改善的聚乙烯亞胺聚乙二醇載體的製作方法

2023-06-14 03:04:26

本發明涉及與能夠結合癌症抗原的靶向部分綴合的非病毒的基於聚乙烯亞胺的多聚物(polyplexes)。發明背景分子醫學面臨的障礙之一是治療物質如DNA或RNA分子的靶向遞送。新興的策略是非病毒載體的構建，如陽離子聚合物和陽離子脂類，其結合併凝聚核酸。這些非病毒的陽離子載體相比於病毒基因載體具有許多優勢，因為它們是非免疫原性的、非致癌的並且容易合成[1-4]。目前，正發展數種合成的聚陽離子聚合物用於核酸的遞送。在這些聚合物中，聚乙烯亞胺(PEI)被認為是用於基因遞送的最有希望的物質[5]。PEI是水溶性的有機大分子，其可以以線型和分枝型結構的形式獲得[6]。PEI隨著廣泛的pH改變其離子化的程度，因為它們骨架鏈中的每三個原子是可以質子化的氨基氮。PEI中大約55％的氮在在生理pH下是質子化的[7]。它們具有高的陽離子電荷密度，因此能夠與核酸形成非共價的複合體。而且，可以通過各種化學修飾改變它們的物理化學和生物特性[8]。基於PEI的複合體(也被稱為多聚物(polyplexes))可被許多細胞類型內吞[9]。多聚物內化後，通過「質子海綿效應」促使內體釋放和高效的基因轉移[10]。PEI凝聚DNA的能力似乎是將大的DNA構建體遞送進許多細胞類型中的重要因子。利用PEI作為遞送載體的主要擔憂是毒性，由於它們高的表面正電荷，其可以導致非特異性結合[11]。最近嘗試改善非病毒載體的選擇性和生物相容性。這導致用聚乙二醇(PEG)修飾PEI分子，為了屏蔽PEI顆粒[12]。異源雙功能PEG基團與PEI的綴合促進PEI與靶配體的耦合，其向具有相應受體的細胞提供了高效的基因遞送[12]。我們之前描述了靶載體的產生，其表明與EGF相連作為靶載體的分枝型PEI(brPEI-EGF)和線型PEI(LPEI)之間的差異[13，WO2004/045491，WO2010/073247]。當前的合成方法不令人滿意，因此它們導致不足夠的同源產物。因此緊迫需要可以以可再生的方式將靶向部分與LPEI-PEG高效綴合的方法，以產生可靠地用於治療癌症的方法中的均質批次的產物。發明概述在一個方面，本發明涉及雙鏈RNA(dsRNA)和聚合綴合物的多聚物，其中所述聚合綴合物由與一個或多個聚乙二醇(PEG)部分共價連接的線型聚乙烯亞胺(LPEI)組成，各PEG部分經接頭與能夠結合癌症抗原的靶向部分綴合，條件是所述靶向部分不是小鼠EGF(mEGF)或序列YHWYGYTPQNVI(GE11)(SEQIDNO:1)的肽。在另一方面，本發明提供藥物組合物，其包含藥學可接受的載體和如本文所述的發明的多聚物。而在另一方面，本發明提供用於治療選自以下的癌症的如本文所述的發明的多聚物，或者包含所述多聚物的藥物組合物：以EGFR過表達的細胞為特點的癌症、以HER2過表達的細胞為特點的癌症和前列腺癌。在另一方面，本發明涉及用於治療選自以下的癌症的方法：以EGFR過表達的細胞為特點的癌症、以HER2過表達的細胞為特點的癌症和前列腺癌，所述方法包括向需要的對象施用如本文所述的發明的多聚物。在又一方面，本發明涉及用於治療癌症的包含藥學可接受的載體和本發明的多聚物的藥物組合物，所述癌症選自：以EGFR過表達的細胞為特點的癌症、以HER2過表達的細胞為特點的癌症和前列腺癌。可以將本發明的多聚物與免疫細胞聯合使用。附圖簡述圖1顯示LPEI(-22kDa)與NHS-PEG-OPSS(～2kDa)的綴合主要產生兩種聚乙二醇化程度不同的共聚合網絡。共聚物LPEI-(PEG2k-OPSS)3(「1:3雙綴合物」)平均由1摩爾LPEI和3摩爾PEG組成，而共聚物LPEI-PEG2k-OPSS(「1:1雙綴合物」)平均由1摩爾比例的LPEI和1摩爾PEG組成(通過1H-NMR分析測定LPEI:PEG的比例)。圖2顯示兩種雙綴合物(LPEI-PEG2k-OPSS(1:1雙綴合物)和LPEI-(PEG2k-OPSS)3(1:3雙綴合物))的1H-NMR分析。通過化學位移的存在指示PEG基團與LPEI的偶聯，所述化學位移與位於3.7ppm(a)的乙二醇氫和位於-3.0ppm(b)的乙亞胺氫有關。這些峰的整數值提供PEG與LPEI的摩爾比，從中推理所闡述的1:1雙綴合(A)和1:3雙綴合(B)的結構。圖3顯示共聚合網絡(1:1雙綴合物和1:3雙綴合物)與親和體(affibody)(「Her-2」)通過二硫化物交換綴合的流程圖，導致兩種有差異的聚二乙醇化三綴合物的產生[20]。圖4描述了純化的親和體、雙綴合物和三綴合物在不存在和存在DTT情況下的SDS/PAGE。在存在DTT的情況下，親和體從三綴合物釋放，並且在純化的親和體旁邊移動(稍微在10kDa上面)。圖5顯示使用DLS測量與在HBG緩衝液pH7.4中的質粒pGreenfire1複合的LPEI、雙綴合物和三綴合物的顆粒大小。圖6描述了與質粒pGreenfire1複合的LPEI、雙綴合物和三綴合物的ξ電位分布。通過DLS測量ξ電位，以及通過Smoluchowski方程式進行計算。圖7A-B顯示源自在HBG緩衝液(pH7.4)中進行測量的兩種多聚物的原子力顯微鏡(AFM)圖像。(A)1:1三綴合物多聚物(B)1:3三綴合物多聚物。比例尺是1μm。圖8描述了顯示有差異的聚二乙醇化多聚物保護質粒pGreenFirel免受DNaseI降解的瓊脂糖凝膠。用或不用DNaseI(2IU)處理單獨的1μg質粒(pGreenFirel)或者含1μg質粒(pGreenFirel)的1:1三綴合物多聚物和1:3三綴合物多聚物。超螺旋質粒(s.c.)，開環質粒(o.c.)。圖9A-C顯示使用分別含有LPEI:PEG比例為1:1和LPEI:PEG比例為1:3的1:1三綴合物多聚物和1:3三綴合物多聚物的pGFP-LUC的Her-2介導的基因轉移。將10000BT474和MDA-MB-231乳腺癌細胞/孔用與pGFP-LUC(1μg/ml)複合以產生兩種多聚物的1:1三綴合物和1:3三綴合物處理48小時。HBS中的PEI氮/DNA磷酸鹽比例為6(N/P＝6)。(A)螢光素酶活性的測量表明MDA-MB-231細胞中的pGreenFirel遞送相比於BT474顯著降低，以及與1:1三綴合物相比，由1:3三綴合物多聚物介導的基因遞送減少(*p<0.001)。48小時之後以一式三份測量螢光素酶活性，將相對螢光素酶單位(RLU)顯示為平均值+S.D。(B)用多聚物處理的細胞的螢光圖像。以X10的放大倍數顯示圖像，並且代表所進行的三次實驗。(C)亞甲藍分析描述了相比於未處理(UT)細胞的細胞存活百分比。圖10顯示了與PolylC複合的PEI-PEG-Her2親和體(PPHA)抑制Her2過表達乳腺癌細胞BT474。複合的載體抑制Her2過表達細胞，包括耐赫賽汀/曲妥單抗的細胞。圖11顯示對在裸鼠中注射的過表達Her2的MCF7細胞的抑制。圖12A-B顯示(A)PEI-PEG-EGFR親和體(PPE親和體)的功效與(B)PPE的功效的比較。圖13顯示與未處理(UT)、pIC/PPE、pI/PPE、pI/PPEA和pIC/PPEA低(複合物中0.1μg/μlpIC)相比，PolylCPPE親和體在體內的活性。圖14顯示與應用如SchaffertD,KissM,W,ShirA,LevitzkiA,OgrisM,WagnerE.(2011)Poly(I:C)-mediatedtumorgrowthsuppressioninEGF-receptoroverexpressingtumorsusingEGF-polyethyleneglycol-linearpolyethylenimineascarrier.PharmRes.28:731-41中所描述的PolylC/mPPE(小鼠)相比，在應用不同濃度的PolylC/LPEI-PEG-hEGF複合物之後存活的U87MG、U87MGwtEGFR細胞。圖15顯示PEI-PEG(PP)-DUPA(PPD)/PolyIC針對LNCaP和VCaP細胞高度有效。在96小時的暴露之後測量活力。圖16A-B顯示通過感染有PolylC/PPD的LNCaP細胞導致細胞因子(A)IP-10和(B)趨化因子(RANRES)的產生。圖17顯示使LNCaP細胞適應的培養基刺激PBMC中細胞因子的表達。在24小時孵育之後測量表達。圖18顯示PolylC/PPD處理的LNCaP細胞與不表達PSMA的PC3-螢光素酶細胞的共孵育經旁觀者效應導致PC3-螢光素酶細胞多至70％的致死。添加健康的人PBMC強烈地增強效果，並且導致PC3細胞90％的致死。圖19顯示PolylC/PPD對體內皮下的LNCaP腫瘤的作用。UT(未處理)。發明詳述聚陽離子，特別是PEI，作為用於基因轉染的物質被廣泛地研究。當聚合的納米顆粒複合體整體具有正電荷時，其允許它們與細胞表面上帶負電荷的硫酸肝素蛋白聚糖結合，獲得最佳的轉染效力[28]。之前的研究表明，線型PEI(LPEI)在基因轉染方面比分枝型PEI(brPEI)更有效[29-31][32，33，WO2010/073247]，但是LPEI具有更高的正電荷，並且因此更毒。