水稻矮縮病毒非結構蛋白Pns10的新用途的製作方法

2023-05-31 07:17:26 1

專利名稱：水稻矮縮病毒非結構蛋白Pns10的新用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及蛋白的新用途，特別是涉及一個水稻矮縮病毒非結構蛋白Pns10在抑制基因沉默中的應用。
背景技術：
基因沉默現象普遍存在於動、植物體中。現有的轉錄後基因沉默的模型中，沉默基因被降解的途徑主要有PTGS、VIGS等。現有的PTGS模型認為系統沉默的產生是由於在引發基因沉默的區域產生系統基因沉默信號，該信號具有序列特異性，並且能夠經植物的胞間連絲和微管系統傳播到植株的各部分。現在還認為雙鏈RNA的產生是引發PTGS的必要條件。並且認為系統基因沉默信號的產生位點在PTGS的起始階段，即形成dsRNA之前(11.Hamilton，A.，Voinnet，O.，Chappell，L.，and D.C.Baulcombe.2002.Two classes of short interfering RNA in RNA silencing.EMBOJ.174671-4679；Mallory，A.C.，Mlotshwa，S.，Bowman，L.H.，Vance，V.B.2003.The capacity of transgenic tobacco to send a systemic RNA silencingsignal depends on the nature of the inducing transgene locus.Plant J.35，82-92；Susi，P.，M.Hohkuri，T.Wahlroos，and N.，J.，Kilby.2004.Characteristics of RNA silencing in plantssimilarities and differencesacross kingdoms.Plant Mol.Bil.54157-174；Voinnet，O.，Baulcombe，D.C.1997.Systemic signalling in gene silencing.Nature 389，553.Hamilton，A.，Voinnet，O.，Chappell，L.，Baulcombe，D.，2002.Two classes of shortinterfering RNA in RNA silencing.EMBO J.21，4671-4679；Voinnet，O.，Lederer，C.and Baulcombe，D.C.2000.A viral movement protein prevents spreadof the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana.Cell 103157-167.)。被沉默基因的mRNA通過PTGS途徑被降解成21-25nt的siRNA。通過檢測siRNA的存在可確定PTGS的產生，因而siRNA又被稱為PTGS的特徵分子(Bernstein，E.，A.A.Caudy，S.M.Hammond，and G.J.Hannon.2001b.Role for a bidentateribonuclease in the initiation step of RNA interference.Nature 409363-366；Hammond，S.M.，E.Bernstein，D.Beach，and G.J.Hannon.2000.An RNA-directednuclease mediates post-transcriptional gene silencing in Drosophila cells.Nature 404293-296；Tuschl，T.，P.D.Zamore，R.Lehmann，D.P.Bartel，and P.A.Sharp.1999.Targeted mRNA degradation by double-stranded RNA invitro.Genes Dev.133191-3197；Zamore，P.D.，T.Tuschl，P.A.Sharp，and D.P.Bartel.2000.RNAidouble-stranded RNA directs the ATP-dependentcleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals.Cell 10125-33.)。
用二種不同的病毒侵染植物常導致病毒症狀的加重，這種現象稱為病毒的協同效應(synergetic effect)(Pruss，G.，X.Ge，X.M.Shi，J.C.Carrington，and V.B.Vance.1997.Synergismthe potyviral genome encodes a broad-rangepathogenicity enhancer that transactivates replication of heterologousviruses.Plant Cell 9859-868.；Voinnet，O.，C.Lederer，and D.C.Baulcombe.2000.A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signalin Nicotiana benthamiana.Cell 103157-167.)。現已知產生這種現象的機制在於二種病毒中的基因沉默抑制因子功能的疊加或互補，導致對VIGS抑制作用的增強，從而使病毒的複製、侵染等活性得以增強(Ding，S.W.2000.RNA silencing.Curr.Opin.Biotechnol.11152-156；Voinnet，O.，C.Lederer，and D.C.Baulcombe.2000.A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signalin Nicotiana benthamiana.Cell 103157-167.Waterhouse，P.M.，and C.A.Helliwell.2003.Exploring plant genomes by RNA-induced gene silencing.Nature429-38.)。
番茄不孕病毒2b蛋白(Tomato aspermy virus，Tav2b)、黃瓜花葉病毒2b蛋白(Cucumber mosaic virus 2b，Cmv2b)為已經報導的基因沉默抑制因子，具有抑制系統基因沉默的功能(Brigneti，G.，O.Voinnet，W.X.Li，L.H.Ji，S.W.Ding，and D.C.Baulcombe.1998.Viral pathogenicity determinants aresuppressors of transgene silencing in Nicotiana benthamiana.EMBO J.176739-6746；Voinnet，O.2005.Induction and suppression of RNAsilencinginsights from viral infections.Nature 6206-220.)。
