生產α1抗胰蛋白酶的方法
2023-06-09 05:57:51 2
專利名稱：生產α1抗胰蛋白酶的方法
技術領域：
本發明涉及一種生產α 1抗胰蛋白酶的方法。
背景技術：
α 1抗胰蛋白酶是一種大約分子量為52000-55000道爾頓(Da)的糖蛋白。此蛋白是由幾個寡核苷酸共價連接的單鏈蛋白，它是一種內源性蛋白酶抑制劑，例如胰蛋白酶、糜蛋白酶、胰彈性蛋白酶、血管緊張肽原酶、皮膚膠原蛋白酶、脲激酶和分葉核淋巴細胞蛋白酶。近來應用α 1抗胰蛋白酶治療由於α 1抗胰蛋白酶缺陷引起的遺傳性疾病和後天獲得性α 1抗胰蛋白酶缺陷性疾病。給予α 1抗胰蛋白酶能有效地抑制肺中淋巴細胞彈性蛋白酶。淋巴細胞彈性蛋白酶能破壞肺的外源蛋白。當α 抗胰蛋白酶缺失時，不能很好地調節彈性蛋白酶的活性，使彈性蛋白酶就破壞肺組織導致肺組織損傷引起肺氣腫，α 1抗胰蛋白酶能成功的用於治療肺氣腫、慢性氣管炎和氣管炎等。由於用於治療的α 抗胰蛋白酶基本上是來源人血漿，原料來源有限，為了最大地滿足臨床病人的需求，應最大可能地提高血漿來源的α 1抗胰蛋白酶產率，同時也要嚴格要求純度。
發明內容
本發明的目的是提供一種α 1抗胰蛋白酶產率高、純度高的生產α 1抗胰蛋白酶的方法。本發明所提供的生產α 1抗胰蛋白酶的方法，包括如下步驟血漿加入生理鹽水進行稀釋，調整ρΗ7.0 7. 5，加入乙醇至乙醇濃度為8% 10%，維持溫度-1 -3 V，離子強度0. 10 0. 14，攪拌，離心，得到上清I和沉澱I ；上清I調整ρΗ6.4 7.0，加入乙醇至乙醇濃度為18% 25%，維持溫度為-3 _5°C，離子強度0. 08 0. 10，攪拌，離心，得到上清II+III和沉澱II+III ；上清II+III調整pH5. 0 5. 4，調整乙醇濃度為16 % 19 %，維持溫度為-3 -5°C，離子強度0. 06 0. 09，攪拌，離心，得到上清IV-I和沉澱IV-I ；沉澱IV-I用緩衝液溶解，溫度-2 3°C，加入冷乙醇至乙醇濃度為8% 12%，攪拌，離心，過濾取上清A ；上清A加入磷酸三丁酯和吐溫-80，磷酸三丁酯濃度為0. 3%，吐溫-80濃度為 1 %，24 ，孵育；然後加入PEG4000至其濃度為10 % 15 %，調整pH5. 0 5. 5離心， 取上清B ；上清B加入PEG4000至其濃度為25% 30%，調整pH6. 2 6. 8，離心，取沉澱；沉澱用磷酸鹽緩衝液溶解，進行DEAE Sepharose fast flow弱陰離子交換層析， 用0. 01 0. 04M pH6. 2 6. 8磷酸鹽緩衝液洗滌，再用0. 1 0. 3M pH6. 2 6. 8磷酸鹽緩衝液洗脫，洗脫液超濾，巴氏滅活，除菌過濾，凍幹，乾熱滅活，得到α 1抗胰蛋白酶粉末。本發明的生產α 1抗胰蛋白酶的方法，其中所述緩衝液為ρΗ8.0 8.6Tris緩衝液。本發明的生產α 1抗胰蛋白酶的方法生產的α 1抗胰蛋白酶平均收率達到27%、 純度達到90%。
具體實施例方式下述實施例中的百分含量如無特殊說明均為質量百分含量。實施例1、血漿加入1倍生理鹽水進行稀釋，用pH4. 0的醋酸-醋酸鈉緩衝液調整ρΗ7. 2，攪拌條件下加入乙醇至乙醇濃度為8%，維持溫度為-10C，離子強度0. 14，持續攪拌2小時，離心，得到上清I和沉澱I;上清I用pH4. 0的醋酸-醋酸鈉緩衝液調整ρΗ6. 7，攪拌條件下加入乙醇至乙醇濃度為25%維持溫度為-5°C，離子強度0. 09，持續攪拌2小時，離心，得到上清II+III和沉澱 II+III ；上清II+III用pH4. 0的醋酸-醋酸鈉緩衝液調整pH5. 2，攪拌條件下加入生理鹽水調整乙醇濃度為18%，維持溫度為_4°C，離子強度0. 09，持續攪拌2小時，離心，得到上清 IV-I和沉澱IV-I ；沉澱IV-I用pH8. OTris緩衝液溶解，溫度_2°C，加入冷乙醇至乙醇濃度為12%， 離心，過濾取上清A ；上清A加入磷酸三丁酯和吐溫-80，磷酸三丁酯的終濃度為0. 