將各種屏蔽體(如PEG[12]、聚-(環氧乙烷)-聚(環氧丙烯)-聚(環氧乙烷)(PEO-PPO-PEO)[18，34]和聚環氧乙烷[35])與陽離子聚合物綴合，試圖降低正電荷和隨後的毒性。的確，PEI與不同長度的PEG基團的屏蔽顯著地降低了毒性，同時維持轉染效率[12，11，36]。根據本發明，發現LPEI與PEG2K的綴合產生了包含不同比例的LPEI與PEG2K的雙綴合共聚物。由於電荷的不同，使用陽離子交換層析可以將這些雙綴合物彼此分開，所述電荷的不同反映了綴合的不同數量PEG2K基團、1H-NMR分析確認了所述雙綴合物彼此的不同在於每LPEI單元平均的PEG2K單元數，其中1:1雙綴合物具有1:1的LPEI:PEG2K比，以及1:3雙綴合物具有1:3的LPEI:PEG2k比。Her-2靶親和體(affibody)與純化的雙綴合物中的每一個的綴合產生適當分子量的三綴合物產物，即，從1:1雙綴合物，我們獲得LPEI:PEG2k:Her-2等於1:1:1的「1:1三綴合物」，以及從1:3雙綴合物，我們獲得比例為1:3:3的「1:3三綴合物」。該方案使我們能夠以可再生的方式獲得均質的產物，靶親和體與LPEI-PEG具有幾乎完全的綴合。我們觀察到，當雙綴合物或三綴合物與質粒DNA複合時，聚乙二醇化強烈地影響多聚物顆粒的大小。1:3雙綴合物多聚物和1:3三綴合多聚物的平均顆粒大小均大於1:1雙綴合物多聚物和1:1三綴合物多聚物。我們相信，增加單條陽離子鏈上的聚乙二醇化的量導致空間位阻，其阻止聚合鏈將質粒凝聚為較小的顆粒。這與以下的發現一致：裸的LPEI多聚物具有最小的顆粒。而且，雖然1:1三綴合物和1:3三綴合物保護複合的質粒免受DNaseI降解，但是1:3三綴合的多聚物提供更好的保護，可能是由於增加的空間位阻。之前的研究暗示：當與核酸複合時，增加與陽離子聚合物綴合的PEG單元的分子量導致獲得的多聚物的表面電荷減少[13]。我們的數據表明，增加類似分子量的PEG基團的數量導致表面電荷的減少，如通過ξ電位分布所限定的。的確，與質粒複合的裸LPEI顯示最高的表面電荷。這些結果支持了這樣的觀點：在化學載體中存在的中性實體越多，則表面電荷越少。意外地，與親和體綴合的三綴合多聚物具有的表面電荷比雙綴合多聚物少，其表明Her-2親和體(其自身具有少量的正電荷)也減少顆粒的表面電荷。我們猜想，Her-2親和體改變了顆粒的外形，用更多的靶向部分屏蔽表面上的電荷，導致表面電荷的減少。多聚物的形狀對其作為藥物遞送候選物的性能具有顯著的影響[37，38]，儘管還不知道哪一種多聚物形狀對有效的藥物遞送是令人滿意的。據我們所知，迄今為止還沒有研究聚乙二醇化對多聚物形狀的影響。在AFM圖中，1:1三綴合物多聚物-其在基因遞送中更有效-呈現形狀均質性，而1:3三綴合物更異質，具有許多非對稱的橢圓顆粒。利用陽離子聚合物進行的選擇性基因轉移仍是重要挑戰。之前的研究顯示，用EGF或運鐵蛋白靶向LPEI和LPEI-PEG綴合物增加它們的選擇性並減少在體外和體內的非特異性相互作用[39，40]。例如，為了檢查我們的Her-2靶向1:1三綴合物和1:3三綴合物多聚物的選擇性，我們使用了差異性表達Her-2的兩種乳腺癌細胞。如通過螢光素酶活性和GFP表達所示，基因遞送在BT474細胞中比在MDA-MB-231細胞中顯著較高，所述BT474細胞高度表達Her-2受體，所述MDA-MB-231細胞在細胞表面上表達少於100倍的Her-2受體。因此，數據表明，1:1三綴合物和1:3三綴合物對於Her-2過表達細胞來說均是高度選擇性的(圖10)。之前的研究顯示，高水平的聚乙二醇化可以導致基因轉染降低[41]。這些結果與我們的觀察一致：如通過螢光素酶活性和GFP表達所顯示的，與較少聚二乙醇化的1:1三綴合多聚物相比，高度聚二乙醇化的1:3三綴合多聚物顯示基因遞送的明顯減少。通過較少聚二乙醇化的1:1三綴合多聚物增加的基因遞送伴有輕微的細胞毒性，最可能是由於其較高的表面電荷。參與該研究之前我們的工作假設是：增加每LPEI單位的靶向部分數將導致改善的基因遞送和/或選擇性。我們推斷，1:3三綴合(每摩爾LPEI綴合3摩爾Her-2親和體分子)將顯示受體介導的顆粒內在化增加。然而，1:3三綴合多聚物顯示較低的ξ電位、較大的顆粒大小和異質性、非球形的形狀，其特徵均可能促成實際觀察到的轉染效率的降低。我們的結果顯示，較少聚二乙醇化的1:1三綴合物在向Her-2過表達細胞介導選擇性且有效的基因遞送方面優於較多聚二乙醇化的1:3三綴合物。根據本發明發現，基於LPEI的多聚物的聚乙二醇化導致表面電荷的減少、多聚物大小增加以及形狀異質性增加，並且這些特性對靶向的基因遞送具有深厚影響。我們的簡單合成允許以可再生形式純化均質產物，目前可對其進行擴展以利用各種靶向部分產生不同的三綴合物。鑑於以上，在一個方面，本發明提供雙鏈RNA(dsRNA)和聚合綴合物的多聚物，其中所述聚合綴合物由與一個或多個聚乙二醇(PEG)部分共價連接的線型聚乙烯亞胺(LPEI)組成，各PEG部分經接頭與能夠結合癌症抗原的靶向部分綴合，條件是所述靶向部分是不是mEGF或序列YHWYGYTPQNVI(GE11)(SEQIDNO:1)的肽。在某些實施方案中，癌症抗原可以是但不限於，表皮生長因子受體(EGFR)，人表皮生長因子受體2(HER2)，前列腺表面膜抗原(PSMA)，胰島素樣生長因子1受體(IGF1R)，血管內皮生長因子受體(VEGFR)，血小板源生長因子受體(PDGFR)或成纖維生長因子受體(FGFR)。所述靶向部分可以是天然的、自然的或修飾的配體或其旁系同源物(paralog)，或者非天然的配體，如抗體、單鏈可變片段(scFv)或抗體模擬物(如針對癌症抗原中的任一種的親和體)。親和體是蛋白A的Z結構域(免疫球蛋白G結合結構域)，並且通過位於涉及親本蛋白結構域的結合活性的兩個α-螺旋處的13個胺基酸的隨機化賦予泛素結合特性。在某些實施方案中，dsRNA是聚肌胞苷酸的雙鏈RNA(聚I:C)，聚合綴合物由與一個PEG部分共價連接的LPEI組成(LPEI-PEG1:1)或與三個PEG部分共價連接的LPEI組成(LPEI-PEG1:3)，以及所述癌症抗原是EGFR、HER2或PSMA。PEG的分子量的範圍可以是2至8kDa，特別是2kDa；LPEI的分子量的範圍可以是10至30kDa，特別是22kDa；以及本發明的多聚物的polyIC可以由各自包含至少22個，優選至少45個核糖核苷酸的RNA雙鏈組成。在某些實施方案中，各條鏈具有的核糖核苷酸數範圍在20至300內。在某些實施方案中，一個或多個PEG部分與LPEI各自獨立地形成-NH-CO-鍵，以及與接頭各自獨立地形成選自-NH-CO-、-CO-NH-、-S-C-、-S-S-、-O-CO-或-CO-O-的鍵。具體而言，一個或多個PEG部分中的每一個與LPEI和接頭形成-NH-CO-鍵。在某些實施方案中，接頭與靶向部分形成-S-S-鍵、NH-CO-鍵、-CO-NH-鍵、-S-C-鍵、O-CO-鍵、-CO-O-鍵或(-NH-CO-NH)脲鍵。接頭可以選自-CO-R2-RX-R3或者由3至7個胺基酸殘基組成的肽部分，其中R2選自(C1-C8)亞烷基、(C2-C8)亞烯基、(C2-C8)亞炔基、(C6-C10)亞芳基-二基或亞雜芳基二基；Rx不存在或為-S-；R3不存在或為式R4選自：(C1-C8)亞烷基、(C2-C8)亞烯基、(C2-C8)亞炔基、(C1-C8)亞烷基-(C3-C8)亞環烷基、(C2-C8)亞烯基-(C3-C8)亞環烷基、(C2-C8)亞炔基-(C3-C8)亞環烷基、(C6-C10)亞芳基-二基、亞雜芳基二基、(C1-C8)亞烷基-(C6-C10)亞芳基-二基或(C1-C8)亞烷基-亞雜芳基二基；其中所述(C1-C8)亞烷基、(C2-C8)亞烯基或(C2-C8)亞炔基中的每一個被各自獨立地選自以下的一個或多個基團獨立取代：滷素、-COR5、-COOR5、-OCOOR5、-OCON(R5)2、-CN、-N02、-SR5、-OR5、-N(R5)2、-CON(R5)2、-SO2R5、-SO3H、-S(＝O)R5、(C6-C10)芳基、(C1-C4)亞烷基-(C6-C10)芳基、雜芳基或(C1-C4)亞烷基-雜芳基，以及被一個或多個相同或不同的選自S、O或N的雜原子和/或各自獨立地選自-NH-CO-、-CO-NH-、-N(R5)-、-N(C6-C10芳基)-、(C6-C10)亞芳基-二基或亞雜芳基二基的至少一個基團任選間隔；以及R5是H或(C1-C8)烷基。在某些實施方案中，R2選自：(C1-C8)亞烷基，優選(C1-C4)亞烷基，所述R2被各自獨立地選自以下的一個或多個基團獨立取代：滷素、-COH、-COOH、-OCOOH、-OCONH2、-CN、-N02、-SH、-OH、-NH2、-CONH2、-SO2H、-SO3H、-S(＝O)H、(C6-C10)芳基、(C1-C4)亞烷基-(C6-C10)芳基、雜芳基或(C1-C4)亞烷基-雜芳基，以及被一個或多個相同或不同的選自S、O或N的雜原子和/或各自獨立地選自-NH-CO-、-CO-NH-、-NH-、-N(C1-C8烷基)-、-N(C6-C10芳基)-、(C6-C10)亞芳基-二基或亞雜芳基二基的至少一個基團任選間隔。