鹽可能用來治療、預防或者 緩解宿主所患有的中風，所述宿主具有很高的患上中風的風險、正在患有中風或者已經發 生過中風。本發明化合物(I)及其藥學上可接受的鹽能夠被用在治療處於中風後恢復期的 宿主的方法中。本發明的另一個方面包括化合物(I)及其藥學上可接受的鹽在製備用於治 療、預防或者緩解宿主所患有的中風的藥物中的應用。中風，也被稱為腦血管意外(CVA)，是一種急性的神經損傷，是由於動脈的封閉或 者血管的破裂而導致的大腦部分區域的血液供應阻斷。所述的血液供應被阻斷的大腦部分 區域不再接收到由所述血液帶來的氧和/或營養。所述的腦細胞被損壞或者壞死，從而削 弱了那部分大腦區域具有的功能以及來自於那部分大腦區域的功能。如果氧氣被剝奪超過 60至90秒，腦組織將終止其功能，並且在幾分鐘之後將遭受不可逆的損傷，可能導致所述 組織的死亡，即，梗死。中風分為兩種主要的類別缺血性中風和出血性中風，其中，缺血性中風是指堵塞 供給腦部的血管，出血性中風是指血液洩漏進入腦中或者分布在大腦周圍。大多數中風是 缺血性中風。缺血性中風通常分成血栓形成的中風、腦栓塞、全身性灌注不足(腦分水嶺梗 死)、或者靜脈血栓形成。在血栓形成的中風中，在受到影響的動脈中形成血栓，形成的血 栓，即血塊會逐漸的使動脈管腔變窄，從而阻止血液流到末梢組織中。這些血塊通常圍繞動 脈粥樣硬化斑塊形成。根據形成血栓的血管種類不同，血栓形成的中風可以被分為兩種。大 血管的血栓形成性中風包括公有的和內部頸動脈、椎動脈和Willis循環動脈血管中風。小 血管形成的中風包括腦內動脈中風、Willis循環分支血管中風、大腦中動脈血管中風和從 脊椎末梢上升的動脈中風和基底動脈中風。血栓，即使是非閉塞性的血栓，也能夠導致栓塞性中風，只要所述的血栓在其成為 栓塞處發生中斷。栓塞指的是在發源於別處的動脈血流中存在的移動的粒子或者碎片。栓 塞性中風指的是由栓塞引起的到達大腦部分區域的動脈通路的封閉。栓塞通常都是血液凝 塊兒，但其也可以是一個從動脈粥樣硬化的血管中脫落的斑塊，或者是許多其他的物質，包 括脂肪，空氣，並且甚至是癌細胞。由於栓塞是來自於別處的，因而局部治療僅僅能解決臨 時性的問題。因此，必須識別出所述栓塞的來源。有四種類型的栓塞性中風具有已知的心 髒來源的血栓；具有可能的心臟來源或者大動脈來源的(來自於經胸廓超聲心動圖或者經 食管超聲心動圖)血栓；具有動脈來源的血栓；以及具有未知來源的血栓。系統性低灌注是指流向身體的所有部分的血液減少。其最常見的原因是由於心搏 停止或者心律不齊、或者心臟輸出量的減少而導致的心臟泵的衰竭，而這些都是由心肌梗 塞、肺部栓塞、心包積液、或者流血造成的。血氧不足(即，低血氧含量)可能促進了所述的血液流動的減少是全局性的，腦部的所有部分都可能受到影響，特別是所 述的「分水嶺」區域，這一區域是由主要的腦動脈供給的邊緣帶區域。血液流動至這些區域 不必然停止，但取而代之的是，可能在腦部損傷發生處血液流動降低。腦部靜脈的功能是將所述的血液排放回身體。當靜脈由於形成血栓的原因而發生 閉塞，所述的血液排放被阻滯並且所述的血液倒流，引發腦水腫。這種腦水腫能夠導致缺血 性中風以及出血性中風。這通常發生在罕見疾病竇靜脈血栓形成中。利用本領域已知的各種技術中的一種或者多種在宿主或者宿主體內診斷中風，所 述的技術是例如，神經系統檢查，血液檢測，CT掃描(不利用對比度增強手段)，MRI (磁共 振成像)掃描，都卜勒超聲，以及動脈造影術(即，在所述血流中注射進不透射線的物質之 後，動脈的X光片)。如果通過造影證實了中風，則進行各種其他的研究，以確定是否存在外 圍來源的栓塞。這些研究包括，例如，針對所述頸動脈的超聲/都卜勒研究(用來檢測頸動 脈狹窄)；心電圖(ECG)以及超聲波心動圖(用來識別心律不齊以及作為結果產生的心臟 凝塊兒，所述的心臟凝塊兒能夠通過血流蔓延至腦血管中)；霍爾特氏心電圖研究，用來識 別間歇性心律不齊，以及大腦血管系統的血管造影片(如果認為出血是來源於動脈瘤或者 動靜脈畸形)。本發明化合物(I)及其藥學上可接受的鹽可以有效的用於治療、預防或者緩解中 風或者與中風有關的症狀的方法中，所述化合物(I)及其藥學上可接受的鹽可以在中風發 生之前、期間或者之後調控激酶信號級聯。在一個實施方案中，這裡描述的可以有效用於 治療、預防或者緩解中風或者與中風有關的症狀的方法中的本發明化合物(I)及其藥學上 可接受的鹽是一種激酶信號級聯的變構抑制劑，可以在中風發生之前、期間或者之後起作 用。在一個方面，例如，所述化合物是一種酪氨酸激酶抑制劑。在一種實施方案中，這裡描 述的可以有效用於治療、預防或者緩解中風或者與中風有關的症狀的方法中的本發明化合 物(I)及其藥學上可接受的鹽是一種激酶信號級聯的非腺苷三磷酸競爭性抑制劑，可以在 中風發生之前、期間或者之後起作用。已經表明，在中風的過程中對於Src活性的抑制能夠提供對於大腦的保護(參見 Paul等人(於2001年)在Nature Medicine《自然醫學》vol.(卷)7 (2) :222_227中發表 的文獻，上述文獻的全部內容通過引用全部併入本文)。血管內皮生長因子(VEGF)，它的產 生是為了對缺血性損傷進行應答，已經證明它能夠提高血管的滲透性。研究表明，在發生中 風之後，所述的Src激酶能夠調節大腦中由血管內皮生長因子介導的血管滲透性(VP)，而 在中風之前以及之後給藥Src抑制劑減輕了水腫，增加了腦部的灌注並且在損傷發生之後 減小了梗塞的體積(參見Paul等人於2001年發表的文獻)。因此，Src抑制劑能夠有效的 用於預防、治療或者改善中風發生之後的次級損傷。本發明化合物(I)及其藥學上可接受的鹽能夠預防、治療或者緩解中風或者與中 風有關的症狀。本發明的另一個方面包括本發明化合物(I)及其藥學上可接受的鹽在製備 用於預防、治療或者緩解中風或者與中風有關的症狀的藥物中的應用。中風的症狀包括突 然麻木或者虛弱，特別是身體單側的突然麻木或者虛弱；突然意識模糊或者發音困難或者 無法理解談話內容；雙眼或者單眼突然無法視物；或者突然的沒有原因的劇烈頭痛。對於中風的治療通常分為三個階段預防，中風發生之後立即採取的治療，以及 中風後的恢復。預防首發或者復發中風的治療是以治療中風的潛在危險因素為基礎的，所
26述的潛在危險因素是例如，高血壓，高膽固醇，心房顫動，以及糖尿病。急性中風的治療是 嘗試在中風發生的時候對其進行終止，通過快速溶解引起缺血性中風的血液凝塊兒或者通 過阻止出血性中風的流血的方式。中風後的恢復是幫助個體克服由中風的損傷所導致的 傷殘。藥物治療是最常見的治療中風的方法。用於預防或者治療中風的最常見的藥物類 型是抗血栓形成劑(例如，抗斑塊劑以及抗凝血劑)以及血栓溶解劑。向宿主給藥所述的 化合物，其中所述的宿主具有患中風的危險、正患有中風或者曾經患有中風，給藥的時間是 在中風的發生之前、發生的過程中、發生之後、以及上述時機的任意組合。本發明中所述 的化合物可以單獨給藥，以藥物組合物的形式給藥，或者與各種已知的治療中的任意一種 進行組合治療，所述的已知的治療是，例如，抗斑塊藥物(例如，阿司匹林，克拉匹多，雙嘧 達莫)，抗凝血劑(例如，華法林)，或者溶解血栓類藥物(例如，組織型纖溶酶原激活因 子(t-PA)，瑞替普酶(reteplase)，尿激酶，鏈激酶，替奈替普酶(tenectaplase)，蘭替普酶 (Ianoteplase),或者阿尼普酶(anistreplase))。本發明化合物(I)及其藥學上可接受的鹽可以用於治療、預防、緩解宿主動脈硬 化症或者其症狀的方法中，所述宿主是指有風險患有或者已經患有動脈硬化症的宿主。本 發明的另一個方面包括本發明化合物(I)及其藥學上可接受的鹽在製備用於治療、預防或 者緩解動脈硬化症的藥物中的應用。動脈硬化症是一種影響動脈血管的疾病，並且其通常被稱為動脈的「硬化」。它是 由所述動脈內的多個斑塊的形成所引發的。動脈粥樣硬化斑塊儘管可以通過動脈的擴張來 補救，但其最終會導致斑塊的破裂以及動脈的狹窄(即，變窄)，上述情況繼而會導致由所 述動脈供血的器官的血液供應補足。或者，如果用於進行補救的動脈擴張處理過度，會導致 動脈瘤的最終結果。這些併發症是慢性的、緩慢發展的並且是累積的。最常見的，柔軟的斑 塊突然破裂，引發血液凝塊兒的形成(即，血栓)，所述的血液凝塊兒迅速的減慢或者終止 血液流動，上述情況繼而會導致由上述動脈供血的組織死亡。這種災變性事件被稱為梗死。 例如，冠狀動脈患有的冠狀動脈血栓症會引發心肌梗塞，通常被認為是心臟病發作。當動脈 粥樣硬化斑塊緩慢的堵塞冠狀動脈的內襯並且隨後突然破裂，完全的封閉所述動脈並且阻 止血液向下遊流動時，就會發生心肌梗塞。使用任何一種臨床試驗和/或實驗室試驗，例如，物理學檢查、放射性試驗或者超 聲試驗和血液分析就可以診斷病人是否患有動脈硬化症和急性心肌梗塞。例如，醫生或者 臨床上可以通過聽取宿主動脈的聲音來檢測異常的流動聲音，也叫做雜音。使用聽診器放 置在收到影響的動脈上可以聽到雜音。做為選擇，或者另外，臨床醫師或者內科醫師也可以 檢查脈衝，例如，檢查腿上或者腳上的脈衝，來確診一些異常情況，例如，虛弱或者失神。內 科醫師或者臨床上可以進行血液研究來檢查膽固醇含量或者檢查心臟酵素水平，從而檢測 異常情況，所述心臟酵素例如肌酸激酶、肌鈣蛋白和乳酸脫氫酶。例如，肌鈣蛋白亞單位I 或者T對心肌具有非常特殊的作用，能夠在造成永久性損傷之前濃度大量上升。在胸痛時 表現肌鈣蛋白陽性的現象可以準確地預告在不久的將來發生心肌梗死的高可能性。其他 診斷動脈硬化症和/或心肌梗死到檢驗法包括，例如，用於測定宿主心跳速率和規律性的 EKG (心電圖)；用於測定腳關節/臂指數的胸部X射線，並將腳關節處的血壓與臂處的血壓 相比較；動脈的超聲分析；重要部分的CT掃描；血管造影術；運動應力試驗，核心臟掃描； 和心臟的核磁共振成像(MRI)和電子發射斷層掃描(PET)掃描。
由Src引起的細胞信號轉導被認為在血管滲透性的增強中起到關鍵性的作用，血 管的滲透性被稱為血管滲透性(VP)。血管內皮生長因子(VEGF)，它的產生是為了對缺血性 損傷進行應答，已經表明它能夠提高血管的滲透性，其中所述的缺血性損傷包括，例如心肌 梗塞。研究表明，對於Src激酶的抑制降低了由血管內皮生長因子介導的血管滲透性(VP) (參見Parang與Sun (於2005年)在Expert Opin. Ther. Patents《治療學專利的專家觀 點》vol.(卷)15(9) :1183-1206中發表的文獻，上述文獻的全部內容通過引用全部併入本 文)。經過Src抑制劑處理過的大鼠表明，與未經處理的大鼠相比，在心肌梗塞之後與血管 的外傷或者損傷相關聯的組織損傷降低了(參見，例如，由Cheresh等人申請的美國專利申 請第20040214836號以及第20030130209號，上述文獻的全部內容通過引證在此全部併入 本文)。因此，Src的抑制能夠有效的用於預防、治療或者改善由於動脈硬化症而產生的損 傷所帶來的次級損傷，例如，心肌梗塞。本發明化合物(I)及其藥學上可接受的鹽能夠用於預防、治療或者緩解動脈硬化 症或者與動脈硬化症有關的症狀。本發明的另一個方面包括本發明化合物(I)及其藥學上 可接受的鹽在製備用於預防、治療或者緩解動脈硬化症或者與動脈硬化症有關的症狀的藥 物中的應用。動脈硬化症通常不顯示任何症狀，除非他已經嚴重的使動脈變窄或者限制血 液流通，或者除非造成了突然的栓塞。動脈粥樣斑和狹窄血管發生的症狀可以出現在任何 位置例如，心、腦、其他的最重要的器官和腿部或者幾乎在身體內的任何地方。動脈硬化症 最初的症狀可能是疼痛或者在運動期間由於身體需要更多的氧氣時引起的痛性痙攣，當缺 少氧氣傳遞到心臟時，人會感覺胸痛(絞痛)，當缺少氧氣傳遞到腿部時，人會感覺腿部痛 性痙攣。動脈供給腦部血液量的減少會導致眩暈或者短暫性缺血性發作(TIA' s)，這時， 中風的症狀會持續少於24小時。一般地，這些症狀會逐漸產生。心肌梗塞的症狀被定義為不同程度的胸部疼痛、不適、發汗、虛弱、噁心、嘔吐、以
及心律不齊，有些時候會導致失去知覺。胸部疼痛是急性心肌梗塞的最常見的症狀，並且通 常被描述為緊縮感、壓迫感、或者壓榨感。疼痛可能蔓延至下頌，頸部，臂部，背部，以及上腹 部，最通常蔓延至左臂或者頸部。當胸部疼痛持續時間超過30分鐘時，其更有可能是由心 肌梗塞引發的。患有心肌梗塞的宿主可能表現出呼吸短促(呼吸困難)，特別是當心肌收縮 性的減弱是由於所述的梗塞足以引發左心室衰竭以及肺部充血或者甚至肺部水腫而產生 的情況。本發明化合物(I)及其藥學上可接受的鹽可以單獨被給藥，也可以處於藥物組合 物中給藥，或者與各種已知的用於動脈硬化症的治療中的任意一種進行聯合治療，所述的 已知的用於動脈硬化症的治療是，例如，降膽固醇類藥物(例如，他汀類)，抗血小板藥物， 或者抗凝血劑。本發明化合物(I)或其藥學上可接受的鹽在治療、預防、緩解神經性疼痛的方法 中的應用，所述神經性疼痛例如慢性神經性疼痛，具有患神經性疼痛的危險、患有神經性疼 痛、或者曾經患有神經性疼痛的宿主所具有的症狀。本發明化合物(I)或其藥學上可接受 的鹽在製備用於治療、預防、緩解神經性疼痛的藥物中的應用。神經性疼痛也叫做神經痛，在疼痛程度上不同於普通受到傷寒之後的疼痛。神經 性疼痛通常表現為一種持續的燒灼痛和/或「如針扎」或者「遭電擊」之類的感覺。受傷寒 的疼痛和神經性疼痛之間的區別是由於「普通」程度不同而產生的。受傷寒的疼痛只不過刺激到疼痛神經，而神經性疼痛通常對同一面積內的疼痛感覺神經和非疼痛感覺神經都有 刺激作用(例如，響應接觸、溫曖、冰冷的神經)，從而生產一種正常狀態下脊髓和大腦不會 收到的信號。神經性疼痛是一種複雜的、慢性的疼痛狀態，並且通常伴隨著組織損傷。發生神經 性疼痛時，所述的神經纖維本身可能被破壞、功能紊亂或者損傷。這些被破壞的神經纖維向 其他疼痛中心發出不正確的信號。所述的神經纖維損傷所帶來的影響包括在所述損傷的位 點處以及所述損傷周圍的區域發生神經功能的變化。使用本領域已知的一種或一種以上實驗室方法和/或臨床方法可以診斷宿主或 者病人所患有的神經性疼痛，所述方法例如，物理學檢查。已經證明，c-Src能夠調節N-甲基_D_天冬氨酸(NMDA)受體的活性(參見Yu等人 (於1999年)在Proc. Natl. Acad. Sci.《美國科學院院刊》，美國，vol.(卷)96 :7697_7704 中發表的文獻，上述文獻的全部內容通過引用全部併入本文)。研究表明，PP2，一種低分子 量的Src激酶抑制劑，降低了所述的N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體匪2亞基的磷酸化 作用(參見Guo等人(於2002年)在J. Neuro.《神經學雜誌》vol.(卷)22 =6208-6217中 發表的文獻，上述文獻的全部內容通過引用全部併入本文)。因此，對於Src的抑制繼而抑 制了所述N-甲基-D-天冬氨酸受體的活性，能夠有效的用於預防、治療或者改善神經性疼 痛，例如慢性神經性疼痛。本發明化合物(I)或其藥學上可接受的鹽能夠用於預防、治療或者改善神經性疼 痛或者由神經性疼痛帶來的症狀，其中所述的神經性疼痛是例如慢性神經性疼痛。神經性 疼痛的症狀包括射傷疼痛和燒灼疼痛，刺痛和失去知覺。本發明化合物(I)或其藥學上可接受的鹽可以單獨被給藥，也可以處於藥物組合 物中給藥，或者與任何一種已知的治療方法結合給藥，例如，止痛藥、鴉片樣物質、三環抗憂 鬱藥、抗驚厥藥和5-羥色胺降腎上腺素再吸收抑制劑。本發明化合物(I)或其藥學上可接受的鹽可以用於治療、預防、緩解宿主乙型肝 炎或者其症狀的方法中，所述宿主是指有患上B型肝炎風險的宿主。本發明的另一個方面 包括本發明化合物(I)或其藥學上可接受的鹽在製備用於治療、預防或者緩解B型肝炎的 藥物中的應用。所述的B型肝炎病毒，是嗜肝DNA病毒家族中的一個成員，由一種蛋白質核心例 子與包埋該蛋白的外層脂質基包膜組成，其中所述的蛋白質核心例子中含有病毒基因組， 所述的病毒基因組以帶有單鏈區域的雙鏈DNA的形式存在。所述的包膜蛋白參與了病毒的 結合以及向易感染細胞中的釋放。所述的內衣層(irmercapsid)重新部署了在病毒mRNA 發生轉錄的細胞核中的DNA基因組。生成了三種編碼所述包膜蛋白的次基因組轉錄體，以 及一種編碼所述的X蛋白的轉錄體。第四個前基因組RNA進行轉錄，其被輸出至細胞溶質 中並且對所述的病毒聚合酶以及核心蛋白進行了翻譯。聚合酶以及前基因組RNA在裝配核 心例子時發生殼體化，所述的聚合酶蛋白使得從前基因組RNA至基因組DNA的逆轉錄發生。 之後，所述的成熟的核心例子經由正常的分泌途徑離開了所述的細胞，在離開的途中獲得 了包膜。B型肝炎是少數幾個已知的將逆轉錄作為複製過程中的一部分的非逆轉錄病毒 中的一個。其他的利用逆轉錄的病毒包括，例如，人T細胞白血病病毒(HTLV)或者人類免疫缺陷病毒(HIV)。在B型肝炎病毒(HBV)的感染過程中，所述的宿主免疫應答負責對肝細胞的損傷 以及病毒的清除產生應答。由於先天性的免疫應答在這些過程中不起到主要的作用，適應 性的免疫應答，特別是病毒特異性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)，促成了與B型肝炎病毒的感 染相關的幾乎全部的肝損傷。通過殺死被感染細胞，以及通過生成能夠從存活的肝細胞中 清除B型肝炎病毒的抗病毒細胞因子，細胞毒性T淋巴細胞也能夠清除所述的病毒。儘管 肝損傷是由所述的細胞毒性T淋巴細胞引發並且介導的，但抗原非特異性炎性細胞能夠惡 化由細胞毒性T淋巴細胞誘導的免疫病理學作用，而血小板能夠促進細胞毒性T淋巴細胞 在肝臟中的積累。可以利用各種臨床檢測和/或實驗室檢測中的任意一種為宿主診斷B型肝炎，所 述的臨床檢測和/或實驗室檢測是例如，身體檢查，以及血液分析或者血清分析。例如，對 血液或者血清進行檢測，看其中是否存在由所述的宿主產生的病毒抗原和/或抗體。在一 項常規的B型肝炎檢測中，對B型肝炎表面抗原(HBsAg)進行探測，用來篩選是否存在感 染。在受到某一病毒感染的過程中，第一個出現的可以被探測到的是該病毒的抗原；然而， 在感染的前期，這種抗原可能並不存在，並且在所述感染的後期可能探測不到這種抗原，因 為它已經被所述的宿主清除了。在這個「空窗期(window)」，所述的宿主仍舊處於感染狀態 但其已經成功的清除了所述的病毒，所述的B型肝炎核心抗原的免疫球蛋白M(IgM)抗體 (anti-HBc IGM)可能是該疾病的唯一的血清學證據。在B型肝炎表面抗原(HBsAg)出現後不久，另外一種名字叫做B型肝炎e抗原 (HBeAg)的抗原也將出現。傳統意義上，宿主血清中B型肝炎e抗原的出現與病毒複製的超 高速率相關；然而，所述的B型肝炎病毒的某些變異體根本不產生所述的「e」抗原。在所述 感染發生的自然過程中，所述的B型肝炎e抗原可能被清除，並且在此之後針對所述「e」抗 原的抗體(anti-HBe)將立即出現。這種轉變通常與病毒複製的戲劇性衰退有關聯。如果 所述的宿主有能力清除所述感染，最終所述的B型肝炎表面抗原將變得不可探測，並且隨 後針對所述的B型肝炎表面抗原的抗體(anti-HBs)也將變得不可探測。B型肝炎表面抗 原呈陰性、但針對B型肝炎表面抗原的抗體呈陽性的人，可能是已經清除了感染，或者是先 前接種過疫苗。許多B型肝炎表面抗原呈陽性的人可能存在非常稀少的病毒繁殖，並且因 此其患有長期併發症的危險很小，或者將這種感染傳播給別人的危險很小。Src在B型肝炎病毒的複製中發揮作用。所述的病毒編碼的轉錄因子HBx在所述 的B型肝炎病毒的傳播所需的步驟中激活Src (參見，例如，Klein等人(於1999年)在 EMBO J. ((EMBO雜誌》vol.(卷)18 =5019-5027中發表的文獻；Klein等人(於1997年)在 Mol. Cell. Biol.《分子細胞生物學》vol.(卷)17 =6427-6436中發表的文獻)，上述文獻的 全部內容通過引用全部併入本文)。因此，對於Src的抑制繼而抑制了由Src介導的乙型肝 炎病毒(HBV)的傳播，能夠有效的用於預防、治療或者改善B型肝炎或者由B型肝炎所帶 來的症狀。本發明化合物(I)或其藥學上可接受的鹽能夠預防、治療或者緩解B型肝炎或者 與B型肝炎有關的症狀。一般在接觸到病毒之後30-180天內，就會發展出現B型肝炎的症 狀。然而，大約有一半感染B型肝炎症狀的病人沒有出現任何症狀。所述B型肝炎的症狀通 常好比是流感、並且包括，例如，食慾下降；疲勞；噁心和嘔吐、全身瘙癢；肝臟疼痛(例如，
30右腹部、下部肋骨架之下)、黃疸症和排洩功能方面的變化。本發明所述的化合物(I)或其藥學上可接受的鹽可以單獨被給藥，也可以處於藥 物組合物中給藥，或者與任何一種已知的B型肝炎治療方法結合給藥，例如，α幹擾素、拉 米夫定(Iamivudine) (Epivir-HBV)和博路定(baraclude)(恩替卡韋(entecavir))。如這裡所述的，本發明化合物(I)或其藥學上可接受的鹽可以用來調節宿主體內 的免疫系統活性，從而預防或者防止自身免疫性疾病，例如，類風溼性關節炎、多發性硬化、 膿毒病和狼瘡以及移植排異反應和過敏性疾病。本發明的另一個方面包括本發明化合物 (I)或其藥學上可接受的鹽在製備用於調節免疫系統的藥物中的應用。做為選擇，所述化合 物(I)或其藥學上可接受的鹽可以用來治療宿主的自身免疫性疾病。例如，所述化合物(I) 或其藥學上可接受的鹽可以減少症狀的嚴重程度或者阻擋自身免疫性疾病的逐漸惡化。自身免疫性疾病是一類由自身耐受性的崩潰而引發的疾病，由於自身耐受性發生 崩潰，所述的適應性免疫系統對自身抗原進行應答，並且介導細胞以及組織的損傷。自身免 疫性疾病可能是器官特異性的(例如，甲狀腺炎或者糖尿病)，或者是全身性的(例如，全 身性紅斑狼瘡)。T細胞調控著所述的適應性免疫系統的由細胞介導的免疫應答。在正常 的情況下，T細胞表達抗原受體(T細胞受體)，所述的抗原受體識別與自身主要組織相容性 複合分子的外源蛋白質的肽片段。在τ細胞受體(TCR)的刺激發生後最先被識別到的事件 是Lck以及Fyn的活化，這種活化導致了存在於免疫受體酪氨酸活化基序中的酪氨酸殘基 上發生了 T細胞受體的磷酸化作用(參見Zamoyska等人於2003年在Immunol. Rev.《免 疫學回顧》191，107-118中發表的文獻)。酪氨酸激酶，例如Lck(它是蛋白質酪氨酸激酶 Src家族中的一個成員)，在細胞信號以及細胞增殖的調節中起到至關重要的作用，其中所 述的細胞信號以及細胞增殖是由肽以及蛋白質的酪氨酸殘基的磷酸化作用導致的(參見 Levitzki於2001年在Top. Curr. Chem.《現代化學論》211，1-15中發表的文獻；Longati等 人於2001年在Curr. Drug Targets《現代藥物靶向》2，41-55中發表的文獻；Qian與Weiss 於1997年在Curr. Opin. Cell Biol.《細胞生物學的現代觀點》9，205-211中發表的文獻)。 因此，儘管不希望受到理論的限制，但可以設想，給藥本發明中所述的能夠調控酪氨酸激酶 (例如，Src)活性的化合物可以有效的用於自身免疫性疾病的治療。上述的酪氨酸激酶Ick以及fyn均在所述的T細胞受體途徑中得到活化；因此， Ick和/或fyn的抑制劑具有作為自身免疫性試劑的潛在效用(參見Palacios與Weiss於 2004年在Oncogene《致癌基因》23，7990-8000中發表的文獻)。Lck以及Fyn主要是由T 細胞在它們大部分的生命期限內進行表達的。通過對動物以及細胞系進行的研究，已經證 明了 Lck以及Fyn在T細胞的形成、動態平衡以及活化中所起的作用(參見Parang與Sim 於2005年在Expert Opin. The. Patents《治療學專利的專家觀點》15，1183-1207中發表的 文獻)。在自身免疫性疾病以及移植排斥中涉及到Lck的活化(參見Kamens等人於2001年 在Curr. Opin. Investig. Drugs《藥物研究的現代觀點》2，1213-1219中發表的文獻)。結果 表明，Ick(-) Jurkat細胞系(砷誘導淋巴細胞系)不能夠增殖、生成細胞因子、並且產生胞 內的鈣、肌醇磷酸、以及酪氨酸的磷酸化作用的增加以應答T細胞受體的刺激(參見Straus 與Weiss於1992年在Cell.