基因沉默抑制因子對可移動的系統基因沉默信號的作用主要分為二種一種是使系統基因沉默的信號不能產生；另一類是阻斷沉默信號的傳播途徑(Brigneti，G.，O.Voinnet，W.X.Li，L.H.Ji，S.W.Ding，and D.C.Baulcombe.1998.Viralpathogenicity determinants are suppressors of transgene silencing inNicotiana benthamiana.EMBO.J.176739-6746；Guo，H.S.，and S.W.Ding.2002.A viral protein inhibits the long range signaling activity of the genesilencing signal.EMBO J.21398-407；Voinnet，O.，C.Lederer，and D.C.Baulcombe.2000.A viral movement protein prevents spread of the gene silencingsignal in Nicotiana benthamiana.Cell 103157-167.)。
水稻矮縮病毒(Rice dwarf virus，RDV)的基因組由12條雙鏈RNA組成，將此12個基因分別命名為S1-S10，編碼12個非結構蛋白(Pns1-Pns10)(Xu，H.，Y.Li，Z.J.Mao，Z.Wu，L.Qu，C.An，.X.Ming，J.Schiemann，R.Casper，and Z.L.Chen.1998.Rice dwarf phytovirus segment sll encodes a nucleic acidbinding protein.Virology 240267-272；Zhang，F.，Y.Li，Y.F.Liu，C.C.An，and Z.L.Chen.1997.Molecular cloning，sequencing，and functionalanalysis and expression in E.coli of major core protein gene(S3)of ricedwarf virus Chinese isolate.Acta Virol.141161-168；Zheng，H.H.，L.Yu，C.H.Wei，D.W.Hu，Y.P.Shen，Z.L.Chen，and Y.Li.2000.Assemblyof double-shelled，virus-like particles in transgenic rice plants expressingtwo major structural proteins of Rice dwarf virus.J Virol.749808-9810；Nobuhiro Suzuki.1995.Molecular analysis of the rice dwarf virus genome.VIROLOGY，6pp 89-95)。

發明內容
本發明發明人的研究證實，水稻矮縮病毒非結構蛋白Pns10可以抑制植物中基因沉默過程的產生。
具體來講，應用水稻矮縮病毒非結構蛋白Pns10抑制植物中目的基因沉默的方法，是將編碼水稻矮縮病毒非結構蛋白Pns10的基因S10導入植物組織或細胞，S10表達後，抑制基因沉默過程的產生，從而得到目的基因獲得表達的植株。
所述水稻矮縮病毒非結構蛋白基因S10可通過含有所述水稻矮縮病毒非結構蛋白基因S10的植物表達載體導入植物組織或細胞；用於構建所述植物表達載體的出發載體可為任意一種雙元農桿菌載體，如pE3、pWEIMING101(物理圖譜見圖16、圖17)等。
使用水稻矮縮病毒非結構蛋白基因S10構建植物表達載體時，在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型、組成型、組織特異型或誘導型啟動子，如花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動子、泛生素基因Ubiquitin啟動子(pUbi)等，它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結合使用；此外，使用本發明的基因構建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉錄增強子，這些增強子區域可以是ATG起始密碼子或鄰接區域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區域可以來自轉錄起始區域或結構基因。
為了便於對轉基因植物細胞或植物進行鑑定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工，如加入可在植物中表達的編碼可產生顏色變化的酶或發光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標記物(慶大黴素標記物、卡那黴素標記物等)或是抗化學試劑標記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標記基因，直接以逆境篩選轉化植株。
攜帶有水稻矮縮病毒非結構蛋白基因S10的植物表達載體可通過使用滲透注射技術、農桿菌介導、Ti質粒、植物病毒載體等常規生物學方法轉化植物細胞或組織，並將轉化的植物細胞或組織培育成植株。被轉化的植物宿主可包括雙子葉和單子葉植物，如菸草、擬南芥或水稻等。
實驗證明水稻矮縮病毒非結構蛋白Pns10均能夠顯著提高植株中瞬時GUS基因的表達量和表達持續時間，與已鑑定的基因沉默抑制因子Cmv2b和Tav2b具有相同的提高基因瞬時表達量的功能，同時Pns10能夠提高轉基因GFP的表達量，是一種新的基因沉默抑制因子，從而為利用植物材料快速、大量表達異源蛋白提供了有效的技術路線。本發明具有較高的實際應用價值。


圖1為滲透注射後6天轉基因菸草葉片綠色螢光蛋白的觀察結果圖2為Northern雜交檢測滲透注射後6天轉基因菸草葉片內GFP基因轉錄情況和由GFP基因的mRNA降解產生的siRNA的積累情況的結果圖3為Western Blott檢測轉基因菸草內S10蛋白表達情況的結果圖4為通過觀察經滲透注射的轉基因菸草系統葉GFP的螢光發光情況檢測Pns10作為基因沉默抑制因子對系統基因沉默的抑制作用的結果圖5A為檢測S10與GFP分離注射後對系統基因沉默的影響的實驗結果圖5B為Northern雜交檢測經滲透注射的轉基因菸草系統葉GFP的轉錄情況檢測Pns10作為基因沉默抑制因子對系統基因沉默的抑制作用的結果。
圖6為GFP基因雙鏈RNA與S10基因瞬時共表達檢測Pns10作為基因沉默抑制因子對由雙鏈RNA引起的局部和系統基因沉默的抑制作用的結果圖7為Northern雜交檢測Pns10作為基因沉默抑制因子對由雙鏈RNA引起的局部和系統基因沉默的抑制作用的結果圖8為(35S-ssGFP或35S-dsGFP)與RDV S10或Tav2b四種組合空間分離滲透注射方式的示意9為GUS組織化學染色觀察經滲透注射農桿菌組合35S-GUS+35S-S10、35S-GUS+35S-Tav2b、35S-GUS+35S-Cmv2b的轉基因菸草葉片中GUS基因表達情況的結果圖10為經滲透注射農桿菌組合35S-GUS+35S-S10、35S-GUS+35S-Tav2b、35S-GUS+35S-Cmv2b的轉基因菸草葉片中GUS活性的螢光檢測結果圖11為經滲透注射農桿菌35S-S10、35S-Tav2b的轉基因菸草葉片中GFP活性的綠色螢光的觀察結果圖12為經滲透注射農桿菌35S-S10、35S-Tav2b的轉基因菸草葉片中GFP活性的Northern雜交檢測結果圖13為分別含S10及其突變體基因的PVX病毒載體pGR107-S10和pGR107-ΔS10侵染菸草第9和第20天後注射葉片的染病情況圖14為分別含S10及其突變體基因的PVX病毒載體pGR107-S10和pGR107-ΔS10侵染菸草第20天後系統葉片的染病情況圖15為分別含S10及其突變體基因的PVX病毒載體pGR107-S10和pGR107-ΔS10侵染菸草第9、20天後葉片中PVX基因組的mRNA穩定態累積量的Northern雜交檢測結果圖16為質粒pE3的物理圖譜圖17為質粒pWEIMING101的物理圖譜圖18為載體p35S-ssGFP的構建流程19為pCAMBIA1300的物理圖譜圖20為pGR107病毒載體的部分物理圖譜圖21為質粒Jawohl8 RNAi的物理圖譜具體實施方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法，所用引物均由上海生工合成。