具體而言，R2選自(C1-C8)亞烷基，優選(C1-C4)亞烷基。在某些實施方案中，Rx是-S-。在某些實施方案中，R3不存在或為其中R4是(C1-C8)亞烷基-(C3-C8)亞環烷基，優選(C1-C4)亞烷基-(C5-C6)亞環烷基。在某些實施方案中，在如上所限定的多聚物中，R2是-CH2-CH2-；RX是-S-；以及R3不存在或者為其中R4是在某些實施方案中，接頭是含有至少一個，具體為兩個或三個芳族胺基酸序列殘基(如苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸或高苯丙氨酸)的肽部分。在某些實施方案中，肽部分是-(NH-(CH2)7-CO)-Phe-Gly-Trp-Trp-Gly-Cys-(SEQIDNO:2)或-(NH-(CH2)7-CO)-Phe-Phe-(NH-CH2-CH(NH2)-CO)-Asp-Cys-(SEQIDNO:3)，所述肽部分經其巰基與靶向部分連接。在某些實施方案中，聚合綴合物是式(i)-(viii)的雙綴合物，其與靶向部分/部分連接：(i)(ii)(iii)-(NH-(CH2)7-CO)-Phe-Phe-(NH-CH2-CH(NH2)-CO)-Asp-Cys-PEG2k-LPEI；(iv)-(NH-(CH2)7-CO)-Phe-Gly-Trp-Trp-Gly-Cys-PEG2k-LPEI；(v)(vi)(vii)其中R6是或者(viii)其中R7是在具體的實施方案中，所述多聚物選自：(a)這樣的多聚物，其中靶向部分是HER2親和體，以及聚合綴合物是上文的式(i)，以及HER2親和體經其巰基連接，在本文也被稱為LPEI-PEG2k-HER2；(b)這樣的多聚物，其中靶向部分是HER2親和體，以及聚合綴合物是上文的式(v)，以及HER2親和體經其巰基連接，在本文也被稱為LPEI-(PEG2k-HER2)3；(c)這樣的多聚物，其中靶向部分是EGFR親和體，以及聚合綴合物是上文的式(i)，以及EGFR親和體經其巰基連接，在本文也被稱為LPEI-PEG2k-EGFR；(d)這樣的多聚物，其中靶向部分是EGFR親和體，以及聚合綴合物是上文的式(v)，以及EGFR親和體經其巰基連接，在本文也被稱為LPEI-(PEG2k-EGFR)3；(e)這樣的多聚物，其中靶向部分是人EGF(hEGF)，以及聚合綴合物是上文的式(ii)，其中hEGF經其氨基基團連接，在本文也被稱為LPEI-PEG2k-hEGF；(f)這樣的多聚物，其中靶向部分是hEGF，以及聚合綴合物是上文的式(vi)，其中hEGF經其氨基基團連接，在本文也被稱為LPEI-(PEG2k-hEGF)3；(g)這樣的多聚物，其中靶向部分是HOOC(CH2)2-CH(COOH)-NH-CO-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-(DUPA殘基)，以及聚合綴合物是上文的式(iii)；(h)這樣的多聚物，其中靶向部分是HOOC(CH2)2-CH(COOH)-NH-CO-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-(DUPA殘基)，以及聚合綴合物是上文的式(vii)；(i)這樣的多聚物，其中靶向部分是HOOC(CH2)2-CH(COOH)-NH-CO-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-(DUPA殘基)，以及聚合綴合物是上文的式(iv)；或者(j)這樣的多聚物，其中靶向部分是HOOC(CH2)2-CH(COOH)-NH-CO-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-(DUPA殘基)，以及聚合綴合物是上文的式(viii)。通過本發明的多聚物形成的納米顆粒的大小範圍可以是120至150nm，特別是135-148nm或142nm。製備本發明中使用的聚合綴合物的方法的非限制性實例在下文的實施例中示例。在某些具體的實施方案中，EGFR親和體是如SEQIDNO:4中所示的胺基酸序列，HER2親和體是如SEQIDNO:5中所示的胺基酸序列，以及hEGF是如SEQIDNO:6中所示的胺基酸序列。在另一方面，本發明涉及藥物組合物，其包含藥學可接受的載體和如上所限定的多聚物。而在另一方面，本發明提供用於治療選自以下癌症的本文所述發明的多聚物，或包含所述多聚物的藥物組合物：以EGFR過表達的細胞為特點的癌症、以HER2過表達的細胞為特點的癌症和前列腺癌。在某些實施方案中，以EGFR過表達的細胞為特點的癌症選自：非小細胞肺癌、乳腺癌、惡性膠質瘤、頭頸部鱗狀細胞癌、結腸直腸癌、腺癌、卵巢癌、膀胱癌或前列腺癌以及它們的轉移性腫瘤。在某些實施方案中，用於治療以EGFR過表達的細胞為特點的癌症的多聚物選自上文限定的(c)、(d)、(e)或(f)的多聚物。在某些實施方案中，以HER2過表達的細胞為特點的癌症選自：乳腺癌、卵巢癌症、胃癌以及子宮癌的侵略性形成，如子宮內膜漿液性癌。在某些實施方案中，Her2過表達的細胞是耐赫賽汀/曲妥單抗的細胞。因此，本發明的多聚物可以用於治療耐赫賽汀/曲妥單抗的癌症，即包含對赫賽汀/曲妥單抗的暴露不響應或較少程度響應的細胞的癌症。具體而言，用於治療以HER2過表達的細胞為特點的癌症的多聚物選自上文限定的多聚物(a)、(b)、(e)或(f)。在某些實施方案中，癌症是前列腺癌，以及用於治療前列腺癌的多聚物選自上文限定的(g)、(h)、(i)或(j)。在另一方面，本發明涉及治療選自以下癌症的方法：以EGFR過表達的細胞為特點的癌症、以HER2過表達的細胞為特點的癌症和前列腺癌，所述方法包括向需要的對象施用如本文所述發明的多聚物。在又一方面，本發明涉及用於治療選自以下癌症的藥物組合物：以EGFR過表達的細胞為特點的癌症、以HER2過表達的細胞為特點的癌症和前列腺癌，所述藥物組合物包含藥學可接受的載體和本發明的多聚物。而在又一方面中，本發明涉及用於與免疫細胞聯合使用的本發明的多聚物、方法或藥物組合物。而在又一方面中，本發明涉及如上的本文所述的多聚物，其中dsRNA被DNA分子(如包含與控制元件(如合適的啟動子和終止子)可操作連接的蛋白編碼核酸序列的質粒)代替。在某些實施方案中，免疫細胞是腫瘤浸潤T細胞(T-TIL)、腫瘤特異性工程化T細胞或外周血單個核細胞(PBMC)。本文使用的術語「多聚物(polyplexes)」指核酸和聚合物之間的複合物。將核酸經非共價或共價鍵特別是靜電鍵與聚合物結合。術語「多聚物」指有益於將核酸攜帶並遞送進細胞的載體，即非病毒載體。術語「患者」、「對象」或「個體」可互換地使用並且指人或非人的動物。本文使用的術語「(C1-C8)烷基」通常意指具有1-8個碳原子的直鏈或支鏈烴自由基，並且包括例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、仲丁基、異丁基、叔丁基、正戊基、2,2-二甲丙基、正己基、正庚基、正辛基等。術語「(C1-C8)亞烷基」指具有1-8個碳原子的直鏈或支鏈二價烴自由基並且包括例如亞甲基、亞乙基、亞丙基、亞丁基、亞戊基、亞己基、亞庚基、亞辛基等。術語「(C2-C8)亞烯基」和「(C2-C8)亞炔基」通常分別意指具有2-8個碳原子和一個或多個雙鍵或三鍵的直鏈或支鏈二價烴自由基。此類自由基的非限制性實例包括亞乙烯基、亞丙烯基、1-和2-亞丁烯基、1-和2-亞戊烯基、1-,2-和3-亞己烯基、1-,2-和3-亞庚烯基、1-,2-,3-和4-亞辛烯基、亞乙炔基、亞丙炔基、1-和2-亞丁炔基、2-甲基亞丙基、1-和2-亞戊炔基、2-甲基亞丁基、1-,2-和3-亞己炔基、1-,2-和3-亞庚炔基、1-,2-,3-和4-亞辛炔基等。術語「(C6-C10)芳基」表示具有6-10個碳原子的芳香碳環基團，其由單環或稠合多環組成，如但不限於苯基和萘基；術語「(C6-C10)亞芳基-二基」表示具有6-10個碳原子的二價芳香碳環基團，其由單環或稠合多環組成，如但不限於，亞苯基和亞萘基。術語「雜芳基」指源自含有一個至三個優選1-2個選自N、O或S的雜原子的5-10元單環或多環雜芳香環的自由基。單環雜芳基的實例包括但不限於，吡咯基、呋喃基、噻吩基、噻嗪基、吡唑基、吡嗪基、咪唑基、噁唑基、異噁唑基、噻唑基、異噻唑基、吡啶基、嘧啶基、1,2,3-三嗪基、1,3,4-三嗪基和1,3,5-三嗪基。多環雜芳基自由基優選包含兩個環，如但不限於，苯並呋喃基、異苯並呋喃基、苯並噻吩基、吲哚基、喹啉基、異喹啉基、咪唑並[1,2-a]吡啶基、苯並咪唑基、苯並噻唑基、苯並噁唑基、吡啶並[1,2-a]嘧啶基和1,3-苯並二氧雜環乙烯基。雜芳基可以被一個或多個基團任選取代，所述一個或多個基團各自獨立地選自：滷素、-OH、-COOH、-CN、-NO2、-SH或-CONH2.應當理解，當多環雜芳基被取代時，取代可以在任何碳環和/或雜環環上。術語「雜亞芳基二基」表示源自本文所定義的「雜芳基」通過從任何環原子移除兩個氫原子的二價自由基。本文使用的術語「滷素」指氟、氯、溴或碘。