3%，吐溫-80的終濃度為1%，M ^°C，孵育6小時；然後加入PEG4000至其濃度為12%，調整pH5. 1，離心， 取上清B ；上清B加入PEG4000至其濃度為，調整pH6. 5，離心，取沉澱；沉澱用磷酸鹽緩衝液溶解，進行DEAE Sepharose fast flow弱陰離子交換層析， 用0. 02MpH6. 2磷酸鹽緩衝液洗滌，再用0. IM pH62磷酸鹽緩衝液洗脫，洗脫液超濾，巴氏滅活，除菌過濾，凍幹，乾熱滅活，得到α 1抗胰蛋白酶粉末。純化路線各步驟收集物經過SDS-PAGE電泳，用AlphaEaseFC軟體對其進行純度分析，純度可達到90%。蛋白含量採用凱氏定氮法測定含有目的蛋白的蛋白濃度，並計算蛋白回收率，結果如下表批次Cohn FIV-I沉澱QSFF層析樣品回收率(mg)(mg)
150. 113. 025.9%
250. 213. 226.3%
350. 113. 426.7%實施例2、血漿加入1倍生理鹽水進行稀釋，用pH4. 0的醋酸-醋酸鈉緩衝液調整pH7. 0，攪拌條件下加入乙醇至乙醇濃度為9%，維持溫度為_2°C，離子強度0. 14，持續攪拌2小時，離心，得到上清I和沉澱I ；上清I用pH4. 0的醋酸-醋酸鈉緩衝液調整pH6. 5，攪拌條件下加入乙醇至乙醇濃度為21 %維持溫度為-3°C，離子強度0. 08，持續攪拌2小時，離心，得到上清II+III和沉澱 II+III ；上清II+III用pH4. 0的醋酸-醋酸鈉緩衝液調整pH5. 0，攪拌條件下加入生理鹽水調整乙醇濃度為16%，維持溫度為_3°C，離子強度0. 08，持續攪拌2小時，離心，得到上清 IV-I和沉澱IV-I ；沉澱IV-I用pH8. 2Tris緩衝液溶解，溫度_1°C，加入冷乙醇至乙醇濃度為10%， 離心，過濾取上清A ；上清A加入磷酸三丁酯和吐溫-80，磷酸三丁酯的終濃度為0. 3%，吐溫-80的終濃度為1 %，M ，孵育6小時；然後加入PEG4000至其濃度為11 %，調整pH5. 3，離心， 取上清B ；上清B加入PEG4000至其濃度為，調整pH6. 2離心，取沉澱；沉澱用磷酸鹽緩衝液溶解，進行DEAE Sepharose fast flow弱陰離子交換層析， 用0. 03MpH6. 5磷酸鹽緩衝液洗滌，再用0. 2M pH6. 5磷酸鹽緩衝液洗脫，洗脫液超濾，巴氏滅活，除菌過濾，凍幹，乾熱滅活，得到α 1抗胰蛋白酶粉末。純化路線各步驟收集物經過SDS-PAGE電泳，用AlphaEaseFC軟體對其進行純度分析，純度可達到91%。蛋白含量採用凱氏定氮法測定含有目的蛋白的蛋白濃度，並計算蛋白回收率，結果如下表批次 Cohn FIV-I沉澱 QSFF層析樣品回收率(mg)(mg)160. 317. 028. 2%260. 516. 827. 8%360. 117. 128. 5%實施例3、血漿加入1倍生理鹽水進行稀釋，用pH4. 0的醋酸-醋酸鈉緩衝液調整pH7. 4，攪拌條件下加入乙醇至乙醇濃度為10%，維持溫度為-3°c，離子強度0. 12，持續攪拌2小時， 離心，得到上清I和沉澱I;上清I用pH4. 0的醋酸-醋酸鈉緩衝液調整pH6. 9，攪拌條件下加入乙醇至乙醇濃度為20%維持溫度為-4°C，離子強度0. 10，持續攪拌2小時，離心，得到上清II+III和沉澱 II+III ；上清II+III用pH4. 0的醋酸-醋酸鈉緩衝液調整pH5. 4，攪拌條件下加入生理鹽水調整乙醇濃度為19%，維持溫度為_5°C，離子強度0. 07，持續攪拌2小時，離心，得到上清 IV—-1 和沉澱 IV-I ；沉澱IV-I用pH8. 4Tris緩衝液溶解，溫度0°C，加入冷乙醇至乙醇濃度為8%，離心，過濾取上清A ；上清A加入磷酸三丁酯和吐溫-80，磷酸三丁酯的終濃度為0. 3%，吐溫-80的終濃度為1%，M ^°C，孵育6小時；然後加入PEG4000至其濃度為10%，調整pH5. 4，離心， 取上清B ；上清B加入PEG4000至其濃度為25%，調整pH6. 7，離心，取沉澱；