滲透注射菌懸液的製備用滲透注射緩衝液重懸菌體至濃度為OD600＝1。室溫下放置3小時以上。如為混合注射，則各菌按相等濃度、等量混合。
滲透注射緩衝液的組成為高壓滅菌蒸餾中含MES 10mM，乙醯丁香酮(AS)150μM，MgCl210mM。
滲透注射方法在植株葉片上用一次性注射器針頭打一小孔。吸有農桿菌的注射器去針頭，並對準、抵住葉片小孔處，另一隻手的食指在葉片另一面抵住小孔，輕推注射器使液體緩慢注射入葉片內。
實施例1、編碼水稻矮縮病毒非結構蛋白中具有抑制基因沉默作用蛋白的基因S10的篩選及檢測一、從水稻矮縮病毒(RDV)的基因組中篩選編碼具有抑制基因沉默作用蛋白的基因1、水稻矮縮病毒非結構蛋白基因S1-S12的克隆根據水稻矮縮病毒非結構蛋白基因S1-S12的序列(GenBank登錄號分別為NC_003773、AY847464、NC_003772、NC_003761、NC_003762、NC_003763、AY305383、D00536、NC_003765、D10221、NC_003767、NC_003768)設計引物進行PCR擴增，引物序列如下擴增S1的引物Ps1F(正向引物)5』-AGAGATCTATGGATCTTGCGAGGTCGGA-3』Ps1R(反向引物)5』-GCGAATTCTCACATTTGCTCGTCGCTCT-3』；擴增S2的引物Ps2F(正向引物)5』-AGAGATCTATGGCTTATCCTAATGACGT-3』Ps2R(反向引物)5』-GCGAATTCTCACAATGCATCATAGATAG-3』；擴增S3的引物Ps3F(正向引物)5』-AGAGATCTATGGACAGTACCGGCCGAGC-3』Ps3R(反向引物)5』-GCGAATTCTCACAGAGGCGGCTGATCTC-3』；擴增S4的引物Ps4F(正向引物)5』-AGAGATCTATGAACCAATCTCGAAGCTT-3』Ps4R(反向引物)5』-GCGAATTCTTACTTTGACAGCTTAGAAG-3』；擴增S5的引物Ps5F(正向引物)5』-AGAGATCTATGTCGAACCCGGACTATTG-3』Ps5R(反向引物)5』-GCGAATTCTCAGATTTTGAATACCAAAT-3』；擴增S6的引物Ps6F(正向引物)5』-AGAGATCTATGGACACAGAAACTCTTTG-3』Ps6R(反向引物)5』-GCGAATTCTTATTTGTACACGGTAATAG-3』；擴增S7的引物Ps7F(正向引物)5』-AGAGATCTATGTCTGCGATTGTAGGCCT-3』Ps7R(反向引物)5』-GCGAATTCTCATAAAGTTGACAACTTTT-3』；擴增S8的引物Ps8F(正向引物)5』-AGAGATCTATGTCACGCCAGATGTGGTT-3』
Ps8R(反向引物)5』-GCGAATTCGTATGCGCACCAGCAGATTC-3』；擴增S9的引物Ps9F(正向引物)5』-AGAGATCTATGGGTAAGCTCCAAGATGG-3』Ps9R(反向引物)5』-GCGAATTCTCAAACTGAGGGTGCGAGTC-3』；擴增S10的引物Ps10F(正向引物)5』-AGAGATCTATGGAAGTAGACACTGCTA-3』Ps10R(反向引物)5』-TTAGGAACCGCCGCCTTTAAGAGCA-3』；擴增S11的引物Ps11F(正向引物)5』-AGAGATCTGCGAATTCATGAGTGGAACA-3』Ps11R(反向引物)5』-TTAGGAACTTAGGAACTTACTTACGCTT-3』；擴增S12的引物Ps12F(正向引物)5』-AGAGATCTATGTTCAAGAGTGGGTCCGG-3』Ps12R(反向引物)5』-TTAGGAACTCACCGTTCAAGAGAAAAGG-3』以水稻矮縮病毒的基因組RNA為模板，分別在上述12對引物的引導下進行RT-PCR擴增，50ul PCR反應體系為dNTP(2.5mM)2.5ul，10×PCR緩衝液5ul，模板1ul，Taq酶+pfu酶(3U/ul)2ul+0.5ul，H2O 39ul。PCR反應條件為94℃ 5min，50-55℃ 45sec，72℃1-3min，72℃10min(反應條件依各被擴增基因的長度和各自引物鹼基組成的不同而不同)。反應結束後，對PCR產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果經PCR擴增得到了大小分別為4422bp、3511bp、3195bp、2218bp、2449bp、1579bp、1559bp、1424bp、1224bp、1321bp、1036bp和1066bp的片段，將上述擴增片段回收並經純化後分別轉化E.coli DH5α感受態細胞，挑選陽性克隆提質粒，進行測序，測序結果表明獲得了序列正確的水稻矮縮病毒12個非結構蛋白基因S1-S12。
2、載體構建1)構建含有花椰菜花葉病毒的35S啟動子和水稻矮縮病毒非結構蛋白基因的載體將步驟1克隆的12個水稻矮縮病毒非結構蛋白基因S1-S12用限制性內切酶BglII和EcoRI酶切後，分別與經相同酶雙酶切的載體pE3連接，得到含有花椰菜花葉病毒的35S啟動子和水稻矮縮病毒非結構蛋白基因的重組載體，分別命名為p35S-S1-p35S-S12。
2)構建含有花椰菜花葉病毒的35S啟動子和S10提前終止突變體基因的載體S10翻譯提前終止突變體片斷是將其讀碼框的第二位的穀氨酸(GAA)替換成終止密碼TAA。該突變位點是通過設計5』端引物而引入的。方法是在引物5』-GGGGTACCCCAACATGTAAGTAGACACTGC-3』(黑斜體鹼基為終止密碼)和5』-GCTCTAGAGCTTAAGAACTGCCGCCTTTGA-3』的引導下進行PCR擴增，PCR反應條件為先94℃5分鐘，55℃40秒，72℃1分鐘30秒，共30個循環，最後72℃10分鐘。將PCR產物和植物表達載體pWEIMING101經Kpn I和Xba I酶切後，連接、重組得到S10提前終止突變克隆載體，命名為p35S-S10stop。
3)構建含有花椰菜花葉病毒的35S啟動子和單鏈綠色螢光蛋白(GFP)基因的載體。
將包含GFP基因的克隆載體pRTL2-GFP(物理圖譜見圖18)經Hind III酶切後得到GFP基因片斷，然後將GFP基因片斷克隆到經同樣酶酶切的載體pWEIMING101中，得到包含GFP基因的植物表達載體，命名為p35S-ssGFP，構建流程見圖18。
4)構建含有花椰菜花葉病毒的35S啟動子和番茄不孕病毒(Tomato aspermycucumovirus，Tav)編碼的基因沉默抑制因子Tav2b基因的載體將番茄不孕病毒(Tomato aspermy cucumovirus，Tav)編碼的基因沉默抑制因子Tav2b基因克隆入載體pCAMBIA1300(物理圖譜見圖19)中，得到的Tav2b基因的植物表達載體，命名為pCAMBIA1300-T2b。