術語「(C3-C8)亞環烷基」表示含有三個至八個碳的單環或雙環飽和二價環烴自由基。此類自由基的非限制性實例包括1,2-環丙烷-二基、1,2-環丁烷-二基、1,3-環丁烷-二基、1,2-環戊烷-二基、1,3-環戊烷-二基、1,2-環己烷-二基、1,3-環己烷-二基、1,4-環己烷-二基、1,2-環庚烷-二基、1,3-環庚烷-二基、1,4-環庚烷-二基、1,2-環辛烷-二基、1,3-環辛烷-二基、1,4-環辛烷-二基、1,5-環辛烷-二基等。本文使用的術語「胺基酸殘基」指任何天然或合成的(即，非天然)L-和D-立體異構體的胺基酸殘基。雖然天然胺基酸是通常在蛋白中存在的二十種胺基酸殘基中的任一種，但是術語合成的/非天然的胺基酸指不是二十種天然胺基酸之一的任何胺基酸，修飾的胺基酸和/或其類似物。天然胺基酸的非限制性實例包括甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、纈氨酸、苯基丙氨酸、穀氨酸、天冬氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、精氨酸、組氨酸、脯氨酸、絲氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸和色氨酸。非天然胺基酸的實例包括但不限於鳥氨酸、高賴氨酸、2,4-二氨基丁酸(DABA)、2,3-二氨基丙酸(DAP)、8-氨基辛酸(EAO)、高苯丙氨酸、高纈氨酸、高亮氨酸等。根據本發明，使用一種或多種生理可接受的載體和/或賦形劑，可以以常規的方式配製藥物組合物。在與組合物的其它成分兼容的意義上來說，載體必須是「可接受的」，並且不會有害於其接受者。將下述示例的載體、施用模式、劑型等列為已知的可能性，從中可以選擇載體、施用模式、劑型等用於本發明使用。然而，本領域技術人員將理解，應當首先測試所選的任何給予製劑和施用模式以確定其是否能實現期望結果。施用的方法包括但不限於，腸胃外途徑，例如靜脈內途徑、腹膜內途徑、肌肉內途徑、皮下途徑、黏膜途徑(例如經口、鼻內、頰內、陰道、直腸、眼內)、囊內途徑、局部途徑和皮膚內途徑。施用可以是全身的或局部的。在某些實施方案中，藥物組合物適於腦內施用。術語「載體」指稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒介物，活性物質與其一起施用。藥物組合物中的載體可以包含粘合劑，如微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮(聚維酮或聚乙烯吡咯酮)、黃蓍膠、明膠、澱粉、乳糖或乳糖一水合物；崩解劑，如藻酸、玉米澱粉等；潤滑劑或表面活性劑，如硬脂酸鎂或十二烷基硫酸鈉；以及潤滑劑，如膠質二氧化矽。可以配製組合物，用於通過注射，例如通過單次快速靜脈注射或持續輸注進行腸胃外施用。用於注射的製劑可以以單位劑型存在，例如，在添加防腐劑的安瓿或在多劑量容器中。組合物可以採用懸液、溶液或者在油或水介質的乳劑的形式，並且可以含有配方劑，如懸浮劑、穩定劑和/或分散劑。可選地，活性成分可以是粉末形式，在使用之前用合適的介質例如無菌無熱原水製備。對於通過吸入進行的施用，例如對於鼻內施用，使用合適的推進劑，例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合適的氣體將本發明的組合物以氣溶膠噴霧呈現的形式從加壓包或噴霧器便利地遞送。在加壓氣溶膠的情況下，通過提供閥確定劑量單位以遞送計量量。可以配製用於吸入器或吹入器的例如明膠的膠囊和藥筒，其含有所述化合物和合適的粉末基底(如乳糖或澱粉)的粉末混合物。在某些實施方案中，將藥物組合物配製為用於通過如上所述的任何已知的方法進行施用。本文考慮的具體施用方法是靜脈內和腦內(大腦內)施用。可以將以上限定的實施方案中任一種的藥物組合物配製為用於靜脈內施用、腦內(大腦內)施用、經口施用、皮內施用、肌肉內施用、皮下施用、經皮施用、經黏膜施用、鼻內施用或眼內施用。現在，將通過下述非限制性實施例描述本發明。實施例材料和方法(M&M)化學藥品分子量為～2kDa的NHS-PEG-OPSS(鄰-吡啶基二硫化物-聚乙二醇-N-羥基琥珀醯亞胺酯)，也被稱為PDP-PEG-NHS(PDP：吡啶基二硫基丙酸酯)購自CreativePEGworks(Winston,USA)。平均分子量(Mn)為～50kDa的聚(2-乙基-2-噁唑啉)以及無水二甲基亞碸(DMSO)購自SigmaAldrich(Israel)。純乙醇購自Romical(Israel)。使用所有的溶劑而不需要進一步純化。～22kDaLPEI的合成(游離基形式)如以前所述[16]，合成線型聚乙烯亞胺(LPEI)的陽離子聚合物。簡言之，用100ml濃縮HCl(37％)使8.0g(0.16mmol)聚(2-乙基-2-噁唑啉)水解，並且回流48小時，產生白色沉澱。將過量的HCl減壓移除，將剩餘的固體溶於50ml水並且冷凍乾燥(5g，78％，1H-NMR，D2O-d6，400MHz:singlet3.5ppm)。通過添加NaOH水溶液(3M)，將得到的LPEI鹽酸鹽(4.5g)製備為鹼性的，以及將得到的白色沉澱進行過濾並用水洗滌直至中性。然後將固體溶於水並進一步凍幹以產生白色固體(2g，81％)。LPEI-PEG2k-OPSS雙綴合物的合成將174mg(8μmol)LPEI溶於2.7ml純EtOH，並且在室溫下攪拌15分鐘。將5倍摩爾過量的OPPS-PEG2k-CONHS(79mg，39.5μmol)溶於500μL無水DMSO並且將一小部分加入LPEI混合物。在環境溫度下，在旋渦攪拌器上將反應混合物以～800rpm攪拌3小時。使用裝填MacroPrepHighS樹脂的HR10/10柱(BioRad)，通過陽離子交換色譜將不同的PEG取代LPEI分開。使用裝備有VydacC-8單體5μm分析柱(4.6x150mm)的逆相HPLC，使用5％-95％乙腈的線性梯度，在25分鐘內以1ml/min的流速評估雙綴合物的洗脫級分的純度。將95％純度或更高純度的級分合併。合併級分針對20mMHEPESpH7.4進一步透析。通過1H-NMR測定雙綴合物中與LPEI綴合的PEG2k基團的比例。使用來自聚乙烯-(CH2-CH2-O)-和來自LPEI-(CH2-CH2-NH)-的氫的整數值來測定兩個綴合共聚物之間的比例。在從陽離子交換獲得的各種產物中，選擇兩種產物(LPEI-PEG2k-OPSS(1:1雙綴合物，LPEI與PEG的摩爾比為～1:1)和LPEI-(PEG2k)3-(OPSS)3(1:3雙綴合物，摩爾比為～1:3))，用於產生三綴合物。使用銅分析來評價共聚物濃度[17]。簡言之，將共聚物與CuSO4(23mg溶於100ml乙酸鹽緩衝液)孵育20分鐘並且測量它們在285nm處的吸光值。蛋白的SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)將樣本(30μL)在含或不含100mMDTT的SDS蛋白樣本緩衝液稀釋，然後施加至Tricine膠(13％聚丙烯醯胺)。使用負極緩衝液(0.1MTris，0.1MTricine和0.1％SDSpH8.25)和正極緩衝液(0.21MTrispH8.9)進行電泳，然後用InstantBlueTM染色使蛋白條帶顯現。親和體表達和純化將Her-2親和體基因克隆進質粒pET28a，其產生編碼Z:2891親和體的載體，所述親和體與N-端的六組氨酸(His6)標籤和C端處的Cys殘基融合。所述親和體如下所述在大腸桿菌BL21(DE3)中表達：使細胞於37℃生長至OD600～0.7。添加IPTG在最終濃度為0.5mM，隨後於30℃孵育4小時。將細胞球儲存於-80℃。為了純化親和體，將細胞球在緩衝液A(20mMHEPESpH7.4，500mMNaCl，10％甘油，10mM咪唑和2mMβ-巰基乙醇)中重懸，並且根據生產商的說明書，使用微流化器處理器M-110EHI進行破壞。通過於4℃，12,000Xg離心10分鐘，回收可溶級分。將得到的級分裝載在Ni親和柱(Clontech,MountainView,CA)上。將柱用緩衝液A洗滌14個柱體積(cv)。其後，使用增加濃度的緩衝液B(20mMHEPESpH7.4，500mMNaCl，10％甘油，500mM咪唑和2mMβ-巰基乙醇)；5cv的6％緩衝液B，1.5cv的10％緩衝液B，2cv的30％緩衝液B進行分步梯度洗脫。將結合蛋白用5cv的100％緩衝液B進行洗脫(蛋白純化設備，Wolfsoncentre，Israel)。然後將洗脫級分用超過濾器(截留3kDa)濃縮，並且裝載在製備級的凝膠過濾柱Superdex30(120ml)(GEhealthcare)上。將純化的蛋白通過SDS–PAGE進一步分析並且使用蛋白印記分析，用抗親和體抗體(Abcam)進行確認。通過如前所述的逆相HPLC(Merck-HitachiL-7100型)進一步評估純度。PEI-PEG-配體親和體(1:1三綴合物和1:3三綴合物)的合成將4.97mg各雙綴合物(1:1和1:3)溶於940μl20mMHEPESpH7.4。