《細胞》70，585-593中發表的文獻；Yamasaki等人於1996年 在Mol. Cell. Biol.《分子細胞生物學》16，7151-7160中發表的文獻)。因此，一種抑制Ick 的試劑能夠有效的阻止T細胞的功能，發揮免疫抑制劑的作用，並且具有治療自身免疫性疾病的潛在效用，例如風溼性關節炎，多發性硬化症，以及狼瘡，並且在移植排斥的區域以 及過敏性疾病中具有潛在效用(參見Hanke與Pollok於1995年在InflammationRes.《炎 症的研究》44，357-371中發表的文獻)。因此，儘管不希望受到理論的限制，但可以設想， 給藥本發明中所述的能夠調控蛋白酪氨酸激酶Src家族中的一個或者多個成員(例如，Ick 和/或fyn)的活性的化合物可以有效的用於自身免疫性疾病的治療。本發明化合物(I)在小鼠、鼠、和狗體內的藥代動力學特性顯示化合物(I)具有口 服生物相容性，並且其藥物接觸量和最大血漿濃度顯示出劑量有關的增加。已經發展出本發明化合物(I)的二鹽酸鹽和化合物(I)的甲磺酸鹽。兩種橋聯的 藥代動力學研究顯示本發明化合物(I)的這兩種鹽形式在鼠和狗體內具有相似的藥代動 力學曲線。因此，對本發明化合物(I) 二鹽酸鹽的研究發現也適用於化合物(I)甲磺酸鹽 的研究。化合物(I)是一種特異性並且選擇性的Src激酶抑制劑，在抗癌細胞方面很有效， 並且與已經獲準的激酶抑制劑和正在研發過程中的激酶抑制劑相比，可以避免產生嚴重的 副作用，例如心臟毒性。本發明化合物(I)以純淨形式或者隔離形式(即，合成生產的形式)存在。本發明化合物(I)或其藥學上可接受的鹽可以通過常規方法製備，例如，通過美 國專利第US2008/0221102號和PCT/US2008/006419號中描述的方法製備。使用一種或者更多種藥學上可接受的載體可以以一種常規的方式配置包含本發 明化合物(I)或其藥學上可接受的鹽的藥物組合物。本發明所述的化合物(I)或其藥學上 可接受的鹽可以被口服給藥、經鼻給藥、透皮給藥、經肺部給藥、吸入給藥、口腔給藥、舌下 給藥、腹膜內給藥、皮下給藥、肌內注射給藥、靜脈內給藥、直腸給藥、胸膜內給藥、鞘內給藥 或者腸胃外給藥。在一個實施方案中，本發明化合物(I)或其藥學上可接受的鹽可以被口 服給藥。本領域普通技術人員可以識別各種給藥途徑的優點。根據各種各樣的因素可以選擇使用本發明化合物(I)的給藥方案，這些因素包括 病人的類型、種類、年齡、體重、性別和醫學狀況；需要治療的疾病的嚴重程度；給藥途徑； 病人的腎臟和肝臟功能和使用的具體化合物或其鹽。在一個實施方案中，本發明包括一種用於口服給藥、靜脈內給藥、肌肉給藥或者皮 下給藥的藥物組合物，所述藥物組合物包括一定量的本發明化合物(I)及其藥學上可接受 的鹽和一種藥學上可接受的載體，所述量為每劑量包含2毫克到400毫克，每天給藥兩次或 者三次。在另一個實施方案中，所述量為10毫克到300毫克。在另一個實施方案中，所述量 為20毫克到250毫克。在另一個實施方案中，所述量為40毫克到200毫克。在另一個實 施方案中，所述量為60毫克到160毫克。在一個實施方案中，所述劑量每日給藥兩次。在 一個實施方案中，所述劑量每日給藥三次。在一個實施方案中，本發明包括一種用於口服給藥、靜脈內給藥、肌肉給藥或者皮 下給藥的藥物組合物，所述藥物組合物包括一定量的本發明化合物(I)及其藥學上可接受 的鹽和一種藥學上可接受的載體，所述量為每劑量包含4毫克到800毫克，每天給藥一次。 在另一個實施方案中，所述量為20毫克到600毫克。在另一個實施方案中，所述量為40毫 克到500毫克。在另一個實施方案中，所述量為80毫克到400毫克。在另一個實施方案中， 所述量為120毫克到320毫克。
在一個實施方案中，本發明包括一種用於如上所述給藥方式的藥物組合物，其中， 所述藥物組合物包括化合物(I)的甲磺酸鹽。在一個實施方案中，所述給藥方式為口服給 藥。在另一個實施方案中，所述給藥方式為靜脈給藥。在另一個實施方案中，所述給藥方式 為肌肉給藥。在另一個實施方案中，所述給藥方式為皮下給藥。配製並且給藥本發明中公開的化合物(I)或其藥學上可接受的鹽的技術可以在 Remington the Science and Practice ofPharmacy《雷明頓藥物科學與實踐》，第 19 版， Mack出版公司，Easton，PA(1995年)中找到。在一種實施方式中，這裡公開的化合物(I) 或其藥學上可接受的鹽與一種藥物上可接受的載體或者賦形劑相結合被用於進行藥物的 製備。適當的藥學上可接受的載體包括惰性固體填充劑或者稀釋劑以及無菌水溶液或者有 機溶液。所述化合物I)或其藥學上可接受的鹽應當以足以提供在本發明所述的範圍之內 的期望的藥劑劑量的量存在於所述的藥物組合物中。在一個實施方案中，製備本發明化合物(I)或其藥學上可接受的鹽用於口服給 藥，其中這裡所公開的化合物(I)或其藥學上可接受的鹽與一種適當的固態載體或者液態 載體或者稀釋劑相結合，形成膠囊劑、片劑、丸劑、粉劑、糖漿劑、液劑、懸浮劑等等。所述片劑、丸劑、膠囊劑等等包含大約1到大約99重量百分數的活性成分和一 種粘合劑、一種賦形劑、一種崩解劑、一種潤滑劑和/或一種甜味劑，所述粘合劑例如黃蓍 樹膠、阿拉伯樹膠、玉米澱粉或者明膠；所述賦形劑例如磷酸二鈣；所述崩解劑例如玉米澱 粉、馬鈴薯澱粉或者海藻酸；所述潤滑劑例如硬脂酸鎂；所述甜味劑例如蔗糖、乳糖、糖精、 木糖醇等等。當單位劑量形式是一種膠囊劑時，除上述類型的材料之外該膠囊通常包含一 種液態載體，例如一種脂肪油。在某些實施方案中，可以存在各種各樣的其它材料作為包覆層或者用於改善所述 劑量單位的物質形式。例如，在某些實施方案中，用蟲膠、糖或者二者的結合物包覆片劑。在 某些實施方案中，糖漿劑或者酏劑除了所述活性成分之外還包括，作為甜味劑的蔗糖、作為 防腐劑的甲基和對羥基苯甲酸丙酯、一種著色劑和一種調味品，例如櫻桃食用香料或者柑 橘食用香料等等。對於涉及腸胃外給藥的一些實施方案，這裡公開的化合物(I)或者其藥學上可接 受的鹽可以與無菌水介質或者有機介質結合從而形成一種可注射溶液或者懸浮液。在一個 實施方案中，可注射組合物是水等滲溶液或者懸浮液。所述組合物可以是無菌的和/或包 含添加劑，例如防腐劑、穩定劑、加溼劑或者乳化劑、溶液助催化劑、調節滲透壓力的鹽和/ 或緩衝劑。此外，所述組合物還包含其他具有治療價值的物質。所述組合物可以分別通過 傳統的混合、粒化或者包衣方法製備，並且作為選擇分別包含大約0. 到75%的所述活 性成分，在另一個實施方案中，所述組合物包含大約1到50%的所述活性成分。例如，使用溶劑，例如，芝麻油或者花生油或者水相丙二醇以及所述化合物(I)的 水溶性藥學上可接受的鹽的水溶液可以製成可注射溶液。在某些實施方案中，可以在甘油、 液態聚乙二醇和其在油劑中的混合物中製備分散劑。在常規的儲存條件和應用條件下，這 些製劑可以包含一種防腐劑，從而預防微生物生長。如這裡所述的術語"腸胃外給藥" 和"通過腸胃外方式給藥」是指除了腸內和局部給藥方式之外的給藥方式，所述局部給藥 通常是指注射。「腸胃外給藥"和"通過腸胃外方式給藥"包括但不僅限於，靜脈內給藥、 肌肉內給藥、動脈內給藥、鞘內給藥、囊內給藥、眶內給藥、心內給藥、皮內給藥、腹膜內給
33藥、經氣管給藥、皮下給藥、表皮下給藥、關節內給藥、包囊下給藥、蛛網膜下給藥、脊柱內給 藥和胸骨內的注射以及輸液。對於直腸給藥，適當的藥物組合物是，例如，局部給藥製劑、栓劑或者灌腸劑。栓劑 可以從脂肪乳劑或者懸浮液中方便的製備。所述組合物可以是無菌的，和/或包含添加劑， 例如防腐劑、穩定劑、加溼劑或者乳化劑、溶液助催化劑、調節滲透壓力的鹽和/或緩衝劑。 此外，所述組合物還包含其他具有治療價值的物質。所述組合物可以分別通過傳統的混合、 粒化或者包衣方法製備，並且包含大約0. 1 %到75 %的所述活性成分，在另一個實施方案 中，所述組合物包含大約1到50%的所述活性成分。在一些實施方式中，所述的化合物(I)或其藥學上可以接受的鹽被配製成通過經 肺給藥的方式傳遞所述的活性試劑，例如，給藥含有所述活性試劑的氣霧劑製劑，通過，例 如，手動泵噴霧器、噴霧器或者定量吸入氣霧劑(pressurized metered-doseinhaler)的形 式。在某些實施方式中，適當的這種類型的製劑中還包括其他試劑，例如抗靜電劑，使所述 被公開的化合物保持有效的氣霧劑形式。用於傳遞氣霧劑的藥物傳遞裝置包括一個帶有計量閥的適當的氣霧劑筒以及一 個排氣洩壓閥外殼，所述的氣霧劑筒中裝有本發明中所述的藥物氣霧劑製劑，所述的排氣 洩壓閥外殼適於承載所述的氣霧劑筒並且允許進行藥物的遞送。所述的藥物傳遞裝置上的 所述筒具有一個頂部空間，其佔據了所述筒的全部體積的大約15%以上。通常，在溶劑、表 面活性劑以及推進劑組成的混合液中將意在進行肺部給藥的所述聚合物溶解、懸浮或者乳 化。將所述的混合液在壓力條件下保存於筒中，所述的筒利用計量閥進行密封。為了實現經鼻給藥，可以使用固態載體或者液態載體。所述固態載體包括一種粗 粉末，這種粗粉末的顆粒尺寸在例如大約20微米到大約500微米的範圍內，且所述製劑通 過鼻腔通道快速吸入給藥。在某些使用液態載體的實施方案中，所述製劑作為一種經鼻噴 霧或者滴劑被給藥，並且所述製劑包括油或者活性成分的水溶液。本發明還包括能夠快速分散的劑量形式，這種劑量形式又名"速釋劑型"。具體 的講，本發明某些實施方案被配製成能夠在一種較短的時間內釋放其組合物的製劑，所述 較短的時間例如，一般小於大約五分鐘，在另一個實施方案中，小於大約九十秒，在另一個 實施方案中，小於大約三十秒和在另一個實施方案中，小於大約十或者十五秒。這種製劑適 合於通過多種途徑對宿主給藥，例如，通過插入體腔或者應用到溼潤的體表或者開放性創 傷上。代表性地，一種"速釋劑型"是一種能夠口服給藥的固態劑量形式，該固態劑量 形式能夠快速的在口中分散開，並因此不需要在吞咽時做很大努力，且所述化合物能夠快 速被吞下或者通過口腔黏膜吸收。在某些實施方案中，適當的快速分散的劑量形式還可以 用於其他的應用中，所述應用包括創傷及其他身體損傷，和不能夠通過外表供給水汽釋放 藥物的疾病狀態的治療。「速釋劑型"在本領域內是已知的，參見例如，美國專利第5，578，322號和第 5，607，697號中所述的不溶物微顆粒的泡騰劑量形式和快速釋放包覆層；美國專利第 4，642，903號和第5，631，023號的冷凍乾燥泡沫和液體；美國專利第4，855，326號、第 5，380，473號和第5，518，730號中的熔融紡絲劑量形式；美國專利第6，471，992號中的固 態形式、游離形式的構造；美國專利第5，587，172號、第5，616，344號、第6，277，406號和第5，622，719號中的基於糖類的載體基質和一種液態粘合劑；以及其他本領域內已知的形式。本發明化合物(I)及其藥學上可接受的鹽還可以被配製成為一種「脈衝釋放」制 劑，其中所述化合物或其藥學上可接受的鹽在一系列的釋放(例如，脈衝)中從藥物組合物 中釋放出來。所述化合物(I)及其藥學上可接受的鹽還可以被配製成"持續釋放"製劑， 其中所述化合物在持續的時間內連續地從藥物組合物中釋放出來。本發明還包括一種製劑，例如液體製劑，所述液體製劑包括環狀的或者非環狀的 裝入膠囊中的或者製成溶劑的試劑，例如，環糊精、聚醚或者多糖(例如，甲基纖維素)， 或者在另一個實施方案中，通過使用一種烷基醚間隔體基團或者多糖，能夠將聚陰離子
環糊精衍生物與鈉磺酸鹽基團一起從親脂性腔中分離出來。在一個實施方案中，所述試 劑是甲基纖維素。在另一個實施方案中，所述試劑是使用丁基醚間隔體基團從親脂性腔中 分離出來的聚陰離子β-環糊精衍生物和鈉磺酸鹽，例如，CAPTISOL (購自CyDex， Overland,KS)。本領域普通技術人員可以計算適當的試劑/公開的化合物製劑比率，例如， 通過製備試劑在水中的溶液，例如，按重量計算佔40%的溶液；通過製備連續稀釋液，例如 製備20%、10%、5%、2.5%、0% (對照物)的溶液等等；通過加入過量的(與可以溶解的 試劑的量相比過量)所述化合物；通過在合適的情況下混合，例如，加熱、攪拌、超聲處理， 等等；通過離心或者過濾所得混合物從而獲得上清液；和通過分析這裡公開的化合物溶液 的濃度。本發明中所引用的全部出版物以及專利文獻在此通過引用作為參考，就如同這些 出版物或者文獻中的每一篇都被具體的並且分別的指明在此引入作為參考一般。對於出版 物以及專利文獻的引用並不意味著認可其中任意一篇作為相關的現有技術，也不構成對其 公開的內容或者日期的任何認可。本發明現在通過記載說明書的方式進行了描述，本領域 技術人員將可以認識到，本發明可以以各種不同的實施方式進行實踐，前述的說明書以及 下述的實施例的目的在於描述，並不構成對後附的權利要求的限制。定義出於方便的目的，在這裡總結了在說明書、實施例以及隨後的權利要求中所使用 到的某些術語。蛋白激酶是酶中的一個大類，它催化了 Y-磷酸從ATP (三磷酸腺苷)至蛋白質以 及肽中的絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)側鏈或者酪氨酸(Tyr)側鏈上的羥基基團的轉移，並 且最終參與控制各種重要的細胞功能，或許最顯著的控制信號轉導，分化以及擴增。據估 計，在人類體內存在大約2000種不同的蛋白激酶，並且儘管它們中的每一種針對特定的蛋 白/肽底物進行磷酸化，但它們都以高度保守的方式與一種同樣的次級底物進行結合。在 已知的致癌基因產物中有大約50%是蛋白酪氨酸激酶(PTK)，並且已經表明，它們的激酶 活性導致了細胞的轉化。所述的蛋白酪氨酸激酶(PTK)可以被劃分為兩個種類，膜受體蛋白酪氨酸激酶 (例如，生長因子受體蛋白酪氨酸激酶)以及非受體蛋白酪氨酸激酶(例如，原致癌基因產 物中的Src家族以及黏著斑激酶(FAK))。已經在多種人類癌症中報導了 Src的過度活化， 包括結腸癌，乳腺癌，肺癌，膀胱癌，以及皮膚癌，還有胃癌，多毛細胞白血病，以及成神經細 胞瘤。
「抑制蛋白激酶信號級聯中的一個或者多個成員」指的是所述的激酶信號級聯中 的一個或者多個成員受到作用，從而使得所述細胞的功能發生改變。蛋白激酶信號級聯中 的成員包括在所述的激酶信號途徑中直接或者間接涉及到的任何的蛋白質，包括第二信使 以及上遊靶向和下遊靶向。「治療」包括任何能夠改善所述情況、疾病、紊亂等等的作用，例如，減輕、減少、調 控或者消除所述情況、疾病、紊亂等等的作用。「治療」或者「醫冶」一種疾病狀態包括(1) 預防疾病狀態發生，也就是說，使有可能接觸某種疾病或者有傾向發展患有某種疾病，但是 還沒有經歷或者表現出疾病症狀的宿主不發展出現所述疾病的臨床症狀；(2)抑制所述疾 病，也就是說，使疾病或者其臨床症狀停止發展；或者(3)減輕所述疾病狀態，也就是說，使 所述疾病或者其臨床症狀產生暫時或永久的衰退。「預防」所述的疾病狀態包括使宿主疾病狀態的臨床症狀不在進一步發展，S卩，抑 制疾病的發病，其中所述的疾病狀態並沒有在宿主中形成，而所述的宿主可能被暴露於或 者被預先安排在所述的疾病狀態之中，但尚未體驗到或者表現出所述疾病狀態的症狀。「緩解」是指在宿主經歷或者顯示疾病狀態症狀之前，通過向宿主給藥化合物來降 低(減輕)宿主疾病狀態臨床症狀的嚴重性，所述的宿主可能被暴露於或者被預先安排在 所述的疾病狀態之中。「疾病狀態」是指任何疾病、紊亂、情況、症狀或者徵兆。如這裡所述，術語「細胞增殖性紊亂」是指一種情況，在這種情況中，未調節的細胞 和/或異常生長的細胞會導致不希望有的情況或者疾病產生，這種不希望有的疾病或者可 能是癌症或者非癌症性疾病，例如，牛皮癬。如這裡所述，術語「牛皮癬情況」或者「銀屑病」 是指一類疾病，這類疾病包括角化細胞過度增生、炎性細胞浸潤和細胞因子變更。在一個實施方案中，所述細胞增殖紊亂是癌症。如這裡所述，所述術語「癌症」包 括實體腫瘤，例如肺癌、乳腺癌、結腸癌、卵巢癌、腦癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌惡性黑色素 瘤、非黑素瘤性皮膚癌，以及血液學腫瘤和/或惡性腫瘤，例如，兒童期白血病和淋巴瘤、多 發性骨髓瘤、惡性淋巴肉芽腫(何杰金病)、淋巴細胞的淋巴瘤和皮膚起源的急性和慢性白 血病，例如，成淋巴細胞白血病、急性髓細胞白血病或者慢性粒細胞性白血病、漿細胞腫瘤、 淋巴腫瘤和與愛滋病有關的癌症。除牛皮癬情況之外，所述能夠使用本發明化合物治療的增生性疾病的種類有表皮 囊腫和皮樣囊腫、脂肪瘤、腺瘤、毛細血管瘤和皮膚血管瘤、淋巴管瘤、痣病變、畸胎瘤、腎 瘤、肌纖維瘤、成骨細胞瘤及其他發育異常物質，等等。所述增生性疾病還可以包括發育異 常和諸如此類的疾病。本發明所述的化合物的「有效劑量」指的是這樣的量當為患有疾病或者障礙的宿 主給藥時，能夠引發所述宿主的疾病或者障礙減退的量。因此，本發明所述的化合物的有效 劑量指的是這樣的量當為患有細胞增殖障礙的宿主給藥時，能夠引發所述宿主的細胞生 長減退的量。給藥給宿主的公開化合物的量將取決於具體的障礙，給藥的方式，結合給藥的 化合物，如果存在的話，以及所述宿主的特徵，例如一般健康狀況，其他疾病，年齡，性別，基 因型，體重以及對藥物的耐受性。熟練的技術人員將有能力依據這些因素以及其他因素來 確定適當的劑量。本發明中所使用的所述術語「有效劑量」指的是當將本發明所述的化合物(I)或其藥學上可接受的鹽，或者所述化合物的組合作為一種抗增殖製劑單獨給藥或者結合給藥 時能夠達到效果的量。例如，有效劑量指的是存在於一種製劑或者一種醫學裝置中的所述 化合物(I)的量，所述的量使得將其給藥至接受治療的宿主或者宿主後足以引發生物學活 性，例如，抗增殖活性，例如，抗癌症活性或者抗腫瘤活性。所述的化合物的組合任選的是一 種協同的組合。正如在例如Chou與Talalay (於1984年)在Adv. Enzyme Regul.《酶調節 進展》vol.(卷)22，pp.(頁)27-55中發表的文獻中所描述的，當所述的組合物進行結合給 藥時所產生的效果大於所述的組合物作為單一製劑進行單獨給藥時所產生的效果的相加 時，就發生了協同作用。通常，在所述化合物的非最適宜濃度條件下能夠最顯著的證明這種 協同效應。協同作用可以根據所述的組合比所述的單獨組分具有更低的細胞毒性、或者增 強的抗增殖效果、或者某些其他的有益效果來確定。有效量的一種或者一種以上化合物可以與一種藥學上可接受的載體一起配製，對 人類或動物給藥。因此，所述的化合物或者製劑可以經由例如口服、腸胃外、或者局部的路 徑進行給藥，從而提供有效劑量的所述化合物。在另外的實施方式中，可以利用依照本發明 而製備的所述化合物(I)或其藥學上可接受的鹽對一種醫學裝置進行塗層或者灌注，所述 的醫學裝置是例如血管支架。所述的術語「預防有效劑量」指的是能夠預防或者降低患有不期望的細胞增殖的 危險而給藥的本發明所述化合物(I)或其鹽的有效劑量。本發明中所使用的「藥理學作用」包括在宿宿主內所產生的、達到了治療的預期 目的的作用。在一種實施方式中，藥理學作用指的是接受治療的宿主的初始跡象(primary indications)被預防、緩解、或者減輕了。例如，藥理學作用應當是導致了接受治療的宿主 的初始跡象被預防、緩解、或者減輕了的作用。在另外一種實施方式中，藥理學作用指的是 接受治療的宿主的初始跡象的障礙或者症狀被預防、緩解、或者減輕了。例如，藥理學作用 應當是導致了接受治療的宿主的初始跡象被預防或者減輕了的作用。「藥物組合物」指的是一種含有所述化合物(I)及其鹽的製劑，其中所述的製劑以 一種適合給藥給宿主的形式存在。在一種實施方式中，所述的藥物組合物以大批劑量的形 式或者以單元劑量的形式存在。所述的單元劑量形式是各種形式中的任何一種，包括，例 如，膠囊，靜脈輸液袋(IV bag)，片劑，氣霧劑吸入器的單流向泵，或者是注射瓶。在單元劑 量的組合物中的所述活性成分(例如，所述被公開的化合物或其鹽、水合物、溶劑化物、或 者異構體的製劑)的量是能夠達到效果的劑量，並且根據具體涉及到的治療方法而存在變 化。本領域技術人員能夠認識到，有些時候根據所述宿主的年齡以及狀況對所述的劑量進 行常規的改變是必要的。所述的劑量還將取決於所述的給藥途徑。可以預期各種不同的途 徑，包括，口服給藥，經肺給藥，直腸給藥，胃腸外給藥，透皮給藥，皮下給藥，靜脈注射給藥， 肌肉注射給藥，腹腔內給藥，吸入式給藥，口腔內給藥，舌下給藥，注射給藥，鞘內注射給藥， 經鼻給藥等等。用於局部或著透皮給藥的本發明化合物的劑量形式包括粉劑、噴霧劑，軟膏 劑，糊劑，霜劑，乳劑，凝膠劑，溶液，貼劑和鼻吸劑。在一個實施方案中，活性化合物在無菌 條件下與一種藥學上可接受的載體、任意防腐劑、緩衝劑、或者需要的推進物相混合。所述的術語「閃釋劑型」指的是以快速分散的劑量形式存在的化合物製劑。所述的術語「立即釋放」定義的是化合物在相對短暫的時間段內從一種劑量形式 中進行釋放，通常達到大約60分鐘。所述的術語「控釋」的定義包括延遲釋放，延長釋放以及脈衝釋放。所述的術語「脈衝釋放」定義的是藥物從一種劑量形式中進行一系列的釋 放。所述的術語「持續釋放」或者「延長釋放」定義的是化合物在一段延長的時間內從一種 劑量形式中進行連續的釋放。「宿主」包括哺乳動物，例如，人類，伴侶動物(例如，狗，貓，鳥，以及類似動物)，農 場動物(例如，牛，羊，豬，馬，家禽，以及類似動物)以及實驗室動物(例如，小鼠，大鼠，豚 鼠，鳥，以及類似動物)。在一種實施方式中，所述的宿主是人類。如這裡所述，成語"藥學上可接受的"是指一種化合物、材料、組合物、載體和/ 或劑量形式，這種化合物、材料、組合物、載體和/或劑量形式通過醫學判斷可以適用於與 人類或者動物的組織接觸，且不會引起過度的毒性、刺激作用、過敏反應或者其他的問題或 者併發症，且具有合理的利益/風險比率。這裡使用的術語「藥學上可接受的載體」是本領域內已知的，並且包括，例如，藥 學上可接受的材料、組合物或者媒介物，例如，一種液態的或者固態的填充劑、稀釋劑、賦形 劑、溶劑或者膠囊材料，這些材料可以包括在組合物中用於攜帶或者從一個器官或者身體 的一部分向宿主的另一個器官或者身體的另外一部分傳遞組合物。每種載體必須是「可 接受的」，這表示它能夠與主體組合物的其他成分相兼容並且不會傷害到病人。在某些實 施方案中，一種藥學上可接受的載體是一種非發熱物質。可以用作藥學上可接受的載體的 材料的實施例包括(1)糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)澱粉，例如玉米澱粉和馬鈴薯澱 粉；(3)纖維素以及它的衍生物，例如羧甲基纖維素鈉鹽、乙基纖維素和醋酸纖維素；(4)粉 末狀的黃芪膠；(5)麥芽；(6)明膠；(7)滑石粉；⑶賦形劑，例如可可脂和栓劑蠟；(9)油 劑，例如花生油、棉花子油、向日葵油、芝麻油、橄欖油、玉米油和豆油；(10) 二醇類，例如丙 二醇；(11)多元醇，例如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；(12)酯類，例如油酸乙酯和 十二烷酸乙酯；(13)瓊脂；(14)緩衝劑，例如氫氧化鎂和氫氧化鋁；(15)海藻酸；(16)無熱 原的水；(17)等滲鹽水；(18)雷明氏(Ringer' s)溶液；(19)乙醇；(20)磷酸鹽緩衝液； 和(21)藥物製劑中可以使用的其他無毒的相容性物質。「藥學上可接受的賦形劑"是指一種對製備藥物組合物有效的賦形劑，所述藥物 組合物通常是安全無毒的，且在生物學上或者其他方面不會產生令人不歡迎的影響。所 述"藥學上可接受的賦形劑"包括適用於獸醫使用的賦形劑以及適用於人類藥物應用的 賦形劑。本發明說明書和權利要求書中使用的"藥學上可接受的賦形劑"包括一個或者一 個以上的這種賦形劑。本發明化合物能夠進一步形成一種鹽。本發明化合物所有的這些形式可應該包含 在要求保護的發明範圍內。本發明化合物(I)可以包括存在原子的同位素。本發明包括在本發明化合物中存 在的原子的所有同位素。同位素是指具有相同的原子序數但是具有不同原子量的原子。作 為常見的例子，氫的同位素包括氚和氘，碳的同位素包括C-13和C-14，這些常見的例子並 不作為對本發明的限制。化合物的「藥物可接受的鹽」指的是一種藥物學上可以接受的鹽類，並且所述的鹽 類具有所述母本化合物的預期的藥物學活性。這裡所使用的「藥物可接受的鹽」指的是被公開的化合物⑴的衍生物，其中所述 的母本化合物(I)通過被製成其酸式鹽或者鹼式鹽而被修飾。藥物可接受性鹽的例子包括，但不局限於，鹼性殘基例如胺的礦物鹽或者有機酸鹽，酸性殘基例如羧酸的鹼金屬鹽或 者有機鹽，以及類似的鹽。所述的藥物可接受性鹽包括所述母本化合物的常規的無毒性鹽 或者季胺鹽，它們來自於，例如，無毒性無機酸或者有機酸。例如，這樣的常規的無毒性鹽包 括，但不局限於，那些來自於無機酸以及有機酸的鹽，選自2-乙醯氧基苯甲酸鹽，2-羥基乙 烷磺酸鹽，醋酸鹽，抗壞血酸鹽，苯磺酸鹽，安息香酸鹽，重碳酸鹽，碳酸鹽，檸檬酸鹽，乙二 胺四乙酸鹽，乙烷二磺酸鹽，1，2-乙烷磺酸鹽，反丁烯二酸鹽，葡庚糖酸鹽，葡糖酸鹽，穀氨 酸鹽，羥基乙酸鹽，對α羥乙醯氨基苯砷酸鹽(glycollyarsanilate)，己基間苯二酚酸鹽 (hexylresorcinate)，hydrabamic,氫溴酸鹽，鹽酸鹽，氫碘酸鹽，羥基馬來酸鹽，羥基萘酸 鹽，羥基乙磺酸鹽，乳酸鹽，乳糖酸鹽，十二烷基磺酸鹽，馬來酸鹽，蘋果酸鹽，扁桃酸鹽，甲 烷磺酸鹽，napsylic,硝酸鹽，草酸鹽，雙羥萘酸鹽，泛酸鹽，苯乙酸鹽，磷酸鹽，多聚半乳糖 醛酸鹽，丙酸鹽，水楊酸鹽，硬脂酸鹽，亞醋酸鹽(subacetic)，琥珀酸鹽，磺酸鹽，磺胺酸鹽， 硫酸鹽，丹寧酸鹽，酒石酸鹽，甲苯磺酸鹽，以及普遍出現的胺基酸，例如，甘氨酸，丙氨酸， 苯丙氨酸，精氨酸，等等。其他的例子包括己酸，環戊烷丙酸，丙酮酸，丙二酸，3-(4_羥基苯甲醯) 苯甲酸，苯乙烯酸，4-氯苯磺酸，2-萘基磺酸，4-甲苯磺酸，樟腦磺酸，4-甲基二 環-[2. 2. 2]-辛-2-烯-1-羧酸，3-苯丙酸，三甲基醋酸，叔丁基醋酸，己二烯二酸，以及類 似的酸。本發明還包括下述方式形成的酸存在於所述母本化合物中的一種酸性質子被一 種金屬離子所取代而生成的酸，或者是這種酸性質子與一種有機鹼發生配位反應而生成的 酸，其中所述的金屬離子是，例如，鹼金屬離子，鹼土金屬離子，或者鋁離子；所述的有機鹼 是例如乙醇胺，二乙醇胺，三乙醇胺，氨基丁三醇，N-甲基葡糖胺，以及類似的有機鹼。本領域技術人員應當理解，所有涉及到的藥學上可接受的鹽包括這裡定義該鹽的 溶劑加成形式(溶劑化物)或者結晶形態(多形體)。術語"結晶多形體"或者"多形體"或者"結晶形態"是指一種晶體結構，其中 化合物(I)(或者其鹽或者溶劑化物)可以以不同的結晶存儲排列形式結晶，且所有的化 合物具有相同的化學組成。不同的結晶形態通常具有不同的X射線衍射圖、不同的紅外光 譜、不同的熔點、不同的密度硬度、不同的晶體形狀、不同的光學和電性質、不同的穩定性和 不同的溶解度。再結晶溶劑、結晶速率、貯存溫度及其他因素可以使一種結晶形態佔主體地 位。所述化合物的結晶多形體可以通過在不同的情況結晶來製備。此外，本發明中所述的化合物(I)，例如，所述化合物(I)的鹽，能夠以水合或者非 水合(無水的)的形式存在，或者以含有其他溶劑分子的溶劑化物的形式存在。水合物的 非限制性例子包括一水合物，二水合物，等等。溶劑化物的非限制性例子包括乙醇的溶劑化 物，丙酮的溶劑化物，等等。「溶劑化物」指的是含有化學計量或者非化學計量的溶劑的溶劑加成的形式。一些 化合物具有以結晶固體的狀態鎖住固定摩爾比率的溶劑分子的趨向，因而形成了一種溶劑 化物。如果所述的溶劑是水，則形成的所述溶劑化物是水合物，當所述的溶劑是乙醇，則形 成的所述溶劑化物是醇化物。當一個或者多個水分子與一種物質發生組合，並且所述的水 在其中仍然以H20的形態保持其分子狀態，則形成水合物，這樣的組合能夠形成一種或者 多種水合物。本發明所述的藥物可接受性鹽可以通過常規的化學方法從化合物(I)中合成得
39到。一般的，可以通過將化合物(I)與化學當量劑量的適當的鹼或者酸，或者二者的混合物 進行反應，來製備這樣的鹽，其中所述的反應是在水中或者在有機溶劑中進行的，或者是在 水以及有機溶劑的混合液中進行的；其中可以使用非水介質，例如乙醚，乙酸乙酯，乙醇，異 丙醇，或者乙腈。適當的鹽的列表可以在Remington，s Pharmaceutical Sciences《雷氏 藥學大全》第18版中找到(Mack出版公司，1990年)。本發明化合物(I)還可以被製備為一種前體藥物，例如，一種藥學上可接受的前 體藥物.術語〃前藥(pro-drug)丨『和〃前體藥物(prodrug)丨『在這裡可以互換使用，涉及 任意能夠在體內釋放活性母體藥物的化合物。由於已知前提藥物能夠提高藥物的許多合乎 需要的性質(例如，溶解度、生物利用率、製備方法等等)。本發明化合物(I)可以以前體藥 物的形式給藥。因此，本發明包括目前要求保護化合物(I)的前體藥物、它的傳遞方法以及 包含該前體藥物的組合物。「前體藥物"包括任何共價結合的載體，當將所述前體藥物對 患者給藥時，所述載體在體內能夠釋放有活性的本發明的母體藥物。本發明的前體藥物可 以通過改進存在於本發明化合物(I)中的功能基團來製備，改進方法可以是裂解所述化合 物(I)，包括通過常規操作裂解或者在活體內裂解。「聯合治療」(或者「共同治療」)包括將本發明所述化合物(I)與至少一種第二試 劑一起進行給藥，作為一個具體的治療方案的一部分，意在通過這些治療試劑的共同作用 來提供有益的效果。這種組合所產生的所述有益的效果包括，但不局限於，由所述治療試劑 的組合而引發的藥物動力學的共同作用或者藥效的共同作用。這些治療試劑的結合給藥通 常是在一段規定的時間段內進行的(通常是分鐘，小時，天或者周，取決於所選擇的組合)。 「聯合治療」可以、但通常並非意在包括本發明中作為分別的單一治療方案的兩種或者更多 種這類治療試劑的給藥，這些治療試劑順帶的並且隨意的構成了本發明中所述的組合。「聯合治療」意在包括以一種連續的方式給藥這些治療試劑，其中每種治療試劑在 不同的時間給藥，也包括以一種本質上同時的方式給藥這些治療試劑，或者至少給藥這些 治療試劑中的兩種。本質上同時給藥的方式可以通過例如向宿主給藥單一膠囊的方式來完 成，所述的膠囊中含有固定比例的每種治療試劑，或者通過向宿主給藥多個膠囊的方式來 完成，所述的每一種膠囊為一種治療試劑。每種治療試劑的連續給藥或者本質上同時給藥 的方式可能受到任意適當的途徑的影響，所述的任意適當的途徑包括，但不局限於，口服途 徑，靜脈內途徑，肌肉內途徑，以及經由黏膜組織的直接吸收。所述的治療試劑可以以同樣 的途徑或者不同的途徑進行給藥。例如，可以以靜脈內注射的方式給藥所選擇的組合中的 第一種治療試劑，而以口服的方式給藥所述組合中的其他的治療試劑。或者，例如，可以以 口服的方式給藥所有的治療試劑，或者以靜脈內注射的形式給藥所有的治療試劑。所述的 治療試劑的給藥順序並不是緊密苛求的。「聯合治療」還包括將如上所述的治療試劑進一步與其他生物活性成分以及非藥 物治療(例如，外科手術或者放射性治療)結合給藥。當所述的聯合治療進一步包括一種 非藥物治療時，所述的非藥物治療可以在任意適當的時間進行，只要通過所述治療試劑與 所述非藥物治療的組合的共同作用能夠達到有益的效果即可。例如，在適當的情況下，當所 述的非藥物治療與所述治療試劑的給藥在時間上發生分離，或許是幾天或者甚至是幾周， 也仍然能夠達到所述的有益效果。在整篇說明書中，當組合物被描述為具有、包括、或者包含具體組分的時候，可以預期到所述的組合物同樣是本質上由上述提及的組分組成，或者由上述提及的組分組成。 類似的，當方法被描述為具有、包括、或者包含具體的方法步驟的時候，所述的方法同樣是 本質上由上述提及的方法步驟組成，或者由上述提及的方法步驟組成。進一步的，應當理解 的是，這些步驟的順序或者完成某些行為的順序並非是實質性的，只要所述的發明仍然能 夠操作即可。並且，兩個或者更多個步驟或者行為可以同時進行。實施例實施例1 化合物(I)的小規樽合成
效的，所述小規模反應例如產生的產物質量高達50克的反應。對於下列合成方法，除非另作說明，試劑和溶劑都按照商業供應者的說明使用。質 子和碳核磁共振波譜源於Bruker AC 300或Bruker AV 300分光光度計，在300MHz下檢測 質子，在75MHz下檢測碳。光譜給出ppm值(δ )和耦合常數，J，以赫茲為單位。四甲基矽 烷被用作質子光譜的內標，對於碳光譜，溶劑峰作為參考峰。質譜和高效液相色譜質譜聯用 (LC-MS)數據來源於Perkin Elmer Sciex 100氣壓流電離(APCI)質譜儀。高效液相色譜 質譜聯用(LC MS)分析是通過利用連有254納米紫外檢測器的Lima C8 (2)柱(100x4. 6毫 米)而獲得，其中，使用一種標準溶劑梯度洗脫(方法B)。薄層色譜法(TLC)的運行是利用 Analtech矽膠板，並通過紫外燈(UV)，碘或20襯％磷鉬酸乙醇溶液觀測。高效液相層析法 分析是利用帶有254納米紫外檢測的流行的C18柱(53x7毫米，Alltech)獲得的，其中，使 用一種標準溶劑梯度程序(方法A或方法B)。方法A A =含0. lv/v三氟乙酸的水溶液B =含0. lv/v三氟乙酸的乙腈溶液
時間(分鐘)流量(毫升/分鐘)% A% B0. 03. 095. 05. 010. 03. 00. 0100. 011. 03. 00. 0100. 0方法B A =含0. 2v/v三氟乙酸的水溶液B =含0. 2v/v三氟乙酸的乙腈溶液
N-苯甲基-2-(5-溴吡啶-2-基)乙醯胺的合成 將5- (5-溴代吡啶-2 (1H)-基亞基)-2，2- 二甲基-1，3- 二氧六環-4，6- 二酮 (1.039克，3. 46毫摩爾)、苯甲基胺(0. 50毫升，4. 58毫摩爾)和甲苯(20毫升)裝入燒瓶 中。在氮氣存在的條件下，回流反應18小時，冷卻後，放入冰箱冷凍。通過過濾收集產物， 用己烷清洗得到大量的明亮的白色晶體(1.018克，96%)。4-(2-(4-(4，4，5，5-四甲基[1，3，2] 二雜氧戊硼烷-2-基)_苯氧基)乙基)嗎啉
的合成 在0°C中，在不斷攪拌的條件下，向4-(4，4，5，5_四甲基[1，3，2] 二雜氧戊硼 烷-2-基)-石炭酸(2. 55克，11. 58毫摩爾)，2-嗎啉基-4-基乙醇(1. 60毫升，1. 73克， 13. 2毫摩爾)和三苯膦(3. 64克，13. 9毫摩爾)溶於二氯甲烷(60毫升)的溶液中逐滴加 入偶氮二甲酸二異丙酯(DIAD) (2. 82克，13. 9毫摩爾)。將反應加熱到室溫，攪拌過夜。反 應18小時後，再加入三苯基膦(1. 51克，5. 8毫摩爾)、2_嗎啉基-4-基乙醇(0. 70毫升， 5. 8毫摩爾和偶氮二甲酸二異丙酯(DIAD) (1. 17克，5. 8毫摩爾)。在室溫下，繼續攪拌反應 2小時，濃縮反應產物，剩餘物通過瞬時色譜法(在CHCl3中的含量為5%到25%的乙酸乙 酯)而得到白色固體產物(2. 855克，74% )。2-(5-(4-(2-嗎啉基乙氧基)苯基)吡啶_2_基)_N_苯甲基乙醯胺化合物⑴的
合成
將N-苯甲基-2- (5-溴代吡啶-2-基)乙醯胺(123毫克，0. 403毫摩爾)、 4-(2-(4-(4，4，5，5_四甲基[1，3，2] 二雜氧戊硼烷_2_基)-苯氧基)乙基)嗎啡(171毫克， 0. 513毫摩爾)和FibreCat ΙΟΟΤ^βΟ毫克，0. 015毫摩爾)裝於帶有隔膜密封和攪拌棒的 10毫升反應管中。然後加入乙醇(3毫升)，隨後再加入含水碳酸鉀溶液(0.60毫升，1.0Μ， 0.60毫摩爾)。密封反應管並微波加熱到150°C，反應10分鐘。接著冷卻反應物，濃縮除 去大部分乙醇，隨後溶於10毫升乙酸乙酯，連續的用水和飽和氯化鈉溶液清洗。有機層用 MgSO4乾燥，過濾，濃縮得到白色固體。該白色固體同乙醚研磨而得到化合物(I)的白色粉末 狀固體(137 毫克，79% ) :mp 135-137°C ；1HNMR(300MHz, CDC13) δ 8. 70 (d，IH，J = 2. OHz)， 7. 81 (dd, IH, J = 2. 4Hz，J = 8. 0Hz)，7. 65 (br s，IH)，7. 49 (d, 2H, J = 8. 8Hz)，7. 37-7. 20 (m, 6H)，7. 01 (d, 2H, J = 8. 8Hz)，4. 49 (d, 2H，· 7 = 5. 8Hz)，4. 16 (t, 2H, J = 5. 7Hz，3. 82 (s, 2H)， 3. 78-3. 72 (m, 4H)，2. 84 (t，2H, J = 5. 7Hz)，2. 62-2. 58 (m, 4H) ；HPLC (方法 B) 98. 0 % (AUC)， tR = 1.834 分鐘.；APCI MS m/z432 [M+H] +。實施例2 中等規樽的化合物(I) 二鹽酸鹽合成本實施例概括的合成途徑可以用於中等規模的反應中。方案1表示了至少50克化 合物(I) 二鹽酸鹽的批量生產方法。由六個步驟組成線性合成，第7步是製備一種試劑的 步驟，該試劑是6-氟代吡啶-3-基硼酸(該試劑也可以商業購得)。順序總產率為35%， 其中平均產率為83%，最低產率步驟的產率為68%。在這7個步驟中只有一個步驟需要用 到色譜技術。下面列出的過程在70克的規模下進行。1聚合物結合的二化合物(醋酸)二環己基苯基膦鈀(II)，由Johnson Matthey， Inc公司生產，從Aldrich公司購得(編錄號#590231)
第一步是威廉森醚合成法，該方法使用K2CO3粉末(3到3. 5當量)作為鹼基，使用 氰化甲烷作為溶劑，在4-溴代苯酚(131克)和N-氯代乙基嗎啉(化合物1作為鹽酸鹽；141 克)之間進行合成。將各種成分混合併攪拌，回流整夜，得到較高的轉化率(96. 3-99. 1%)0 然後用二氯甲烷和正庚烷稀釋，過濾反應混合物並蒸發，從而以基本上穩定的產率產生需 要的產物2(216克)。注意，當含有相似的底物(S卩，4-溴代-3-氟代苯酚)時，轉化率(即 使在具有多次加熱的情況下)通常是不高的(例如，59. 9-98. 3% )。烷基氯和所述1(20)3優 選從Aldrich公司購買獲得。如果持續的加熱不能使反應完成，通過將粗品反應混合物溶 解在4部分的甲烷中，並用4部分的15%的氫氧化鈉水溶液衝洗除去苯酚，來方便的除去未 反應的溴代苯酚。第二步驟(Suzuki偶聯反應)中需要的一種試劑是6-氟代吡啶-3-基硼酸(4)。 這種試劑既可以通過商業途徑購得，也可以通過在低溫條件下( 98% )的材料；產率是68% (79. 5克)。使用乾淨的化合物5事下面的步驟中不在需要進行色譜分析法，下一步驟是氟 原子的氰化甲烷取代。用氰化甲烷取代氟化物也是一種簡單的反應，簡單的室溫條件下的結晶作用就可 以以較高的產量和純度提供乾淨的化合物6的粗產品。該反應包括，使用六甲基乙矽烷鉀 KHMDS(Seq)/四氫呋喃在-10°C下使氰化甲烷(6. 5eq)形成「烯醇化物」，隨後立即加入化 合物5的氟化物(79克)。該反應是快速的，在用飽和鹽水進行一小時淬火之後完成。幹 燥並蒸發有機溶劑，之後，所得粗品混合物只由兩種組分組成，即需要的產品和一種更少的 極性產物，這種極性產物是由氰化甲烷的表面自縮合作用形成的。將粗品混合物在異丙醇 /正庚烷中攪拌，並靜置過夜，從而導致產物完全結晶，將結晶過濾出來並洗滌，以很好的產 率(64克，76% )產生高純度(99. 3% AUC)的化合物6。在40%的硫酸(在甲醇中)中加熱直到反應完全(25小時)可以完成化合物6 (64 克)的甲醇分解作用。隨後冷卻反應，用硫酸鎂攪拌，將微量痕量的水解產品(ArCH2-CO2Me) 轉入產物中，然後加入到冷卻的K2CO3水溶液中，同時用二氯甲烷提取。乾燥並蒸發大部分 的二氯甲烷，隨後加入5%的乙酸乙酯(在庚烷中)，然後進一步濃縮至產生產物結晶。過 濾固體產物並洗滌，得到高純度(98. 9% AUC)高產率(82%)的化合物7，其他的高純度產 物(4克)可以從母液中獲得，總產率是61. 7克(87%)。該反應也包括醯胺化步驟，用各種組分(化合物7(61克)、苄胺(3eq)、和高沸 點的苯甲醚)裝入反應容器中，然後加熱回流直到反應完全。冷卻反應混合物以高純度 (98.9% )高產率(81% )得到目標化合物的完整的結晶。最後一步是目標化合物二鹽酸鹽的形成。為了保證兩個鹼基位點的完全質子化， 在完全的乙醇中進行反應，乙醇可以自如的溶解二鹽酸鹽。然後蒸發直至全乾，用乙醇「驅 逐」反應混合物兩次從而去掉過量的氯化氫。將所得粘性油溶解於乙醇(2份)中，然後加 入大體積(20份)的乙酸乙酯，同時快速攪拌。過濾，用乙酸乙酯(不含正庚烷)洗滌，並 真空乾燥，從而提供奶油色-白色粉末狀的化合物(I) 二鹽酸鹽。最後總共獲得68克(產 率97%)的高純度(99. 6% AUC)鹽，該鹽包括痕量的乙酸乙酯(4. 8%重量/重量)、乙醇 (0. 3 %重量/重量)、和正庚烷(0. 6 %重量/重量；在真空乾燥之前用正庚烷進行最後的洗 滌)。這些鹽可以從熱的乙醇/乙酸乙酯中結晶(與上面描述的沉澱法不同)，從而產生結 晶珠，該結晶珠具有很低的俘獲溶劑水平(只有0. 26%重量/重量的乙酸乙酯和0. 45%重 量/重量的乙醇)並且可以自由流動。 4- (2- (4-溴代苯氧基)乙基)嗎啉(化合物2)的製備將化合物1 (140. 7克，0. 756摩爾)、4_溴代苯酚(130. 6克，0. 755摩爾)、無水 K2CO3粉末(367.6克，2. 66摩爾，3. 5eq)、和氰化甲烷(1. 3升)裝入5升的三頸圓底燒瓶 中，該三頸圓底燒瓶裝有機械攪拌器、帶有轉換接頭的溫度計、冷凝器和氮氣入口管(在冷 凝器的頂部)。在80°C下劇烈攪拌所述混合物(槳葉觸到燒瓶的低端)過夜，隨後用二氯 甲烷(DCM) (500毫升)和正庚烷(200毫升)稀釋並用硅藻土過濾。蒸發(旋轉蒸發，然後 真空蒸發)至乾燥，產生淡黃色油狀的化合物2 (216. 00克，產率100 %,96.3% AUC，包括 3. 7%未反應的溴代苯酚)。這些材料不經過進一步純化就可以使用。1H 匪R(CDCl3) δ 2. 57 (t, 4Η), 2. 79 (t, 2H), 3. 73 (t, 4H), 4. 08 (t, 2H), 6. 78 (d, 2H), 7. 37 (d, 2H) · MS (來自 LC/MS) :m/z 287. 1 [M+I] ·通過2克的樣品進行的試驗證明溴代苯酚可以被方便的被去除，方法是首先將樣 品溶解於甲苯(8克)中並用8克的15%氫氧化鈉水溶液洗滌；液相色譜顯示回收所得的 產品(1.97克；98. 5%回收率)中沒有未反應的溴代苯酚的痕跡。6-氟代吡啶-3-基硼酸(化合物4)的製備攪拌並冷卻(乾冰-丙酮浴)無水甲基叔丁基醚(TBME) (620毫升；在裝備有機械 攪拌器、帶有轉換接頭的溫度計、冷凝器和氮氣入口管的3升三頸圓底燒瓶中)，將其加入 (通過注射器加入)到2M的仙1^(352毫升，0.704摩爾，1.2叫)中。在13分鐘內，向這種 快速攪拌的、冷卻的(< -75V )混合物中加入化合物3(102. 2克，0. 581摩爾)在無水甲 基叔丁基醚(TBME) (100毫升)中的溶液，在此期間，內部溫度上升到_62°C。繼續攪拌反應 物45分鐘(將溫度維持在_62°C到-80°C之間)，隨後快速、連續的添加4份三異丙基硼酸 鹽(總量180克，0. 957摩爾，1. 65eq)。在添加將近完成的時候，內部溫度達到_33°C。隨 後在冷水浴中再進行45分鐘的攪拌(內部溫度下降至_33°C到_65°C )，去掉冷水浴使攪拌 混合物在50分鐘內自己升溫到-22°C。之後在15分鐘內加熱(通過水浴加熱)到6°C，將 所述攪拌的反應混合物放置到冰水浴中，在氮氣條件下用冷卻的氫氧化鈉(160克)在水中 (500毫升)的溶液淬火。一旦添加完成，內部溫度是20°C。在室溫條件下攪拌混合物1. 5 小時。倒掉水層，用350毫升濃縮的鹽酸中和到pH值大約為7，然後用乙酸乙酯(3x1升) 提取。這是PH值大約為8-9，因此，使用大約15毫升濃縮的HCl將水層的PH值調節到大 約為7，並進一步用乙酸乙酯(2x1升)提取。乾燥(Na2SO4)結合了乙酸乙酯的萃取物，過 濾並濃縮到體積大約為150毫升。攪拌濃縮物，分部分加入正庚烷(總體積大約為300毫 升)，使產物沉澱/結晶。過濾，用正庚烷(100毫升、300毫升，之後在用300毫升)洗滌固 體並風乾，從而產生灰白色固體狀的標題產物(68. 6克，產率是79-90% ；液相色譜純度為 96. 4%，核磁共振展示大約5. 5% w/w的正庚烷)，該產物不經過進一步純化就可以成功的 被使用。質譜聯用(LC/MS)顯示這是如下兩種物質的混合物，較高分子量物質的密度起主 要作用(注意如果假定成分中只有硼酸鹽時，反應產率是79%，如果假定成分中之後環硼
精確質量141. 04
N F精確質量369.091H NMR(CDCl3) δ 7. 14 (dd, 1H), 8. 27 (ddd, 1H), 8. 39 (br s,2H,20H) ,8. 54 (fine d, 1H)。MS (來自LC/MS) :m/z 143. 0 [M+l ；對於硼酸鹽]且370. 0 [M+l ；對於上述環硼酸鹽]·
(HO)2B>
O、
a
4 N F
N
O,
￡4- (2- (4- (6-氟代吡啶_3_基)苯氧基)乙基)嗎啉(化合物5)的製備將化合物2(110. 7 克，0. 387 摩爾)、化合物 4(71. 05 克，0. 477 摩爾，1. 23eq)和二 甲醚(DME) (700毫升)裝入2升的三頸圓底燒瓶中，該三頸圓底燒瓶裝有機械攪拌器、帶有 轉換接頭的溫度計、冷凝器和氮氣入口管(在冷凝器的頂部)。通過向攪拌後的溶液中快速 通入氮氣5分鐘對所得的攪拌溶液脫氣，隨後，加入脫氣後的碳酸鈉(121. 06克，1. 142摩 爾，3eq)在水(250毫升)中的溶液和固體pd(pph3)4 (19. 8克，0. 044eq)。在末次添加完成 之後，用氮氣純化容器中位於反應混合物上部的空間，然後在80°C -85°C (內部溫度)條件 下攪拌混合物7小時，隨後冷卻到室溫由於缺少水相層，輕輕倒出上清液，留下無機鹽(還 有吸附的水)。用50%的二氯甲烷/乙酸乙酯(2x250毫升)洗滌含有無機鹽的反應燒瓶， 相倒出的上清液中加入洗滌物。乾燥結合的有機物(Na2SO4),過濾並蒸發直至乾燥，產生暗 褐色的油狀物(148克)。向這種油狀物中加入150克50%的正庚烷/異丙醇(IPA)，隨後 攪拌、冷卻(通過冰水浴冷卻)，再次結晶。加入額外的正庚烷(50克)過濾所得固體、洗 滌並風乾，產生48克的淡褐色固體。之後，蒸發濾液直至乾燥，在100毫升50%的正庚烷/ 異丙醇(IPA)中攪拌反應混合物，隨後加入更多的正庚烷(大約100毫升)，停止反應並放
47
酸鹽的話，反應產率為90% )
入冰箱中結晶。過濾所得固體、用正庚烷洗滌並風乾，得到61克的膠狀固體。蒸發所得濾 液產生一種油狀物(34克)，這種油狀物中含有非常少的極性雜質，所述極性雜質包括Ph3P =0，因此，將其分別放入2N的鹽酸(240毫升)和乙酸乙酯(220毫升)中。去掉底部水 相層，然後與乙酸乙酯一起攪拌，用碳酸鈉將PH值中和到大約為7-8。乾燥乙酸乙酯層，過 濾並蒸發至乾燥(22克)。將48克、61克和22克部分在DCM包裹的矽膠(1. 1千克)中進 行色譜分離。用二氯甲烷(00釐)(400毫升)、50%二氯甲烷(DCM)/乙酸乙酯(5升)洗提， 然後用包含增加量的甲醇/Et3N(最開始含有1. 5%甲醇/1 % Et3N,最後含有5%甲醇/3% Et3N)的50%的二氯甲烷(DCM)/乙酸乙酯(8升)洗提，產生77. 68克的粘性油狀物(純 度98.0%)，隨後立刻在攪拌的正庚烷(300毫升)中結晶。過濾、用正庚烷洗滌並風乾，產 生75. 55克的固體化合物5(98. 7% AUC)。按照對上述24克樣品所進行的一樣，通過從包 括Ph3P = ο的較早的色譜餾分中除去雜質Ph3P = 0，獲得其他純的化合物5 (總量為3. 9 克，98. 6-99. 3% AUC)，隨後蒸髮結晶。化合物5的總產率為79. 5克(68% )。
1H NMR(CDCl3) δ 2. 59(t，4H)，2· 84(t，2H)，3· 75(t，4H)，4· 16(t，2H)，6· 97 (dd, 1H) ,7. 01 (d, 2H)，7. 46 (d, 2H)，7. 92 (ddd, 1H)，8. 37 (fine d, 1H) · MS (來自 LC/MS) :m/z 303. 2[M+I],2-(5-(4-(2-嗎啉代乙氧基)苯基)吡啶_2_基)氰化甲烷(6)的製備在3升三頸圓底燒瓶上裝有機械攪拌器、帶有轉換接頭的溫度計、另外的漏鬥和 氮氣入口管(在漏鬥的頂部，通過鼓泡器提供正壓)。通過快速的氮氣流通過鼓泡器，除去 阻聚劑並用KHMDS (415. 8克，2. 08摩爾)和無水四氫呋喃(1升)裝入所述燒瓶中。攪拌並 冷卻(冰/甲醇浴冷卻，溶液的內部溫度為_8°C )KHMDS/四氫呋喃溶液，然後在22分鐘內 將其逐滴加入到乙腈(MeCN) (70克)在四氫呋喃(110毫升)中的溶液中，隨後立即以相對 快的速度(4分鐘)加入化合物5(79. 06克，0. 262摩爾)在四氫呋喃(400毫升)中的溶 液，此時，反應混合物的內部溫度達到10°C。持續冷卻(1小時)使溫度下降到_6°C，然後 通過薄層色譜法顯示反應完全。隨後，用飽和鹽水(1升)淬火反應混合物30分鐘(內部 溫度為_3°C)，並用乙酸乙酯(500毫升)稀釋。之後，除去水相層，乾燥有機溶液(無水硫 酸鈉)並過濾，蒸發至乾燥(成一種油)，隨後完全溶解於異丙醇(IPA) (150毫升)中，用正 庚烷(300毫升)稀釋，加入晶種(通過將大約100毫克的粗品油狀物溶解於異丙醇(IPA， 大約150毫克)中，並用正庚烷(大約2. 5毫升)稀釋獲得)，然後靜置整夜。在攪拌打碎 結晶固體之後，過濾固體，用250毫升2 1正庚烷/異丙醇(IPA)洗滌，然後用正庚烷洗 滌多次，風乾，產生64. 38克結晶的黃褐色固體狀標題產物6 (產率為76% )。從濾液中獲 得另外的5. 88克較少的純物質。1H 匪R(CDCl3) δ 2. 59 (t, 4Η), 2. 84 (t, 2H), 3. 74 (t, 4H), 3. 97 (s, 2H), 4. 17 (t, 2H), 7. 02 (d, 2H)，7. 46 (d, 1H)，7. 51 (d, 2H)，7. 87 (dd, 1H)，8. 77 (fined, 1H) · MS (來自 LC/MS) :m/ ζ 324. 4[M+I],
48
向2升的單頸圓底燒瓶中裝入化合物6 (64. 00克，0. 198摩爾)和甲醇(360克)， 隨後緩慢、小心的逐滴加入硫酸(240克)，回流攪拌(115°C油浴)所得均勻溶液直到反應 完全(25小時，還有0. 8%的未反應的起始材料)和3. 5%的ArCH2CO2H15冷卻一段時間之 後，加入硫酸鎂(75克)，攪拌混合物並靜置45分鐘(組合物中含有96. 3%的產物、0. 8%未 反應的起始材料和2. 5% ArCH2CO2H)。然後緩慢的將該反應混合物加入到快速攪拌的冷卻 的混合物中，該混合物是二氯甲烷(DCM) (2升)和碳酸鉀(450克)水(600毫升)溶液的 混合物。將所得乳狀劑靜置整夜。虹吸抽出有機溶液中清澈的部分，用水和二氯甲烷(DCM) 反覆處理剩餘的部分，將清澈的有機物與虹吸出來的原始部分相結合。結合的有機物被幹 燥(無水硫酸鈉)、過濾並濃縮到體積為大約1. 2升，隨後，加入300毫升的5%的乙酸乙酯 (在正庚烷中)和正庚烷，再次濃縮混合物(加熱旋轉蒸發)，從而除去二氯甲烷(DCM)。此 時，加入15毫升乙酸乙酯，攪拌加熱的材料直到開始出現結晶，攪拌直到結晶過程幾乎完 全，然後靜置並冷卻到室溫完成結晶作用。隨後過濾固體，用300毫升5%的乙酸乙酯(在正 庚烷中)和正庚烷(100毫升)洗滌，然後徹底風乾，產生57. 74克(產率為82%)淡黃色 固體狀的化合物7 (98. 9% AUC)。從濾液中獲得另外的3. 94克較少的純淨的產物(97. 9% AUC)(總產率為87% ) ο1H NMR(CDCl3) δ 2. 60(t，4H)，2· 84(t，2H)，3· 74 (重疊並且 s，6H)，3. 89(s，2H)， 4. 17 (t, 2H)，7. 01 (d, 2H)，7. 34 (d, 1H)，7. 49 (d, 2H)，7. 80 (dd, 1H)，8. 74 (fine d, 1H) · MS (來 自 LC/MS) :m/z 357.4[M+I],
自由基)的製備 向1升的單頸圓底燒瓶中裝入化合物7(61. 4克，0. 172摩爾)、苄胺(55. 6克， 0.519摩爾，3eq)和無水甲氧基苯(300克)，然後回流攪拌直到反應基本完全(23小時， 165°C油浴溫度；內部溫度147°C )，然後冷卻直至接近室溫。用甲苯(1毫升)稀釋一部分 的反應混合物(1毫升)從而得到這部分的完全結晶。然後將這些晶種加入到反應混合物 中，靜置，直到全部的反應混合物生成結晶成為單一單元。向其中加入甲苯(150毫升)，攪 拌混合物從而打碎固體。向其中加入正庚烷/甲苯(1 1，100毫升)，進一步粉碎固體混合 物。最後，加入正庚烷(50毫升，然後25毫升)再次進一步的粉碎混合物，在過濾固體之前靜置反應混合物30分鐘。過濾固體，先後用2 1的甲苯/正庚烷(300毫升)，1 2的甲 苯/正庚烷(300毫升)，和正庚烷(2x300毫升)洗滌過濾所得固體，然後乾燥(先是空氣 乾燥，然後高真空乾燥)產生60. 16克(產率是81%)白色固體狀的標題產物(>98.9% AUC)。從原始液體中獲得另外的2. 5克較少的純淨的產物(97. 4% AUC)。1H NMR(CDCl3) δ 2. 60(t，4H)，2· 83(t，2H)，3· 74(t，4H)，3· 82(s，2H)，4· 18 (t， 2H)，4. 49 (d, 2H)，7. 01 (d, 2H)，7. 2-7. 35 (m, 6H)，7. 49 (d, 2H)，7. 64 (brt, 1H)，7. 81 (dd, 1H)， 8. 69 (fine d，1H). MS (來自 LC/MS) :m/z 432. 5[M+I],
啉-4-氯化苯鎂(化合物(I) 二鹽酸鹽)的製備。向攪拌的化合物⑴(自由基，60. 00克)在完全乙醇(600毫升)的懸浮液中加 入170毫升2. 5M的鹽酸(在乙醇中)，加入25毫升的乙醇從而衝洗燒瓶的幾個側壁。在室 溫條件下攪拌所得的均勻溶液(20分鐘)，然後蒸發至接近乾燥(從而起泡)。在加入乙醇 (2x150毫升)洗滌之後，將殘餘物溶解在乙醇(150毫升)中，然後緩慢的加入正庚烷直到 所得混合物呈現飽和狀態(從出現渾濁到出現剩餘物共需要33毫升)。然後靜置整夜，形 成兩層。之後加入額外的正庚烷(250毫升)，這時仍不能誘導產生結晶，因此將反應混合物 濃縮直到體積大約為200毫升，此時，反應混合物仍然是均質的。將這種濃稠的均質溶液逐 滴加入到快速(機械)攪拌的乙酸乙酯(2升)中，在加入完成之後，用25毫升的乙醇洗滌 原始燒瓶，然後向快速攪拌的混合物中加入一個漏鬥。繼續持續快速攪拌反應混合物大約 一小時，然後過濾混合物並且將所得固體(部分成膠的)用乙酸乙酯(300毫升)洗滌，之 後，用正庚烷洗滌。一旦開始使用正庚烷洗滌，所得固體會產生更多的膠體。將玻璃狀陶瓷 質的布氏漏鬥和他的內含物一起包裹(用毛巾紙包裹/橡膠帶包裹)，然後立刻放入真空幹 燥爐中。在_45°C下真空乾燥整夜，在氮氣條件下打開真空，包含產物(起泡沫的固體)的布 氏漏鬥立刻被放入拉鏈封閉的背袋中，然後，在氮氣條件下(手套帶)轉移到瓶中，並將起 泡沫的固體粉碎成粉末。第二天晚上在高度真空(_45°C )條件下乾燥，只產生1. 3克的額 外重量損失。經過第三天晚上的高真空(_45°C )乾燥可以獲得基本上穩定的重量，此時的 重量損失只有0.2克。最後得到的材料重量為68. 05克(產率97%)，包括0. 29eq((4.8% 重量/重量)的乙酸乙酯、0.035eq(0. 3%重量/重量)的乙醇和0. 03eq(0. 6%重量/重 量)的正庚烷。純度是99.6%。1H NMR(二甲基亞碸-(16) δ 3. 1—3. 3 (m，2H)，3. 45—3. 65 (m，4H)，3. 8—4. 0 (m，4H)， 4. 11 (s，2H)，4· 32(d，2H)，4· 57(t，2H)，7· 19(d，2H)，7· 2_7· 4 (m，5H)，7. 88(d，2H)，7· 93 (d, 1H) ,8. 68 (dd, 1H) ,8. 99 (br t, 1H) ,9. 10 (fine d, 1H), 11. 8(br s，1H) · MS (來自 LC/MS) :m/
50z432. 5[M+1 自由基]。元素分析(對於C26H29N3O3 · 2HC1 · 0. 035乙醇· 0. 29乙酸乙酯· 0. 03正庚 烷· 0. 8H20)a.計算百分比(% ) :C,60. 03 ；H, 6. 54 ；N, 7. 65 ；Cl, 12. 91b.觀測百分比(% ) :C,59. 85/59. 97 ；H, 6. 54/6. 47 ；N, 7. 67/7. 67 ；Cl, 13. 10/13. 24計算的FW:534.63(由於1H NMR對H2O不敏感，因此這裡並沒有考慮0. 8H20的值， 這個值在處理這種極易吸溼的粉末過程中可能是上升的)。測定這些材料中乙基氯化物水平，測定結果是98ppm。同時分析樣品，測定結果發 現包含5，800ppm的正庚烷。分析這些樣品的另一部分，得到下列結果99. 6% AUC、1640ppm乙醇、41，480ppm 乙酸乙酯，5600ppm正庚烷、未檢測到甲氧基苯和120ppm的乙基氯化物。使用上述乾燥的鹽也可以發展鹽的重結晶過程。這種過程只有在處理高度純淨的 粗品鹽(包含剩餘的乙醇)時才能很好的發揮作用，所述高度純淨的粗品鹽是通過濃縮鹽 酸鹽形成反應混合物而產生的。將鹽(575毫克)溶解於兩倍重量的純乙醇(1. 157克)中，然後在氮氣條件下加 熱。向這種加熱後的溶液(攪拌的)中加入1.6克25%的乙醇(在乙酸乙酯中)，隨後加 入乙酸乙酯得到一種混濁的溶液。將這種混濁的加熱後的溶液冷卻到室溫，在冷卻過程中 發生結晶作用。在結晶作用完成之後(2小時)，過濾收集結晶的固體，用無水乙酸乙酯(大 約40毫升)洗滌，並真空乾燥，從而產生424毫克可隨意流動的固體狀的化合物(I)的 二鹽酸鹽(細小的珠粒，99.8%々肌)，其中只包含0.05叫(0.45%重量/重量)的乙醇和 0.015叫(0.26%重量/重量)的乙酸乙酯。使用異丙醇/乙酸乙酯能夠獲得稍微好一些的 回收率(從586毫克中獲得460毫克)，但同時，溶劑捕獲水平也更好
。實施例3 化合物(I) 二鹽酸鹽的大規模合成這裡使用的試劑或者溶劑是從供貨商處購買得到的。通過高壓液相色譜、氣相色 譜/質譜聯用、或者1H NMR監控反應過程。使用Analtech矽膠板進行薄層色譜(TLC)分 析並且通過紫外(UV)燈(254納米)觀測。在AgilentllOO系列儀器上進行高壓液相色譜 (HPLC)。使用Bruker AV 300可以獲得質子核磁共振譜圖和碳原子的核磁共振譜圖，其中 在300MHz下獲得質子的核磁共振譜圖，在75MHz下獲得碳原子的核磁共振譜圖。使用溶劑 的峰作為質子譜圖和碳原子譜圖的參照峰。4-(2-(4-溴代苯氧基)乙基)嗎啉(化合物2)的製備向裝配有回流冷凝器和測溫 傳感器的50升夾套反應器中裝入4-(3-氯代丙基)嗎啉(2. 44千克，0. 54摩爾)、4_溴代 苯酚(2. 27千克，0. 54摩爾，1. 0當量)，製成粉末狀的碳酸鉀(6. 331千克，1. 88摩爾，3. 50 當量)和二甲基甲醯胺(DMF，12.2升)並攪拌。隨後，江反應混合物加熱到60-65°C然後攪 拌過夜。在17. 5小時之後，將反應混合物冷卻到20-25°C。將反應混合物倒入不同的反應 器中，這裡的反應器裝配有底部閥門。當溫度維持在20-30°C時，向反應器中加入水(48.7 升)。分離各個相。用甲基三丁基乙醚(MTBE) (2x24. 4升)提取水相層。向結合的有機相 中加入Dl水(18. 3升)，然後加入6M的氫氧化鈉(18. 2升)。將混合物攪拌2_5分鐘，然後分離各相。用水(24.4升)和鹽水(24.4)洗滌有機相，用硫酸鎂乾燥，過濾並濃縮，從而 產生3370克黃色油狀物(89%，粗產品，通過高壓液相色譜測定AUC為99. 4% )。6-氟代吡啶-3-基硼酸(化合物4)的製備一種72升的反應器上裝配有回流冷凝器和測溫傳感器。向這種反應器中加入 5-溴代-2-氟代吡啶(1. 17升，0. 568摩爾)、甲苯(18. 2升)和三異丙基硼酸鹽(3. 13升， 0.68摩爾，1.2當量)並攪拌。向反應器中加入四氫呋喃(4. 4升)然後將反應混合物冷卻 到-35°C到-500C之間。當溫度維持在-35°C到-45°C之間時，小心的向反應器中加入正丁基 鋰(2. 5M的正庚烷溶液，5. 44升，0. 68摩爾，1. 2當量)。5小時後，認為反應完全，將反應混 合物加熱到溫度大約為-15°C到-20°C之間。向反應中加入2M鹽酸(11. 80升)同時將反應 溫度維持在大約-15°C到0°C之間。在18°C到23°C條件下攪拌反應混合物(16小時)，分離 各相。用6M氫氧化鈉(6.0升)提取有機相。在反應器中混合酸性和鹼性的水相，加入6M 的鹽酸(2. 5升)直到pH值達到7. 5。然後向水相中加入氯化納(6.0千克)。ffl THF(3x20 升)提取水相。用硫酸鎂乾燥結合的有機相併濃縮產生1300克黃褐色固體(81%粗產率)。
4- (2- (4- (6-氟代吡啶-3-基)苯氧基)乙基)嗎啉(化合物5)的製備向72升裝配有回流冷凝器、噴射管、鼓泡器和測溫傳感器的反應器中裝入6-氟代 吡啶-3-基硼酸(2. 84千克、1.24當量)、4_ (2-(4-溴代苯氧基)乙基)嗎啉(4. 27千克， 1.0當量)和二甲醚(DME) (27升)。開始攪拌並且向反應混合物中加入碳酸鈉(4. 74千克， 3.0當量)在去離子水(17. 1升)中的溶液。向反應混合物中通入氬氣鼓泡50分鐘。在氬 氣環境下，向反應混合物中加入四(三苯基膦)合鈀(750克，0.04當量)在二甲醚(DME) (1.0升)中的料漿。將反應混合物加熱到75°C-85°C並且攪拌過夜(17小時)。冷卻反應 混合物使溫度在18°C -22°C之間。向反應器中加入去離子水(26. 681千克)和甲基叔丁基 醚(26. 681升)病攪拌5分鐘。分離各個相，並且用甲基叔丁基醚(2x26. 7升)提取水相。 用2M鹽酸(1x15.0升，3x21.8升)提取結合的有機相。然後將水相倒回反應器中並加入乙 酸乙酯(26. 7升)。使用6M的氫氧化鈉(26. 7升)將pH值調節到6. 2，同時將溫度維持在 15-25°C之間。分離各個相，用乙酸乙酯(2x26. 7升)提取水相。用硫酸鎂乾燥結合的有機 相併且濃縮產生4555克殘餘物(101%粗產率，通過高效液相色譜測定AUC為67. )。4- (2- (4- (6-氟代吡啶_3_基)苯氧基)乙基)嗎啉(化合物5)的製備使用矽膠色譜分析法純化粗產品(575克)，使用甲醇/乙酸乙酯/正庚烷(先後使 用30%乙酸乙酯/正庚烷，50%乙酸乙酯/正庚烷、75%乙酸乙酯/正庚烷、100%乙酸乙酯 和5%甲醇/乙酸乙酯)洗提。通過薄層色譜法(TLC，10%甲醇/ 二氯甲烷，Rf = 0.3)得 到的純餾分進行濃縮，得到420克淡褐色的固體(73%回收率，通過高效液相色譜測定AUC > 99. 9% )。2-(5-(4-(2-嗎啉代乙氧基)苯基)吡啶_2_基)氰化甲烷(化合物6)的製備向5升的燒瓶中加入IM六甲基二矽基胺基鈉(NaHMDS) (2.0升，5.0當量)在四氫 呋喃中的溶液，並將溫度冷卻到-20°C到-15°C之間。當溫度維持在-10°C範圍內時，在20 分鐘的時間內向燒瓶中裝入氟化物(119. 7g，1.0當量)在四氫呋喃(500毫升)中的溶液。 在20分鐘內向燒瓶中加入氰化甲烷(82. 5毫升，4.0當量)在四氫呋喃(170毫升)中的溶 液，同時維持溫度低於-10°C。隨後攪拌反應混合物一小時。向反應中按照一定速率加入鹽 水(1.5升，12. 6vol.)，同時維持溫度低於10°C。然後加熱溶液至室溫，分離各個相。使用
52硅藻土過濾混合物並用四氫呋喃(先後用1x200毫升，1x100毫升)洗滌。用甲苯(750毫 升)提取水相。用硫酸鎂乾燥結合的有機相，過濾並用甲苯(2x250毫升)洗滌，並濃縮至幹 燥。向反應物中加入甲苯(1升)並將反應物濃縮至再次乾燥，產生169. 8克的油狀物。在 50°C下向油狀物中加入甲基叔丁基醚(1190毫升，7vol.)，攪拌15分鐘。在50°C條件下，10 分鐘內加入正庚烷(850毫升，5vol.)。然後在1. 5小時內將反應混合物冷卻至室溫並攪拌 2小時。過濾所得料漿，用1 4的MBTE/正庚烷(2x100毫升)洗滌，在烘箱中45°C條件 下乾燥過夜，從而產生102. 3克的灰白色固體(80%粗產率，通過高效液相色譜測定AUC為 98. 8% )。甲基2-(5-(4-(2_嗎啉代乙氧基)苯基)吡啶_2_基)醋酸鹽(化合物7)的制 備將腈類6 (101克)和甲醇(1.01升，10vol.)裝入3升的燒瓶中，該燒瓶裝備有攪 拌棒和溫差電偶式測溫儀。在15分鐘內，向溶液中逐滴加入濃縮的硫酸(175毫升，10.0當 量)，同時維持溫度低於60°C。隨後向溶液中逐滴加入30%的發煙硫酸(124毫升)同時維 持溶液溫度低於60°C。然後使用加熱罩加熱回流所述溶液並攪拌過夜。當認為反應完全 時，將溫度冷卻到20°C。向另一個燒瓶(22升)中加入飽和碳酸氫鈉(10. 7升)和二氯甲 烷(1. 1升)，將溫度冷卻到15°C。同時維持溫度小於20°C，將反應混合物添加到所述碳酸 氫鈉/ 二氯甲烷混合物中，攪拌15分鐘淬火併分離各個相。用二氯甲烷(1x550毫升，1x300 毫升)提取水相。用硫酸鎂乾燥結合的有機相併濃縮至乾燥，產生105克橙黃色固體(94% 粗產率，通過高效液相色譜測定為AUC為97. 7% )。2-(5-(4-(2-嗎啉代乙氧基)苯基)吡啶_2_基)_N_苯甲基乙醯胺(化合物(I)) 的製備將酯類化合物7(103克)、甲氧基苯(513毫升，5vol.)和苯甲胺(94毫升，3.0當 量)裝入3升的燒瓶中，該燒瓶裝備有溫差電偶式測溫儀和高架攪拌棒。將反應混合物加 熱到142°C並攪拌2天。將反應混合物冷卻到45-50°C並繼續攪拌兩個小時。在一個小時 內，向反應混合物中逐滴加入正庚烷(1. 5升)，然後在三個小時內將反應混合物溶液冷卻 到室溫，在攪拌過夜。過濾所得漿液，先後用4 1的甲氧基苯/正庚烷(200毫升)和正 庚烷(3x100毫升)洗滌。在烘箱內乾燥整夜，得到112. 1克黃褐色固體狀的產物(90%產 率，通過高效液相色譜法測定AUC為99. 6% )。單一正庚烷異構體的使用對充分測定殘餘 溶劑是必不可少的。參加圖5所述的化合物(I)的1H NMR。2-(5-(4-(2-嗎啉代乙氧基)苯基)吡啶-2-基)-N-苯甲基乙醯胺二鹽酸鹽(化 合物(I) 二鹽酸鹽)的製備向2升燒瓶中加入乙醇(1.0升)，並向該燒瓶中緩慢的加入乙醯氯(62. 5毫升， 3.0當量)並攪拌40分鐘。在30分鐘內向所得溶液中加入化合物(I) (100克)，同時維持 溫度為30V。將所得溶液的質量濃縮到270克。向濃縮後的溶液中在20分鐘內加入乙酸 乙酯(2升)同時進行劇烈的攪拌。將反應混合物攪拌過夜然後在氮氣條件下過濾從而產 生2種不同的固體產物，分別是黃褐色的固體(73. 5克)和黑色的固體克)。混合乾燥的固 體，產生的結合產率為99.9%。通過高效液體色譜分析表明純度(AUC)為99.0%。分析表明乙醇以2530ppm的濃度存在、乙酸乙酯以48，IlOppm的濃度存在、乙基氯 以170ppm的濃度存在、並且沒有檢測到正庚烷和甲氧基苯的存在。檢測鈀含量三次，測定值分別為29ppm、2ppm和小於lppm。化合物(I) 二鹽酸鹽的結晶作用研究下表中顯示的試驗旨在研究化合物(I) 二鹽酸鹽不同的結晶作用和沉澱狀況。化合物(I) 二鹽酸鹽的結晶作用研究
鹽形成的條件結晶條件概述Expt醯胺 (克)Lot (類別)溶劑酸溶劑 (體 積)Lot (類 別)乙酸 乙酯 (體 積)溫度 (Γ )精細 的固 體 (y/n )02BP097 A0.102BP090D (灰白色)異丙 醇異丙醇- 鹽酸 (SM)異丙 醇 (10)1060N力口入乙酸 乙酯後形 成粘性固 體/漿液02BP097 B0.102BP091E (白色)異丙 醇異丙醇- 鹽酸 (5M)並丙 醇 (10)60N膠體析出 W/冷卻02BP097 C0.102BP091E (白色)異丙 醇異丙醇- 鹽酸 (5M)異丙 醇 (15)665N首先乾燥 W/乙酸乙 醋；產物發 生油性析 出W/冷卻02BP097 D0.102BP091E (白色)異兩醇- 鹽酸 (5M)乙酸 C. Si/ 異丙 醇60N異丙醇-鹽 酸加入■醯 胺溶液中； 在加入過 程中有膠 體析出(兩 滴)02BP097 E0.302BP090D (灰白色)乙醇異丙醇· 鹽酸 (5M)乙醇 (3.3)Acros30-60Y加入乙酸 乙酯後在 30 'C時觀 察到固體； 緩慢攪拌02BP097 F0.302BP093G (棕褐色固 體)乙醇異丙醇- 鹽酸 (5M)乙醇 (3.3)Acros60Y加入乙酸 乙酯後在 冷卻過程 中觀察到 固體；緩慢 攪拌
通過向大量的快速攪拌的乙酸乙酯中反向加入化合物(I) 二鹽酸鹽在乙醇中的 濃縮溶液，可以實現沉澱作用。對示範批次進行沉澱過程，產生兩種不同的固體類型。使用 物理方法分離這兩種不同的固體類型並分別過濾。首先過濾出一種低密度的黃褐色固體 (編號02BP11IE，74克，通過高效液相色譜法測定AUC為99. 1 % )，隨後過濾出一種深黑色 的固體(編號02BP11IF，43克，通過高效液相色譜法測定AUC為99. 1%99. 1%)。在真空 烘箱中進行再次乾燥，乾燥之後，在混合之前，將兩種固體中的每一種都取出一些樣品用於 分析。當差示掃描量熱法(DSC)和X射線粉末衍射法(XRPD)的數據不同時，比較這兩種樣 品的高效液體色譜數據。使用高效液體色譜製備純度大於99. 0% (面積％ )的產品。編號02BP11IE樣品在大約198°C下顯示單一的吸熱反應，而編號02BP11IF樣品在117°C和189°C條件下顯示兩 個吸熱反應。兩個樣品的X射線粉末衍射法(XRPD)數據也是不同的，編號02BP11IE樣品 觀察到結晶，而編號02BP11IF樣品好像是無固定形態的。從高效液體色譜數據、X射線粉 末衍射法(XRPD)數據和差示掃描量熱法(DSC)數據都可以證明這兩種樣品是相同材料的 不同形式。乾燥兩個編號的化合物(I) 二鹽酸鹽(編號02BP11IE和編號02BP11IF)，並混合， 從而得到一種新的化合物(I) 二鹽酸鹽編號(編號02BP11IG)。化合物(I) 二鹽酸鹽編號 (編號02BP11IG)包括170ppm的乙基氯。實施例4 2~ (5- (4- (2~嗎啉代乙氧基)苯基)吡啶_2_基)苯甲基乙醯胺甲 磺醯基鹽(化合物(I)MSA)2-(5-(4-(2-嗎啉代乙氧基)苯基)吡啶_2_基)氰化甲烷(化合物6)的製備在52分鐘內向圓底反應器1中加入六甲基二矽基胺基鈉(NaHMDS) (1. OM在四氫 呋喃中的溶液，23.2升)並將溫度冷卻到-10°C以下。在氮氣條件下，向箱護玻璃瓶中加入 化合物5 (1400克，1個重量)和四氫呋喃(7.0升，無水，5體積)。在氮氣條件下，用氣動攪 拌棒攪拌該批次的反應。該批次不是完全可溶的，形成一種渾濁溶液。在41分鐘內，通過 一種5升添加漏鬥向反應器1中加入化合物5的溶液。製備氰化甲烷(965毫升，無水的， 0.69體積)在四氫呋喃(2.0升，無水的，1.43體積)中的溶液，並且在10°C以下在48分鐘 內使用同一個添加漏鬥將此溶液添加到反應器1中(在反應器壁還有少量的黃色固體)。 在-10°C以下老化混合物45分鐘，將該批次作為樣品進行分析，化合物5轉化了 0. 03% (轉化規格小於1. 5% )。在製成樣品1小時24分鐘之後，在52分鐘的時間內向反應器1 中加入鹽水(17. 6升，12. 6vol)，從而產生一種緩慢攪拌的批次(類似一種乳狀液)。在一 種24-英寸的聚丙烯漏鬥上製備硅藻土濾墊(1026克硅藻土 545在3. 3升水中製漿，丟棄 濾液)。使用抽水泵使用濾墊對該批次混合物過濾，用四氫呋喃(1.75升，1.25vol)洗滌反 應器並，將洗滌液加入到濾餅中。將濾餅用另外一份四氫呋喃(1.75升，1.25vol)洗滌，總 過濾時間為1小時17分鐘。將濾液轉移到反應器2中，並分離各個相，靜置整夜(在氮氣 條件下，將批次反應物存儲在反應器中)。排乾有機相(大約34. 5升)並用甲苯(8.1升， 5. 8vol)提取水相，攪拌16分鐘並沉澱12分鐘。也可以省略甲苯提取步驟，只是簡單的在 分離之後直接將甲苯加入到有機相中。去掉所得水相(大約19升)，然後結合有機相併用 硫酸鎂(1400克，1個重量，無水的)在反應器2中乾燥有機相55分鐘。使用24英寸的聚 丙烯漏鬥過濾批次混合物，將混合物過濾到箱護玻璃瓶中，所述24英寸的聚丙烯漏鬥裝備 有一種串聯過濾器，將批次混合物中衝入氬氣並將其保存在低溫空間(2-8°C)中，濃度待 定。在隨後的幾天中，濃縮反應批次，得到一種殘餘物，並用甲苯(11.8升，8. 4vol)，隨後繼 續濃縮(水浴50士5°C)。在接近添加甲苯的時候，批次混合物是一種橙黃色漿狀物，並在 之後的濃縮過程中一直保持這種狀態。總濃縮時間是5小時3分鐘。向反應器3中裝入甲基叔丁基醚(13. 9升，9. 9體積，ACS)，然後加熱到45士5°C。 排乾所述甲基叔丁基醚並使用大約2升的甲基叔丁基醚製漿，將批次反應物從燒瓶中導入 反應器3中。向反應器3中加入剩餘的甲基叔丁基醚，並將批次溫度維持在45士5°C範圍 內，然後在此溫度範圍內靜置反應批次混合物33分鐘。然後在39分鐘內向反應器3中加 入正庚烷(10升，7. 1體積，99%)，並維持批次溫度在45士5°C範圍內。切斷熱源，並且在4
56小時5分鐘內將批次反應物冷卻到25士5°C，並在此溫度範圍內靜置批次混合物27小時4 分鐘。然後，使用抽水泵通過24-英寸聚丙烯漏鬥(聚四氟乙烯(PTFE)包衣)過濾批次反 應物，在氮氣條件下掩護並吸乾。總過濾時間是20分鐘。在真空烘箱中，設定45士5°C，幹 燥橙黃色批次(淨溼重1322克)48小時3分鐘至恆重。將批次混合物轉移到2個80盎司 的褐色玻璃振擊器(聚四氟乙烯線密封)並通入氬氣(1217克的化合物6，理論值81%)。甲基2-(5-(4-(2_嗎啉代乙氧基)苯基)吡啶_2_基)醋酸鹽(化合物7)的制 備向22升的反應器中裝入化合物6 (900克，2. 78摩爾)和甲醇(9. 0升，10體積，無 水的)。在2小時11分鐘內向懸浮液中加入硫酸(1115毫升，發煙的)，從而產生一種黑色 的溶液。最高溫度是65. 5°C (目標是大約65°C )。在1小時49分鐘內加入硫酸(1565毫 升，1. 74體積，濃縮的)，然後加熱批次混合物直到出現明顯的回流(74°C )，加熱持續18分 鍾，將反應批次維持在這種溫度在16小時57分鐘。記錄明顯的適度回流直到回流停止，然 後再次加熱批次混合物在79-80°C條件下回流2小時15分鐘。將批次混合物維持在該溫度 (80士5°C )條件下10小時57分鐘然後終端熱源；在26小時4分鐘之後再次進行甲醇的加 入(0.75升，0.8體積，無水的)，從而補充損失的溶劑體積。據估計，在蒸發過程中大約損 失了 2. 5升-3. 3升的溶劑。在42小時31分鐘回流反應之後，進行高效液相色譜分析，分 析結果表明化合物6的轉化水平是0.6% (規格小於1.0%)。向反應器1和反應器2中 分別加入亞甲基氯(4. 8升，5. 3vol)和碳酸氫鈉溶液(48升，53. 3vol，飽和的)。在2-8°C 條件下儲存碳酸氫鈉溶液整夜，然後在第二天早上去掉碳酸氫鈉溶液。在47分鐘內分部分 向反應器1中加入22升反應器中批次混合物中的一半(批次溫度分別是12-13°C )，在44 分鐘內分部分向反應器2中加入22升反應器中批次混合物中的另一半(批次溫度分別是 14-15°C)。在伴隨有二氧化碳(漩渦式強力通入)的情況下進行淬火。從每個反應器中 將批次混合物轉移到200升的反應器中，攪拌批次混合物16分鐘，然後沉降25分鐘，分離 有機相。連續使用兩部分甲基氯化物(5升，5. 6體積和2. 7升，3體積)提取水相，每個提 取過程在15分鐘內發生，同時攪拌，分別沉降6分鐘和9分鐘。將結合的有機相轉移到反 應器3中，用硫酸鎂(900克，lwt，無水的)乾燥35分鐘。使用抽水泵通過裝備有雪克斯金 細呢並裝備有串聯過濾器(10微米，Pall ρ/Ν 12077)的24英寸聚丙烯漏鬥過濾所述批次 反應物。在旋轉蒸發器上，2小時18分鐘的時間內，在40士5°C (水浴溫度)條件下濃縮濾 液。在54分鐘之後，固化批次混合物並形成小球。將這些溶解並繼續濃縮。所述批次反應 物(細微固體物和脆塊狀物的混合物)進行進一步的研磨，將其放回燒瓶中繼續濃縮。將批 次混合物轉移到一種80盎司的褐色玻璃振擊器中並通入氬氣從而產生一種化合物7(871 克，理論值88% )，所述80盎司的褐色玻璃振擊器帶有聚四氟乙烯線密封。2-(5-(4-(2-嗎啉代乙氧基)苯基)吡啶_2_基)_N_苯甲基乙醯胺(化合物⑴) 的製備向22升反應器中加入化合物7 (650克，1.82摩爾)、甲氧基苯(3. 25升，5體積， 無水的)和苯甲胺(600毫升，0. 92體積，3equiv)。在1小時44分鐘的時間內，將該批次 (大約18°C)加熱到142士5°C，在30°C時出現溶解現象。將該批次維持在142士5°C條件 下69小時30分鐘，此時，進行高效液相色譜分析顯示化合物7轉化了 0. 9% (轉化規格 < 1. 7 % )。在5小時12分鐘的時間內將該批次冷卻到45-50 °C (為了實現冷卻的目的，一旦批次溫度達到大約72°C，就向該批次中通入氮氣流)。在此溫度範圍內，緩慢的攪拌批次 混合物進行混合，在混合同時緩慢的增加批次反應物溫度至52°C。在小於15分鐘的時間內 就可以使溫度升高到50°C以上。將批次反應物老化2小時2分鐘，一旦溫度低於50°C，就 在1小時56分鐘的時間內向批次反應物中加入正庚烷(9. 75升，15體積，99% )，維持批次 溫度在45-50°C範圍內。然後停止加熱，在10小時32分鐘的時間內將批次反應物冷卻到 25°C，在大約20分鐘的時間內將溫度冷卻到大約20°C。該批次反應溫度維持在25°C以下 的總時間大約是4小時50分(其中右2小時47分鐘該批次反應的溫度維大約20°C )。使 用抽水泵通過24英寸聚丙烯過濾漏鬥(裝有聚四氟乙烯(PTFE)包衣)過濾批次混合物， 用甲氧基苯/正庚烷(1.3升，4 1)洗滌反應器然後將洗滌液倒入濾餅中。然後，連續用 兩部分正庚烷(分別是1. 3升，0. 65升)洗滌濾餅。總過濾時間是39分鐘。將批次反應物 (淨溼重為1004克的化合物(I))轉入三個玻璃託盤中，然後放置於真空烘箱內，設置溫度 50°C進行乾燥，直至在96小時26分鐘之後乾燥至恆重。2-(5-(4-(2-嗎啉代乙氧基)苯基)吡啶_2_基)_N_苯甲基乙醯胺甲磺醯基鹽 (化合物(I)-MSA)的製備將化合物(I) (520克，1.21摩爾)轉移到反應器1中，使用丙酮(41. 6vol,80vol, ACS)加速轉移。在33分鐘內將該批次加熱到50士5°C，在溫度達到30°C時出現溶解。使用 安裝有串聯過濾器(Pall P/N12077，10微米)的轉移泵將該批次反應物轉移到另一個反應 器中，然後重新加熱，使溫度從46°C升高到50士5°C。在12分鐘內，將甲基硫酸(121. 4克， 1.05當量，99%，超純)加入到淡黃色的批次反應物中，並停止加熱。在經過十四分鐘之後， 可以觀測到白色的固體，白色固體的數量逐漸增加，在59分鐘之後會產生一種白色的懸浮 物。經過7小時51分之之後，該批次反應物的溫度在25士5°C範圍內，將其進一步老化19 小時21分鐘(其中有10小時30分鐘的時間內溫度小於27°C )。使用抽水泵通過24英寸 聚丙烯過濾漏鬥(裝有聚四氟乙烯(PTFE)包衣)過濾批次混合物，用丙酮(2.0升，澄清 的，ACS)洗滌反應器然後將洗滌液倒入濾餅中。用不鏽鋼蓋將濾餅蓋住並通過氮氣流將濾 餅吸乾。總過濾時間為21分鐘。將批次反應物(淨溼重為7644克)轉入三個玻璃乾燥託 盤中，然後放置於真空烘箱內，設置溫度25士5°C進行乾燥，乾燥時間為21小時54分鐘。然 後將批次混合物轉移到兩個80oz的棕色玻璃瓶中(用聚四氟乙烯連接的聚丙烯密封)，通 入氬氣並在-10°C到-20°C條件下儲藏。實施例5 對上升的單一劑量(RSD)和上升的多倍劑量(RMD)的劑量確定研究根據在狗和老鼠體內進行的28天毒性研究結果選擇起始劑量。在這些研究中， 發現狗是更為敏感的物種。通過口服飼料給藥法確定的最小毒性水平是0. 5毫克/千克/ 劑量。在這一水平上，沒有觀察到任何臨床徵象、在體重方面的變化或者任意肉眼可見的變 化。唯一被認為可能與實驗物品有關的變化是丙氨酸氨基轉移酶最低限度到中等程度的增 加。在給藥劑量達到0. 5毫克/千克/劑量時，可以在動物體內發現很多微小的變化，但是 與大劑量研究組相比，這一劑量造成的嚴重性較小並且感染較少的動物，並且不與任何臨 床徵象相關。根據美國食品與藥物管理局的指南，起始劑量被計算做對10%的齧齒動物產 生嚴重毒性的每平方米劑量的十分之一(STDlO)，也就是說，2毫克。為了確定單一劑量的化合物(I)的口服藥代動力學，對上升的單一劑量(RSD)部 分選擇三個劑量水平，並且支持或者精製上升的多倍劑量(RMD)部分研究的劑量表。對於上升的單一劑量(RSD)部分研究選擇的化合物(I)的劑量水平為2毫克、5毫克和10毫克 (等量的游離鹼)，作為一種口服溶液給藥。選擇上升的多倍劑量(RMD)部份的劑量水平從而高效並且慎重的達到化合物(I) 的最大耐藥劑量。在預計更高劑量水平的毒性時，在劑量水平達到80毫克之後，逐步提高 劑量，每次增加40毫克。每天對狗進行2次口服給藥，可以觀察到半衰期的範圍為5-8小 時。對於上升的多倍劑量(RMD)研究部分，根據安全性和可耐受性考慮，所選擇的化合物 (I)的劑量水平是2毫克、5毫克、10毫克、20毫克、40毫克、80毫克、120毫克、160毫克或 者更高(增量為40毫克)，作為口服溶液給藥，每日給藥兩次。根據化合物(I)單一劑量的 藥代動力學和安全性考慮，劑量和給藥的頻率都可以是變化的。實施例6 :卜.升的單一劑量(RSD)和卜.升的多倍劑量(RMD)研究為了確定化合物(I)的單一劑量的藥代動力學(PK)，進行單一劑量增加的上升的 單一劑量(RSD)研究。連續的3位病人參加劑量逐步增加的研究組。每個病人承受單一口 服劑量的化合物(I)溶液，化合物(I)劑量分別為2毫克、5毫克或者10毫克(在給藥之前 和給藥之後要求至少2個小時的禁食)，然後觀察病人7天。如果沒有產生毒性(如下面所 定義的)，在上升的多倍劑量(RMD)研究部分，繼續對該病人給藥化合物(I)，每天定時給藥 2次，給藥2個訓環。當作為多倍口服溶液對患有多重惡性腫瘤的病人給藥時，為了確定化合物(I)的 最大耐藥劑量，進行多倍劑量增加的上升的多倍劑量(RMD)研究。上升的多倍劑量(RMD) 研究部分按照如下方式進行第一循環向3個病人給藥口服溶液狀的化合物⑴，給藥劑量為2毫克、10毫克、20毫克、40 毫克、80毫克、120毫克、160毫克或者更高(增量為40毫克)，每日給藥兩次(間隔大約10 小時，在給藥之前和給藥之後需要至少兩個小時的禁食)，給藥21天，為了延長進樣的藥代 動力學，在第22天，對病人給藥額外的劑量(AM)。第22天的給藥只發生在第一個循環，隨 後所有的循環都只有21天的給藥。根據並發的藥代動力學(PK)表現和安全性考慮，可以改變給藥時間表。如果被研究的人群在研究的第一部分或者第二部分發現明顯的二級臨床毒性 (如下面的定義)，除非有其他證據清楚的顯示這是疾病發展的結果，否則減少劑量增加的 程度。對下個給藥群體的劑量增量減少。如果三位病人中的一位發展出劑量限制性毒性(DLT，如下面的定義)，則需要將 被研究的群體從三人增加到六人。如果六位病人中只有一位，或者沒有人顯示劑量限制性 毒性(DLT)，則將劑量增加到下一個水平(參見第6. 3. 1節)。如果三位病人或者六位病人 中有兩位或者兩位以上的病人顯示劑量限制性毒性(DLT)，則需要停止在此劑量水平下的 治療。對另外三位病人給藥減少的劑量，每日給藥兩次。持續該過程直到MTD被確定。MTD 的定義是僅僅使六位中不超過一位病人發展出劑量限制性毒性(DLT)的最高劑量。對另外 十位病人在MTD劑量條件下給藥，從而更好的定義化合物(I)安全的藥代動力學和生物效 應。如果產生劑量限制性毒性(DLT)的病人數目大約33%，則立即停止該劑量條件下的給 藥。僅次於該水平的劑量被認為是MTD，並且對額外的10位病人在該水平下進行試驗。第二循環
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當一個研究群中的病人完成第一循環的排出時期且不產生劑量限制性毒性(DLT) 時，對其進行為期21天的第二循環和7天的排出時間。在給藥兩個循環之後，對可以忍受 化合物(I)並且疾病發展受到抑制的病人給藥額外的化合物(I)循環(21天給藥時間和7 天排出時間)。毒性的定義是一種副作用，這種副作用的起因可能、大概或者明確與調查性治療有關。在第一治療循環過程中評價劑量限制性毒性(DLT)並且做出如下定義 美國國立癌症研究組織制定的不良反應評價標準NCI-CTCAE3. 0版本定義的三 級以上非血液型毒性。只有在有足夠支持性護理條件下，噁心、嘔吐、腹瀉和電解質不平衡 情況大於三級，才會被認為是劑量限制性毒性(DLT)； 持續5天以上的4級嗜中性白細胞減少症； 發熱性的嗜中性白細胞減少症(定義為絕對嗜中性白細胞數量[ANC] < 1.0xl09/L並且發燒大於38.5°C)或者經過證明的3級以上感染並且絕對嗜中性白細胞 數量(ANC) 1. 5x109/升、血小板計數(PLT) > 100x109/升或者血紅蛋白(Hgb) > 10克/升)7.通過血清膽紅素、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸轉氨基酶(AST)和鹼性磷 酸酯酶(ALP) < 2. 5x正常值上限(ULN)顯示足夠的肝功能8.足夠的腎臟功能(血清肌氨酸酐 60毫升/分)9.對同意進行腫瘤活組織檢查的病人來講，在研究進行前1星期中，具有正常的 凝結曲線(PT/INR和aPTT值在制度規定的正常範圍內)。10.在篩選過程中，對於女性病人來講妊娠檢查試驗應呈陰性，優選在第一天給藥 之前一周之內進行妊娠檢查試驗(對進行過雙邊卵巢切除術和/或子宮切除的病人不適用 此條)11.在對病人進行第一天給藥之前28天時間內和最後一此給藥之後六個月內，自 願避免性活動或者進行物理障礙避孕法12.對於其他的10位將要進行MTD給藥的病人和患有易取得的腫瘤的病人需要手 寫籤字的腫瘤活組織檢查書面知情同意書。如果參加研究的病人出現以下情況，則不能再繼續參加本研究1.經過上述抗癌治療或者由於被研究的試劑產生大約一級嚴重性的不能解決的
毒性2.在第一次給藥之前14天之內接受了或者接受過被研究試劑或者全身性抗癌試 劑，或者如果被研究試劑的消除半衰期未知或者半衰期大約50小時的話，在第一次給藥之 前28天之內接受了這種試劑3.在開始研究給藥4星期內接受了大範圍的放射療法，包括胸骨、骨盆、肩胛骨、 脊椎骨或者顱骨，或者在開始進行研究給藥之前一周內接受了限於四肢的低劑量的緩和性 放射療法，或者還未從這種療法的副作用中恢復4.正在服用激素(即，雌性激素類避孕藥、激素代替物、抗雌性激素)、抗血小板試 劑或者抗凝結劑，例如下丙酮香豆素鈉的病人，除了為了進行靜脈內插管而服用預防性劑 量的抗凝劑的病人5.在第一天給藥之前2周或者5個半衰期內，或者在研究期間使用細胞色素P450 3A4酶的烈性抑制劑或者誘導物6.懷孕或者人工哺乳7.在第一次給藥前4周時間內進行大手術 8.進行過上胃腸道的大手術或者患有炎症性腸病、吸收不良症候群或者其他可能 影響口服吸收的醫學狀況9.出現末端器官失調、除了癌症之外的主要慢性疾病或者其他嚴重的伴隨病況的 病症或者症狀，研究員認為不適合於繼續參加本研究或者會對本研究方案造成破壞10.患有心絞痛、冠狀動脈病或者腦血管意外、短暫性缺血性發作或者需要進行治
61療的心律不齊11.有證據證明患有B型肝炎或者C型肝炎、人類免疫機能缺陷性(愛滋病病毒) 傳染病、凝固障礙、或者溶血性疾病，例如，鐮刀形紅細胞貧血病研究過稈在對病人進行定期回訪的時候進行如下操作。知情同意書和完整病歷在篩選過程中收取知情同意書和完整的病歷卜遍I一摧(RSD)■雲力褲(PK) _在第一天0小時(給藥之前)、和給藥後第1、2、3、4、6、9、11、24小時(第2天)、 第48小時(第3天)、第96小時(第5天)和第168小時(第8天)收集血液進行藥代動 力學分析。在第一天的0小時(給藥之前)>0-6小時、6-12小時、12-24小時和24-28小時 收集尿液進行藥代動力學分析(5個樣品)。按照如下的方法收集並製備血漿樣品從留置導管中吸取血液樣品(大約2. 0毫 升)，或者通過Vacutainer收集管進行靜脈穿刺收集血液樣品(大約2. 0毫升)，其中使用 乙二胺四乙酸鉀(K3)(度量-3毫升)作為抗凝血劑，在進行離心作用之前保持在冰中。在 收集之後30分鐘內對樣品離心(在4°C下以2，000轉/分的速度離心10分鐘)。使用聚 丙烯移液吸管立即吸取血漿，並在預先標記的聚丙烯傳輸管中將所得血漿分成兩個體積相 等的部分(大約400微升)。將所得血漿樣品密封並立即放入冰箱中在-70°C下保存。按照如下的方法收集並製備尿液樣品按照固定的時間間隔將尿液收集在尿液袋 中。在大約4°C條件下儲存尿液袋(冷凍或者在冰上放置)，知道完成收集過程。在收集 之後，通過搖晃將每種尿液樣品混合均勻。在每個收集時間間隔的末端，測定體積並記錄 在CRF中。為了進行尿液分析，通過移液吸管收集大約2毫升等份的尿液並通過量尺測量。 為了進行藥代動力學(PK)測量，從每個收集液中收集大約5毫升的尿液，將其分別轉移到 兩個預先標記號的聚丙烯輸送管中。將所得尿液樣品蓋嚴並立即放置在冰箱上，溫度維持 在-70 0C ο上升的多倍劑量(RMD)藥代動力學取樣在以下時間點收集血液樣品(如上所述)進行藥代動力學分析在第一階段(對給藥量為2毫克、5毫克、10毫克的病人取樣20次；對給藥量在10 毫克之上的病人取樣25次)在第一天的0小時(在第一次AM給藥之前)並在第1小時、2 小時、3小時、4小時、6小時、10小時(在PM給藥之前)、11小時(PM給藥1小時之後)；第 2天0小時(AM給藥之前)、1小時之後；第3天0小時(AM給藥之前)、給藥1小時之後；第 8天0小時(AM給藥之前)、給藥1小時之後；第15天0小時(AM給藥之前)、給藥1小時 之後；第22天0小時(AM給藥之前，即，最後一次給藥)、給藥1小時之後；以及第1小時、2 小時、3小時、4小時、6小時、9小時、11小時、12小時(第23天)和第48小時(第24天)。進行上升的單一劑量(RSD)研究的頭三組病人(即接受2毫克、5毫克或者10毫 克給藥的病人)在第一天進行如下的藥代動力學(PK)取樣第一天第0小時(AM給藥之 前)、第11小時(PM給藥1小時之後)。第二循環(5個樣品)在第29天第0小時(AM給藥之前)；在第36天第0小時 (AM給藥之前)；在第43天第0小時(AM給藥之前)；在第50天；和第57天。對於能夠忍受進一步劑量給藥並且疾病不會進一步發展的病人，以及在頭兩個循環之後選擇進行繼續 給藥循環的病人在隨後每個循環開始給藥前和給藥結束後(最後一個給藥2小時之後)進 行藥代動力學(PK)取樣。輪紐(卜遍I一摧(RSD)禾口卜遍雜摧(RMD))在下列時間內測定脈搏率、心臟收縮和舒張時的血液壓力、呼吸和體溫篩選的時 候、上升的單一劑量(RSD)和上升的多倍劑量(RMD)在第一天的0小時(在第一次AM給 藥之前)、給藥後第2小時和第8小時；在每個臨床訪問中。在安靜狀態下(靜坐至少5分鐘)獲得病人的脈搏率，脈衝計數30秒，乘以2從 而記錄每分鐘的心跳次數。使用血壓計在安靜狀態下(垂直靜坐至少5分鐘)獲得病人的 測定心臟收縮和舒張時的血液壓力，每次測定都使用同樣的胳膊。以毫米汞柱(mmHg)為單 位記錄血壓。在安靜狀態下(垂直靜坐至少5分鐘)獲得病人的呼吸，在30秒的時間內計 算呼吸次數，乘以2從而記錄每分鐘的呼吸次數。使用口部或者耳部溫度計在安靜狀態下 (垂直靜坐至少5分鐘)獲得病人的體溫。體重和身高在以下時間測量病人的體重和身高，體重以千克為單位、身高以英寸為單位篩選 時；上升的多倍劑量(RMD)第1天、第22天、第29天、第50天和第57天。對安全件講行實驗室評價在以下時間收集血液進行血液學、血清化學作用和尿分析篩選時；上升的單一 劑量(RSD)第2天、第3天和第8天；上升的多倍劑量(RMD)第2天、第3天、第8天、第 15天、第22天、第29天、第36天、第43天、第50天和第57天。在頭兩個周期之後，對其他 循環上的病人在隨後每個循環的開始給藥之前和給藥完成之後進行安全性實驗室評價。在 研究開始之前一周之內對進行腫瘤活組織檢查的病人進行PTANR和aPTT血液檢查。物理檢杳在以下時間進行完全的身體檢查篩選時。在以下時間進行一部分身體檢查從而 更新身體所產生的變化上升的單一劑量(RSD)研究期間第一天和第八天；上升的多倍劑 量(RMD)研究期間第1天、第22條、第29條、第50條和第57條。心電圖(ECG)檢驗在以下時間進行12導聯心電圖和long Lead II檢查篩選時；上升的單一劑量 (RSD)研究期間第1天給藥後第1小時和第4小時和第8天；上升的多倍劑量(RMD)研究 期間第1天在給藥後第1小時和第4小時，和第8天、第22天、第50天和第57天。經歷 過上升的單一劑量(RSD)的頭三組病人(即給藥2毫克、5毫克或10毫克的病人)只在上 升的多倍劑量(RMD)研究部分的第8天、第22天、第50天和第57天進行心電圖(ECG)檢 查。妊娠診斷試驗在篩選過程中，從女性病人體內收集血液進行血清妊娠診斷試驗，優選在給藥第 一天之前一周之內進行(對進行過雙邊卵巢切除術和/或子宮切除的病人不適用此條)。副作用在整個研究過程中檢測副作用。在每次訪問時，研究員從詢問每個病人是否發生 副作用開始，通常，根據情況適當的進行非直接詢問，例如「從上次訪問以來感覺如何？ 」或者直接詢問並進行檢測。聯合給藥在每次訪問過程中如果同時使用其他任何藥物、處方藥或者成藥，應記錄在案，同 時記錄使用這些藥物的原因。牛物學效應的評價收集血液測定血漿中的血管內皮生長因子(VEGF)；在上升的多倍劑量(RMD)研究 的第1天、第22天和第50天評價外周血液單核細胞(PBMC)中的Src何選擇底物的磷酸化 作用對於符合活組織檢驗標準的病人，在進行第一日給藥之前4周之內進行給藥前的 活組織檢查，並在第20-22天進行給藥後的活組織檢查。在進行活組織檢查的同時，收集血 液測量生物學作用。另外，在第50天收集血液進行生物學作用分析。伴隨療法病人不允許使用任何慢性的能夠作為細胞色素P450 3A4或者凝血作用強烈抑制 劑或者誘導物的伴隨性藥物。例如，在進行第一天給藥之前14天或者5個半衰期(兩者更 久的時間為準)之內以及整個研究過程中，禁止全身使用下列CYP3A4調節劑CYP3 A4誘導劑巴比妥類藥物、醯胺咪嗪、依法韋侖(efavirenz)、腎上腺糖皮質 激素、Modafinil (莫達非尼)、奈韋拉平、苯巴比妥、二苯乙內醯脲、利福平、聖約翰草(St. John』 sWort)、曲格列酮、奧卡西平(oxcarbazepine)、卩比格列酮、利福布汀。CYP3 A4抑制劑乙胺碘呋酮、阿瑞匹坦、氯黴素、甲腈咪胍、克拉黴素、二乙基-二 硫代氨基甲酸鹽、地爾硫卓、紅黴素、麥道氟康(Fluconazole)、氟伏草胺(Fluvoxamine)、 吉士脫酮(Gestodene)、葡萄柚汁、伊馬替尼、伊曲康唑、裡素勞(Ketoconazole)、米非司酮 (Mifepristone)、萘法唑酮、諾氟沙星、諾氟西汀、米貝拉地爾(mibefradil)、楊桃、異搏定、 伏立康唑。少量的使用抗凝結劑從而維持靜脈傷口和導管不出現閉合。禁止同時使用激素 (即，雌性激素類避孕藥、激素代替物、抗雌性激素)(見下文，衝洗時間)。衝洗時間在上升的單一劑量(RSD)研究期間，單一劑量給藥之後至少存在7天的衝洗時間 或者觀察時間。上升的多倍劑量(RMD)部份第一循環之後的衝洗時間是6天。兩個連續的 循環之間所有其他循環的衝洗時間是7天。治療適應性如果發現有病人不經意的加入與本研究方案技術規範嚴重不符的時間，則應立刻 停止對該病人進行本研究。嚴格根據給藥時間表對病人進行評價。病人應根據指導在家完 成研究日程表，從而跟蹤他們的給藥。在每周的定期訪問中，病人應攜帶這份日程表和所有 已經使用的和未被使用的給藥瓶子道臨床地點。在對病人進行新的研究藥物供給之前，臨 床地點工作人員應當檢查這些。每次複診過程中，研究者應該詢問病人是否在上次訪問之 後服用過任何伴隨藥物，確定服用這些藥物是否會對本方案造成侵害，並記錄所得數據和 結論。研究藥物在這些研究中提供作為游離鹼2-(5-(4-(2_嗎啉基乙氧基)苯基)吡啶-2-基)-N-苯甲基-乙醯胺甲磺酸鹽的化合物(I)。以游離鹼在溶液中的重量計算臨床 給藥劑量。化合物(I)的甲磺酸鹽是一種白色結晶性粉末，其化學分子式為C26H29N303. H03SCH3，其分子量為527. 63道爾頓。所述游離鹼的分子量為431. 53道爾頓。一次給每個研究群體給藥化合物(I)的甲磺酸鹽粉末，該粉末存在於單位劑量瓶 中，包括不同劑量的研究藥物，相對應的劑量分別為2毫克、5毫克、10毫克、20毫克、40毫 克、80毫克、120毫克、160毫克或者更高(游離鹼等量)。為了確保安全性進行修飾的劑量 水平也應在單位劑量瓶中製備並轉交給臨床地點。隨著溶解，所得化合物(I)甲磺酸鹽的 溶液時澄清的，並且在單位劑量瓶中對病人給藥，濃度範圍是0. 2到4. 0毫克/毫升(游離 鹼等量)。劑量和劑量方案根據病人所屬的劑量群對病人口服給藥化合物(I)甲磺酸鹽，即，上升的單一劑 量(RSD) 2毫克、5毫克或者10毫克；上升的多倍劑量(RMD) 2毫克、5毫克、10毫克、20 毫克、40毫克、80毫克、120毫克、160毫克(游離鹼等量)、或者更高，增量為40毫克。對 於上升的多倍劑量(RMD)部份，在每個循環中，頭21天的時間裡每日給藥2次化合物(I) (間隔大約10小時，在禁食至少2小時之後給藥，給藥之後再進行2小時的禁食)，隨後經 歷7天的衝洗時間。只有第一循環例外，在第一循環中，在第22天給藥額外的劑量，從而減 輕延長的藥代動力學(PK)取樣。在第一循環，衝洗時間為6天。經歷頭兩個上升的多倍劑 量(RMD)循環之後，能夠耐受這種研究藥物並且疾病不在發展的病人可以被選擇進行其他 的給藥循環。向化合物(I)甲磺酸鹽的單位劑量瓶中加入固定體積的無菌水並均勻搖動(逆向 搖晃大約10次)直到獲得澄清溶液。
劑量水平 (毫克，游離 鹼)在瓶中化合物 ⑴粉末的量 (毫克，游離 鹼)向每個瓶中加 入的水的體積 (毫升)所得濃度 (毫克/毫升)單一劑量體積 (毫升)22100.21055200.25201010200. 50202020201. 0204040202. 0208080204. 020120120403. 040160160404. 040 在禁食至少2小時之後服用化合物(I)。但在任何時候飲水都是允許的。在現場
65管理下，病人將第一劑量的整個單位劑量瓶對其自己給藥。使用20毫升的無菌水衝洗該瓶 子並將所得物口服，完全喝完首次劑量。重複該過程。在此後2小時時間內不能進食。對於上升的多倍劑量(RMD)，製備供給量為7天的化合物(I)溶液並在臨床位點 藥房分給病人。病人每周回來一次，分別在第8天、第15天、第22天、第36天、第43天和 第50天，並送回用後的瓶子。在第8天、第15天、第36天、第43天，使病人得到新的7日 供給量。劑量緩慢擴大的劑量改變當發生2級毒性時，可以放緩劑量的擴大。下一研究群體的給藥水平應該具有較 小的增量，如下所示
當發生2級毒 性時的劑量水 平(毫克)下次增加 的劑量 (毫克)在瓶中化合 物⑴的 量(毫克)向每個瓶 中加入的 水的體積 (毫升)所得濃度 (毫克/毫升)單一劑量 體積 (毫升)23. 53. 5100. 351057. 57. 5200. 37520101515200. 7520203030201. 520406060203. 020607070203. 52080100100402. 540100110110402. 7540120140140403. 540140150150403. 7540160180180404. 540
如果隨著劑量水平的增加不在發生2級或更高的毒性，可以重新恢復最初的劑量 增加日程表。在劑量限制件毒件(DLT)中的劑量改變當一個研究組的3位或6位病人中有兩位病人發生劑量限制性毒性(DLT)時，停
止劑量擴大。向下一個研究群給藥減少的劑量，如下所述 藥代動力學分析使用WinNonlin 專業軟體(Pharsight 公司，Mountain View, CA，第 4· 1 版)或其 他適當的軟體對個體血漿內化合物(I)濃度-時間數據進行非房室藥代動力學分析。當來 自個別病人的數據不能被分析時，使用平均血漿化合物(I)濃度-時間數據計算藥代動力 學參數。從血漿濃度中計算下列藥代動力學參數=Cmax (最大血清濃度)、tmax (達到最大 濃度的時間)、時間T時的AUCT(從零時間到最後可測量的濃度(CT)時間中濃度-時間曲 線下面積)、AUCo--(從零時間到最後的濃度-時間曲線下面積)、XlA(末期半衰期)、 Ae (在尿液中分泌的藥物的量)。根據研究技師(pharmacokineticist)的經驗來確定其他 適合用於描述並解釋藥代動力學的參數。牛物學效應的評價通過酶聯免疫吸附測定來確定血管內皮生長因子(VEGF)的血漿水平。確定外周 血液單核細胞中磷酸Src Tyr419水平和選擇底物的轉磷酸化作用。在MTD條件下進行治 療之前和之後的腫瘤活組織檢查能夠確定化合物(I)在移植Src激酶磷酸化作用方面的生 物學作用，其中所述Src激酶的磷酸化作用可能涉及在腫瘤的擴增中。對MTD擴大研究組中的10位病人進行成對的活組織檢查。將組織分成兩半，其中一半通過常規病理學方法評 價，另一半用於評價磷酸Src Tyr419水平和選擇底物的轉磷酸化作用。疾病講稈的評價對於可測量的疾病，根據RECIST標準評價腫瘤反應(Therasse，P.，et. al.，New Guidelines to Evaluate the Response toTreatment in Solid Tumors (評價實體月中瘤反 應的新指南).J NatCan Inst. 2000，92 (3)，p. 205-216)。在基線和之後其他循環(2個循 環)中獲得測量值。所有有反應的病人(完全反應和部分反應)在第一次有記載的反應發 生之後4周時，必須使用與基線測量時相同的測量方法對病人的反應進行確認。對於患有 不可測量的疾病的病人，根據臨床表現(腫瘤標記物、射線測量、超聲、等等)評價反應。當 骨骼變形時唯一病發的地點時，使用用於評價骨骼疾病反應的國際衛生組織標準來評價反 應。通過在連續兩個月的測量中腫瘤標記物上升25%或者疾病有明顯的放射性發展來定義 非可測量性疾病的發展。使用同樣的方法重新評價腫瘤反應從而建立腫瘤測量基線。按照 如下方式評價腫瘤反應目標病變 完全性反應(CR)所有目標病變消失 部分反應(PR)目標病變的最大直徑(LD)之和減少至少30%，參照基線最大直 徑之和 進行性疾病參照開始治療之後記錄的最小最大直徑(LD)之和數值，目標病變 最大直徑(LD)之和增加至少20%，或者出現一種或者一種以上新的病變 穩定的疾病參照開始治療之後記錄的最小最大直徑(LD)之和數值，既沒有足 夠縮小到部分反應資格，也沒有足夠增加到進行性疾病的資格非目標病變 完全性反應(CR)所有目標病變消失 不完全反應/穩定的疾病一種或一種以上非目標病變的持久性 進行性疾病出現一種或一種以上新病變或者非目標病變存在明顯的發展，或 者兩者皆發生只有非目標病變的明確發展是個例外現象。但是，如果研究員相信只發生非目標 病變的發展，則這些發展應該在四周之後進行CT檢查來驗證。使用與基線評價相同的方法 在四周之後確認部分反應(PR)之上的腫瘤反應。根據下面的表格確定目標病變和非目標病變中腫瘤反應所有可能的結合產生的 全部臨床反應
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CR =完全性反應；IR =不完全反應；PD =進行性疾病；PR =部分反應；SD =穩定 的疾病。實施例7 細胞生長的抑制作用與對照樣品相比，抑制50%細胞生長所需的藥物濃度作為GI5tl進行測量。在這裡 描述了本發明化合物(I)的GI5tl值測定方法。HT29細胞株是一種美國國立癌症研究組織(NCI)規定的標準人類結腸癌細胞株。 HT-29細胞從ATCC的第125傳代獲得，能夠用於第126-151傳代細胞的抑制作用。HT29細 胞能夠在補充有胎牛血清(1. 5%體積/體積)和L-穀氨醯胺(2毫摩)的McCoy' s 5A 培養基上按照常規方法培養。c-Src 3T3是用定點突變的人類c_Src細胞株轉染的老鼠成纖維細胞NIH 3T3正 常細胞株，其中定點突變的人類c-Src細胞株中527位的酪氨酸被轉變為苯基丙氨酸。這 一突變導致「自體活化」的c-Src，由於527位酪氨酸的磷酸化作用導致Src摺疊在其自身 的SH2區域上，從而導致Src的自動抑制。當被轉化為苯基丙氨酸時，苯基丙氨酸不會發生 磷酸化作用，因此不會發生自動抑制。在這種情況下，一直具有高度活性的突變株Src能夠 將正常的老鼠成纖維細胞轉變成迅速生長的腫瘤細胞。由於過度活躍的Src是促使這些細 胞生長的主要因素(特別是當在低生長的血清條件下培養時)，通常認為所述化合物在抑 制這一生長方面的活性是通過阻斷Src信號完成的(例如，作為一種直接的Src激酶抑制 劑或者作為一種作用於Src信號級聯其他位點的抑制劑)。將所述細胞在補充有胎牛血清 (2. 0%體積/體積)、L-穀氨醯胺(2毫摩)和丙酮酸鈉(1毫摩)的DMEM中按照常規方法 培養。在用於細胞生長抑制測定的5-溴脫氧尿核苷測定中，根據DNA合成期間結合 的5-溴脫氧尿核苷的測得量確定細胞增殖的量。從羅氏應用科學公司(Roche AppliedScience)獲得細胞增殖酶聯免疫吸附5_溴脫氧尿核苷測定試劑盒(比色)並按照操作指 南進行測定。生長抑制作用用GI5tl表示。其中，GI5tl是指能夠抑制50%細胞生長的樣品劑量。 生長抑制作用(GI)能夠從公式GI = (T0-TnxlOO/T0-CONn)中計算得出，其中，Ttl是未處理 細胞在「0」時刻的5-溴脫氧尿核苷生長量，Tn是處理過的細胞在第「η」天的5-溴脫氧尿 核苷生長量，CONn是對照細胞在第「η」天的對照5-溴脫氧尿核苷生長量。推算GI50值，所 得數據使用XL-Fit 4.0軟體繪製曲線。對促進生長的培養基進行胰蛋白酶化，並在96孔板的每個小孔中，將細胞在懸浮 在190微升補充有1.05% FB S適當的培養基中(1000個ΗΤ-29細胞；2500個c-Src 3T3細 胞)。在96孔板培養試驗中，向c-Src 3T3培養基中補充IOmM HEPES緩衝液。在96孔板 的標準組織培養基中接種HT-29細胞，對塗布有聚-D-賴氨酸(BI0C0AT )的96孔板接種 c-Src 3T3細胞。為了增加二氧化碳的擴散，使用2毫米後的無菌橡膠栓抬起c-Src 3T396 孔板的蓋子進行培養。接種的96孔板在37°C，5%二氧化碳條件下允許HT-29附著18-24小時，或者在 37°C，10%二氧化碳條件下允許c-Src 3T3附著18-24小時。再接種18-24小時之後，使用 5_溴脫氧尿核苷分析確定未處理細胞的最初生長量(TO)。將樣品在二甲亞碸中重建並在 中間時使用包含10% FBS的DMEM稀釋。FBS的最終測定濃度是1. 5%，二甲亞碸的最終測 定濃度是0. 05%。將樣品分成10微升每份，加入三份，按照上述方法培養孔板大約72小 時。其中包括陰性對照(煤介物)和陽性對照(例如，AZ(KX2-328))。對孔板進行5-溴脫 氧尿核苷分析並按照上述對與GI5tl的方法分析所得數據。所述結果顯示在下表中。在下表中，數據是按照相對參照物的生長％列出的，因 此，在指定濃度下較低的數表示所示化合物在一直腫瘤細胞株增長方面具有更大的效力。 所有的化合物最初製備為20mM 二甲亞碸儲備溶液，然後用緩衝液稀釋，進行體外腫瘤生長 試驗。NG是指沒有細胞生長超過對照品，T是指在藥物處理的小孔中的細胞數目小於對照 中的細胞數目(即，細胞損失)。NT表示沒有進行試驗。化合物AZ(KX2-328)是一種腺苷 三磷酸-競爭性酪氨酸激酶抑制劑，參見Ρ et al. , J.Med. Chem,47 =871-887(2004)的 描述。如下表所示，獲得本化合物(I)在其他細胞系中的GI5tl值。使用與上面對於HT29 細胞株詳細描述的標準腫瘤生長抑制作用測定確定這些GI50值，使用下列細胞系進行試 驗結腸腫瘤細胞系KM 12、肺癌細胞系H460和肺癌細胞HneA549 (所有都是NCI標準腫瘤
細胞株)。
HT-29 相對參照物的生長％, n=3c-Src 3T3 相對參照物的生長》/。， n=3化合物5uM500 nM50 nMGl5010 uM1.0 uM100 nMKX2-328T10.073.099 nM (c-Src 3T3), 794 nM (HT29)TT13.0(化合物I >13 nM (c-Src 3T3); 23 nM (HT-29)NG=沒有生長，完全生長抑制；T =對細胞的細胞毒性作用，負生長；NT=未試驗
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下面的表顯示了與目前臨床上使用的三磷酸腺苷競爭性Src抑制劑相比，化合物 (I)對Src驅使的腫瘤細胞生長的抑制作用 下表顯示了化合物⑴對腦腫瘤細胞系的抑制作用。按照實施例7中詳細表述的 相似的方法，使用標準腫瘤生長抑制試驗確定GI5tl值。化合物(I)和達沙替尼對腦腫瘤細胞系的GI5tl值 下表顯示了化合物(I)對腎部腫瘤的抑制作用。按照實施例部分詳細表述的相似 的方法，使用標準腫瘤生長抑制試驗確定GI5tl值。
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化合物(I)和達沙替尼對腎臟腫瘤細胞系的GI5tl值 下表概括了化合物(I)對5種肝細胞性肝癌細胞系的抑制作用下表顯示了化合物(I)甲磺酸鹽和達沙替尼在78小時在肝細胞性肝癌細胞系中 的IC50和IC80(8. OxlO3細胞/孔，1. 5% FBS) ；IC50和IC80值來之標準化反應數據化合物(I)和達沙替尼對腎臟腫瘤細胞系的GI5tl值 在100%的二甲亞碸中配製檢測化合物的樣品，從而獲得20毫摩儲備溶液；在4°C 條件下存儲。按照如下的方法確定IC5tl和IC8tl值。按照常規方式培養人腫瘤細胞系Huh7、 WRL-68、PLC/PRF/5、H印3B和H印G2，並且在37 °C，5% 二氧化碳條件下保存在包含2% FBS 的基礎培養基中。將這些細胞接種在96孔板的每個小孔中，每個小孔接種4. 0x107190微 升和8. 0x107190微升/孔。試驗用培養基為基礎培養基/1.5% FBS。在37°C下，在適當 的二氧化碳環境中，在加入化合物(I)的甲磺酸鹽(化合物(I)MSA)和達沙替尼之前，在96 孔板中將細胞培養過夜。按照如下方式配製檢測物質稀釋溶液將20毫摩爾儲備溶液樣品 在基礎培養基/1.5% FBS中按照1 3的稀釋法進行逐級稀釋，產生20x濃度在131微摩 到0.24納摩範圍內。10微升20x稀釋液被添加到包含190微升癌細胞系的適當的孔中(η =3)，產生的最終濃度在6561納摩到0. 012納摩範圍內。細胞的載體參照且無樣品；細胞 的培養基對照物、無樣品，和0.03%二甲亞碸(存在於樣品中的最高濃度的二甲亞碸)。在 37°C，5%二氧化碳條件下對被治療的細胞進行72小時的培養。在第三天，向每個小孔中加 入10微升MTT (5毫克/毫升)。在MTT存在的條件下，在37 °C，5% 二氧化碳中培養細胞4 小時。培養之後，向每個小孔中加入90微升10%十二烷基磺酸鈉(+HCl)從而裂解細胞並 溶解三苯基甲脂。然後，在37°C下，在5%二氧化碳環境中，將細胞培養整夜。使用BioTek
72SynergyHT多平臺微板閱讀器測量OD57tl值。使用GraphPad Prism 4統計軟體確定生長抑 製作用曲線IC5tl和IC80值。實施例8 分離激酶的抑制作用普遍認為在細胞外部Src的構造與在細胞內部Src的構造是有顯著不同的，這是 由於在細胞內部Src嵌和在多蛋白信號複合物中。因此，由於在分離的Src中沒有很好的 形成多肽底物結合位點(根據Src的X-射線顯示的結構所知)，普遍相信抵抗分離的Src 作為多肽底物結合抑制劑的活性將被減弱。為了結合在這些位點上，在分離酶試驗中需要 使用抑制劑捕獲小百分率的與存在於細胞內部的Src具有相同構造的Src蛋白。這一過程 需要大量過量的抑制劑來排除試驗中催化循環的大量酶。然而，在細胞內部，不需要這種大量過量的抑制劑，這是由於SH2&SH3區域結合蛋 白已經被轉移到Src構象中，因此肽底物結合位點已經被完整的形成了。在這種情況下，由 於所有的酶都處於緊密結合的構象中，低濃度的抑制劑就可以出去催化循環中的酶。KX2-328是AstraZeneca，s所公開的一種三磷酸腺苷-競爭性Src抑制 劑(AZ28)，並且可以在這裡描述的許多試驗中用作陽性參照。KX2-328是具有式
廣S
性，這是由於在細胞外部，沒有很好的形成多肽結合位點。不希望局限於任何理論，普遍認 為，相對於分離的激酶試驗，這種活性上的差異是由於在細胞中的多肽結合位點被很好的 形成了。多肽結合位點很好的形成是多蛋白信號複合物中參與結合蛋白的別構效應造成 的。下表表示了相對於參照(未處理的)分離激酶，在AstraZeneca三磷酸腺苷-競 爭性抑制劑(KX2-328，AZ-28)或者化合物(I)存在的情況下分離激酶的活性百分比。
靶點AZ28@10μ M化合物(I) @10μΜAbl (h)1120CHKl (h)NT105EGFR (h)3134FGFR2 (h)9494Fyn (h)285IGF-IR (h)110101IR (h)125112Lck (h)1109Lyn (h)0113MAPK2 (h)105112PDGFR β (h)98110PKCa (h)111111Pyk2 (h)4397Yes (h)192ZAP-70 (h)97108PI3激酶99100AstraZeneca三磷酸腺苷-競爭性抑制劑相對於三磷酸腺苷_競爭性抑制劑表 現了典型的脫靶點激酶抑制作用活性，和較差的選擇性，所述較差的選擇性可以通過Abl、 EGFRTK、Fyn、LCk、Lyn&Yes強抑制作用證明。相反對化合物(I)觀察到了其對這些脫靶點 激酶較弱的抑制作用但是，從上面實施例中描述的實驗可知，化合物(I)是Src促使的細胞生長的更為 有效的抑制劑。在c-Src/NIH-3T3基因工程細胞株中，AZ28的GI50值是99納摩，而化合物 (I)的GI50值是13納摩。且在NCI人類結腸癌細胞株HT29中，AZ28的GI50值是794nM， 而化合物(I)的GI50值是13納摩。在其他的實施例中，滴定數據表明AZ28是分離的Src的有效的抑制劑(IC50 = 8nM)。附著斑激酶的滴定數據顯示AZ28對分離的附著斑激酶的效力小至少100倍(IC50
74> 500nM)。然而，滴定數據顯示化合物(I)是分離的Src的作用較小的抑制劑(IC50分別 為46微摩)。附著斑激酶的滴定數據顯示化合物(I)對分離的附著斑激酶具有相似的效力 (IC50 > 48 微摩)。應當注意，AZ28與分離的Src相比對細胞生長的效力少10-100倍。由於全細胞 中競爭性三磷酸腺苷的濃度比分離酶試驗中的濃度高很多，所以這是三磷酸腺苷競爭性抑 製劑的典型特徵。化合物(I)顯示對c-Src的IC50 = 46mM。實施例9 化合物對細胞內磷酸化水平的作用使用化合物(I)或者AstraZeneca' s腺苷三磷酸競爭性Src抑制劑AZ28處理 HT29(結腸癌)和c-Src527F/NIH-3T3(Src轉化的)細胞系。AZ28可以作為一種陽性參 照，顯示在這些試驗中確定的Src抑制劑起到的作用。在用化合物處理之後，細胞溶解，進 行PAGE試驗並用一組抗體做探針。選擇抗體來確定化合物是否引起已知Src底物在磷酸 化作用方面的變化。另外，還調查了酶切蛋白的磷酸化作用。此外，通過Caspase 3分裂計 算細胞凋亡的感應現象。由於對藥物濃度增加的響應去世是活性最可靠的指示劑，因此要 對多劑量的各個化合物進行檢測。在IX濃度下，使用這些化合物在這兩種細胞系的每一種中的GI50值繪製化合物 (I)的劑量反應曲線。除了無藥物的參照物「C 」之外，還試驗了三個其他的劑量0.2X、5X 和25X倍的GI50值。測定AZ28在這兩種細胞系中相同倍數範圍的GI50值，如圖1所示， 從而獲得在兩種細胞系中兩種化合物響應Src-Y416自動磷酸化所需的理想的劑量。這些 數據顯示化合物(I)是一種細胞內部Src抑制劑。圖2顯示了黏著斑激酶酪氨酸925的磷酸化作用，所述黏著斑激酶酪氨酸925是 一種細胞內部已知的Src磷酸根轉移作用底物。化合物(I)和AZ28能夠抑制Src轉磷酸 化作用。這些數據顯示化合物(I)是一種細胞內部Src抑制劑。圖3顯示了 Y239/240的磷酸化作用，所述Y239/240是一種已知的細胞內部Src 磷酸根轉移作用底物。化合物(I)和AZ28能夠抑制Src轉磷酸化作用。這些數據顯示化 合物(I)是一種細胞內部Src抑制劑。圖4顯示了樁蛋白Y-31的磷酸化作用，所述樁蛋白Y-31是一種已知的細胞內部 Src磷酸根轉移作用底物。化合物(I)和AZ28能夠抑制Src轉磷酸化作用。這些數據顯示 化合物(I)是一種細胞內部Src抑制劑。注意在HT29細胞中無論有沒有加入藥物，都不 會檢測出樁蛋白Y-31。Caspase-3的分裂作用是細胞凋亡感應現象的一種很好的測量點。普遍已知，在 HT29(結腸癌)和c-Src527F/NIH-3T3 (Src轉化的)細胞系中，AZ28在導致細胞凋亡方面 是無效的。相反，如圖5所示，化合物(I)在導致細胞凋亡方面很有效。由於Src在HT29 (結腸癌)和c-Src527F/NIH_3T3 (Src轉化的)細胞系中都有很 高的活性，當Src活性被抑制時，可以看到的一個現象是總磷酸化酪氨酸水平的降低。圖6 顯示這一現象對AZ28和化合物(I)都能觀察到。所述數據表明化合物(I)是一種細胞內 部Src抑制劑。PDGF受體酪氨酸激酶在Y572/574上進行自動磷酸化。這並不被認為是一種細胞 中直接的Src底物。普遍已知的是，AZ28是分離的PDGF受體酪氨酸激酶一種有效的抑制 劑(參見實施例8中的表)。然而，如圖7所示，對於AZ28可以觀察到PDGF受體自動磷酸化作用的劑量反應減少。這樣就可以假定這是一種間接作用。對於化合物(I)可以觀察到 一些作用，但是在某種程度上說，這一作用的效力較少。因此，在間接抗PDGF自動磷酸化作 用的抑制作用方面，化合物(I)比AZ28具有更少的活性。如果沒有加入藥物的話(或者有 藥物加入)，在HT29細胞中都不會檢測出PDGF受體酪氨酸激酶Y572/574。黏著斑激酶Y397是一種主要地黏著斑激酶自動磷酸化作用位點，也是一種較差 的Src轉磷酸化作用位點。AZ28不是一種有效的黏著斑激酶抑制劑(參見實施例8中分離 酶的數據)。儘管如此，圖8中表示了在有AZ28存在的情況下，在c-Src527F/NIH3T3細胞 中黏著斑激酶自動磷酸化作用的某些抑制作用。然而，在化合物(I)存在的情況下沒有發 現在c-Src527F/NIH3T3細胞中黏著斑激酶自動磷酸化作用的抑制作用。這種相反的情況 也可以發現在NCI人類結腸癌細胞株HT29中。實施例8中顯示的分離酶的數據表明，AZ28是一種有效的EGFR酪氨酸激酶抑制 劑。據此，圖9中腫瘤細胞的數據顯示AZ28能夠有效的抑制EGFR酪氨酸激酶自動磷酸化 作用。該位點不是一種直接的Src磷酸化作用位點。圖9中顯示的腫瘤細胞數據還顯示了 化合物(I)對於EGFRTK的酶切自動磷酸化作用具有較少的活性。自動磷酸化作用的抑制作用與本發明化合物的GI5tl值有關。圖IOA和圖IOB顯 示了與Az28在c-Src527F/NIH-3T3細胞和在HT-29細胞中相比，化合物(I)對Src自動磷 酸化作用(Y416)的抑制作用。轉磷酸作用的抑制作用也與本發明化合物(I)的GI5tl值有 關。圖IOD和IOE顯示了與Az28在c-Src527F/NIH-3T3細胞和在HT-29細胞中相比，化合 物(I)對Src轉磷酸作用的抑制作用。在全細胞試驗中，本發明化合物(I)顯示了非常高的蛋白質酪氨酸激酶選擇性。 例如，圖11顯示了與達沙替尼相比，化合物(I)對於酪氨酸激酶的選擇性。^MM 10 寸Di咅導致的聽力喪失的彳呆護措施使用灰鼠(N = 6)來研究噪音導致的聽力喪失。在實驗操作之前，使用標準電物 理方法測量動物的「聽覺靈敏度」。尤其是，按照標準實驗方法通過將誘發性電位從弓I導電 極慢慢的嵌入下丘處來測定聽覺閾值。將動物麻醉，打開其耳道(auditory bullae)觀察 左邊和右邊的耳蝸。耳蝸處圓窗導致的鼓階可以作為藥物的給藥點。使用化合物(I)或者 KX2-328(來自AstraZeneca的非腺苷三磷酸競爭性抑制劑，ΚΧ2-238)在二甲亞碸中乳化後 的IOOOmM鹽溶液處理動物，將藥物給藥在一個耳朵的圓窗上。將3mM二甲亞碸在IOOOmM鹽溶液中形成的參照溶液放置於另一個耳朵的圓窗中。 將所述溶液放置於圓窗中30分鐘，然後關閉耳道。隨後，對動物在105分貝SPL下進行四 個小時4千赫茲頻帶噪音處理。在暴露於噪音環境下之後，在第1天、第7天和第21天時 檢測動物的聽力，從而確定誘發性電位的閾值位移。在第21天估定永久性閾值位移。實施例11 使用PTK抑制劑對順鉑導致的聽力喪失的保護措施高水平噪音和耳毒性藥物在耳朵內部起到幾乎相同的作用，其中，所述耳毒性藥 物例如順鉬或者氨基糖苷類藥物。首先，噪音和/或藥物能夠改變耳蝸(內耳)中自由基/ 抗氧化劑水平。自由基的增加被證明是感覺細胞凋亡的致病因素。在順鉬導致的聽力喪失 的研究中使用豚鼠(N = 7)。在實驗操作之前，使用標準電物理方法測量動物的「聽覺靈敏 度」。尤其是，按照標準實驗方法通過將誘發性電位從引導電極慢慢的嵌入下丘處來測定聽 覺閾值。將動物麻醉並用順鉬處理，隨後，測定動物的聽力從而確定誘發性電位閾值位移。
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實施例12 化合物對破骨細胞形成的影響為了確定化合物(I)對破骨細胞形成的影響，向衍生自脾細胞的破骨細胞前體加 入所述化合物。為了產生脾衍生出的破骨細胞，在核因子-κΒ配位體(RANfKL)和巨噬細 胞菌落-刺激因子(M-CSF)存在的條件下，用雷帕黴素、化合物(I)、KX2-328 (AstraZeneca 化合物)處理包括破骨細胞前體的脾細胞5天。在老鼠或者人類破骨細胞體外模型中， 可溶解的RANKL能夠在M-CSF存在的條件下區別出破骨細胞前體(Quirm，et al ，1998， Endocrinology, 139,4424-4427 Jimi, et al. ；1999，J. Immunol.，163，434-442)。將未處 理的參照細胞在RANKL和M-CSF單獨存在的情況下進行培養。使用雷帕黴素作為破骨細胞 形成抑制作用的陽性對照。實施例13 化合物對成骨細胞存活的作用為了確定化合物對破骨細胞存活的作用，在核因子-κΒ配位體(RANfKL)和巨噬 細胞菌落-刺激因子(M-CSF)存在的條件下，用雷帕黴素、化合物(I)、KX2-328處理破骨細 胞48小時。將未處理的參照細胞在RANKL和M-CSF單獨存在的情況下進行培養。使用雷 帕黴素作為破骨細胞存活抑制作用的陽性對照。實施例14 化合物對體外骨吸收的作用為了確定骨切片上化合物(I)對破骨細胞形成的作用，使用增加濃度的雷帕黴 素、化合物(I)、ΚΧ2-328處理骨切片，例如，濃度為0.1納摩，1納摩，或者10納摩。計數骨 切片上破骨細胞的數目。在骨吸收過程中，成骨細胞形成吸收池。為了確定骨切片上化合物(I)對吸收池 形成的作用，按照如上所述方法使用雷帕黴素、化合物(Ι)、ΚΧ2-328處理骨切片。計數骨切 片上吸收池的數目。按照上述方法處理骨切片，然後使用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)對骨切片染色。 確定抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)陽性成骨細胞的數目。按照上述方法處理骨切片，然後使用甲苯胺藍對洩露的吸收池染色，所述甲苯胺 藍是破骨細胞調節的骨吸收的指示劑。實施例15 化合物對成骨細胞的作用由於涉及在骨質鈣化值得磷酸鹽的過程中，鹼性磷酸酶可以被用作成骨細胞活性 的指示劑。為了確定化合物(I)對成骨細胞活性的作用，用增加濃度的化合物(I)、KX2-328 處理成骨細胞並確定鹼性磷酸酶的表達(ηΜ鹼性磷酸酶/yg蛋白質/分鐘。作為對照物， 用單獨的培養基、二甲基亞碸(DMSO)或者骨促骨生成蛋白-2(BMP2)處理成骨細胞。BMPs的 定義是通過其能力進行骨誘導從而導致在嵌入額外的骨位點時導致骨生成，通常認為BMPs 能夠調節未分化的間充質細胞轉化成為生產骨的成骨細胞。為了決定化合物⑴在成骨細胞活性和蛋白質表達方面的作用，用培養基、二甲 亞碸、BMP2、化合物(I)、KX2-328按照如上所述的方法處理成骨細胞。確定細胞溶解產物中 的蛋白質濃度。實施例16 對肥胖症的作用下列實施例說明本發明化合物(I)可用於治療肥胖症。使用先前描述的方法 對化合物(I)進行試驗(Minet-Ringuet, et al. ，2006， Psychopharmacology (精神藥理 學)，Epub出版，通過引證在這裡併入本文)。將三十個最初體重在175-200克的雄性Sprague-Dawley鼠分別放置在膠質玻璃籠中，所述膠質玻璃籠帶有仿真12:12-白天-黑夜 循環(在08:00開始照明)系統，並且房間中溫度維持在24士 1°C，將溼度維持在55士5%。 在整個過程中，食物和水無限制的供應。用中等脂肪食品(代謝能17. 50千焦耳/克)餵 養所有的小鼠，所述中等脂肪食品由140克/公斤全乳蛋白質、538. 1克/公斤玉米澱粉、 87. 6克/公斤蔗糖和137克/公斤豆油組成，並在日常飲食中補充以礦物和維生素(無機 鹽35克/公斤、維生素10克/公斤、纖維素50克/公斤和膽鹼2. 3克/公斤)。這些食物 也叫做P14-L，與人類日常飲食相似(14%蛋白質、31%脂質和54%碳水化合物)，該食物在 實驗室中以粉末形式被製備。除了參照溶液之外，還對若干劑量的本發明化合物⑴進行檢測0. 01,0. 1,0. 5和 2毫克/公斤。將化合物溶解於水中，然後結合進日常飲食中，在適應期內記錄基本的食物攝 入並由此確定每日結合近食物中的本發明化合物的量。將所述化合物混合入實驗室製備的食 物中。在經過一星期，適應了實驗室的情況之後，將這些小鼠分為5組(每組n = 6)，每組的 重量相同並餵給加入本發明化合物的食物6星期。每周記錄重量三次。在研究結束後通過 解剖測定身體組織的重量並對主要的器官和組織稱重。通過腹膜內注射過量的麻醉劑(戊巴 比妥鈉48毫克/公斤)並進行肝素化(100U肝素/100克體重)使小鼠快速的被深度麻醉。 在移去並稱重主要新鮮器官(肝、脾、腎臟和胰腺)和組織(腎周脂肪組織和肩胛粗脂肪組 織、附睪脂肪組織、腹膜後脂肪組織、內臟脂肪組織和皮下白色脂肪組織(WATs)，和由肌肉和 骨骼組成的屍體)以前，通過切斷大靜脈和腹主動脈對小鼠放血(為了避免凝結在組織中)。實施例17 化合物對3T3-L1脂肪細胞,中胰島素導致的GLUT4移位作用的影口向下列實施例說明本發明化合物(I)可用於治療糖尿病。使用先前描述的方法對本 發明化合物(I)進行試驗(Nakashima, et al ；2000，J. Biol. Chem.，275，12889-12895)。將 對照物IgG(免疫免疫球蛋白G)或者本發明化合物注入培養片上辨別出的3T3-L1脂肪細 胞細胞核中。為了進行檢測，將穀胱甘肽5-轉移酶融合蛋白質與5毫克/毫升羊免疫免疫 球蛋白G—起注射。再染色之前，允許細胞恢復1個小時。將細胞在無血清的培養基中培 養2小時，用或者不用胰島素刺激(0. 5納摩或者17納摩)20分鐘，然後固定。使用兔多克隆抗GLUT4(F349)(1微克/毫升)進行免疫染色。在質膜_有關的 GLUT4著色存在的情況下，對每個異硫氰酸螢光素_陽性微注射的細胞進行評價。使用預免 疫的羊免疫免疫球蛋白G對參照細胞進行注射，然後按照進行試驗注射的細胞相同的方法 進行處理。通過螢光免疫檢驗法的GLUT4染色進行測定，胰島素導致向質膜的GLUT4移位 作用增加。本發明化合物能夠刺激胰島素導致的GLUT4移位作用，這表明給藥本發明化合 物能夠抑制激酶活性，例如，PTEN功能，從而導致胞內磷脂醯肌醇3，4，5-三磷酸鹽水平的 增加，刺激GLUT4移位作用。實施例18 化合物對視網膜新血管生成的影響下列實施例說明本發明化合物(I)可用於治療眼部疾病，例如，黃斑變性、視網膜 病和黃斑浮腫。化合物對視網膜新血管生成的影響可以使用之前描述的視網膜新血管生成 模型確定(Aiello, et al. ； 1995，Proc. Natl. Acad. Sd.，92，10457-10461)。C57B 1/6J 在出生後第7天(Ρ7)到第12天暴露於75%氧氣條件下，並精心照顧。在第12天，將小鼠 放回室內空氣中，在第12天和第14天的某些時候進行如下所述的眼球內注射。在17天， 通過心臟灌注4 %的多聚甲醛在磷酸鹽緩衝鹽水中的溶液致死小鼠，並剜出眼睛，在包入石蠟中之前，在4°C條件下，固定在4%多聚甲醛中過夜。在所有步驟中，使用三溴代乙醇將小鼠深深的麻醉。打開眼瞼(例如，使用11號 解剖刀)將眼睛提升(proptosed)。首先使用Ethicon TG 140_8縫合針進入左眼到達後部 的異組織邊緣，進行眼球內注射，使用32-定徑的漢彌爾頓針和注射器通過已經存在的入 口位點傳遞用Alcon平衡鹽液稀釋後的本發明化合物。然後將眼睛復位並將眼瞼大致蓋住 角膜。2天後通過先前未處理的斷口進行重複注射。作為參照，對右眼注射等量的鹽水。從視覺神經頭部開始，製造超過50個6微米石蠟包埋的軸向截面。在用高碘酸 /Schiff 試劑和蘇木精染色之後(Pierce，et al ； 1995，Proc. Natl. Acad. ScL USA.，92， 905-909 ；Smith et al ；1994, Invest. Ophthal. Vis. Set.，35，101-111)，對具有相同長度、 間隔30微米的10個完整的截面進行評估，所述斷面跨度為300微米。顯示視網膜剝離或 者眼內炎的眼睛從評價試驗中除去。在完全遮蓋的試驗中，在每個截面內計算在內界膜之 前的所有視網膜血管細胞核。所有10個計數的截面的平均值產生平均新生視網膜細胞核 每6-微米截面每眼。在正常的、未處理的動物中，不會觀察到在內界膜之前的血管細胞核 (Smith et al ;1994，Invest. Ophthal. Vis. ScL，35，101-111)。與鹽水對照組的眼睛相比， 用本發明化合物處理的眼睛可以觀察到減少的新血管生成。實施例19 與中風有關的激酶信號級聯的調節
已經發展並定性了很多中風的動物模型，參見，例如，Andaluz, et al.， Neurosurg. Clin. North Am. , vol. 13 385-393 (2002) ；Ashwal, S. and W. J. Pearce., Curr.Opin.Pediatr.，voll3 506-516(2001) ；De Lecinana, et al, Cerebrovasc. Dis.， vol. lKSuppl. 1) 20-30(2001) ；Ginsberg and Busto, Stroke, Vol. 20 :1627_1642 (1989)； Lin, et al. ， J. Neurosci. Methods, vol. 123 89~97 (2003) ；Macrae, I. M. ， Br. J. Clin. Pharmacol. , vol. 34 :302_308 (1992) ；McAuley, Μ. Α. , Cerebrovasc. Brain Metab. Rev.，vol. 7 153-180(1995) ；Megyesi, et al, Neurosurgery, vol. 46 :448_460(2000)； Stefanovich, V. (ed. ).，Stroke animal models. Pergamon Press, Oxford(1983)； 禾口 Traystman, R. J. , ILAR J. 44 :85_95 (2003)，這些文獻通過引證在此全部併入本文。作為用 於局部(中風)和整體(心臟驟停)腦缺血動物模型的參考，參見，例如，Traystman, ILAR J. ,vol. 44(2) :85-95 (2003)禾口 Carmichael，NeuroRx :The Journal of the American Society forExperimental NeuroTherapeutics, vol. 2 :396_409 (2005)(實驗性神經治療 的美國社會期刊)，這些文獻通過引證在此全部併入本文。在中風中，使用本領域已知的用於中風的模型識別能夠調控細胞死亡的化合物。 在這裡所描述的研究中，使用動脈內縫合閉塞大腦中動脈(MCA)通過頸內動脈作為用作在 中風中細胞死亡模型，該方法也叫做MCAo。在小鼠的控制組和檢測組，橫切頸外動脈，將頸 總動脈結紮，然後將頸外動脈用作一種途徑，允許通過頸內動脈的縫線經過，其中，將所述 縫合固定在前面和中間腦動脈接合處。為了減少蛛網膜下出血和早發再灌注。優選的在縫 合處塗布一種試劑，例如，矽樹脂。將縫合處用於阻塞MCA並持續一段時間，例如，持續60 分鐘、90分鐘或者120分鐘，或者永久的阻塞MCA。在檢測組，在使用縫合方法MCA閉塞之前、期間或之後不同的時間對小鼠給藥本 發明化合物⑴。將檢測組中本發明化合物的影響與在參照組中觀察到的影響相比，例如， 通過測量每個MCAo基團細胞死亡的程度進行比較。一般地，在對照組，細胞死亡按照從紋
79狀體的早期梗死開始到覆蓋所述紋狀體的背外側皮層的延遲梗塞死為止，以這一過程為特 徵。紋狀體通常先壞死並且此壞死發生的非常迅速。將檢測組細胞死亡方式與控制組的細 胞死亡方式相比，從而識別能夠調控中風過程中細胞死亡的化合物。棚列20湖胃謹已經發展並定性了很多用於動脈粥樣硬化症的動物模型。作為動脈粥樣硬化症、 再狹窄和血管內移植研究動物模型的回顧，請參見，例如，Narayanaswamy et al.，JVIR， vol. 11(1) :5-17(2000)，所述文獻通過引證在此全部併入本文。使用高脂肪/高膽固醇 (HFHC)日常飲食可以在適當的動物模型中誘發動脈粥樣硬化症。所述試驗動物是包含膽固 醇酯轉移酶的動物，例如兔子或者豬。通過例如商業可購得的補充有脂肪的食物製備HFHC 日常飲食。膽固醇攝取量在日常飲食的0. 5-2.0%之間。對實驗組的動物，例如兔或者豬給 藥本發明化合物(I)。將檢測化合物的作用與未處理的對照組動物中對動脈粥樣硬化症的 作用相比。被比較的作用包括，例如，動脈粥樣斑形成的程度、在每組動物中觀察到的心肌 梗塞的數量和/或頻率，以及冠狀組織中顯示的從屬於心肌梗塞二發生的組織損傷程度。使用多種動物模型研究心肌梗塞，所述動物模型例如鼠和老鼠。大多數心肌梗塞能 夠引起已經存在的冠狀動脈粥樣斑快速血栓閉塞，在動物模型中通過結紮鼠和老鼠左側冠狀 動脈來模仿所述冠狀動脈的動脈粥樣斑。心肌梗塞導致心室結構的整體變化，這個過程叫做 心室重新塑造。血管梗塞的心臟逐漸膨脹並加速心室功能紊亂的惡化，最終導致心力衰竭。通過結紮左前部下行的冠狀動脈在檢測組和對照組動物，例如老鼠或者鼠體內導 致心肌缺血。在出現局部缺血感應現象之後，將受影響的心臟組織給藥本發明化合物(I)， 例如通過腹膜內(i. P.)注射給藥。在手術後24小時，測定高解析度磁共振成象(MRI)、幹 重測量值、梗塞面積、心臟容積、和受風險的面積。對受到本發明化合物(I)注射的小鼠在 手術後各個時間測定存活率和超聲波心動描記。將檢測化合物的其他作用與對照組小鼠進 行對比。例如，使用超聲波心動描記法對左心室幾何和功能方面的改變進行定性，從而對比 末端-心臟舒張直徑、相對胞壁厚度和縮短分數百分比。在離體心室中，計算梗塞面積並表 示為佔左心室表面面積的百分比。^MM 21用於神經性疼痛，例如慢性神經性疼痛的許多動物模型已經被發展並定性，參 見，例如，Bennett & Xie, Pain, vol. 33，87-107 (1988) ；Seltzer et al.，Pain, vol. 43, 205-18(1990) ；Kim & Chung， Pain, vol. 50,355-63(1992) ；Malmberg & Basbaum， Pain, vol.76,215-22(1998) ；Sung et al. ,Neurosci Lett.，vol. 246，117-9(1998) ；Lee et al.， Neuroreport, vol. 11,657-61(2000) ；Decosterd& Woolf，Pain, vol. 87,149-58(2000)； Vadakkan et al.，J Pain, vol. 6，747-56 (2005)，這些文獻的全部內容通過引證在此全部 併入本文。作為用於神經性疼痛的動物模型的回顧，參見，例如，Eaton, J. Rehabilitation Research and Development,(復原研究禾口發展)vol. 40 (4 Supplement) :41_54 (2003)，該 文獻的全部內容通過弓I證在此全部併入本文。使用任意本領域內已知的用於神經性疼痛的模型來識別能夠調控神經性疼痛的 化合物。例如，用於神經性疼痛的模型通常包括坐骨神經傷害，儘管該方法常常會導致傷害 變化。例如，通過部分收縮、完全橫切、神經冷凍和對神經進行新陳代謝損傷、化學損傷或者 免疫損傷使坐骨神經受傷。經過這種神經傷害的動物已經表現出發展成非正常的疼痛，這種疼痛類似於患有神經性疼痛的病人所報導的疼痛。在這裡描述的研究中，檢測組和對照 組主體，例如，老鼠的坐骨神經被損害。在檢測組中，在坐骨神經受到損傷之前、期間或者之 後對主體給藥本發明化合物。將本發明化合物(I)對檢測組的影響與對照組觀察到的影響 相比較，例如，通過對主體進行物理觀察和檢驗。例如，在老鼠體內，使用老鼠的後爪檢測對 非有害刺激物，例如觸覺刺激的反應，或者檢測老鼠對在正常狀態下有可能有害的刺激的 反應，所述刺激例如，將後爪加熱。在患者體內，異痛症、通常無痛的刺激導致的疼痛或者痛 覺過敏、對疼痛過度敏感或者易感的跡象表明檢測化合物在調控測試主體內神經性疼痛方 面是無效的。棚列22 站珊純銀及周 Γ用於B型肝炎的許多動物模型已經被發展並定性。作為用於B型肝炎的動物模 型的回顧，參見，例如，Guha et al.，Lab Animal, vol. 33(7) :37_46 (2004)，所述文獻通 過引證在此全部併入本文。適當的動物模型包括，例如，黑猩猩、樹鼯(非齧齒小動物，在 動物種類史上接近於靈長類，參見Walter et al，H印atology (肝臟病學)，vol. 24 (1) 1-5(1996)，所述文獻通過引證在此全部併入本文)，以及代位模型例如旱獺、鴨子和黃鼠 (參見例如，Tennant and Gerin, ILAR Journal, vol. 42(2) :89_102 (2001)，所述文獻通過 引證在此全部併入本文。例如，從樹鼯種樹鼯屬belangeri的肝臟中分離出初始肝細胞，並用HBV感染。體 外傳染導致病毒DNA和RNA在肝細胞中合成並向培養基中分泌B型肝炎表面抗原(HBsAg) 和B型肝炎抗原(HBeAg)。還可以用HBV在體內感染樹鼯屬，導致病毒DNA複製和樹鼯屬肝 髒中的基因表達，與人類急性自我限制型B型肝炎相似，B型肝炎表面抗原能夠快速的從 血清中清除，隨後血清轉變成抗HBe和抗HBs。使用任意本領域內已知的用於B型肝炎的模型來識別能夠調控神經性疼痛的化 合物。在這裡描述的研究中，用HBV病毒感染檢測組和對照組的動物，例如，黑猩猩或者樹 鼯。在檢測組中，在暴露於HBV病毒之前、期間和之後的不同時間內，對主體給藥本發明化 合物(I)。將本發明化合物(I)對檢測組的影響與對照組觀察到的影響相比較，例如，通過 對主體進行物理觀察和檢驗或者通過血液或者血清分析從而確定傳染從主體清除的時間。 例如，運行試驗從而檢測B型肝炎病毒要求的表面抗原和其片段的存在和/或量。做為選 擇或者另外，分析主體的肝臟。使用肝功能試驗分析某些蛋白質和酶的水平，所述蛋白質和 酶例如，天冬氨酸轉氨酶(AST，從前的血清穀氨酸草醯乙酸轉氨酶(SGOT))和丙氨酸轉氨 酶(ALT，從前的血清穀氨酸-丙酮酸鹽轉氨酶(SGPT))。^MM 23 -J^mmmmmmmmimmmm下列實施例說明本發明化合物(I)可用於治療自身免疫疾病。使用先前描述的 方法檢驗所述化合物(I) (Goldberg，et al. ；2003，J. Med. Chem.，46，1337-1349)。使用 DELFIA (離解作用提高的鑭系元素氟代免疫試驗)測量激酶活性，所述試驗利用銪螯合-標 記的抗磷酸化酪氨酸抗體檢測轉入無規聚合物聚Glu4-TyrI(PGTYR)中的磷酸鹽。在處於 激酶測定緩衝劑(50毫摩爾HEPES, pH值為7.0,25毫摩爾MgCl2, 5毫摩爾MnCl2, 50毫摩 爾KC1，100微摩Na3VO4,0.2% BSA,0.01% CHAPS)中的中性鏈親和素塗布的96孔白板上 進行激酶測定試驗。將試驗樣品(本發明化合物(I))首先以1毫克/毫升的濃度溶解於 二甲亞碸中，用測定緩衝劑進行預稀釋，用於劑量反應(10劑量，起始終濃度為1微克/毫
81升，1-3. 5連續稀釋)。將25微升等份的稀釋樣品和25微升的稀釋酶(Ick) (0. 8納摩終濃 度)相繼添加到每個小孔中。在50微升/孔的底物混合物中起始反應，所述底物混合物包 含2微摩腺苷三磷酸(最終腺苷三磷酸濃度是1微摩)和在激酶緩衝劑中濃度為7. 2毫微 克/微升PGTYR-生物素。對照孔只用緩衝液和底物培養。在室溫下培養45分鐘之後，用 300微升/孔DELFIA洗滌緩衝劑洗滌測定孔板三次。向每個小孔中加入100微升/孔等 分的用DELFIA測定緩衝劑稀釋後的銪-標記的抗磷酸化酪氨酸(Eu3+-PT66，1納摩，Wallac CR04-100)，並在室溫下培養30分鐘。培養完成之後，所述孔板用300微升/孔的洗滌緩衝 劑和100微升/孔的DELFIA洗滌緩衝劑洗滌孔板四次。向每個小孔中加入增強作用溶液 (Wallac)。十五分鐘之後，測量LJL分析(在360納摩下激發，在620nm下傳播，EU 400分 色鏡)在延遲250微秒後的時間分辨螢光色譜圖。本發明化合物可以抑制Ick的激酶活性， 這一結果表明所述化合物可能用來治療患者的自身免疫性疾病。棚列24 僕剎勿(I)禾口·#尼龍難#尼-騎_胞名IC^ft碰 自細胞株中十二種抑制劑的濃度。根據最新資料的報導，癌細胞株是具有達沙替尼抗藥性的(Le.，C0L0-320DM, H460，H226，and HCT-116)，將此達沙替尼-抗藥性癌細胞系在有KXOl/化合物(I) Src抑制 劑或者達沙替尼參照物存在的情況下培養，從而確定KXOl/化合物(I)對細胞生長抑制作 用的影響。使用MTT比色定量試驗評價細胞增殖/生長抑制作用。另外，確定KX01/KX2-391 和達沙替尼對照物的IC5(I。下表提供了在生長抑制作用研究中使用的一系列細胞系。
名稱ATCC No.類型H460HTB-177NSCLCH226CRL-5826NSCLCC0L0-320DMCCL-220結腸直腸腺癌HCTl16CCL-247結腸直腸癌按照常規方法培養C0L0-320DM、H460、H226和HCT-116人類癌細胞系，並在37°C 下，5% 二氧化碳環境中，將所述細胞系保存在包含2% FBS的基礎培養基中。為了進行試 驗，將細胞接種96孔板中，所述細胞處於基礎培養基/1. 5% FBS中，接種量為4. 0xl03/190 微升和8. 0x107190微升/孔。在37°C下，在適當的二氧化碳環境中，在加入化合物(I)和 達沙替尼之前，在96孔板中將細胞培養過夜(16小時)。為了稀釋化合物(I)和達沙替尼(BMS354825)，將20毫摩爾儲備溶液樣品在基礎 培養基/1.5% FBS中按照1 3的稀釋法進行逐級稀釋，產生20x濃度在131微摩到0.74 納摩範圍內。10微升20x稀釋液被添加到包含190微升癌細胞系的適當的孔中(η = 3)， 產生的最終濃度在6561納摩到0. 037納摩範圍內。使用下列對照物細胞的載體參照且無 樣品；細胞的培養基對照物、無樣品，和0. 03%二甲亞碸(存在於樣品中的最高濃度的二甲 亞碸；沒有報導結果)。在37°C下，在適當的二氧化碳環境中，將處理後的癌細胞培養3天(78小時)。在第3天，向每個小孔中加入10微升的MTT (5毫克/毫升)。然後在37°C下，在適當的二氧 化碳環境中，在MTT存在的條件下培養細胞4小時。培養之後，向每個小孔中加入90微升 10%十二烷基磺酸鈉(+HCl)從而裂解細胞並溶解三苯基甲脂。然後，在37°C下，在適當的 二氧化碳環境中，將細胞培養整夜。使用微板閱讀器測量0D5TO。使用GraphPad Prism 4統計軟體確定生長抑制作用 曲線和EC5Q/IC5Q值。整理數據從而表示最大反應百分比。下表顯示了在78小時，化合物(I)和達沙替尼在癌細胞系中的IC50值(8. OxlO3 細胞/孔，1. 5% FBS)(是標準化反應數據的結果)。
人類實體肖中瘤 細胞林化合物(I ) nM達沙替龍nM達沙替龍 nM名稱IC50IC80IC90IC50IC80IC90理論IC50H46051105162907,11048,8801800*H226982774901637,75834,34010,000*COLO-320DM3080144151410,000*HCTl 1631106195880NANA5,000**Johnson et al.，Clin Cancer Res 2005 ；11 (19) :6924_6932，October 1,2005**Puputti et al.，Mol Cancer Ther 2006 ；5 (12) :927_934，December 2006實施例25 化合物(I)對達沙替尼和甲磺酸伊馬替尼抗藥性白血病細胞的作用。在96孔板中，使用完全培養基+IL-3培養Ba/F3細胞(參見例如，Palacios et al. ,Nature 309 126-131(1984) ；Palacios et al. ,Cell 41 :727_734(1985))對Ba/F3細 胞進行培養，並將培養後的Ba/F3細胞進行轉染，從而表達野生型(WT) Bcr-Abl,Bcr-Abl的 E255K突變體，或者Bcr-Abl的T315I突變體，並在96孔板中，使用不含有IL-3的完全培養 基培養。當發生Bcr/Abl酪氨酸激酶E225K突變時，對Ba/F3細胞株賦予格列衛(Gleevec) 抗藥性。當發生Bcr/Abl酪氨酸激酶T3151突變時，對Ba/F3細胞株賦予格列衛(Gleevec) 抗藥性和達沙替尼抗藥性。然後分別用無藥物、0. 1-10，000納摩達沙替尼或者0. 1-10,000 納摩化合物(I)的10倍稀釋液中處理各組細胞96小時。進行MTT試驗(在570納摩時進 行孔板讀數)。將所有試驗重複3遍。圖12-13和下表概括了所述研究的結果，結果顯示，在GI5tl = 35處，化合物(I)能 夠抑制BCR-AbI的T315I突變株，而達沙替尼在10，000納摩時仍不能抑制。此外，達沙替 尼不能夠抑制IL-3-導致的Ba/F3細胞增殖，而化合物(I)是一種有效的抑制劑(GI50 = 3. 5納摩)。
細胞林GI50 值(nM)達沙替尼化合物(I)Ba/F3—3.5+ WT BCR-AbI185+E225K180+T3151>10,00035
實施例26 使用化合物(I)和BMS354825對五個細胞系講行溴脫氧尿核 苷試驗使用化合物(I)估價五個細胞系(SK0V-3、K562、HT-29、A549和MDA-MB 231)的 GI50值，並使用5-溴脫氧尿核苷在T = 0和T = 72時進行BMS354825試驗。為了進行這些試驗，將細胞接種到兩個96孔板中，每個細胞株按照下面所示的細 胞編號，每個96孔板的小孔中含有200微升包含1. 5% FBS的生長培養基。被評價的細胞 系是SK0 V-2、K562、HT-29、A549 和 MDA231。除了 HT-29 和 MDA MB 231 細胞外，在每個小 孔中接種1000個其他的試驗細胞，HT-29接種2000個細胞，MDA MB 231接種5000個細胞。 除了 MDA231，其他的細胞在37°C下，5%二氧化碳環境中接種之後，將孔板培養24小時。對 於MDA231，該細胞株在37°C下，0%二氧化碳環境中生長。在接種24小時之後，向一個孔板的細胞株(η = 3)中加入ΚΧ2-391和BMS354825 濃度為128納摩、64納摩、32納摩、16納摩、8納摩、4納摩、2納摩和1納摩。經過入ΚΧ2-391 和BMS354825處理的細胞株孔板在37°C下，5%二氧化碳環境中培養72小時。除了 MDA231， MDA231在37°C下，0%二氧化碳環境中生長。在T = 0和T = 72時進行5-溴脫氧尿核苷試驗。生長抑制使用公式GI = [(T1-Ttl)/(Con-To) ]χ100，和5_溴脫氧尿核苷試驗數據 確定每個樣品濃度的生長抑制百分比。其中，TO =細胞在0時的螢光度；Ti =表示在第χ 小時的處理後細胞螢光度；Con =在χ時參照細胞的螢光度。(TO值的Ti值被叫做T細 胞毒性。使用XLFit估計GI50，除了彡TO值的Ti (細胞毒性)值之外。圖14-18和下表概
括了研究結果。
數椐概括化合物(I)BMS - 354825HT-291.54E-08M2.05E-08MSKOV- 39.75E-09M3.24E-09MA5499.39E-09M1.25E-08MK5621.09E-08M< 1.0E-9MMDA - MB - 3211.98-08M6.02E-09M實施例27 5~溴脫氧尿核苷試驗測定Gemzar和化合物⑴在L3. 6pl細胞株中的 聯合GI50。該試驗包括使用5-溴脫氧尿核苷試驗(羅氏化學商品分類號11647229001)在 T = 0和T = 72時進行試驗，評價L3. 6pl細胞株中Gemzar士化合物(I)的GI50值。將 L3. 6pl細胞接種到3個96孔板中，所述L3. 6pl細胞是一種胰腺癌細胞株，向每個孔板中 接種2000細胞/孔，所述細胞是位於190微升包含1. 5% FBS的生長培養基中的L3. 6pl。 Trevino et al. Am J Pathol. 2006Mar ； 168 (3) :962_72 的文獻中已經描述了 L3. 6pl 細胞，該文獻的全部內容通過在此引用全部併入本文。在接種之後，在37°C下，5%二氧化碳環境 中培養細胞18-24小時· 24小時之後，向L3. 6pl細胞(η = 3)中加入Gemzar+化合物(I)、 Gemzar、和化合物(I)。在濃度為8納摩、4納摩、2納摩、I納摩、0. 5納摩、0. 25納摩、0. 125 納摩、0. 063納摩時評價Gemzar。在濃度為100納摩、50納摩、25納摩、12. 5納摩、6. 25納 摩、3. 125納摩、1. 56納摩、和0. 78納摩條件下對化合物(I)進行評價。在37°C下，5%二氧 化碳環境中將各個用樣品處理過的孔板培養72小時。在T = 0時進行5-溴脫氧尿核苷試 驗，然後在培養72小時之後，在進行一次試驗，T = 72。圖19和20中提供了所述研究的結 果。下表概括了計算所得的Gemzar士化合物(I)的GI5tl結果。
^MM 28 用於研窮.體內轉移的IH位前歹肌斜草型用PC3-MM2前列腺癌細胞對Nu/Nu老鼠(8_12星期大的)的前列腺進行注射，如 Pettaway et al, Clin Cancer Res 1996，2 :1627_1636 之前的描述，該文獻的全部內容通 過引證在此全部併入本文。正位注射PC3-MM2細胞十四天後，將老鼠隨機分為4組分別 用達沙替尼(15毫克/公斤/天)處理；化合物(I) (5毫克/公斤/天)處理；化合物(I) (10毫克/公斤/天)處理和作為對照物(煤介物)。達沙替尼、化合物(I)和煤介物通過 口服給藥方式給藥。在大約42天後，通過頸脫位致死所有老鼠。記錄腫瘤體積(通過圓規 測定)、重量和區域發病率(腹腔或者主動脈)淋巴結次生腫瘤。下表、圖21和圖27中記 錄了試驗結果。
實施例29 :HBV初步試驗
按照Korba (Antiviral Res. 15 217-228 (1991)和Antiviral Res. 19 55-70(1992))等人描述的方式進行HBV初步試驗的發展，但是其中的病毒DNA的檢測和量 化已經被改善和簡化了(Korbaet al. , Antiviral Res. 19:55-70(1992))。在標準化H印G2-2. 2. 15抗病毒試驗中使用單個高試驗濃度的化合物來評價化合 物(I)的潛在的抗HBV活性。所述H印G2-2. 2. 15是一種穩定的細胞株，能夠產生高水平的 野生型HBVaywl菌株。簡單的講，將H印G2-2. 2. 15細胞放入96孔板中。只使用所述孔板的 內部小孔，從而減少在細胞培養期間觀察到的「邊緣效應」；將外部小孔中充滿完全培養基 從而最小化樣品蒸發。在第二天，洗滌H印G2-2.2. 15細胞融合的單層細胞，並將所述培養 基替換為包含三倍檢驗濃度試驗物品的完全培養基。使用3TC作為陽性參照物，當單獨加 入培養基時，將此細胞用作未處理的參照物。三天之後，將所述培養基替換為包含適當稀釋 藥物的新鮮培養基。在最初給藥測試化合物之後六天，收集細胞培養物懸浮液，用鏈黴蛋白 酶和脫氧核糖核酸酶(DNAse)處理，然後用於實時定量TaqMan PCR試驗中，使用ABI Prism 7900順序檢測系統(Applied Biosystems 公司，Foster City，CA)，直接測量HBV DNA拷貝。通過將其HBV DNA拷貝與未處理的參照細胞(100% )的拷貝相比較，計算各個檢 驗化合物的抗病毒活性，從而得到抑制作用水平百分比。之後除去上清液，將剩餘細胞進行 CellTiter 96Aqueous One (購自 Promega 公司，Madison，WI)溶液細胞增殖試驗(MTS-基 礎的)，從而檢測細胞存活期。通過將化合物處理後的細胞活性與未處理的細胞參照物的細 胞活性相比較，來確定化合物的細胞毒性，從而得到細胞參照物的百分比。下表和圖23中 顯示了所述研究的結果。 實施例30 全細胞中Src激酶活件的抑制作用在全細胞中本發明化合物⑴能夠抑制Src激酶活性，如圖10A、10B、10C、和IOD 所示。圖IOA是一種描繪C-SrC/NIH-3T3細胞中化合物(I)對Src自動磷酸化作用影響的 圖表；圖IOB是一種描繪HT-29細胞中化合物(I)對Src自動磷酸化作用影響的圖表；圖 IOC是一種描繪c-Src/NIH-3T3細胞中化合物(I)對Src轉磷酸化作用影響的圖表；且圖 IOD是一種描繪HT-29細胞中化合物(I)對Src轉磷酸化作用影響的圖表。在全細胞中，化 合物(I)是一種有效的Src激酶活性抑制劑。如圖10A-10D所示，在全細胞中，化合物(I) 是一種有效的Src激酶活性抑制劑。具體的講，在多種細胞系中，化合物(I)是一種有效的 Src自動磷酸化作用的抑制劑(圖IOA和10B)且是一種Src轉磷酸作用的有效的抑制劑 (圖IOC和10D)。對於附加的轉磷酸作用底物可以得到類似於全細胞的抑制作用，所述附加的轉磷酸作用底物也叫做黏著斑激酶Y925和樁蛋白Y31。在全細胞中，PDGF Y572/574、 表皮生長因子 Y845、JAKl Y1022/1023 和 JAK2 Y1007/1008、Lck Y405 和 ZAP70 Y319 的磷 酸化作用沒有被抑制。Lyn Y416和Bcr/Abl&245的磷酸化作用的抑制作用比較小。實施例31 蛋白質酪氨酸激酶在全細胞中的詵擇件本發明化合物(I)對於蛋白質酪氨酸激酶(PTKs)具有選擇性。圖11是一種描繪 全細胞中同達沙替尼相比化合物(I)對蛋白質酪氨酸激酶(PTKs)選擇性的附圖。所述達 沙替尼是目前在臨床試驗中廣泛使用的腺苷三磷酸-競爭性的Src抑制劑。SYF細胞是一 種缺少Src激酶族成員Src、Yes和Fyn的老鼠成纖維細胞。與達沙替尼相比，化合物⑴ 在全細胞中顯示了相當高的PTK選擇性。實施例32 口服效力本發明化合物(I)顯示了很好的口服效力。例如，圖24顯示了與達沙替尼相比化 合物(I)的口腔效力。使用階段性的HT29(人類結腸癌)老鼠異種移植物，在28天時間內 用kxol處理，並在2. 0和4毫克/公斤時檢測來確定口服效力。對於達沙替尼在25毫克 /公斤時檢測。在第5天，由於重量損失，將達沙替尼劑量減少為15毫克/公斤。實施例33 :HCV初步試驗本發明化合物(I)可用於治療HCV。使用 Pietschmann, T.，et al. J. Virol. 76 4008-4021描述的方法檢測本化合物。ET細胞株是人類肝癌細胞株，Huh_7含有帶有穩定 的螢光素酶(Luc)指針的HCV RNA複製子(基因型Ib)和三個細胞培養物適應性突變。 在37°C下，5%二氧化碳環境中，在Dulbecco' s改進的基礎培養基(DMEM)、10%胎牛血清 (FBS)、1%青黴素-鏈黴素(pen-str印)、1%穀氨醯胺、5毫克/毫升G418中培養細胞。所 有的細胞培養基試劑來自例如，Mediatech(Herndon, VA)。實施例34 向血漿和腦的暴露化合物(I)顯示了很好的血漿和腦的暴露。例如，下面描述了化合物(I)向血漿 和腦的暴露。在口服給藥之後，測量老鼠體內的血漿濃度。在純淨水中配製AU製劑。在服 藥後4小時進行密集的培養，隨後對雄性CD-I鼠給藥。劑量如下所述
組號給藥途徑化合物劑量劑量體積1PO化合物(I) 甲磺酸鹽10102PO化合物(I) 甲磺酸鹽5010*注意給藥的劑量是毫克自由鹼/千克用0. 25毫升乙腈沉澱血漿中的蛋白質，用0. 25毫升乙腈沉澱腦中蛋白質。進行 離心之後，將上清液直接注入到LC/MS系統中。使用50微升等份的血漿和50微升等份的 腦，數量限制為1納克/毫升。腦和血漿的標準曲線是1到1000納克/毫升。高效液相色 譜條件如下所述高效液相色譜系統Shimadzu SCL-10系統
87
分析柱Aquasil Cl 85微米100x2毫米柱。柱溫環境溫度自動取樣器溫度環境溫度流動相A) IOmM甲酸銨在水中的溶液(pH值為4)B)乙月青。流速0. 6毫升/分注射體積2微升梯度
時間(分鐘)1. 01. 62. 63. 83. 94. 14. 44. 64. 657. 0% B202065652020959520停止質譜條件如下所述工具ABISciex API 4000模式ESI+實驗MRM (多重反應監測)轉換化合物(I):m/z 432. 4 ^ 114. 2 (Rt = 3. 11 分鐘)下面的四個表分別顯示了化合物(I)以10毫克/千克和50毫克/千克的劑量進 行單一給藥劑量後的血漿和腦濃度以10毫克/千克的劑量對雄性CD-I鼠進行單一 PO給藥後的化合物(I)的血漿 濃度(第一組)
時間(小時)組A組B組C中值標準差(SD)%CV0BLQBLQBLQ0.000.00NA0.5778.511096.62737.37870.83196.6222.581516.97328.28243.96363.07139.7938.502328.47271.89261.57287.3136.0212.545133.38147.74160.62147.2513.639.26NA:不適用。BLQ 低於定量限制(1毫微克/毫升)BLQ =當計算平均數、標準差和％ CV時為0以10毫克/千克的劑量對雄性CD-I鼠進行單一 PO給藥後的化合物(I)的腦濃 度(第一組)
88 以50毫克/千克的劑量對雄性CD-I鼠進行單一 PO給藥後的化合物(I)的血漿 濃度(第二組) 以50毫克/千克的劑量對雄性CD-I鼠進行單一 PO給藥後的化合物(I)的腦濃
度(第二組) 以10毫克/千克的劑量(第一組)對鼠進行單一劑量給藥之後化合物(I)在老 鼠腦部和血漿中的藥代動力學參數
血漿0. 508711503注意腦Cmax和AUClast的單位分別為毫微克/毫升和毫微克·小時/毫升。腦AUClast/ 血菜 AUClast 的比率是 0. 42。以50毫克/千克的劑量(第二組)對鼠進行單一劑量給藥之後化合物(I)在老 鼠腦部和血漿中的藥代動力學參數
樣品 IDTmax (小時)Cmax (毫微克/ 毫升)AUClast (毫微 克·小時/毫升)腦0. 5036924211血漿0. 50972110818注意腦Cmax和AUClast的單位分別為毫微克/毫升和毫微克·小時/毫升。腦AUClast/ 血菜 AUClast 的比率是 0. 39。實施例35 神經膠質瘤存活者研究進行腦腫瘤鼠異種移植研究來比較化合物⑴和Temodar (替莫唑胺)。在 C57BL/6鼠中進行研究。將GL261神經膠質瘤細胞(在5微升DMEM中IxlO5個)植入顱內 對等位置前囟點、側部2. 0mm、前部1. 2mm、硬腦脊膜3. Omm深度。在移植3天之後開始治 療。治療組如下所示(所有劑量都在100微升的水中)
載體(水)化合物(I) 2.5毫克/千克口月良給藥(bid oral)化合物(I) 5毫克/千克口月艮給藥(bid oral)Temodar (替莫唑胺)5毫 克/千克每周口服給藥一次下表顯示了結果的概括。存活範圍中值和對數軼(log-rank) (mantel-cox)統計
學檢測試驗能夠獲得樣品存活分布的比較結果。 圖24和圖25A-D顯示了不同的治療組中每隻⑶57BL/6鼠體重的增量。下表顯示 了每個治療組末端時的平均體重。圖26的圖表顯示了每個治療組經過40天時間之後的平 均體重。在末端的平均體重 實施例36.使用一種結合物對細胞牛長的協同抑制作用體外檢測化合物(I)和他莫西酚的結合物，從而確定該結合物在MCF-7乳腺癌細 胞中抑制細胞生長的能力。如下所示，通過MTT試驗檢測了一種濃度範圍。第一欄是指化 合物⑴的濃度。 使用CalcuSyn軟體(Biosoft公司)來分析MTT細胞生長數據。該程序使用中值 作用原則(77)來描述兩種藥物之間的相互作用。對於結合物的每種劑量，該程序產生一種 結合指數(Cl)。這種結合指數(Cl)小於1、等於1或者大於1分別表示協同效應、加成作 用或者結抗作用。圖27顯示了 IOOnM他莫昔芬(tamoxifen)與75nM化合物(I)相結合所 獲得的協同的生長抑制效果。計算得到所述結合物的結合指數(Cl)是0.505。其它實施方案儘管本發明已經結合其詳細的說明進行了描述，但是之前的描述只是起到說明作 用，並不能作為本發明範圍的限制，而本發明的範圍由所述權利要求書來定義。本發明其他 的方面、優點和改良也包括在隨後的權利要求書的範圍內。本發明所述領域普通技術人員 應該理解的是，在不背離由所附權利要求書定義的本發明範圍的情況下，可以進行多種形 式和細節方面的改變。
權利要求
用於口服給藥、靜脈內給藥、肌肉給藥或者皮下給藥的藥物組合物，該藥物組合物包括一定量的化合物(I)或其藥學上可接受的鹽，所述一定量是指每劑量中包含2毫克到400毫克，每日給藥2次或3次，該藥物組合物還包括一種藥學上可接受的載體。
2.根據權利要求1所述的藥物組合物，其中，所述一定量是指10毫克到300毫克。
3.根據權利要求1所述的藥物組合物，其中，所述一定量是指20毫克到250毫克。
4.根據權利要求3所述的藥物組合物，其中，所述一定量是指40毫克到200毫克。
5.根據權利要求4所述的藥物組合物，其中，所述一定量是指60毫克到160毫克。
6.用於口服給藥、靜脈內給藥、肌肉給藥或者皮下給藥的藥物組合物，該藥物組合物包 括一定量的化合物(I)或其藥學上可接受的鹽，所述一定量是指每劑量中包含4毫克到800 毫克，每日給藥1次，該藥物組合物還包括一種藥學上可接受的載體。
7.根據權利要求6所述的藥物組合物，其中，所述一定量是指20毫克到600毫克。
8.根據權利要求7所述的藥物組合物，其中，所述一定量是指40毫克到500毫克。
9.根據權利要求8所述的藥物組合物，其中，所述一定量是指80毫克到400毫克。
10.根據權利要求9所述的藥物組合物，其中，所述一定量是指120毫克到320毫克。
11.根據權利要求1-10中任意一項所述的藥物組合物，其中所述組合物包括化合物 (I)的甲磺酸鹽。
12.根據權利要求1-11中任意一項所述的藥物組合物，其中，所述藥物組合物用於口 服給藥。
13.根據權利要求1-11中任意一項所述的藥物組合物，其中，所述藥物組合物用於靜 脈內給藥。
14.根據權利要求1-11中任意一項所述的藥物組合物，其中，所述藥物組合物用於肌 肉給藥。
15.根據權利要求1-11中任意一項所述的藥物組合物，其中，所述藥物組合物用於皮 下給藥。
16.根據權利要求1-5、11-16中任意一項所述的藥物組合物，其中，所述劑量每日給藥 兩次。
17.根據權利要求1-5、11-16中任意一項所述的藥物組合物，其中，所述劑量每日給藥三次。
18.根據權利要求1-17中任意一項所述的藥物組合物，其中，所述組合物與一種或更 多種抗癌治療法或者抗癌劑結合給藥。
19.根據權利要求18所述的藥物組合物，其中，所述組合物與抗癌劑吉西他濱結合給藥。
20.根據權利要求18所述的藥物組合物，其中，所述組合物與抗癌劑奧沙利鉬 (oxaliplatin)結合給藥。
21.一種治療或者預防一種疾病或者紊亂的方法，該方法包括給藥權利要求1-20中任 意一項所述的藥物組合物，其中，所述疾病或者紊亂選自癌症、細胞增殖性紊亂、微生物感 染、過度增殖性紊亂、黃斑水腫、骨質疏鬆症、心血管疾病、眼部疾病、免疫系統機能失調、II 型糖尿病、肥胖症、移植排異、聽力喪失、中風、動脈硬化症、慢性神經性疼痛、B型肝炎和自 身免疫性疾病。
22.根據權利要求21所述的方法，其中，所述疾病或者紊亂是癌症。
23.根據權利要求22所述的方法，其中，所述癌症選自腎癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、胰 腺癌、腦癌、乳腺癌、結腸癌、白血病、卵巢癌、上皮細胞癌和食道癌。
24.根據權利要求22所述的方法，其中，所述癌症選自惡性腫瘤、實性腫瘤、和惡性淋 巴瘤。
25.根據權利要求21所述的方法，其中，所述疾病或者紊亂是細胞增殖性紊亂。
26.根據權利要求25所述的方法，其中，所述細胞增殖性紊亂選自銀屑病、糖尿病性視 網膜病和黃斑變性。
27.根據權利要求21所述的方法，其中，所述疾病或者紊亂是微生物感染。
28.根據權利要求27所述的方法，其中，所述微生物感染選自細菌感染、真菌感染、寄 生蟲感染、和病毒感染。
29.根據權利要求21所述的方法，其中，所述疾病或者紊亂是過度增殖性紊亂、黃斑水 腫、骨質疏鬆症、心血管疾病、眼部疾病、免疫系統機能失調、Π型糖尿病、肥胖症、移植排 異、聽力喪失、中風、動脈硬化症、慢性神經性疼痛、B型肝炎和自身免疫性疾病。
30.一種調節免疫系統活性的方法，包括給藥權利要求1-20中任意一項所述的藥物組 合物。
全文摘要
本發明涉及一種藥物組合物，這種藥物組合物包括2-(5-(4-(2-嗎啉基乙氧基)苯基)吡啶-2-基)-N-苯甲基-乙醯胺或其藥學上可接受的鹽以及一種藥學上可接受的載體。
文檔編號A61K31/5377GK101932319SQ200880120233
公開日2010年12月29日 申請日期2008年10月20日 優先權日2007年10月20日
發明者戴維·G·漢格爾 申請人:金克斯醫藥品有限公司