5)構建分別含有S10、S10缺失和移碼突變基因和S10 25K缺失突變基因的PVX載體以水稻矮縮病毒的基因組RNA為模板，在引物Ps10F(引物序列為5』-AGATCGATATGGAAGTAGACACTGCTA-3』)和Ps10R(引物序列為5』-AGGTCGACTTAGGAACCGCCGCCTTTAA-3』)的引導下進行PCR擴增，得到含Cla I和Sal I識別位點的S10基因。PCR反應條件為先94℃，5分鐘；55℃，40秒；72℃，1分鐘30秒，共30個循環，然後72℃ 10分鐘。將PCR產物和pGR107(部分物理圖譜見圖20，其中LB、RB分別表示整合到植物基因組中的左、右邊界，RdRP代表病毒的依賴於RNA的RNA聚合酶，25K、12K、8K和CP分別代表病毒編碼的25K、12K、8K和外殼蛋白，MCS代表多克隆位點，下方箭頭所示gRNA、sgRNA1、sgRNA2和sgRNA3分別代表病毒轉錄產物基因組、亞基因組1、亞基因組2和亞基因組3)經Cla I和Sal I酶切後，經過連接、轉化和在含50ug/mL卡那黴素的LB抗性培養基上篩選陽性克隆，提質粒，將質粒載體命名為pGR107-S10。含有S10缺失和移碼突變的克隆載體pGR107-ΔS10的構建方法為將pGR107-S10載體用Csp45 I酶切，用T4 DNApolymerase補平，再經連接得到。含有PVX p25缺失突變克隆pGR107-Δ25K-S10是用pGR107-S10經Bsu36I酶切，DNA聚合酶補平並連接後得到，該25K缺失突變基因保留3』端的75個核苷酸，將該質粒命名為PVXΔ25K-S10。
3、轉化農桿菌將步驟2構建的載體p35S-S1-p35S-S12、p35S-S10stop、p35S-ssGFP、pCAMBIA1300-T2b和PVXΔ25K-S10分別轉化農桿菌EHA105，篩選轉化子，將轉化有上述載體的陽性克隆分別命名為35S-S1-35S-S12、35S-S10stop、35S-ssGFP、35S-Tav2b和PVX-S10。
4、利用GFP的瞬時表達結果從水稻矮縮病毒的基因組中篩選具有抑制基因沉默作用的基因採用滲透注射技術，將水稻矮縮病毒12個非結構蛋白基因的轉化農桿菌35S-S1至35S-S12與單鏈GFP基因的轉化菌35S-ssGFP等濃度(OD600＝1)、等體積混合，共注射轉有GFP基因的菸草(Nicotiana benthamiana)16c株系，同時以35S-Tav2b和35S-ssGFP共注射植株作為正對照，以35S-S10stop和35S-ssGFP共注射植株作為負對照，以35S-ssGFP單獨注射植株為參照。注射後2-3天，在長波長的紫外燈下觀察上述轉基因植株內GFP基因的瞬時表達情況。正常情況下，GFP應呈現較亮的綠色螢光，而野生型的菸草在紫外燈下呈紅色(由於葉綠素在紫外燈下呈紅色的緣故)，且轉有GFP基因的菸草(Nicotiana benthamiana)16c在GFP基因沉默的情況下也呈紅色。結果35S-ssGFP單獨注射和與上述其它轉化菌同時注射的葉片，由於外源和內源GFP基因同時表達的緣故，注射區域在紫外燈下呈現亮的綠色螢光。在共注射組合35S-S10+35S-ssGFP、35S-Tav2b+35S-ssGFP中，注射區域的螢光可一直持續保持發光達7天以上，並且前一種組合(35S-S10+35S-ssGFP)注射區的螢光強度比後一種的(35S-Tav2b+35S-ssGFP)較弱。共注射PVXΔ25K-S10+35S-ssGFP的結果與上述相同。而35S-Tav2b+35S-ssGFP共注射區的螢光可一直持續發光直到注射區的葉片組織死亡為止。35S-ssGFP單獨或與除35S-S10以外的其它轉化有花椰菜花葉病毒的35S啟動子和水稻矮縮病毒非結構蛋白基因的農桿菌轉化菌以及與35S-S10stop共注射的葉片區域從第3天開始，綠色螢光蛋白的螢光亮度逐漸減弱，至第6-7天則完全變紅(如圖1所示，1、2、3、4分別表示注射有下述組合的GFP轉基因菸草葉片35S-ssGFP+35S-S10、35S-ssGFP+PVXΔ25K-S10、35S-ssGFP+35S-Tav2b、35S-ssGFP+35S-S10stop；5表示經35S-ssGFP單獨注射的葉片)。與經文獻報導的結果相同，GFP綠色螢光的丟失表明GFP基因的表達被沉默(Anandalakshmi et al.，1998；Brignetiet al.，1998；Hamilton et al.2002；Voinnet et al.，1997)。GFP螢光的觀察結果表明，S10的表達與番茄不孕病毒(Tomato aspermy cucumovirus，Tav)編碼的基因沉默抑制因子Tav2b一樣，具有抑制基因沉默(本實施例為GFP基因)的功能。而RDV的其它11個非結構蛋白基因表達後則沒有此功能。
二、Northern雜交檢測轉基因菸草內GFP基因的表達水平進一步用Northern雜交的方法鑑定水稻矮縮病毒12個非結構蛋白基因中負責編碼基因沉默抑制因子的基因。對步驟一獲得的各種注射滲透組合的葉片材料在第6天取樣，剪下注射區域，提取RNA後進行Northern雜交驗證，所用探針為地高辛標記的GFP基因，結果如圖2所示(泳道1-5分別表示經35S-ssGFP+35S-Tav2b、35S-ssGFP+PVXΔ25K-S10、35S-ssGFP+35S-S10、35S-ssGFP+35S-S10stop組合注射和經35S-ssGFP單獨注射的葉片；圖中底部rRNA為溴化乙錠染色的18S RNA，作為相等上樣量的標示)，共注射35S-ssGFP+35S-S10和35S-ssGFP+35S-Tav2b的葉片的穩定態mRNA的表達水平在第6天仍有大量的積累，而單獨注射35S-ssGFP或35S-GFP+35S-S10stop注射組合的轉基因植株葉片組織中的mRNA則基本上檢測不到，表明1)外源引入的GFP基因的大量表達可引起內、外源GFP基因的沉默，即在第6天時35S-ssGFP單獨注射或與35S-S10stop共注射導致GFP基因不表達，其mRNA被降解；2)與對照相比，35S-ssGFP+35S-S10共注射葉片GFP基因的mRNA仍有大量積累，與步驟一中GFP螢光仍然保持的觀察結果一致，證明RDV S10與Tav2b一樣，具有抑制由ssGFP引起的基因沉默的功能，進一步從分子水平上證明S10是RDV的基因沉默抑制因子。
三、Northern雜交檢測轉基因菸草內siRNA的積累情況將步驟一獲得的的各種注射滲透組合的葉片材料在第6天取樣，剪下注射區域，提取小RNA樣品，通過變性15％PAGE膠分離，以地高辛標記的GFP基因為探針進行Northern雜交，檢測由GFP基因的mRNA降解產生的siRNA的積累情況，結果如圖2所示，35S-ssGFP單獨注射或與S10stop共注射的葉片內siRNA大量積累。與對照相比，共注射組合35S-ssGFP+S10和35S-ssGFP+TAV2b葉片中的siRNA的積累量則顯著減少，表明負對照(35S-ssGFP單獨注射或與S10stop共注射)組的植株在注射後第6天GFP基因的mRNA的消失的確是由於其被特異性地降解成siRNA，而共注射組合35S-ssGFP+S10、35S-ssGFP+Tav2b樣品中GFP基因的mRNA大量累積，且siRNA相對少量累積，表明GFP基因的mRNA經PTGS機制的降解過程被大部分抑制，即RDV S10與Tav2b一樣，具有抑制GFP基因轉錄後基因沉默的功能。此外，35S-S10和35S-TAV2b二種與35S-GFP共注射的樣品中均有少量21nt、25nt的siRNA產生，說明RDV S10與Tav2b一樣，均不能完全阻斷或去除siRNA的產生(Guo，H.S.and Ding S.-W.2002.A viral protein inhibitsthe long range signaling activity of the gene silencing signal.EMBO J.21398-407.；Li，H.W.，A.P.Lucy，H.S.Guo，W.X.Li，L.H.Ji，S.M.Wong，S.W.Ding.1999.Strong host resistance targeted against a viralsuppressor of the plant gene silencing defence mechanism.EMBO J182683-2691.)。
四、Western Blott檢測轉基因菸草內S10蛋白的表達情況1、S10在農桿菌中的克隆將實施例1獲得的p35S-S10用Bgl II和EcoR I雙酶切後，切膠回收S10，將其克隆到經同樣酶雙酶切的植物表達載體pE3中，經連接得到含有S10的重組載體，命名為pE3-S10。在含有50ug/mL的利福平和50ug/mL的壯觀黴素的3-5mL LB液體培養基中接種農桿菌EHA105，在28℃、200rpm下振蕩培養12-24小時至菌濃度OD600＝1-2，再按1∶1000擴大培養至菌濃度OD600＝1-2，擴大培養基組成LB液體培養中含MES 10mM，AS20μM，50ug/mL的利福平和50ug/ml的壯觀黴素。培養結束後，2000g離心5分鐘，去除上清。
2、S10在大菸草中的表達將步驟一構建的含S10的重組載體pE3-S10轉化農桿菌AGL-1，挑選陽性克隆，滲透注射入菸草葉片中(Nicotiana benthamiana)16c株系，使S10在菸草內瞬時表達。
3、Western Blott檢測轉基因菸草內Pns10的表達情況用Western Blott法檢測步驟一獲得的35S-ssGFP+PVX-S10、35S-ssGFP+35S-S10stop共注射植株內S10編碼蛋白Pns10的表達情況，以步驟1在大腸桿菌中表達的S10蛋白和步驟2轉化有pE3-S10的植株內表達的Pns10為陽性對照，所用抗體為常規方法製備的Pns10抗體，結果如圖3所示(泳道1-5分別表示在大腸桿菌中表達的Pns10、瞬時表達pE3-S10的植株內的Pns10、35S-ssGFP+PVX-S10共注射植株內Pns10的表達情況、35S-ssGFP+S10stop共注射植株內Pns10的表達情況、空白對照)，表明S10的翻譯提前終止突變體35S-S10stop沒有抑制基因沉默的功能，該突變體不能翻譯成完整的Pns10，與正常Pns10所具有的抑制基因沉默功能相比，RDV S10所具有的基因沉默抑制子的功能是其蛋白Pns10、而非其核酸的作用產生的。
實施例2、檢測水稻矮縮病毒的非結構蛋白Pns10作為基因沉默抑制因子對系統基因沉默的抑制作用一、通過觀察GFP的螢光檢測水稻矮縮病毒的非結構蛋白Pns10作為基因沉默抑制因子對系統基因沉默的抑制作用以GFP基因為例檢測水稻矮縮病毒的非結構蛋白Pns10作為基因沉默抑制因子對系統基因沉默的抑制作用。實施例1的試驗結果表明Pns10具有抑制本葉(即葉片的滲透注射區)GFP基因沉默的功能。GFP轉基因菸草Nicotiana benthamiana 16c株系經滲透注射35S-ssGFP、35S-ssGFP+35S-S10stop不但能誘導本葉的GFP基因沉默(圖1中的4、5所示)，而且還能在2周以後引起上部系統葉以及最後全植株的GFP基因沉默(Voinnet，O.，and D.C.Baulcombe.1997.Systemic signalling in genesilencing.Nature 389553.)。為了確定RDV Pns10作為基因沉默抑制因子是否對系統基因沉默具有抑制作用，觀察經下述各種滲透注射組合的菸草植株GFP的表達情況，方法為在轉GFP基因的菸草Nicotiana benthamiana 16c株系處於4葉期大小的時候，在植株的底部2片葉上分別注射各種農桿菌組合，6-7天後觀察上部未注射葉片(稱為系統葉)的GFP表達情況，結果如圖4所示(1-3分別表示經35S-ssGFP單獨注射、35S-ssGFP+35S-S10、35S-ssGFP+35S-Tav2b)，負對照組中的35S-ssGFP單獨注射組的植株最早從注射後第6天開始在最上部的系統葉上即開始出現GFP基因的沉默現象，表現為在紫外燈下，先在主葉脈和次級葉脈處出現紅色，繼而擴展到整個葉片(注射2周後)乃至整個植株(注射15天後的觀察結果見圖4中的第1圖)，大部分的負對照均出現GFP的系統沉默現象。共注射35S-ssGFP+35S-S10、35S-ssGFP+35S-Tav2b的大部分植株均未發現GFP系統沉默上傳的現象(見圖4中的第2、3圖)。
二、Northern雜交檢測水稻矮縮病毒的非結構蛋白Pns10作為基因沉默抑制因子對系統基因沉默的抑制作用用與實施例1相同的方法，通過檢測步驟一獲得的轉基因菸草內GFP基因的表達水平和由GFP基因的mRNA降解產生的siRNA的積累情況，檢測水稻矮縮病毒的非結構蛋白Pns10作為基因沉默抑制因子對系統基因沉默的抑制作用，顯微注射結果如圖5A所示，Northern雜交檢測結果如圖5B所示(泳道1-5分別表示經35S-ssGFP+35S-S10、35S-ssGFP+35S-Tav2b、35S-ssGFP(T)+35S-S10(B)、35S-ssGFP單獨注射、35S-ssGFP(B)+35S-S10(T)滲透注射的葉片；B和T分別代表葉的基部(base)和頂部(tip)單獨注射的葉片；圖中底部rRNA為溴化乙錠染色的18S RNA，作為相等上樣量的標示)，35S-ssGFP+35S-S10、35S-ssGFP+35S-Tav2b和35S-ssGFP(T)+35S-S10(B)共注射植株的系統葉中GFP基因的mRNA含量豐富，由其降解的siRNA則檢測不到(見泳道1-3)，負對照組(35S-ssGFP單獨注射、35S-ssGFP(B)+35S-S10(T))的GFP基因的mRNA基本檢測不到，而由其降解的siRNA則大量地累積(見泳道4-5))。與步驟一GFP綠色螢光觀察結果相一致，進一步證明RDV S10對由ssGFP引起的系統沉默同樣具有抑制作用。表明Pns10對GFP的系統基因沉默具有抑制作用，其作用機制可能阻斷系統基因沉默信號的傳播或使其失活。
實施例3、檢測水稻矮縮病毒的非結構蛋白Pns10作為基因沉默抑制因子對由雙鏈RNA引起的局部和系統基因沉默的抑制作用實施例2的試驗結果表明水稻矮縮病毒的非結構蛋白Pns10對於由ssGFP引起的局部和系統的GFP基因沉默均有抑制作用。現有的PTGS模型認為系統沉默的產生是由於在引發基因沉默的區域產生系統基因沉默信號，該信號具有序列特異性，並且能夠經植物的胞間連絲和微管系統傳播到植株的各部分。現在還認為雙鏈RNA的產生是引發PTGS的必要條件。並且認為系統基因沉默信號的產生位點在PTGS的起始階段，即形成dsRNA之前。有鑑與此，用下述實驗進一步分析RDV S10作用於PTGS途徑中的具體步驟，從而更深入地闡明S10的作用機制。該實驗所依據的原理是，在植物細胞中引入GFP基因的雙鏈RNA(dsGFP)，按照PTGS作用模式，同樣能夠引發GFP的沉默，而且根據已有的報導，雙鏈RNA比單鏈RNA是更強的引起基因沉默的誘導分子(Bernstein et al.，2001；Elbashir et al.，2001b；Fire et al.，1998；Tuschl et al.，1999；Voinnetet al.，1998；Winston et al.，2002)。ssRNA和dsRNA引起PTGS的區別在於前者需要細胞的RdRP以合成雙鏈，而後者不依賴於這一過程而直接形成dsRNA。如果S10與PTGS的作用位點在形成dsRNA的上遊，則在S10與35S-dsRNA GFP共表達的情況下，推測S10不能夠影響GFP的RNA沉默的產生。反之如果S10作用於形成dsRNA的下遊，則無論由ssRNA還是dsRNA引起的GFP的RNA沉默均受到抑制。利用dsRNA與待鑑定的基因沉默抑制因子共表達，觀察基因沉默是否受影響，可以確定該因子是作用於形成dsRNA的上遊還是其下遊，或是與dsRNA相結合。具體方法如下1、含有GFP基因反向重複序列的載體pJawohl8-GFP RNAi的構建及農桿菌轉化子的獲得構建含反向重複序列GFP的植物表達載體pJawohl8-GFP RNAi的過程如下GFP基因片斷經PCR擴增獲得，模板為克隆的GFP基因(GeneBank No.M62653)，引物序列為5-CACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3』和5』-GGGGTACCTTACTTGTACAGCTCGTCCA-3』。PCR反應條件為94℃ 5分鐘，52℃ 40秒，72℃ 1分鐘15秒，共30個循環；然後72℃ 10分鐘。用Invitrogen公司的「TOPO克隆技術」將PCR擴增的GFP基因先克隆到中間載體pTOPO中，反應條件為PCR GFP片斷(約100ng/μl)5.5μl，pENTR 2μl，Salt solution2.5μl，室溫下放置1小時或適當延長反應時間，將連接產物轉化大腸桿菌DH5α，在含有50ug/ml卡那黴素的LB培養基上篩選陽性克隆，提質粒，命名為pENTR-GFP。然後將陽性克隆質粒再與載體pJawohl8 RNAi(物理圖譜見圖21及載體序列為GeneBankNo.AF408413)一起經LR重組反應，將二個GFP片斷重組進載體pJawohl8 RNAi中，反應體系及反應條件為5×LRreaction buffer 4μl，pENTR-GFP 10μl，pJawohl8 RNAi4μl，LR clonase Mix 2μl，室溫下反應12-24小時，將產物轉化大腸桿菌DH5α，將在含有50ug/mL氨卞青黴素的LB培養基上篩選陽性克隆，提質粒，得到含有GFP基因反向重複序列的質粒載體，命名為pJawohl8-GFP RNAi。該載體在轉錄後由於有同源配對序列將形成GFP基因的雙鏈RNA，從而抑制GFP基因的表達。將pJawohl8-GFP RNAi電擊轉化農桿菌GV3101(其中包含質粒pMP90RK)，篩選陽性重組子，命名為35S-dsGFP。
2、GFP基因雙鏈RNA與S10基因瞬時共表達檢測水稻矮縮病毒的非結構蛋白Pns10作為基因沉默抑制因子對由雙鏈RNA引起的局部和系統基因沉默的抑制作用將35S-ssGFP、35S-dsGFP分別和35S-S10、35S-Tav2b混合後，分別滲透注射入GFP轉基因菸草Nicotiana benthamiana 16c株系中，以35S-ssGFP+35S-dsGFP以及35S-ssGFP+35S-dsGFP+35S-S10stop混合菌注射植株作為負對照。其中各組合中加入單鏈、正義鏈GFP基因是為了便於觀察GFP基因的表達及其沉默狀況，因為35S-dsGFP不能表達GFP。在注射5天後在紫外燈下觀察並拍照，結果如圖6所示(1-4分別表示ssGFP+dsGFP、35S-ssGFP+35S-dsGFP+35S-S10、35S-ssGFP+35S-dsGFP+S10stop、35S-ssGFP+35S-dsGFP+35S-Tav2b注射組的葉片；5表示35S-S10+35S-dsGFP在植株底部葉片注射後15天系統葉片GFP沉默的情況)，混合注射ssGFP+dsGFP、35S-ssGFP+35S-dsGFP+35S-S10及35S-ssGFP+35S-dsGFP+S10stop的葉片中GFP基因完全沉默。同時在注射後15天觀察，系統葉也發生了GFP基因的沉默現象，表明S10對於由雙鏈RNA引起的局部和系統基因沉默均沒有抑制作用。而混合注射35S-ssGFP+35S-dsGFP+35S-Tav2b的本葉在葉片注射區存活的情況下，GFP一直表達，表明Tav2b對於由雙鏈引起的GFP局部基因沉默具有抑制作用(圖6中的第4圖)。
3、Northern雜交檢測水稻矮縮病毒的非結構蛋白Pns10作為基因沉默抑制因子對由雙鏈RNA引起的局部和系統基因沉默的抑制作用用與實施例1相同的方法，通過檢測步驟2獲得的轉基因菸草內GFP基因的表達水平和由GFP基因的mRNA降解產生的siRNA的積累情況，檢測水稻矮縮病毒的非結構蛋白Pns10作為基因沉默抑制因子對由雙鏈RNA引起的局部和系統基因沉默的抑制作用，結果如圖7所示(泳道1-4分別表示ssGFP+dsGFP、35S-ssGFP+35S-dsGFP+35S-S10、35S-ssGFP+35S-dsGFP+S10stop、35S-ssGFP+35S-dsGFP+35S-Tav2b注射組的葉片；泳道5表示35S-S10+35S-dsGFP在植株底部葉片注射後15天系統葉片GFP沉默的情況)，表明S10對於由雙鏈RNA引起的局部和系統基因沉默均沒有抑制作用(見泳道2)。但系統葉在注射35S-ssGFP+35S-dsGFP+35S-Tav2b 2周以後GFP沉默，表明Tav2b對於由雙鏈RNA引起的GFP局部基因沉默具有抑制作用(見泳道4)，而對系統沉默沒有抑制作用(因與S10混合注射引起的結果相同，數據未顯示)。Northern雜交檢測結果與GFP螢光觀察結果一致，進一步證明1)RDV S10不能抑制由雙鏈RNA產生的局部和系統GFP基因沉默。由此推測S10作用於PTGS途徑中雙鏈RNA產生的上遊，即可能作用於細胞中的RdRP或其輔助因子。2)Tav2b對由雙鏈引起的GFP局部基因沉默具有抑制作用，但對系統基因沉默則沒有作用。暗示系統基因沉默信號的產生和傳播路徑可能具有以下二種性質(1)系統基因沉默信號可能不止一種；(2)該信號的傳播途徑可能也不止一條。並且這種多信號組成或多信號傳播途徑依賴於引起基因沉默引發分子的不同(即單鏈或雙鏈RNA)。這二種可能性或者同時存在，或者其中任何一種存在均導致所觀察的結果。而Tav2b對不同形式的引發分子產生的不同結果則說明其可能只作用於其中的一種信號或阻斷其中的一條傳播途徑。
實施例4、水稻矮縮病毒的非結構蛋白Pns10在基因沉默信號傳播途徑中的表達對系統基因沉默影響的分析實驗上述實施例中的實驗表明RDV S10具有抑制系統基因沉默信號產生的功能。已知基因沉默信號的傳播過程實際上也是其不斷擴增、放大的過程(Himber，C.，P.Dunoyer，G.Moissiard，C.Ritzenthaler，and O.Voinnet.2003.Transitivity-dependent and-independent cell-to-cell movement of RNAsilencing.The EMBO Journal 224523-4533.)，當RDV S10在基因沉默信號傳播的途徑中表達時，即在產生沉默信號的區域(稱為信號的源，source)與接受信號區域之間表達，如果Pns10對基因沉默信號產生作用，則勢必影響該信號的傳播，並最終影響基因系統沉默的產生。參照Guo等描述的方法(Guo，H.S.and Ding S.-W.2002.A viral protein inhibits the long range signaling activity of the genesilencing signal.EMBO J.21398-407.)中所進一步確定Pns10對系統基因沉默信號的作用方式，具體方法為將引起GFP沉默的引發分子(35S-ssGFP或35S-dsGFP)與RDV S10或Tav2b分別經滲透注射入同一葉片的不同部位(基部或頂部)或同一植株的的不同部位(上部葉片和下部葉片)，其空間分離滲透注射方式的示意圖如圖8所示(紅色代表注射含基因沉默抑制因子的農桿菌區域，綠色代表注射含GFP基因的農桿菌區域)。含GFP基因沉默的引發分子(ssGFP或dsGFP)與基因沉默抑制因子(S10或Tav2b)的4種組合及其注射方式對GFP系統基因沉默影響的部分統計結果如表2所示。當S10或Tav2b在系統基因沉默信號傳播的途徑中表達時(即在葉基部或植株的第二片系統葉)，而系統沉默信號在葉頂部或第一片葉中由35S-ssGFP產生時，大部分植株中GFP基因的系統沉默不能產生(表2中的第8、12組合)。但在同樣的注射方式下，當產生信號源為dsGFP時，幾乎所有的植株均有系統基因沉默的產生(表2中的第10、14組合)。負對照中所有植株中的GFP基因也均產生系統基因沉默。用Tav2b所做的同樣的實驗所得結果與S10的實驗結果一致(表2中未列出)。以上實驗表明Pns10能夠抑制由GFP單鏈、正義鏈引起的系統基因沉默信號的傳播，從而使GFP系統基因沉默不能夠建立。而對由GFP雙鏈引起的系統基因沉默信號的傳播和系統基因沉默的建立沒有影響。
表2 各種組合農桿菌滲透注射引起的GFP系統基因沉默株數統計表

*括號中的B和T分別指注射部位葉的基部(Base)和頂部(Tip)；**括號中的U和L分別指植株的上部葉(Upper)和下部葉(Lower)。
實施例5、水稻矮縮病毒的非結構蛋白Pns10具有增強瞬時和永久基因表達的功能驗證實驗一、檢測水稻矮縮病毒的非結構蛋白Pns10對瞬時表達GUS基因的影響上述實施例中用滲透注射法在GFP轉基因的菸草Nicotiana benthamiana 16c株系中進行的基因沉默抑制因子(S10、Tav2b)與GFP基因的瞬時表達實驗結果表明Pns10抑制本葉GFP基因沉默的效率比Tav2b要弱，此結論是從注射葉片GFP綠色螢光的亮度和持續時間上得出的，即前者比後者的螢光亮度在注射後第6天要弱，並且持續的時間也比後者要短。用葡萄糖醛酸酶(β-glucuronidase，GUS)基因作為誘導基因沉默的引發分子，觀察瞬時表達GUS基因的條件下Pns10的作用情況，以進一步比較Pns10和Tav2b在抑制基因沉默效率上的差異，已知的基因沉默抑制因子Tav2b和Cmv2b分別被用作正對照，具體方法如下所示1、GUS組織化學染色觀察經滲透注射農桿菌組合35S-GUS+35S-S10、35S-GUS+35S-Tav2b、35S-GUS+35S-Cmv2b的菸草葉片中GUS基因的表達情況將農桿菌組合35S-GUS+35S-S10、35S-GUS+35S-Tav2b、35S-GUS+35S-Cmv2b分別滲透注射GFP轉基因的菸草Nicotiana benthamiana 16c株系中的菸草葉片，單獨注射的35S-GUS作為負對照。滲透注射後5天的葉片取樣，進行GUS組織化學染色，結果如圖9所示(1-4分別表示35S-GUS單獨注射組、35S-GUS+35S-S10、35S-GUS+35S-Cmv2b、35S-GUS+35S-Tav2b混合注射組)，單獨注射35S-GUS的葉片在注射後的第5天只有較少量的GUS活性可以檢測到，表現為只能檢測到痕量的藍色反應底物。而在混合注射35S-GUS+35S-S10、35S-GUS+35S-Tav2b和35S-GUS+35S-Cmv2b的葉片中，注射後5天的GUS活性仍然較強，表現為有大量的藍色反應底物累積。表明S10與Tav2b和Cmv2b一樣，在非轉基因的、外源瞬時表達基因作為唯一的誘導PTGS引發分子的實驗體系中同樣具有抑制基因沉默的功能。
2、經滲透注射農桿菌組合35S-GUS+35S-S10、35S-GUS+35S-Tav2b、35S-GUS+35S-Cmv2b的菸草葉片中GUS活性的定量檢測用螢光分光光度法定量測定步驟1獲得的3種基因沉默抑制因子與GUS基因共表達後第5天菸草葉片中GUS的相對活性，以進一步比較RDV Pns10、Tav2b和Cmv2b三者之間抑制GUS基因沉默效能方面的差異，35S-GUS單獨注射葉片作為負對照。結果如圖10所示，與負對照相比，Pns10、Cmv2b和Tav2b均能顯著提高GUS的表達活性。但三者之間也存在差異，相對於負對照，三者與35S-GUS共注射葉片中的GUS相對活性分別約提高37.5倍、46倍和66.04倍，即Pns10使GUS相對活性提高的幅度最小，Cmv2b次之，Tav2b最強，與步驟1的GFP的綠色螢光觀察結果基本一致。
二、檢測水稻矮縮病毒的非結構蛋白Pns10對瞬時表達GFP基因的影響1、螢光觀察經滲透注射農桿菌組合35S-GUS+35S-S10、35S-GUS+35S-Tav2b的菸草葉片中GFP基因的表達情況上述實驗結果均證明Pns10具有抑制基因沉默的功能，但這些實驗均是以瞬時表達基因作為研究的對象。新近的研究表明除了已知的抗病毒等功能外，PTGS機制可能具有調節自然狀態下基因的表達功能(Senda，M.，C.Masuta，S.Ohnishi，K.Goto，A.Kasai，T.Sano，Jin-Sung Hong，and S.MacFarlaned.2004.Patterning ofVirus-Infected Glycine max Seed Coat Is Associated with Suppression ofEndogenous Silencing of Chalcone Synthase Genes.The Plant Cell 16807-818.；Tuteja，J.H.，S.J.Clough，W.C.Chan，and L.O.Vodkin.2004.Tissue-Specific Gene Silencing Mediated by a Naturally Occurring ChalconeSynthase Gene Cluster in Glycine max.The Plant Cell 16819-835.)。受該研究及步驟一進行的Pns10對GUS基因瞬時表達調控的實驗結果進行了以下實驗，以檢測Pns10是否對轉基因的組成型表達的基因具有調控作用。具體方法為將35S-S10和35S-Tav2b單獨滲透注射入GFP轉基因菸草N.benthamiana 16c的株系中。注射後3天觀察轉記憶植株葉片組織綠色螢光蛋白的螢光強度，以滲透注射空載體pE3和未轉GFP基因的野生型菸草為對照，結果如圖11所示(1-4分別表示為滲透注射空載體pE3、35S-Tav2b、35S-S10、未轉GFP基因的野生型菸草)，與注射空載體的葉片相比，在35S-S10和35S-Tav2b的葉片注射區域GFP的綠色螢光明顯增強。
2、Northern雜交檢測經滲透注射農桿菌組合35S-GUS+35S-S10、35S-GUS+35S-Tav2b的菸草葉片中GFP基因的表達情況用與實施例1相同的方法，檢測步驟一獲得的轉基因菸草內GFP基因的表達水平的積累情況，水稻矮縮病毒的非結構蛋白Pns10作為基因沉默抑制因子對系統基因的沉默具有抑制作用，結果如圖12所示(泳道1-4分別表示滲透注射空載體pE3、35S-Tav2b、未轉GFP基因的野生型菸草滲透注射的葉片、35S-S10；圖中底部rRNA為溴化乙錠染色的18S RNA，作為相等上樣量的標示)，用GFP探針對以上葉片進行的Northern雜交實驗結果表明瞬時表達S10和Tav2b組織中的GFP的mRNA累積量明顯高於對照。這與GFP的綠色螢光觀察結果相一致。但這些樣品中的siRNA檢測不到(結果未顯示)。
上述實驗實驗結果表明1)RDV Pns10在由瞬時表達基因(此處為GUS基因)作為單一誘導基因沉默的引發分子的條件下同樣具有抑制基因沉默的功能，GUS基因的表達和抑制都是在沒有內源基因存在的背景下產生。Pns10等抑制其沉默的功能也是在同一背景下產生。這與前述在轉GFP菸草中所進行的實驗是有差別的；2)三種用於檢測的基因沉默抑制因子的作用效能存在差別，即Pns10的效能最小，Cmv2b次之，Tav2b最強；3)Pns10和Tav2b均能提高轉基因植株的GFP(組成型表達)表達量。
實施例6、檢測Pns10對病毒引起的基因沉默的抑制作用一、含S10的病毒載體(PVX)侵染菸草及其病症觀察將實施例1構建的重組PVX載體pGR107-S10和pGR107-ΔS10轉化含有質粒pJICSA_Rep的農桿菌GV3101中，挑選陽性克隆，將轉化有pGR107-S10的重組子命名為35S-PVX-S10，將轉化有pGR107-ΔS10的重組子命名為35S-PVX-ΔS10，將兩者分別滲透注射於4-6葉期大的野生型菸草N.benthamiana最下部的二片葉，以轉有PVX空載體pGR107的重組子為對照，觀察植株的發病情況，第9和第20天的葉片觀察結果如圖13所示，三種注射葉片均未表現病毒病症，但三種注射植株的系統葉(即上部未注射的葉片)均表現不同程度的病毒症狀。病症在最上部葉的出現最早可在注射後6天出現。滲透注射35S-PVX，35S-PVX-ΔS10植株系統葉上的病症較注射35S-PVX-S10上的要輕，前二者最開始感病葉片上的病症為在主葉脈和次級葉脈上現出現褪綠病斑，繼而擴展至全葉。但在注射2周後，隨後新長出的大部分葉片的病症減輕或消失，即這些植株重又恢復健康狀態。35S-PVX-S10感病植株的系統葉在2周以後觀察病症較前二種的嚴重，表現為大部分系統葉沒有出現恢復健康的現象，並且大部分系統葉片上均出現散在分布的壞死斑，注射後20天的系統葉如圖14所示(1、健康的、未侵染病毒的葉片(對照)；2、PVX侵染的葉片；3、PVX-ΔS10侵染的葉片；4、PVX-S10侵染的葉片)。
二、侵染有重組PVX病毒載體pGR107-S10和pGR107-ΔS10的Northern雜交檢測為確定S10在異源病毒中的表達所引起的病症加重的機理，即驗證是否與VIGS有關，現對步驟一的3種侵染植株的系統葉分別在注射後第9、20天剪下，提取RNA並分別以此為模板，用地高辛標記的PVX的CP(外殼蛋白)基因探針，以pGR107為模板經PCR擴增獲得，引物序列為正向引物5』-ATGTCAGCACCAGCTAGCAC-3』；反向引物5』-TTATGGTGGT GGTAGAGTGA-3』)，反應體系為模板1μl，dNTP(其中A為地高辛標記)1μl，10×PCR緩衝液2μl，正、反向引物各1μl，Taq DNA聚合酶1μl，無菌水13μl。PCR反應條件與前述相同。PCR反應產物用蛋白酶K在56℃降解30分鐘，再經酚、氯仿抽提後，溶於DEPC處理的水中。進行Northern雜交檢測PVX基因組的mRNA穩定態的累積量，以健康的、未染病植株作為對照，結果如圖15所示(gRNA、gRNA1-3分別指PVX轉錄的全長基因組、亞基因組1-3)，在注射後第9天的葉片中三種侵染植株葉片的PVX基因組mRNA均有大量累積，但在侵染後第20天，35S-PVX、35S-PVX-ΔS10侵染樣品中的mRNA大部分被降解，而35S-PVX-S10的侵染樣品中仍有大量mRNA累積。上述實驗結果表明1)在PVX載體上表達的S10對病毒在本葉的病症沒有增強作用；2)Pns10對PVX系統侵染及其在系統葉上的病症具有增強作用，即與前述的Pns10主要抑制GFP系統基因沉默的作用相同，推斷Pns10對VIGS的影響主要也是抑制VIGS的系統RNA沉默信號的產生。
序列表1608210121128212DNA213人工序列220
223
4001agagatctat ggatcttgcg aggtcgga 28210221128212DNA213人工序列220
223
4002gcgaattctc acatttgctc gtcgctct 28210321128212DNA213人工序列220
223
4003agagatctat ggcttatcct aatgacgt 28210421128212DNA213人工序列220
223
4004gcgaattctc acaatgcatc atagatag 28210521128212DNA213人工序列220
223
4005agagatctat ggacagtacc ggccgagc 28210621128212DNA213人工序列
220
223
4006gcgaattctc acagaggcgg ctgatctc 28210721128212DNA213人工序列220
223
4007agagatctat gaaccaatct cgaagctt 28210821128212DNA213人工序列220
223
4008gcgaattctt actttgacag cttagaag 28
權利要求
1.水稻矮縮病毒非結構蛋白Pns10在抑制基因沉默中的應用。
2.根據權利要求1所述的應用，其特徵在於所述應用是將編碼水稻矮縮病毒非結構蛋白Pns10的基因S10導入植物組織或細胞，S10表達後，得到目的基因獲得表達的植株。
3.根據權利要求2所述的應用，其特徵在於所述水稻矮縮病毒非結構蛋白基因S10通過含有所述水稻矮縮病毒非結構蛋白基因S10的植物表達載體導入植物組織或細胞。
4.根據權利要求3所述的應用，其特徵在於用於構建所述植物表達載體的出發載體為pE3、pWEIMING101或pCAMBIA1300。
5.根據權利要求2所述的應用，其特徵在於所述攜帶有水稻矮縮病毒非結構蛋白基因S10的植物表達載體通過滲透注射技術、農桿菌介導、Ti質粒、Ri質粒或植物病毒載體轉化植物細胞或組織。
6.根據權利要求2所述的應用，其特徵在於所述植物宿主包括雙子葉或單子葉植物。
7.根據權利要求6所述的應用，其特徵在於所述植物宿主為菸草、擬南芥或水稻。
全文摘要
本發明公開了水稻矮縮病毒非結構蛋白Pns10的新用途。其目的是提供水稻矮縮病毒非結構蛋白Pns10在抑制基因沉默中的應用。具體來講，應用水稻矮縮病毒非結構蛋白Pns10抑制植物中目的基因沉默的方法，是將編碼水稻矮縮病毒非結構蛋白Pns10的基因S10導入植物組織或細胞，得到目的基因獲得表達的植株。實驗證明水稻矮縮病毒非結構蛋白Pns10均能夠顯著提高轉基因植株中GUS基因的表達量和表達持續時間，與已鑑定的基因沉默抑制因子Cmv2b和Tav2b具有相同的提高基因瞬時、穩定表達量的功能，是一種新的基因沉默抑制因子，從而為利用植物材料快速、大量表達異源蛋白提供了有效的技術路線。本發明具有較高的實際應用價值。
文檔編號C12N15/82GK1955298SQ20051011438
公開日2007年5月2日 申請日期2005年10月24日 優先權日2005年10月24日
發明者曹雪松, 李毅 申請人:北京大學