然後，將含3.4mgHer-2親和體的HBS逐滴添加至所述反應物。將4ml20mMHEPES加上700μL乙腈(HPLC級)加入反應混合物，用於增加溶解度。將反應物於室溫進一步旋渦(800rpm)，直到A343顯示完全的反轉。通過陽離子交換色譜，在裝填MacroPrepHighS樹脂(BioRad)的HR10/10柱上(使用20mMHEPESpH7.4的三步梯度洗脫至含3MNaCl的20mMHEPES)上純化得到的三綴合物。將洗脫級分引至分析RP-HPLC以評估三綴合物的純度，將95％純度和更高純度的級分合併，並且保存在-80℃。通過銅分析(如上)測定三綴合物的濃度。使用Nano-Drop2000，通過A280測定綴合的蛋白的量。綴合靶向蛋白的化學載體的驗證和純度。使三綴合物在SDS-PAGE上電泳，並且用InstantBlueTM染色，以確認親和體與LPEI-PEG2k的綴合。通過逆相HPLC，使用VydacC-8單體5μm分析柱(4.6x150mm)以1ml/min的流速，同時於220nm處進行監測來確認三綴合物的純度。對於HPLC分析，使用含0.1％TFA的三重蒸餾水(TDW)作為流動相，在25分鐘內，用乙腈(5％-95％)進行梯度洗脫。多聚物的形成將編碼螢火蟲螢光素酶和GFP的質粒pGreenFire1(系統Biosciences，Inc)在大腸桿菌中擴增，並且根據生產商的實驗指南，通過QiagenPlasmidMaxi試劑盒(Qiagen,Valencia,CA,USA)純化。將1:1三綴合物或1:3三綴合物與質粒以N/P＝6的比例在HEPES葡萄糖緩衝液中複合(其中N＝來自LPEI的氮，以及P＝來自DNA的磷)，其產生兩種多聚物。為了允許多聚物顆粒的完全形成，將樣本於室溫孵育30分鐘。多聚物樣本中的最終質粒濃度是100μg/ml，然而對於DNase保護和螢光素酶分析，質粒的最終濃度是10μg/ml。ξ-電位和大小測量使用體積分布計算，使用Nano-ZSZetasizer(Malvern,UK)，通過動態光散射，於25℃測量在HBG緩衝液中分散之後獲得的多聚物顆粒的大小。儀器配有633nm的雷射，並且通過背散射技術(NIBS，非侵入式背散射)，於173°檢測光散射。將各樣本運行三次。還使用Nano-ZSZetasizer(Malvern,UK)，於25℃進行ζ電位測量。將多聚物在HBG緩衝液(pH7.4)中孵育之後評價ζ電位。於17°檢測來自移動顆粒的光散射，並且使用Smoluchowski模型測定Henry函數值。原子力顯微鏡對於AFM測量，將多聚物置於新解理雲母片(V112mm,TedPellaUSA)上。使用商業化的AFM(具有QITM模型的3(JPK儀器，Berlin，Germany))，於25℃，在HBG緩衝液中進行成像。通過熱波動方法(包括在AFM軟體中)校準彈簧常數範圍為10至30pNnm-1的Si3N4(MSNL-10系列，Bruker)懸臂，具有大約10％的絕對不確定性。QITM的設置如下所示：Z-長度：0.1μm；作用力：0.5nN；速度：50μm/s。DNase保護分析如前所述[18]進行DNaseI保護分析。簡言之，在HBS溶液中，將單獨的1μgpGreenFire1DNA與1:1多聚物或1:3多聚物在50μl的最終體積中混合。於室溫孵育30分鐘後，將2μLDNaseI(2單位)或PBS添加至10μL的各樣本中，並且於37℃孵育15分鐘。通過添加5μL100mMEDTA，於室溫持續10分鐘來終止DNaseI的活性。為了使質粒從三綴合物分離，添加10μL5mg/mL肝素(Sigma,St.Louis,MO)，然後將管於RT孵育2小時。使樣本在0.8％瓊脂糖凝膠上電泳，並且用溴化乙錠染色。使用GelDocEZ成像儀(BioRadLaboratories,Inc)獲得圖像。細胞培養將Her-2過表達的BT474細胞在補充有10％胎牛血清(FBS)、104U/L青黴素和10mg/L鏈黴素的RPMI培養基中於37℃，5％CO2下培養。將MDA-MB-231人乳腺癌細胞在補充有10％FBS、104U/L青黴素和10mg/L鏈黴素的LeibovitzL-15培養基中於37℃無CO2的情況下培養。細胞系來自ATCC，以及細胞培養試劑來自生物Industries,BetHa'emek,Israel。螢光素酶分析和共焦顯微鏡將10000BT474andMDA-MB-231細胞一式三份接種在96-孔板上。將細胞用與質粒複合的1:1三綴合物和1:3三綴合物處理48小時，處理之後，將細胞用PBS洗滌，並且每孔用30μL細胞裂解緩衝液(Promega,Mannheim,Germany)裂解。根據生產商的建議，使用螢光素酶分析系統(Promega)，在25μl裂解物樣本中測量螢光素酶活性。使用LuminoskanTMAscent微孔板發光儀(ThermoScientific)進行測量。將相對光單位(RLU)的數值呈現為來自一式三份樣本的螢光素酶活性的平均值和標準偏差。使用共焦顯微鏡(FV-1200Olympus)來顯現GFP，所述GFP被用來反映質粒pGreenFire1的內化。在×10放大倍數下拍攝照片。細胞活力的定量如之前所述[19]，通過比色分析的方法，使用亞甲藍，測量細胞活力。簡言之，將10000BT474和MDA-MB-231細胞以一式三份接種在96孔板中。將細胞用含1μg/mlpGreenFire1的1:1多聚物和1:3多聚物處理。處理後48小時，將細胞固定在於PBS(pH7.4)中的1％甲醛內，用DDW洗滌，然後用亞甲藍在硼酸鹽緩衝液中的1％(wt/vol)溶液染色1小時。其後，用0.1MHCl萃取染色液，並且在酶標儀(ELx800BIO-TEX儀器股份有限公司)中，於630nm處讀取染色液的光學密度。實施例1–硫醇反應共聚物的合成。3.1.之前的研究已表明LPEI的聚乙二醇化以及其與EGFR靶向部分的綴合[13]。然而，單條LPEI鏈上的聚乙二醇化的量還未被完全表徵。為了產生差異化的聚二乙醇化共聚物，將LPEI上的仲胺與PEG上的末端NHS酯正交保護基綴合。N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)酯與LPEI上的仲骨架胺自發反應，提供LPEI的有效聚乙二醇化。而且，NHS-PEGOPSS與PEI的胺反應導致穩定不可逆的醯胺鍵的形成(圖1)。通過陽離子交換色譜純化聚乙二醇化產物。在NaCl的最高濃度處洗脫出兩個峰，一個在120mS/cm處，另一個在132mS/cm處(數據未示出)。推測兩個產物的LPEI:PEG比值不同，因此它們的淨正電荷不同。使用PEG(-CH2-CH2-O-)上氫原子的相對整數值(圖2)和LPEI(-CH2-CH2-NH-)上的氫原子的整數值(圖2)分析1H-NMR光譜。該分析表示，在第一峰中洗脫出的材料由這樣的共聚物組成：其中各摩爾的LPEI與大約三摩爾的PEG綴合。該產物被命名為LPEI-(PEG2k)3-(OPSS)3(「1:3雙綴合物」)。第二峰由這樣的共聚物組成：其中PEG與LPEI綴合的摩爾相等，並且被命名為LPEI-PEG2k-OPSS(「1:1雙綴合物」)(圖2)。實施例2.三綴合物，LPEI-PEG2k-Her2親和體(1:1三綴合物)&LPEI-(PEG2k)-(Her2)3親和體(1:3三綴合物)的合成本研究的最初目的是開發靶向Her-2過表達腫瘤細胞的陽離子聚合物。因為Her-2是「孤兒受體」，使用靶向Her-2受體的親和體分子(而不是配體)來產生Her-2靶向三綴合物。我們表達並純化了C-末端具有Cys殘基的Her-2親和體以允許進一步綴合。通過Her-2親和體的末端Cys殘基，將硫醇反應共聚物(1:1雙綴合物和1:3雙綴合物)與Her-2親和體綴合，分別產生1:1三綴合物和1:3三綴合物(圖3)。為了產生三綴合物，所述反應必須在低濃度親和體(為了防止聚集)且在作為有機極性溶劑用於增加溶解度的10％乙腈(ACN)的存在下進行。兩種三綴合物反應的反應產率大約是33％，如通過銅分析所測定的。為了確認親和體與雙綴合物的綴合，用DTT還原三綴合物產物，並且在SDS-PAGE上分離。考馬斯亮藍染色確認了還原的三綴合物釋放親和體(圖4)。通過測量A280，測定三綴合物中存在的Her-2親和體的量。使用銅分析，我們定量了LPEI。如上所述，1H-NMR分析顯示，純化的雙綴合物中LPEI:PEG的比例是1:1或1:3。比較Her-2親和體和LPEI的摩爾比，我們測定1:1三綴合物中Her-2親和體與LPEI的平均比是1:1，以及在1:3三綴合物中，平均比是3:1。因此，我們斷定，實現了親和體與LPEI-PEG的幾乎完全綴合。為了產生多聚物，將純的雙綴合物和三綴合物(1:1和1:3)與質粒DNA複合，如材料和方法中所述(圖3)。實施例3.多聚物的ξ電位和大小關於大小和表面電荷，使用動態光散射(DLS)，我們進一步表徵了多聚物。多聚物的大小對於其遞送特性具有顯著的影響[21]。為了研究靶配體對多聚物的大小的影響，我們決定將1:1雙綴合物和1:3雙綴合物二者與質粒複合並且測量它們的大小。