沉澱用磷酸鹽緩衝液溶解，進行DEAE Sepharose fast flow弱陰離子交換層析， 用0. 01MpH6. 7磷酸鹽緩衝液洗滌，再用0. 3M pH6. 6磷酸鹽緩衝液洗脫，洗脫液超濾，巴氏滅活，除菌過濾，凍幹，乾熱滅活，得到α 1抗胰蛋白酶粉末。純化路線各步驟收集物經過SDS-PAGE電泳，用AlphaEaseFC軟體對其進行純度分析，純度達89%。蛋白含量採用凱氏定氮法測定含有目的蛋白的蛋白濃度，並計算蛋白回收率，結果如下表批次 Cohn FIV-I沉澱 QSFF層析樣品回收率(mg)(mg)
15213. 826.5%
25314. 226.8%
352. 614. 427.3% 以上的實施例僅僅是對本發明的優選實施方式進行描述，並非對本發明的範圍進行限定，在不脫離本發明設計精神的前提下，本領域普通工程技術人員對本發明的技術方案作出的各種變形和改進，均應落入本發明的權利要求書確定的保護範圍內。
權利要求
1.生產α 抗胰蛋白酶的方法，包括如下步驟血漿加入生理鹽水進行稀釋，調整PH 7.0 7. 5，加入乙醇至乙醇濃度為8% 10%， 維持溫度-1 -3 V，離子強度0. 10 0. 14，攪拌，離心，得到上清I和沉澱I ；上清I調整ΡΗ6. 4 7. 0，加入乙醇至乙醇濃度為18% 25%，維持溫度為_3 _5°C， 離子強度0. 08 0. 10，攪拌，離心，得到上清II+III和沉澱II+III ；上清II+III調整pH5. 0 5. 4，調整乙醇濃度為16% 19%，維持溫度為-3 _5°C， 離子強度0. 06 0. 09，攪拌，離心，得到上清IV-I和沉澱IV-I ；沉澱IV-I用緩衝液溶解，溫度-2 3°C，加入冷乙醇至乙醇濃度為8% 12%，攪拌， 離心，過濾取上清A ；上清A加入磷酸三丁酯和吐溫-80，磷酸三丁酯濃度為0. 3%，吐溫-80濃度為1 %， M ^°C，孵育；然後加入PEG4000至其濃度為10% 15%，調整pH5. 0 5. 5離心，取上清B;上清B加入PEG4000至其濃度為25% 30%，調整pH6. 2 6. 8，離心，取沉澱； 沉澱用磷酸鹽緩衝液溶解，進行弱陰離子交換層析，用0. 01 0. 04M pH6. 2 6. 8磷酸鹽緩衝液洗滌，再用0. 1 0. 3M pH6. 2 6. 8磷酸鹽緩衝液洗脫，洗脫液超濾，巴氏滅活， 除菌過濾，凍幹，乾熱滅活，得到α 抗胰蛋白酶粉末。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述緩衝液為pH8.0 8. 6Tris緩衝液。
全文摘要
本發明公開了一種生產α1抗胰蛋白酶的方法，包括血漿稀釋，pH7.0～7.5，加入乙醇，溫度-1～-3℃，離子強度0.10～0.14，攪拌，離心，得到上清I和沉澱I；上清I pH6.4～7.0，加入乙醇18％～25％，溫度為-3～-5℃℃，離子強度0.08～0.10，攪拌，離心，得到上清II+III和沉澱II+III；上清II+III pH5.0～5.4，調節乙醇濃度為16％～19％，溫度為-3～-5℃，離子強度0.06～0.09，攪拌，離心，得到上清IV-1和沉澱IV-1；沉澱IV-1溶解，溫度-2～3℃，調整乙醇濃度至8％～12％，攪拌，離心，過濾取上清A；上清A加入磷酸三丁酯和吐溫-80，24～26℃，孵育；然後加入PEG4000，pH5.0～5.5離心，取上清B；上清B加入PEG4000，pH6.2～6.8，離心，取沉澱；沉澱溶解，進行弱陰離子交換層析，洗脫液超濾，巴氏滅活，除菌過濾，凍幹，乾熱滅活，得到α1抗胰蛋白酶粉末。本發明的生產α1抗胰蛋白酶的方法生產的α1抗胰蛋白酶產率高、純度高。
文檔編號C07K1/36GK102558295SQ20101060980
公開日2012年7月11日 申請日期2010年12月28日 優先權日2010年12月28日
發明者魏舒 申請人:同路生物製藥有限公司