1:1雙綴合物的平均顆粒大小為115.2±8.2nm，1:3雙綴合物的平均顆粒大小為253.1±9.5nm。由1:1三綴合物與質粒產生的多聚物的平均顆粒大小為141±5.8nm，而與質粒複合的1:3三綴合物的平均顆粒大小為256±24.2nm(圖5)。在通過將質粒與單獨的LPEI複合產生的多聚物中得到最小的顆粒(73.9±3.0nm)。親和體與雙綴合物的綴合對顆粒大小只有較少的影響。然而，PEG基團的數量不影響顆粒大小，其表示PEG基團引起空間位阻，幹擾與質粒的凝聚。正的表面電荷促進多聚物與帶負電的細胞表面的結合，但是過多的正電荷可以導致非特異性結合和顯著的毒性[12]。圖6中呈現的各種複合物的ξ電位與之前的研究一致，之前的研究顯示，隨著PEG單元數量的增加，ξ電位降低[13]。為了評估PEG基團對我們化學載體的表面電荷的影響，我們測量了通過質粒DNA與前體1:1雙綴合物和1:3雙綴合物，以及與1:1三綴合物和1:3三綴合物的複合所形成的多聚物的ξ電位。1:1雙綴合物多聚物的ξ電位為27.0±0.1mV，1:3雙綴合物多聚物的平均ξ電位為20.0±1.0mV。1:1三綴合物多聚物顯示平均值為17.1±0.7mV的ξ電位，而1:3三綴合物多聚物顯示10.2±0.44mV的平均值(圖6)。和大小不同，多聚物的ξ電位受PEG基團的數量和Her-2親和體的綴合二者的影響。儘管用裸的LPEI獲得最小、大多數帶正電的多聚物，但是這些顆粒極毒[22]。我們期待，PEG基團和靶向部分的添加將減少毒性，但是因為多聚物的大小仍然相對較小，我們希望它們作為核酸遞送載體的效率將不受連累。實施例4.使用原子力顯微鏡評估多聚物形狀。顆粒形狀的重要性及其對遞送特性的影響正得到公認[23]。使用原子力顯微鏡(AFM)，我們分析了用三綴合物獲得的多聚物在溶液中的形態學。1:1三綴合物多聚物和1:3三綴合物多聚物的直徑均為納米大小的範圍(圖7A-B)，與通過DLS獲得的結果一致。1:1三綴合物多聚物主要顯示為橢圓顆粒。大多數顆粒的直徑範圍為101nm至178nm，平均顆粒直徑為142nm。幾乎沒有顆粒異常大，某些甚至達到>250nm(圖7A)。1:3三綴合物多聚物的形狀更異質，而且，產生大的聚集體，具有不明確的顆粒形狀(圖7B)。這些顆粒的長度範圍為150nm至650nm，平均顆粒長度為312nm，以及它們的寬度範圍為85nm至400nm，平均寬度為175nm。實施例5.DNAse保護分析。成功的體內基因遞送取決於有效保護抵抗核酸酶。為了確定三綴合物保護質粒免受降解且能夠進行有效基因遞送的能力，將多聚物用DNaseI處理並且使用凝膠電泳進行分析。如圖8所示，在與2個單位的DNaseI孵育10分鐘後，裸的質粒pGreenFire1DNA被完全地降解。相比之下，當通過將質粒與三綴合物混合而產生多聚物時，保護質粒免受DNaseI的降解。對於1:3三綴合物多聚物而言，觀察到質粒的完全保護，而對於1:1三綴合物多聚物而言，發生一些切割，如質粒從超螺旋(s.c.)至開環(o.c.)形狀的變化所示。通過1:3三綴合物多聚物賦予的較強保護抵抗DNaseI可能歸因於這些複合物中另外的PEG-蛋白單元提供的空間位阻的增加。的確，之前的研究顯示，PEI的聚乙二醇化可以使多聚物穩定，並且通過妨礙它們與酶和血清因子的作用增加它們在血液中的循環[24，25]。實施例6.靶三綴合物多聚物的生物活性多聚物大小和ξ電位影響靶DNA遞送和基因表達的效率，但是大小的影響似乎取決於具體的綴合物[2][21]。為了評價1:1三綴合物多聚物和1:3三綴合物多聚物的特異性和轉染效率，使用差異表達Her-2的兩種乳腺癌細胞系。用pGreenFire1形成1:1三綴合物和1:3三綴合物的多聚物，並且將其轉染進MDA-MB-231細胞(表達大約9x103個Her-2受體/細胞[26])和BT474細胞(表達大約1x106個Her-2受體/細胞[27])。轉染之後48小時，觀察到有差異的螢光素酶活性。在BT474細胞中，1:1三綴合物多聚物和1:3三綴合物多聚物均產生比在MDA-MB-231中高超過300倍的螢光素酶活性(*p<0.001)(圖9A)。通過GFP的表達確認向BT474的更高效基因遞送，如通過共焦顯微鏡所看到的(圖9B)。這些結果顯示，多聚物的選擇性取決於Her-2的表達。通過1:1三綴合物多聚物向BT474細胞的靶向遞送比1:3三綴合物多聚物的遞送高效10倍多(圖9A，B)，甚至儘管1:3三綴合物具有更多的靶向部分。這可能反映了ξ電位越高，1:1三綴合物多聚物的大小越小。帶正電荷的LPEI基化學載體與明顯的毒性相關。因此，我們進一步測試了在用1:1三綴合物多聚物和1:3三綴合物多聚物處理之後存活的MDA-MB-231和BT474細胞。在亞甲藍分析中，兩種多聚物均未顯示在MDA-MB-231細胞中的細胞毒性作用。在用1:3三綴合物多聚物處理的BT474細胞中觀察到類似的結果。然而，在用1:1三綴合物多聚物處理的BT474中觀察到細胞毒性的輕微增加(圖9C)。總之，這些結果顯示，1:1三綴合物多聚物的小的尺寸和較高的ξ電位賦予了高效的靶向遞送特性，毒性僅有輕微的增加。因此，1:1三綴合物的多聚物在基因遞送方面優於更多屏蔽的1:3三綴合物多聚物。實施例7.PEI-PEG-Her2親和體的抗腫瘤活性與聚肌苷/聚胞苷(PolyIC)複合的PEI-PEG-Her2親和體(PPHA)具有強烈的抗腫瘤活性。發現過表達Her-2的乳腺癌細胞系被PEI-PEG-Her2親和體與PolyIC的複合物很強地抑制。還觀察到對耐曲妥單抗的Her2過表達乳腺癌細胞系的強烈抑制。圖10顯示載體/多聚物抑制Her2過表達細胞，包括耐赫賽汀/曲妥單抗的細胞。將0.5x106個MCF-7HER-2細胞皮下注射進裸鼠。在腫瘤達到100mm3的平均值之後，開始處理。每24小時靜脈注射1mg/kgpIC/PPHA。將曲妥單抗一周一次(通過箭頭指示)靜脈施用至兩組小鼠。一周兩次測量腫瘤的生長。如圖11中所示例的，在小鼠模型(其中將這些細胞系植入裸鼠)中，發現複合物PolyIC/PPHA具有強烈的抗腫瘤活性。實施例8.LPEI-PEG-EGFR親和體的合成5mg(2×10-4mmol)LPEI-PEG2k-OPSS(1:1雙綴合物)溶於1ml20mMHEPESpH7.4。然後，將含3.4mg(3.8×10-4mmol，～2eq)EGFR親和體的HBS逐滴添加至所述反應物。將4mL20mMHEPES加上700μL乙腈(HPLC級)加入反應混合物用於增加溶解性。將反應物於室溫且黑暗條件下進一步旋渦(800rpm)，直到A343顯示完全反轉。通過陽離子交換色譜，在裝填MacroPrepHighS樹脂(BioRad)的HR10/10柱上純化得到的三綴合物(使用20mMHEPESpH7.4的三步梯度洗脫至含3MNaCl的20mMHEPES)。將洗脫級分引入分析型RP-HPLC以評估LPEI-PEG-EGFR三綴合物的純度，將具有95％純度和更高純度的級分合併，並且保存於-80℃。通過銅分析測定三綴合物的濃度。使用Nano-Drop2000，通過A280測定綴合的蛋白的量。實施例9.PEI-PEG-EGFR親和體的抗腫瘤活性與PolyIC複合的PEI-PEG-EGFR親和體(PPEA)具有強烈的抗腫瘤活性。發現過表達EGFR的各種細胞系被與聚肌苷/聚胞苷(PolyIC)複合的PEI-PEG-EGFR親和體(PPEA)的複合物強烈地抑制。可以看出，PPEA的功效高於PPE的功效(圖12)。在將這些細胞系植入裸鼠的小鼠模型中，發現複合物PolyIC/PPEA具有強烈的抗腫瘤活性。用2百萬個A431細胞皮下注射六十五隻5周齡的雌性裸鼠。七天後，腫瘤的平均體積為136mm3，並且將小鼠如下所述分為6組(7-8隻小鼠/組)：UT；pIC/PPEA，對於25gr小鼠，0.75mg/kg＝250μLpIC，IC，6次/周；pI/PPEA，0.75mg/kgIV，6/周；pIC/PPEA低，對於25gr小鼠，0.1mg/kg＝250μL0.01μg/μlpIC，IC，6次/周。將pIC、pI和PPE以及PPEA在混合前稀釋以獲得複合物中的pIC低於通常(0.1μg/μl)濃度。圖13顯示體內PolyIC/PPEffibody的活性。再一次，PPEA/PolyIC的功效高於PolyIC/PPE的功效。實施例10.LPEI-PEG-h/mEGF的合成10.1.LPEI-PEG-SH中間體的合成向含5mgLPEI-PEG-OPSS(0.2μmol，根據24000g/mol)的5mL20mMHEPES(pH7.4)緩衝液添加50倍摩爾過量的二硫蘇糖醇(DTT；0.1mmol,1.5mg)，並且在15ml塑料離心管中通過旋渦於室溫混合20分鐘。使用5ml樣本環，將還原的雙綴合物在SephadexG-25柱(20ml，4x5ml)上分離，並且用20mMHEPES(pH7.4)以1.0ml/min的流速進行洗脫，以及通過HPLC，使用與上述相同的條件和方法進行分析。使用Ellman’s分析來評價LPEI-PEG-SH中間體中硫氫基的濃度。SH基的濃度與由游離的硫醇釋放的發色團6-硝基-3-硫代環己基-1,4-二烯-1-羧酸的濃度成正比，所述游離的硫醇與Ellman’s試劑定量反應。經由於412nm處的吸光值測量發色團，而不受樣本或Ellman’s試劑的任何幹擾。10.2m/hEGF-MCC中間體的合成合成概要.將h/mEGF(人/小鼠表皮生長因子)修飾成h/mEGF-MCC(EGF-4-(N-馬來醯亞胺甲基)環己烷-1-羧酸；MCC)並且進行純化以稍後用於與LPEI-PEG-SH的綴合。通過連接MCC基團活化h/mEGF防止蛋白被DTT還原，並且允許避免h/mEGF對粗糙條件的暴露。該方式改善綴合反應效率，而且-EGF-MCC是穩定的材料，其可以於-80℃儲存數周。hEGF-MCC的合成：將1mghEGF(160nmol)在0.5ml水中復溶，然後用氬氣脫氣。使用nano-drop2000，於280nm處測定hEGF的量。將溶液添加至0.5mL200mM乙酸鈉緩衝液pH6.0和60％乙醇，同時劇烈混合。在氬氣的情況下，將溶液與在0.5mL100％乙醇中的10當量4-(N-馬來醯亞胺甲基)環己烷-1-羧酸3-硫代-N-羥基琥珀醯亞胺酯鈉鹽(Sulfo-SMCC)混合。稍微酸性pH的反應混合物(pH6)是必需的，以選擇性地修飾hEGF的N-端氨基。於室溫4小時之後，通過透析袋(3.5ka截留)，針對HBS(100mM)純化功能化的肽，在1L中透析三次，每次1小時，然後在1L中透析過夜。使用HPLC-質譜(MS)分析hEGF-MCC，其分子量為6435.7g/mol，其顯示，硫代-SMCC與hEGF存在一個綴合。使用裝配逆相C-18柱(phenomenex，Aeris，3.6μm，2.1mmx50mm，100A°)的ThermoSCIENTIFIC/LCQFLEET進行HPLC-MS分析。mEGF-MCC的合成：將0.5mg(0.088μmol總量)鼠EGF(PeproTech)溶於2100μL20mMHEPES緩衝液，形成清澈的粘性溶液。將1mg硫代-SMCC(30eq.，Ornat,IL)溶於0.9mL純EtOH並且與EGF溶液緩慢混合以在3.0ml總體積中達到30％EtOH的最終濃度。簡短的混合導致清澈的溶液。將反應容器於環境溫度震蕩4小時。所述時間段之後，溶液保持清澈。首先將mEGF-MCC在SephadexG-25柱(4x5ml)上分離，並且用20mMHEPES，pH7.4以1.0ml/min的流速進行洗脫，進一步洗脫，通過HPLC，使用與如上所述用於LPEI-PEG-OPSS的相同條件和標準方法進行分析。10.3LPEI-PEG-h/mEGF的合成將一當量和半當量的hEGF-MCC或mEGF-MCC與1.0當量LPEI-PEG-SH混合。最初將反應混合物於室溫攪拌2小時，然後在緩慢震動的情況下於+4℃孵育4天。通過陽離子交換色譜(在10/1cmTricornGEHealthcare柱中的7.8cmMacroPrepHighS樹脂(BioRad))，使用經A18緩衝進口的梯度泵，以0.5ml/min的流速並且使用溶劑A：20mMHEPESpH7.4和溶劑B：20mMHEPESpH7.4NaCl3.0M分離反應產物(LPEI-PEG-hEGF或LPEI-PEG-mEGF)。通過HPLC分析純化的LPEI-PEG-hEGF或LPEI-PEG-mEGF三綴合物，並且通過「銅分析」和EGF光度分析進行定量以相應地測量[LPEI]和[EGF]的濃度。10.4LPEI-PEG-hEGF的生物活性。使用我們通過採用的細胞分析，我們比較了PolyIC/LPEI-PEG-hEGF複合物(PPEm)與在SchaffertD,KissM,W,ShirA,LevitzkiA,OgrisM,WagnerE.,2011(Poly(I:C)-mediatedtumorgrowthsuppressioninEGF-receptoroverexpressingtumorsusingEGF-polyethyleneglycol-linearpolyethylenimineascarrier.PharmRes.28:731-41)中所述描述的PolyIC/mPPE(小鼠)的活性。可以看出，新HEGF綴合物在殺死EGFR過表達細胞方面更有效(圖14)。在它們的表面表達適度量的EGFR分子的細胞(U87MG細胞表達80,000個EGFR/細胞)對處理的敏感性比過表達大量的細胞(U87MGwtEGFR細胞表達1,000,000個EGFR/細胞)低。實施例11.DUPA類似物-DyLight680的合成使用標準的Fmoc固相肽合成(SPPS)方法在作為固體支持物的Fmoc-Cys(trt)王樹脂上合成肽。溶脹：將樹脂在二氯甲烷中溶脹至少2小時。Fmoc的移除：首先用20％哌啶在二甲基甲醯胺(DMF)中的溶液處理樹脂(2x20分鐘)，然後用DMF洗滌(5x2分鐘)。Fmoc-Asp(OtBu)-OH的偶聯：將3當量Fmoc-Asp(OtBu)-OH，3當量(1-[二(二甲氨基)亞甲基]-1H-1,2,3-三唑[4,5-b]吡啶鹽3-氧化六氟磷酸酯)(HATU)溶於15mLDMF，並且將8當量N,N-二異丙基乙胺(DIEA或DIPEA)添加至混合物。將溶液於室溫混合(預活化)10分鐘，然後添加至樹脂，持續1小時。為了確保天冬氨酸的完全偶聯，用新混合物將偶聯重複兩次。進行Keiser測試以確保完全偶聯。將樹脂用DMF(3x2分鐘)和二氯甲烷(DCM)(2x2分鐘)洗滌。加帽：將樹脂用乙酸酐(10當量)和DIPEA(8當量)在DMF中的溶液處理20分鐘並且用DMF洗滌(3x2分鐘)。Fmoc的移除：首先用20％哌啶在DMF中的溶液處理樹脂(2x20分鐘)，然後用DMF洗滌(5x2分鐘)。Fmoc-二氨基丙酸(DAP)的偶聯：3當量Fmoc-二氨基丙酸(DAP)，3當量HATU和8當量DIEA溶於15mLDMF。將溶液於室溫混合(與活化)10分鐘，然後將其添加至樹脂，持續1小時。進行Keiser測試以確保完全偶聯。將樹脂用DMF(3x2分鐘)和DCM(2x2分鐘)洗滌。肽的延長：將下述化合物按下述順序與樹脂偶聯：(1)Fmoc-Phe-OH，(2)Fmoc-Phe-OH，(3)Fmoc-8-氨基辛酸(EAO)，和(4)OtBu-Glu(Fmoc)-OH。Fmoc的移除：用20％哌啶在DMF中的溶液處理樹脂(2x20分鐘)，然後用DMF(5x2分鐘)和DCM(3x2分鐘)洗滌。DUPA配體的偶聯：將0.9mL三乙胺(6.6mmol)與含0.9克(3mmol)L-穀氨酸二叔丁酯鹽酸鹽的15mLDCM合併。於0℃，在45分鐘內將該溶液逐滴添加至5mLDCM和三光氣(0.35g，1.1mmol)的溶液。在攪拌另外50分鐘後，將混合物與另外0.9mL三乙胺添加至樹脂。將具有樹脂的反應混合物震蕩3小時，並且用DMF洗滌(3x2分鐘)。完全切割：將樹脂用DCM洗滌(3x2分鐘)並且真空乾燥。於0℃，添加2.5％TDW和2.5％三異丙基矽烷在三氟乙酸(TFA)中的溶液。反應於室溫進行4小時，過濾並用乙醚/己烷1:1的冷溶液處理，以及通過離心將肽沉澱。將粗肽溶於乙腈/TDW1:1溶液並凍幹。通過製備型逆相(RP)HPLC純化粗品。DyLight680偶聯：在氬氣氣氛下，將1mgDyLightTM680(LifeTechnologies，Cat.No.46418)溶於含50當量無水二異丙基乙胺的無水二甲亞碸(DMSO；100μL)。將溶於無水DMSO(100μL)的兩倍摩爾過量的DUPA肽接頭添加至以上混合物並且於室溫攪拌。通過液相色譜-質譜聯用(LC-MS)確認產物的形成。然後通過製備型RP-HPLC純化粗DUPA近紅外(NIR)探針。實施例12.Dupa類似物-藥物先導的合成使用標準FmocSPPS程序，在作為固體支持物的Fmoc-Cys(trt)wang樹脂上合成肽。溶脹：將樹脂在二氯甲烷中溶脹至少2小時。Fmoc移除：用20％哌啶在DMF中的溶液處理樹脂(2x20分鐘)，然後用DMF洗滌(5x2分鐘)。Fmoc-Gly-OH的偶聯：將3當量Fmoc-Gly-OH和3當量HATU溶於15mLDMF，隨後添加8當量DIEA。將溶液於室溫混合(預活化)10分鐘，然後將其添加至樹脂，持續1小時。用新混合物重複兩次偶聯。進行Keiser測試以確保完全偶聯。將樹脂用DMF(3x2分鐘)和DCM(2x2分鐘)洗滌。加帽：將樹脂用乙酸酐(10當量)和DIPEA(8當量)在DMF中的溶液處理20分鐘，並且用DMF洗滌(3x2分鐘)。Fmoc的移除：用20％哌啶在DMF中的溶液處理樹脂(2x20分鐘)，然後用DMF洗滌(5x2分鐘)。Fmoc-Trp(Boc)-OH的偶聯：將3當量Fmoc-Trp(Boc)-OH，3當量HATU和8當量DIEA溶液15mlDMF。將溶液於室溫混合(預活化)10分鐘，然後將其添加至樹脂，持續1小時。進行Keiser測試以確保完全偶聯。將樹脂用DMF(3x2分鐘)和DCM(2x2分鐘)洗滌。肽的延長：將下述化合物按下述順序與樹脂偶聯：(1)Fmoc-Trp(Boc)-OH，(2)Fmoc-Gly-OH，(3)Fmoc-Phe-OH，(4)Fmoc-8-氨基辛酸(EAO)和(5)OtBu-Glu(Fmoc)-OH。Fmoc的移除：用20％哌啶在DMF中的溶液處理樹脂(2x20分鐘)，然後用DMF(5x2分鐘)和DCM(3x2分鐘)洗滌。DUPA配體的偶聯：將0.9mL三乙胺(6.6mmol)與含0.9克(3mmol)L-穀氨酸二叔丁酯鹽酸鹽的15mLDCM合併。於0℃，在45分鐘內，將該溶液逐滴添加至5mLDCM和三光氣(0.35g，1.1mmol)的溶液。攪拌另外50分鐘後，將混合物與另外0.9mL三乙胺添加至樹脂。將具有樹脂的反應混合物震蕩3小時，並且用DMF洗滌(3x2分鐘)。完全切割：將樹脂用DCM洗滌(3x2分鐘)，並且真空下乾燥。添加0℃的2.5％TDW和2.5％三異丙基矽烷在三氟乙酸(TFA)中的溶液。反應於室溫進行4小時，過濾並用乙醚/己烷1:1的冷溶液處理，並且通過離心沉澱含有DUPA類似物的肽。將粗肽溶於乙腈/TDW1:1溶液並凍幹。通過製備型RP-HPLC純化粗品。PEI-PEG-DUPA類似物的合成：將4.37mg(1.2×10-4mmol)1:1雙綴合物或1:3雙綴合物(如本文上述的實施例1中所說明的製備)溶於940μL20mMHEPESpH7.4。然後，將以1:1的比例溶於2mL乙腈(ACN；HPLC級)/(20mMHEPESpH7.4)的1mg(9.1×10-4mmol，～5當量)DUPA類似物逐滴添加至反應物。然後，為了達到ACN在反應物中大約～10％總濃度，將4mL20mM的添加物引入反應混合物。於室溫黑暗條件下將反應進一步旋渦(800rpm)直到波長343(A343)處的吸光值顯示完全的反轉。通過陽離子交換色譜，在裝填MacroPrepHighS樹脂(BioRad)的HR10/10柱上純化得到的三綴合物(使用20mMHEPESpH7.4的三步梯度洗脫至含3MNaCl的20mMHEPES)。將洗脫級分引入分析型RP-HPLC以評估三綴合物的純度。將具有95％純度和更高純度的級分合併並且於-80℃保存。通過銅分析測定三綴合物的濃度。通過發色團(Trp胺基酸)的吸光值測定綴合的DUPA類似物的量。實施例13.PolyIC/LPEI-PEG-DUPA靶向前列腺癌。前列腺表面膜抗原(PSMA)在轉移性前列腺癌中過表達。其還存在於大多數固體腫瘤的新血管系統中。因為PSMA基於配體的結合被內化，所以我們選擇其作為靶標，設計併合成PolyICPSMA靶向載體。的確，DUPA-Daylight680被內化至PSMA過表達細胞(LNCaP)，但不被內化至MCF7(過表達Her2)(未顯示)。圖15顯示PEI-PEG-DUPA(PPD)/PolyIC針對LNCaP和VCaP細胞高度有效。96小時的暴露之後測量活力。PPD還誘導細胞因子的產生(圖16)。在圖17中，表明使LNCaP細胞適應的培養基刺激在條件培養基中生長的PBMC中細胞因子INF-γ、IL-2和TNF-α的表達。然後顯示，PolyIC/PPD處理的LNCaP細胞與不表達PSMA的PC3-螢光素酶細胞的共孵育經旁觀者效應導致PC3-螢光素酶細胞多至70％的致死。健康的人PBMC的添加強烈地增強效果並導致PC3細胞90％的致死(圖18)。實施例14.癌症的體內處理。當在SCID小鼠中測試時，PolyIC/PPD具有顯著的抗腫瘤效果(圖19)。由於實驗小鼠中免疫系統的缺乏，腫瘤抑制是不完全的。參考文獻1.Boussif,O.,etal.,Aversatilevectorforgeneandoligonucleotidetransferintocellsincultureandinvivo:polyethylenimine.ProcNatlAcadSciUSA,1995.92(16):p.7297-301.2.Wagner,E.,etal.,Transferrin-polycation-DNAcomplexes:theeffectofpolycationsonthestructureofthecomplexandDNAdeliverytocells.ProcNatlAcadSciUSA,1991.88(10):p.4255-9.3.Little,S.R.,etal.,Poly-betaaminoester-containingmicroparticlesenhancetheactivityofnonviralgeneticvaccines.ProcNatlAcadSciUSA,2004.101(26):p.9534-9.4.Davis,M.E.,Z.G.Chen,andD.M.Shin,Nanoparticletherapeutics:anemergingtreatmentmodalityforcancer.NatRevDrugDiscov,2008.7(9):p.771-82.5.Remy,J.S.,etal.,Targetedgenetransferintohepatomacellswithlipopolyamine-condensedDNAparticlespresentinggalactoseligands:astagetowardartificialviruses.ProcNatlAcadSciUSA,1995.92(5):p.1744-8.6.Jager,M.,etal.,Branchedandlinearpoly(ethyleneimine)-basedconjugates:syntheticmodification,characterization,andapplication.ChemSocRev,2012.41(13):p.4755-67.7.Ziebarth,J.D.andY.Wang,UnderstandingtheprotonationbehavioroflinearpolyethylenimineinsolutionsthroughMonteCarlosimulations.Biomacromolecules,2010.11(1):p.29-38.8.Hobel,S.,etal.,Maltose-andmaltotriose-modified,hyperbranchedpoly(ethyleneimine)s(OM-PEIs):PhysicochemicalandbiologicalpropertiesofDNAandsiRNAcomplexes.JControlRelease,2011.149(2):p.146-58.9.Rejman,J.,A.Bragonzi,andM.Conese,Roleofclathrin-andcaveolae-mediatedendocytosisingenetransfermediatedbylipo-andpolyplexes.MolTher,2005.12(3):p.468-74.10.Behr,J.P.,Theprotonsponge:Atricktoentercellsthevirusesdidnotexploit.Chimia,1997.51(1-2):p.34-36.11.Suh,J.,H.J.Paik,andB.K.Hwang,IonizationofPoly(Ethylenimine)andPoly(Allylamine)atVariousPhs.BioorganicChemistry,1994.22(3):p.318-327.12.Ogris,M.,etal.,PEGylatedDNA/transferrin-PEIcomplexes:reducedinteractionwithbloodcomponents,extendedcirculationinbloodandpotentialforsystemicgenedelivery.GeneTher,1999.6(4):p.595-605.13.Schaffert,D.,etal.,Poly(I:C)-mediatedtumorgrow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erSerHisHisHisHisHisHisSerSerGlyLeuValPro151015ArgGlySerHisMetAlaGluAlaLysTyrAlaLysMetArgAsnAla202530TyrTrpGluIleAlaLeuLeuProAsnLeuThrAsnGlnGlnLysArg354045AlaPheIleArgLysLeuTyrAspAspProSerGlnSerSerGluLeu505560LeuSerGluAlaLysLysLeuAsnAspSerGlnAlaProLysCys657075653PRT智人6AsnSerAspSerGluCysProLeuSerHisAspGlyTyrCysLeuHis151015AspGlyValCysMetTyrIleGluAlaLeuAspLysTyrAlaCysAsn202530CysValValGlyTyrIleGlyGluArgCysGlnTyrArgAspLeuLys354045TrpTrpGluLeuArg50當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp