通過抑制盤狀大同系物(dlg)的天然反義轉錄物而治療dlg相關疾病的製作方法

2023-06-25 18:53:01 2

專利名稱：通過抑制盤狀大同系物(dlg)的天然反義轉錄物而治療dlg相關疾病的製作方法
通過抑制盤狀大同系物(DLG)的天然反義轉錄物而治療DLG相關疾病發明領域
本申請要求2010年7月14日提交的美國臨時專利申請No. 61/364，211的優先權， 其通過引用整體併入本文。
本發明的實施方案包括調節DLGl和相關分子的表達和/或功能的寡核苷酸。
背景
DNA-RNA和RNA-RNA雜交對於核酸功能的許多方面是重要的，包括DNA複製、轉錄和翻譯。雜交對於檢測特定核酸或改變其表達的多種技術也是關鍵的。反義核苷酸，例如通過與靶RNA雜交從而幹擾RNA剪接、轉錄、翻譯和複製來破壞基因表達。反義DNA具有額外的特性，即DNA-RNA雜交物作被核糖核酸酶H消化的底物，這是在大多數細胞類型中存在的活性。反義分子可被遞送到細胞中，如寡脫氧核苷酸(ODN)的情形，或反義分子可從內源基因表達為RNA分子。FDA最近批准了一種反義藥物VITRAVENE (用於治療巨細胞病毒視網膜炎)，反映了反義藥物具有治療效用。
概述
提供本概述以展示本發明的概述，以簡要地指出本發明的性質和實質。提交本概述應理解的是，其不會用來解釋或限制權利要求書的範圍或含義。
在一個實施方案中，本發明提供通過利用靶向天然反義轉錄物任何區域的反義寡核苷酸而導致相應有義基因的上調來抑制天然反義轉錄物作用的方法。本文還預期，天然反義轉錄物的抑制可由siRNA、核酶和小分子實現，認為這些在本發明的範圍中。
—個實施方案提供體內或體外調節患者細胞或組織中DLGl多核苷酸的功能和/ 或表達的方法，包括將所述細胞或組織與長度為5至30個核苷酸的反義寡核苷酸接觸，其中所述寡核苷酸與包括SEQID NO: 2的核苷酸I至1706中的5至30個連續核苷酸的多核苷酸的反向互補序列具有至少50%序列同一1丨生,從而體內或體外調節患者細胞或組織中DLGl 多核苷酸的功能和/或表達。
在實施方案中，寡核苷酸靶向DLGl多核苷酸的天然反義序列，例如，SEQ ID NO:2 所列的核苷酸及其任何變體、等位基因、同系物、突變體、衍生物、片段及其互補序列。反義寡核苷酸的實例如SEQ ID NO:3至12所列。
另一實施方案提供體內或體外調節患者細胞或組織中DLGl多核苷酸的功能和/ 或表達的方法，包括將所述細胞或組織與長度為5至30個核苷酸的反義寡核苷酸接觸，其中所述寡核苷酸與DLGl多核苷酸的反義的反向互補序列具有至少50%序列同一'丨生；從而體內或體外調節患者細胞或組織中DLGl多核苷酸的功能和/或表達。
另一實施方案提供體內或體 外調節患者細胞或組織中DLGl多核苷酸的功能和/ 或表達的方法，包括將所述細胞或組織與長度為5至30個核苷酸的反義寡核苷酸接觸，其中所述寡核苷酸與DLGl反義多核苷酸的反義寡核苷酸具有至少50%序列同一性；從而體內或體外調節患者細胞或組織中DLGl多核苷酸的功能和/或表達。
在實施方案中，本發明包括調節生物體系中的盤狀大同系物I(DLGl)多核苷酸的功能和/或表達的方法，所述方法包括將所述體系與靶向盤狀大同系物I (DLGl)多核苷酸及其同種型的天然反義寡核苷酸的區域的至少一個反義寡核苷酸相接觸；由此調節盤狀大同系物I (DLGl)多核苷酸的功能和/或表達。
在實施方案中，組合物包括一種或多種結合有義和/或反義DLGl多核苷酸的反義寡核苷酸。
在實施方案中，寡核苷酸包括一種或多種修飾或取代的核苷酸。
在實施方案中，寡核苷酸包括一種或多種修飾的鍵。
在又一實施方案中，修飾的核苷酸包括包含硫代磷酸酯、膦酸甲酯、肽核酸、 2』 -O-甲基、氟-或碳、亞甲基或其它鎖核酸(LNA)分子的修飾的鹼基。優選地，修飾的核苷酸是鎖核酸分子，包括a-L-LNA。
在實施方案中，將寡核苷酸皮下、肌內、靜脈內或腹膜內施用給患者。
在實施方案中，寡核苷酸以藥物組合物施用。治療方案包括向患者施用反義化合物至少一次；然而，可修改該治療以包括經一段時間的多個劑量。該治療可與一種或多種其它類型的治療聯合。
在實施方案中，將寡核苷酸封裝在脂質體中或連接於載體分子(例如，膽固醇、 TAT 肽)。
其它方面在以下描述。
附圖簡述


圖1顯示用靶向DLGl特異性天然反義轉錄物的反義寡核苷酸處理後ΗΕΚ293Τ細胞中的DLGlmRNA水平的增加(通過實時PCR測定)。⑶R-1695至⑶R-1704是針對DLGl 天然反義靶向的反義寡核苷酸。*_P〈0. 05 ;**-P〈0. 01001。標為CUR-1695至 CUR-1704的條柱分別對應用SEQ ID NO:3至12處理的樣品。
圖2顯示用靶向DLGl特異性天然反義轉錄物的反義寡核苷酸處理後HEK293T細胞中的單層完整性的加速恢復(如通過閉合測定來測定)。⑶R-1696至⑶R-1704是針對 DLGl天然反義靶向的反義寡核苷酸。*_P〈0. 05 ;**-P〈0. 01001。標為CUR-1696、 CUR-1699、CUR-1700、CUR-1703 和 CUR-1704 的條柱分別對應用 SEQ ID N0:4、7、8、ll 和 12 處理的 樣品。
序列表描述-SEQ ID NO:1 :智人盤狀,大同系物I (Drosophila) (DLGl),轉錄變體 2，mRNA(NCBI 登記號NM_004087) ；SEQ ID NO: 2 :天然 DLGl 反義序列(Hs. 636103) ；SEQ ID NO:3至12 :反義寡核苷酸。*指示硫代磷酸酯鍵。
詳述
下面參考用於示例的實例應用來描述本發明的多個方面。應理解的是，列出許多具體細節、關聯和方法以提供對本發明的完全理解。然而，相關領域普通技術人員將容易認識到，可沒有一種或多種具體細節地實踐本發明或以其它方法實踐本發明。本發明不限於行為或事件的順序，因為一些行為可以不同順序進行和/或與其它行為或事件同時進行。 而且，並非所有列舉的行為或事件都是實施根據本發明的方法所需的。
本文公開的所有基因、基因名稱和基因產物預期對應來自本文公開的組合物和方法可適用的任何物種的同系物。因此，這些術語包括但不限於來自人和小鼠的基因和基因產物。應理解的是，當公開來自具體物種的基因或基因產物時，這一公開僅旨在示例，不應解釋為限制，除非在其存在的上下文清楚地指明。因此，例如，對於本文公開的基因，其在一些實施方案中涉及哺乳動物核酸和胺基酸序列，預期涵蓋來自其它動物的同源和/或直系同源基因和基因產物，所述其它動物包括但不限於其它哺乳動物、魚、兩棲類、爬行動物和鳥類。在實施方案中，基因或核酸序列是人的。
定義
本文所用的術語僅是為了描述具體實施方案的目的，並不旨在限制本發明。除非上下文另外清楚地指明，否則本文所用的單數形式〃一個/ 一種(a)〃、〃一個/ 一種(an)〃 和〃該(the)"預期包括複數形式。而且，就詳述和/或權利要求書中使用術語〃包括 (including) 〃、〃 包括(includes) 〃、〃 具有(having) 〃、〃 具有(has)"、〃帶有(with) 〃或其變化形式來說，這些術語預期以類似於術語〃包含(comprising) 〃的方式被包括。
術語〃約〃或〃大約〃是指在由本領域普通技術人員確定的特定數值的可接受誤差範圍內，其將部分地取決於如何測量或確定該數值，即，測量系統的限度。例如，按照本領域中的實踐，〃約〃可表示在I個或多於I個標準差內。可選地，〃約〃可表示給定數值的達20%、優選地達10%、更優選地達5%、仍更優選地達1%的範圍。可選地，尤其是有關生物系統或方法，術語可表示在數值的數量級內，優選地在5倍內，更優選地在2倍內。當在本申請和權利要求書中描述特定數值時，除非另外指明，否則應假設術語"約"表示在特定數值可接受的誤差範圍內。
本文所用的術語〃mRNA〃是指靶基因的目前已知的mRNA轉錄物和可能說明的任何進一步的轉錄物。
〃反義寡核苷酸〃或〃反義化合物〃是指結合另一 RNA或DNA (靶RNA、DNA)的RNA 或DNA分子。例如，如果其是RNA寡核苷酸，其藉助於RNA-RNA相互作用結合另一 RNA靶並且改變靶RNA的活性。反義寡核苷酸可上調或下調特定多核苷酸的表達和/或功能。該定義意為包括從治療、診斷或其它觀點來說有用的任何外來RNA或DNA分子。這種分子包括， 例如，反義RNA或DNA分子、幹擾RNA(RNAi)、微RNA、誘餌RNA分子、siRNA、酶促RNA、治療性編輯RNA和激動劑與拮抗劑RNA、反義寡聚化合物、反義寡核苷酸、外部指導序列(EGS)寡核苷酸、可選剪接體、引物、探針以及與靶核酸的至少一部分雜交的其它寡聚化合物。因此， 這些化合物可以單鏈、雙鏈、部分單鏈或環狀寡聚化合物的形式引入。
在本發明的範疇中，術語"寡核苷酸"是指核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA) 或其模擬物的寡聚物或聚合物。術語"寡核苷酸"還包括天然和/或修飾的單體或鍵合的線性或環狀寡聚物，包括脫氧核糖核苷、核糖核苷、其取代形式和其α -異頭形式、肽核酸 (PNA)、鎖核酸(LNA)、硫代磷酸酯、膦酸甲酯和類似物。寡核苷酸能夠經由規則方式的單體與單體間的相互作用，例如Watson-Crick型鹼基配對、Hoog steen或逆HoOgsteen型鹼基配對或類似物特異性結合靶多核苷酸。
寡核苷酸可以是〃嵌合的"，即，包括不同區域。在本發明的範疇中，"嵌合〃化合物是寡核苷酸，其包含兩個或更多個化學區域，例如，DNA區域、RNA區域、PNA區域等等。每個化學區域由至少一個單體單位構成，在寡核苷酸化合物的情形中所述單體單位即為核苷酸。這些寡核苷酸通常包括至少一個區域，其中寡核苷酸經修飾以表現一種或多種期望特性。寡核苷酸的期望特性包括但不限於，例如，對核酸酶降解增加的耐受性、增加的細胞攝取和/或對靶核酸增加的結合親和力。因此，寡核苷酸的不同區域可具有不同特性。如上所述，本發明的嵌合寡核苷酸可形成為兩種或更多種寡核苷酸的混合結構、修飾的寡核苷酸、 寡核苷和/或寡核苷酸類似物。
寡核苷酸可由可被〃成行〃地連接(即當單體被連續地連接時，如在天然DNA中) 的區域或經由間隔物連接的區域構成。預期間隔物構成區域之間的共價"橋"，在優選情形中具有不超過約100個碳原子的長度。間隔物可攜帶不同功能性，例如，具有正電荷或負電荷，攜帶特殊的核酸結合特性(嵌入劑、槽溝結合物、毒素、螢光團等等)，為親脂性的，誘導特殊的二級結構，如例如，誘導α -螺旋的含丙氨酸的肽。
本文所用的"DLG"和〃盤狀大同系物〃和DLG多核苷酸包括所有家族成員、同種型、突變體、等位基因、片段、種類(species)、編碼和非編碼序列、有義和反義多核苷酸鏈等坐寸ο
本文所用的詞語『盤狀大同系物I』、dJ1061C18.1.1、DKFZp761P0818、 DKFZp781B0426、DLGH1、hdlg、hDlg、SAP97、SAP-97、突觸相關蛋白97被認為在文獻中是相同的，且在本申請中可交換地使用。
本文所用的術語〃對…有特異性的寡核苷酸〃或〃靶向…的寡核苷酸〃是指具有 (i)能夠與靶基因的一部分形成穩定複合體，或(ii)能夠與靶基因的mRNA轉錄物的一部分形成穩定雙鏈體的序列的寡核苷酸。複合體和雙鏈體的穩定性可通過理論計算和/或體外測定來確定。用於確定雜交複合體和雙鏈體的穩定性的示例性測定在以下實施例中描述。
本文所用的術語〃靶核酸〃涵蓋DNA、從這種DNA轉錄的RNA (包括前體mRNA和 mRNA)、還有從這種RNA衍生的cDNA、編碼序列、非編碼序列、有義或反義多核苷酸。寡聚化合物與其靶核酸的特異性雜交幹擾核酸的正常功能。特異性地與靶核酸雜交的化合物對靶核酸功能的這一調節通常稱為〃反義〃。待幹擾的DNA功能包括，例如複製和轉錄。待幹擾的RNA功能包括所有重要功能，例如，RNA向蛋白翻譯位置的移位，從RNA翻譯為蛋白，剪接RNA以產生一種或多種mRNA種類以及可能由RNA參與或促進的催化活性。這種幹擾靶核酸功能的總效果是調節編碼的產物或寡核苷酸的表達。
RNA幹擾"RNAi "由對其〃靶〃核酸序列具有序列特異性的同源性的雙鏈 RNA(dsRNA)分子介導。在本發明的某些實施方案中，介導物是5-25個核苷酸的〃小幹擾 "RNA雙鏈體(siRNA)。siRNA來源於稱為Dicer的RNA酶對dsRNA的加工。siRNA雙鏈體產物被募集到稱為RISC (RNA誘導沉默複合體)的多蛋白siRNA複合體中。不希望受任何特定理論束縛，認為隨後RISC被引導至靶核酸(適當地為mRNA)，在那裡siRNA雙鏈體以序列特異性方式相互作用來以催化方式介導裂解。根據本發明可使用的小幹擾RNA可根據本領域公知並且本領域普通技術人員熟悉的方案合成和使用。用於本發明方法的小幹擾RNA 適當地包括約I至約50個核苷酸(nt)。在非限制性實施方案的實例中，siRNA可包括約5 至約40nt、約5至約30nt、約10至約30nt、約15至約25nt或約20-25個核苷酸。
通過利用自動比對核酸序列並指明同一性或同源性的區域的電腦程式來便於選擇適當的寡核苷酸。這種程序用來比較獲得的核酸序列，例如通過搜尋資料庫例如 GenBank或通過對PCR產物測序。比較來自一系列物種的核酸序列允許選擇在物種之間展示適當的同一性程度的核酸序列。在未被測序的基因的情形中，進行DNA印跡以允許確定靶物種與其它物種的基因之間的同一性程度。如本領域所熟知的，通過以不同的嚴格性程度進行DNA印跡，可能獲得近似的同一性測量。這些方案允許選擇展現與待控制的受治療者中的靶核酸序列的高程度互補性和與其它物種中的相應核酸序列的較低程度互補性的寡核苷酸。本領域技術人員將認識到，在選擇用於本發明的基因的適當區域方面存在相當大的自由。
〃 酶促 RNA"是指具有酶促活性的 RNA 分子(Cech, (1988) J. American. Med. Assoc. 260，3030-3035)。酶促核酸(核酶)通過首先結合靶RNA來作用。這種結合經由被保持在鄰近用於裂解靶RNA的分子的酶促部分處的酶促核酸的靶結合部分來進行。因此， 酶促核酸首先識別靶RNA然後經由鹼基配對結合靶RNA，結合到正確位置時，酶促地作用以切割靶RNA。
〃誘餌RNA"是指模擬配體的天然結合結構域的RNA分子。因此，誘餌RNA與天然結合靶競爭結合特定配體。例如，已經顯示HIV反式激活響應(TAR)RNA的過表達可作為〃 誘餌〃起作用並有效地結合HIV tat蛋白，從而阻止其結合HIV RNA中編碼的TAR序列。這表示一個特定的實例。本領域技術人員將認識到，這僅是一個實例，利用本領域通常已知的技術可容易地產生其它實施方案。
本文所用的術語〃單體〃通常是指由磷酸二酯鍵或其類似物連接以形成大小從數個單體單位例如約3-4個至約數百個單體單位範圍的寡核苷酸的單體。磷酸二酯鍵合的類似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、硒代磷酸酯、氨基磷酸酯和類似物，如以下更充分地描述。
術語「核苷酸」涵蓋天然存在的核苷酸以及非天然存在的核苷酸。本領域技術人員應清楚的是，此前被認為是"非天然存在的"各種核苷酸後來已在自然界中發現。因此， "核苷酸"不僅包括已知的含嘌呤和嘧啶雜環的分子，還包括其雜環類似物和互變異構體。 其它類型的核苷酸的示例性實例是含腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶、嘌呤、黃嘌呤、二氨基嘌呤、8_氧代-N6-甲基腺嘌呤、7-脫氮雜黃嘌呤、7-脫氮雜鳥嘌呤、N4，N4-橋亞乙基胞嘧啶、N6, N6-橋亞乙基-2，6- 二氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-(C3-C6)-炔基胞嘧唆、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、假異胞嘧啶、2-羥基-5-甲基-4-三唑並吡啶、異胞嘧啶 、異鳥嘌呤、肌苷的分子以及Benner等，美國專利No. 5，432，272中描述的〃非天然存在的〃核苷酸。術語"核苷酸"預期涵蓋這些實例的每一種和所有以及其類似物和互變異構體。尤其關注的核苷酸是包含腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶的那些，它們被認為是與在人的治療和診斷應用有關的天然存在的核苷酸。核苷酸包括天然2』 -脫氧糖和2』 -羥基糖，例如在Kornberg和 Baker, DNA Replication,第 2 版· (Freeman, San Francisco, 1992) 中描述的，以及它們的類似物。
提及核苷酸的"類似物"包括具有修飾的鹼基部分和/或修飾的糖部分的合成的核苷酸(參見例如，通常描述於Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York, 1980 ； Freier&Altmann, (1997) Nucl. Acid. Res.，25 (22)，4429-4443, Toulme, J. J. , (2001) Nature Biotechnologyl9:17-18 ；Manoharan M. , (1999)Biochemica et Biophysica Actal489:117-139 ；Freier S.M. , (1997)Nucleic Acid Research,25:4429-4443， Uhlman,E., (2000)Drug Discovery&Development, 3:203-213, Herdewin P. , (2000) Antisense&Nucleic Acid Drug Dev. , 10:297-310) ;2』-0，3'-C-連接的[3.2.0] 二環阿拉伯糖核苷。這種類似物包括經設計以增強結合特性，例如，雙鏈體或三鏈體穩定性、特異性或類似特性的合成的核苷酸。
本文所用的〃雜交〃是指寡聚化合物的大致互補鏈的配對。配對的一種機制包括寡聚化合物的鏈的互補核苷或核苷酸鹼基(核苷酸)之間的氫鍵合，其可以是 Watson-Crick、Ho0gsteen或逆H00gsteen氫鍵合。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是經由氫鍵形成而配對的互補核苷酸。雜交可在不同情況下發生。
當反義化合物與靶核酸的結合幹擾靶核酸的正常功能以導致功能和/或活性的調節時，該化合物是"可特異性雜交的"，且在期望特異性結合的條件下(即，在體內測定或治療性治療的情形中的生理條件下和在體外測定的情形中進行測定的條件下)存在足夠程度的互補性以避免反義化合物與非靶核酸序列的非特異性結合。
本文所用的短語"嚴格雜交條件"或"嚴格條件"是指本發明化合物將與其靶序列雜交，但與最小數目的其它序列雜交的條件。嚴格條件是序列依賴性的且在不同情況中將是不同的，並且在本發明範疇中，寡聚化合物與靶序列雜交的"嚴格條件"由寡聚化合物的性質和組成以及研究它們的測定決定。通常，嚴格雜交條件包括低濃度(〈O. 15M)的帶有無機陽離子例如Na+或K+的鹽(即，低離子強度)、高於20°C _25°C低於寡聚化合物靶序列複合體的Tm的溫度、和存在變性劑例如甲醯胺、二甲基甲醯胺、二甲亞碸或去垢劑十二烷基硫酸鈉(SDS)。例如，對於每種1%甲醯胺，雜交率降低1. 1%。高嚴格雜交條件的實例是在60。。下O.1 X氯化鈉-檸檬酸鈉緩衝液(SSC) /0. l%(w/v) SDS進行30分鐘。
本文所用的〃互補〃是指一條或兩條寡聚鏈上的兩個核苷酸之間準確配對的能力。例如，如果在反義化合物某一位置的核鹼基能夠與在靶核酸某一位置的核鹼基氫鍵結合，所述靶核酸為DNA、RNA或寡核苷酸分子，則認為寡核苷酸與靶核酸之間的氫鍵結合位置是互補位置。當每個分子的足夠數目的互補位置由可彼此成氫鍵的核苷酸佔據時，寡聚化合物和另外的DNA、RNA或寡核苷酸分子是彼此互補的。因此，〃可特異性雜交〃和〃互補"是用來表示經足夠數目的核苷酸足夠程度的準確配對或互補性，從而在寡聚化合物和靶核酸之間發生穩定和特異性結合的術語。
本領域應理解的是，寡聚化合物的序列不必與待可特異性雜交的其靶核酸的序列 100%互補。而且，寡核苷酸可經一個或多個區段雜交，從而其間的或相鄰區段不牽涉在雜交事件中(例如，環結構、錯配或髮夾結構)。本發明的寡聚化合物包括與其所靶向的靶核酸序列中靶區域具有至少約70%、或至少約75%、或至少約80%、或至少約85%、或至少約90%、 或至少約95%、或至少約99%序列互補性。例如,其中反義化合物的20個核苷酸中的18個與靶區域互補從而將特異性雜交的反義化合物將表示90%互補性。在這一實例中，其餘非互補核苷酸可成串或散布於互補核苷酸，不必彼此連續或與互補核苷酸連續。因此，具有側翼為與靶核酸具有完全互補性的兩個區域的4 (四)個非互補核苷酸的長度為18個核苷酸的反義化合物將與靶核酸具有77. 8%總互補性，因此屬於本發明的範圍中。反義化合物與靶核酸的區域的互補性百分比可常規地利用本領域已知的BLAST程序(基本局部比對搜索工具)和PowerBLAST程序來確定。同 源性、序列同一性或互補性的百分比可通過例如使用 Smith 和 Waterman 的算法(Adv. Appl. Math. , (1981)2，482-489)的 Gap 程序(Wisconsin 序列分析軟體包，用於 Unix 的版本 8，Genetics Computer Group, University Research Park, Madison ffis.)確定，並使用默認設置。
本文所用的術語"熱熔點(Tm)"是指在指定的離子強度、pH和核酸濃度下，與靶序列互補的寡核苷酸的50%平衡地與靶序列雜交的溫度。通常，嚴格條件將是其中鹽濃度為至少約O. 01至1. OM Na離子濃度(或其它鹽)、ρΗ7· O至8. 3，且對於短寡核苷酸(例如， 10至50個核苷酸)溫度為至少約30°C的條件。嚴格條件還可通過加入去穩定劑例如甲醯胺來實現。
本文所用的〃調節〃是指基因表達的增加(刺激)或減少(抑制)。
術語〃變體〃當在多核苷酸序列的上下文中使用時，可涵蓋與野生型基因相關的多核苷酸序列。這一定義還可包括，例如，〃等位〃、〃剪接〃、〃物種〃或〃多態〃變體。剪接變體可與參考分子具有顯著的同一性，但由於在mRNA加工期間外顯子的可選剪接通常將具有更大數目或更小數目的多核苷酸。相應的多肽可具有另外的功能結構域或缺少結構域。物種變體是在物種之間不同的多核苷酸序列。本發明中特別有用的是野生型基因產物的變體。變體可來源於核酸序列中至少一種突變，並可產生改變的mRNA或產生結構或功能可能改變或可能不改變的多肽。任何給定的天然或重組基因可具有O種、一種或多種等位基因形式。產生變體的常見突變改變通常歸因於核苷酸的天然缺失、添加或取代。在給定序列中，這些類型改變的每一種可單獨發生，或組合其它類型改變發生一次或多次。
所得的多肽通常將具有相對於彼此顯著的胺基酸同一性。多態變體是給定物種的個體之間特定基因的多核苷酸序列的變化。多態變體還可涵蓋"單核苷酸多態性"(SNP) 或其中多核苷酸序列差異為一個鹼基的單鹼基突變。SNP的存在可指示，例如，具有疾病狀態的傾向的某一群體，所述傾向相比於耐受性為易感性。
衍生的多核苷酸包括經受化學修飾(例如以烷基、醯基或氨基代替氫)的核酸。衍生物例如，衍生物寡核苷酸，可包括非天然存在的部分，例如改變的糖部分或糖間鍵合。其中示例的有硫代磷酸酯和本領域已知的其它含硫物質。衍生的核酸還可包含標記，包括放射性核苷酸、酶、螢光劑、化學發光劑、顯色劑、底物、輔因子、抑制劑、磁性粒子和類似物。
〃衍生物〃多肽或肽是例如通過糖基化、聚乙二醇化、磷酸化、硫酸化、還原/烷基化、醯化、化學偶合或適度福馬林處理修飾的多肽或肽。還可修飾衍生物以直接或間接包含可檢測的標記，包括但不限於，放射性同位素、螢光和酶標記。
本文所用的術語〃動物〃或〃患者〃意為包括，例如人、綿羊、麋鹿、鹿、長耳鹿、 貂、哺乳動物、猴、馬、牛、豬、山羊、犬、貓、大 鼠、小鼠、鳥類肩、爬行動物、魚、昆蟲和蛛形綱動物。
〃哺乳動物〃涵蓋通常處於醫療護理下的溫血哺乳動物(例如，人和馴養的動物)。實例包括貓科動物、犬科動物、馬科動物、牛科動物和人，以及僅僅人。
〃治療(Treating) 〃或〃治療(treatment) 〃涵蓋治療哺乳動物的疾病狀態,並包括(a)防止疾病狀態在哺乳動物中發生，尤其是當所述哺乳動物傾向於疾病狀態但還未被診斷為患有其的時候；(b)抑制疾病狀態，例如阻止其發展；和/或(C)緩解疾病狀態，例如導致疾病狀態消退，直到達到期望端點。治療還包括疾病症狀的改善(例如，減輕疼痛或不適)，其中所述改善可或不可直接影響疾病(例如起因、傳染、表達等等)。
本文所用的"癌症"是指在哺乳動物中發現的所有類型的癌症或贅生物或惡性腫瘤，包括但不限於白血病、淋巴瘤、黑素瘤、癌和肉瘤。癌症本身表現為〃腫瘤〃或包括癌症惡性細胞的組織。腫瘤的實例包括肉瘤和癌，例如但不限於纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內皮肉瘤、 滑膜瘤、間皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝細胞瘤、膽管癌、絨毛膜癌、精原細胞瘤、胚胎性癌、腎母細胞瘤、宮頸癌、睪丸腫瘤、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮源性癌、神經膠質瘤、星形細胞瘤、髓母細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、血管母細胞瘤、聽神經瘤、少突神經膠質瘤、腦膜瘤、黑素瘤、神經母細胞瘤和視網膜母細胞瘤。可用根據本發明公開的組合物治療的其它癌症包括但不限於，例如霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多發性骨髓瘤、神經母細胞瘤、乳腺癌、 卵巢癌、肺癌、橫紋肌肉瘤、原發性血小板增多症、原發性巨球蛋白血症、小細胞肺腫瘤、原發性腦瘤、胃癌、結腸癌、惡性胰島腫瘤、惡性類癌瘤、膀胱癌、胃癌、惡變前皮膚損傷、睪丸癌、淋巴瘤、甲狀腺癌、神經母細胞瘤、食管癌、泌尿生殖道癌、惡性高鈣血症、宮頸癌、子宮內膜癌、腎上腺皮質癌和前列腺癌。
本文所用的"神經病學疾病或病症"是指神經系統和/或視覺系統的任何疾病或病症。〃神經病學疾病或病症〃包括牽涉中樞神經系統(腦、腦幹和小腦)、外周神經系統(包括顱神經)和自主神經系統(其部分位於中樞神經系統和外周神經系統兩者中)的疾病或病症。神經病學病症包括但不限於，獲得性癲癇樣失語症；急性播散性腦脊髓炎；腦白質腎上腺萎縮症；年齡相關的黃斑變性；胼胝體發育不全；失認症；艾卡迪症候群；亞力山大病；阿爾佩斯病；交替性偏癱；阿爾茨海默氏病；血管性痴呆；肌萎縮性側索硬化；無腦；Angelman症候群；血管瘤病；缺氧症；失語症；失用症；蛛網膜囊腫；蛛網膜炎；阿-基氏腦畸形；動靜脈畸形；阿斯佩各症候群；共濟失調毛細血管擴張；注意力缺乏過動症；孤獨症；自主神經失調；背痛；巴藤病；白塞病；貝耳麻痺；良性自發性瞼痙攣；良性局灶性肌萎縮；良性盧頁內高壓；賓斯旺格氏病；瞼疫攣；Bloch Sulzberger症候群；臂叢損傷；腦膿腫；腦損傷；腦腫瘤(包括多形性膠質母細胞瘤)；脊髓腫瘤；布朗-塞卡爾症候群；卡納萬病；腕管綜合症；灼痛；中樞性疼痛綜合症；腦橋中部髓鞘溶解；頭部障礙；腦動脈瘤；腦動脈硬化；腦萎縮；大腦性巨人症；大腦性麻痺；夏-馬-圖三氏病；化療引起的神經病和神經性疼痛；基氏腦畸形；舞蹈症；慢性炎症性脫髓鞘多神經病；慢性痛；慢性局部疼痛症候群；科_勒二氏症候群；昏迷，包括持續性植物人狀態；先天性面癱；皮質基底節變性；顱動脈炎；顱縫早閉；克雅氏病；積累性損傷錯亂；柯興症候群；巨細胞包涵體病；巨細胞病毒感染；眼舞蹈-足舞蹈症候群；丹_沃二氏症候群；DaWSon病；德摩西埃氏症候群；下臂叢麻痺；痴呆；皮肌炎；糖尿病性神經病；瀰漫性硬化症；家族性自主神經異常；書寫困難； 閱讀困難；張力障礙；早期幼兒癲癇性腦病；空蝶鞍症候群；腦炎；腦膨出；腦三叉神經血管瘤病；癲癇；歐勃氏麻痺；特發性震顫；法布裡氏病；法爾氏症候群；昏厥；家族性痙攣麻痺症；熱性癲癇發作；菲希爾症候群；弗裡德賴希氏共濟失調；額顳痴呆和其它"tau病變 〃；高歇病；格斯特曼氏症候群；巨細胞性動脈炎；巨細胞性包涵體病；球樣細胞腦白質營養不良；格-巴二氏症候群；HTLV-1相關的骨髓病；哈-斯二氏病；頭部損傷；頭痛；半面痙攣；遺傳性痙攣性截癱；多神經炎型遺傳性共濟失調；耳部帶狀皰疹；帶狀皰疹；Hirayama 症候群；HIV相關的痴呆和神經病(也是AIDS的神經病學表現)；前腦無裂畸形；亨延頓氏舞蹈病和其它多穀氨醯胺重複序列病；積水性無腦畸形；腦積水；皮質醇過多症；低氧； 免疫介導的腦脊髓炎；包涵體肌炎；色素失調症；嬰兒植烷酸貯積病；嬰兒雷夫敘姆病；嬰兒疫攣；炎性肌病；盧頁內囊腫；盧 頁內高壓Joubert症候群；卡恩斯-塞爾症候群；Kennedy 病；金斯布林納症候群；克-費二氏症候群；克拉貝病；庫-韋二氏病；庫魯病；拉福拉病；Lambert-Eaton肌無力症候群；Landau_Kleffner症候群；側髓(瓦倫伯格氏)症候群；學習障礙；利氏病；Lennox-Gustaut症候群；萊_萘二氏症候群；腦白質病變；路易體痴呆；無腦回症；閉鎖症候群；Lou Gehrig病(即，運動神經元病或肌萎縮性側索硬化)；椎間盤退變； 萊姆病-神經病學後遺症；Machado-Jos印h病；巨頭；巨腦；梅_羅二氏症候群；美尼爾症； 腦膜炎；門克斯病；異染性腦白質營養不良；頭小畸形；偏頭痛；Miller Fisher症候群；小中風；線粒體肌病；默比厄斯氏症候群；單肢肌萎縮；運動神經元病；Moyamoya病；粘多糖貯積症；多發梗塞性痴呆；多灶性運動神經病；多發性硬化和其它脫髓鞘病症；伴有體位性低血壓的多系統萎縮症；肌肉萎縮症；重症肌無力；腦脫髓鞘彌散性硬化；嬰兒肌陣攣性腦病；肌陣攣；肌病；先天性肌強直；嗜睡病；神經纖維瘤病；抗精神病藥的惡性症候群；AIDS 的神經病學表現；狼瘡的神經病學後遺症；神經性肌強直；神經元蠟樣脂褐質沉積症；神經元移行異常 』尼-皮二氏病；0』 Sullivan-McLeod症候群；枕神經痛；隱性脊柱神經管閉合不全序列徵；大田原症候群；橄欖體腦橋小腦萎縮；眼陣攣-肌陣攣；視神經炎；直立性低血壓；過度使用症候群；感覺異常；神經變性疾病或病症(帕金森病、亨延頓氏舞蹈病、阿爾茨海默氏病、肌萎縮性側索硬化(ALS)、痴呆、多發性硬化和與神經元細胞死亡相關的其它疾病和病症)；先天性肌強直病；副腫瘤性疾病；突發性癲癇；帕_羅二氏症候群；佩-梅氏病；周期性麻痺；外周神經病；痛性神經病和神經性疼痛；持續性植物人狀態；全身性發育遲緩；光噴嚏反射；植烷酸貯積病；皮克氏病；神經挾捏；垂體腫瘤；多肌炎；孔洞腦；小兒麻痺症後期綜合症；帶狀皰疹後神經痛；感染後腦脊髓炎；體位性低血壓；帕-魏二氏症候群；原發性脊髓側索硬化；朊病毒病；進行性面偏側萎縮症；進行性多灶性白質腦病；進行性硬化性灰質萎縮；進行性核上性麻痺；假性腦瘤；Ramsay-Hunt症候群(I型和II型)； Rasmussen腦炎；反射性交感神經營養不良症候群；雷夫敘姆病；重複性運動損傷；重複性壓力損傷；多動腿症候群；逆轉錄病毒相關的脊髓病；Rett症候群；雷依氏症候群；聖維特斯舞蹈病；桑德霍夫病；謝耳德氏病；腦裂；視隔發育不全；搖晃嬰兒綜合症；帶狀皰疹； 希-德二氏症候群；斯耶格倫氏症候群；睡眠窒息；Soto症候群；僵直；脊柱裂；脊髓損傷； 脊髓腫瘤；脊髓性肌萎縮；僵人症候群；中風；斯特奇-韋伯症候群；亞急性硬化全腦炎 』動脈硬化性皮層下腦病；西德納姆舞蹈；暈厥；脊髓空洞症；遲發性運動障礙；泰-薩二氏病； 顳動脈炎；脊髓拴系症候群；肌強直性白內障；胸部出口症候群 ；三叉神經痛；託德氏麻痺； 圖雷特綜合症；暫時性缺血性發作；傳染性海綿狀腦病；橫貫性脊髓炎；外傷性腦損傷；震顫；三叉神經痛；熱帶痙攣性輕截癱；結節性腦硬化；血管性痴呆(多發梗塞性痴呆)；血管炎(包括顳動脈炎)；希-林二氏病；瓦倫伯格氏症候群；韋-霍二氏病；韋斯特症候群；鞭抽式損傷(whiplash);威廉斯症候群；Wildon病和澤韋格症候群。
〃心血管疾病或病症〃包括但不限於與不正常血流和/或心臟不正常運轉相關的疾病和疾患。這些疾病或疾患包括但不限於充血性心力衰竭、心肌梗死和任何其它心臟相關疾病。
"炎性疾病或疾患"包括但不限於導致炎症作為此類疾病或疾患的症狀的疾病或疾患。
〃肺部疾病或病症〃包括但不限於與不正常肺功能相關的疾病和疾患。
「增殖性疾病或病症」包括但不限於造血贅生性病症，其牽涉由髓細胞系、淋巴細胞系/紅細胞系或其前驅細胞產生的造血源的增生性細胞/贅生性細胞。這些包括但不限於成紅細胞性白血病、急性早幼粒細胞白血病(APML)、慢性骨髓性白血病(CML)、淋巴細胞惡性腫瘤(包括但不限於急性成淋巴細胞性白血病(ALL)，其包括B系ALL和T系ALL ;慢性淋巴細胞性白血病(CLL);幼淋巴細胞性白血病(PLL)、毛細胞性白血病(HLL)和瓦氏巨球蛋白血症(WM)。惡性淋巴瘤的其它形式包括但不限於非霍奇金淋巴瘤及其變體、周圍T 細胞淋巴瘤、成人T細胞白血病/淋巴瘤(ATL)、皮膚T-細胞淋巴瘤(CTCL)、大顆粒性淋巴細胞性白血病(LGF)、霍奇金病和李特-斯頓伯格病。
本發明包括用本發明的寡核苷酸治療以上指定的任何一種疾病或疾患的方法。本發明涉及靶向DLG mRNA同種型的天然反義轉錄物的寡核苷酸在製備治療與異常DLG表達相關的疾病或疾患的藥物中的用途。
多核苷酸和寡核苷酸組合物和分子
靶在一個實施方案中，靶包括盤狀大同系物(DLG)及其同種型的核酸序列，包括但不限於DLG相關的有義和/或反義的非編碼和/或編碼序列。優選表達靶是DLGl。在優選實施方案中，本發明涉及DLG家族mRNA的天然反義轉錄物和祀向所述天然反義轉錄物且與所述天然反義轉錄物至少部分互補的具有約5至約30個核苷酸的寡核苷酸。
果蠅屬(Drosophila)盤狀大的人同系物(Dlgl)是在中樞神經系統的突觸後密度中發現的MAGUK。Dlgl已牽涉於在上皮細胞極性中、以及在控制果蠅屬成蟲盤的增殖中果蠅屬緊密接點的形成。其由氨基末端富含脯氨酸的結構域、多個PDZ結構域、SH3結構域、 HOOK結構域、 3結構域和鳥苷酸激酶(GK)樣結構域。
膜相關鳥苷酸激酶(MAGUK)蛋白對於離子通道和受體在神經元突觸和緊密接點處的構造是重要的。MAGUK在心肌細胞中表達，並且特別是，突觸相關蛋白97 (SAP97)以閏盤在心房和心室的心肌中的水平被發現，其中它與Kvl. 5通道共定位。而且，心臟SAP97和 Kvl. 5亞基已被共沉澱，表明兩個蛋白之間的直接交互。SAP97與Kvl. 5之間的強交互已被證明，使用蛋白微陣列和定量螢光極化以表徵PDZ結構域的結合選擇性。然而，通過通道的 NH2-末端部分或涉及第二信使的間接交互也是可能的。不論兩個蛋白之間的交互的性質如何，所有研究承認SAP97與Kvl. 5亞基的共表達導致異源體系中的外向鉀流增加。膜相關鳥苷酸激酶(MAGUK)蛋白對於數種離子通道的構造是重要的伴侶。MAGUK蛋白SAP97在心肌中大量表達並且與電壓依賴性混合器通道(Shaker channel) Kvl. 5和通道。如同在其他組織中，SAP97可調節心臟離子通道在肌膜中的靶向。的確，在新生大鼠肌細胞中，SAP97 過表達引起Kvl. 5通道在血漿膜中的聚類和固定並且增加相應的電流。
在實施方案中，反義寡核苷酸用來預防或治療DLGl家族成員相關的疾病或病症。 可用本發明的寡核苷酸和/或用從利用反義化合物獲得的幹細胞再生的細胞/組織治療的示例性盤狀大同系物I (DLGl)介導的疾病和病症包括 與DLGl的異常功能和/或表達相關的疾病或病症、癌症、與細胞增殖相關或特徵在於細胞增殖的疾病或疾患、由致瘤人病毒引起的疾病或病症、與細胞命運特化相關的疾病或病症、與細胞抑制受損、眼部癌發生、 導管癌、宮頸瘤形成、惡性纖維組織細胞瘤相關的疾病或病症、與DLGl的突變或異常表達或功能相關的疾病 或病症、與細胞周期缺陷相關的疾病或病症、與PDZ功能失常接合相關的疾病或病症、與T細胞活化受損相關的疾病或病症、免疫系統的疾病或病症、人免疫缺陷病毒-1感染性、神經髓鞘形成的軸突刺激受損、神經髓鞘形成受損、施萬細胞髓鞘形成的膜內穩態受損、神經病學疾病或病症、精神分裂症、帕金森病、智力遲鈍、孤獨症、進行性腓骨肌萎縮、與心臟Kv4和Kvl. 5通道調節受損相關的疾病或病症或疾患、與GluRl在CF/ Purkinje細胞突觸的轉運和插入受損相關的疾病或病症或疾患、與突觸發生受損相關的疾病或病症或疾患、與突觸功能相關的疾病或病症或疾患、與突觸強度減少相關的疾病或病症或疾患、視網膜損傷、與角質形成細胞分化和/或傷口癒合相關的疾病或病症、與跨膜受體從ER至質膜的運輸受損相關的疾病或病症或疾患、泌尿生殖發育受損、腎盂積水、泌尿道異常、與平滑肌取向受損相關的疾病或病症或疾患、與骨骼肌和神經肌肉接頭的運動神經元組件受損相關的疾病或病症或疾患、腎臟疾病或病症和顎裂。如在下面引用的摘要所述，配子發育需要協調的體細胞-種系交互，其確保種系和成體幹細胞的更新和分化。其中作者陳述，種系和體細胞群體之間的物理接觸是重要的，因為其允許在它們中可擴散信號的交換。他們進一步陳述，所述腫瘤抑制劑基因盤狀大(DLG)編碼分隔連接蛋白，在上皮細胞極性、非對稱成神經細胞分配和神經肌肉接頭形成中起作用。最近出版物表明，DLG在果蠅屬睪丸中的新作用，如DLG的突變導致睪丸缺陷和細胞死亡。在成體譜系的精子發生以及其沿著睪丸頂部的體細胞的質膜從均勻分布至生長囊腫的遠端定位體細胞上的有限定位的定位變化中需要DLG。DLG在睪丸中的廣泛缺乏強調體細胞在建立和維持雄性幹細胞生態位和體細胞分化中的重要性。這也可明確地施加於哺乳動物細胞並且因此DLG的上調在與雄性幹細胞生態位和體細胞分化的不正常運轉相關的疾病或疾患中有益。參見 http://www. ncb1. nlm. nih. gov/pubmcd/20798604。
在本發明的實施方案中，向需要組織治療例如皮膚治療等或處於發展他們將需要組織修復或復壯例如皮膚治療的疾患的危險的受試者，提供治療和/或美容方案和相關的定製治療。可例如基於受試者的DLGl狀態，進行診斷。患者在給定組織/器官例如皮膚、 肌肉、腦、脊髓、甲狀腺、胰臟、肺、心或肌肉/神經元接頭中的DLGl表達水平可通過本領域技術人員已知的及本文他處所描述的方法，例如通過使用PCR或基於抗體的檢測方法分析組織來測定。
在實施方案中，將一種或多種反義寡核苷酸對DLG調節向需要其的患者施用以預防或治療與正常對照相比的DLG異常表達、功能、活性相關的任何疾病或病症。
在實施方案中，寡核苷酸是對DLGl多核苷酸有特異性,該多核苷酸包括但不限於非編碼區。DLGl靶包括DLGl的變體；DLG1的突變體，包括SNP ；DLG1的非編碼序列；等位基因、片段和類似物。優選地寡核苷酸是反義RNA分子。
根據本發明的實施方案，靶核酸分子不限於僅DLGl多核苷酸，還延伸到DLGl的任何同種型、受體、同系物、非編碼區和類似物。
在實施方案中，寡核苷酸靶向DLGl靶的天然反義序列(與編碼區和非編碼區天然反義)，包括但不限於，其變體、等位基因、同系物、突變體、衍生物、片段及其互補序列。優選地寡核苷酸是反義RNA或DNA分子。
在實施方案中，本發明的寡聚化合物還包括變體，其中在化合物中一個或多個核苷酸位置存在不同鹼基。例如，如果第一個核苷酸是腺嘌呤，可產生在這一位置包含胸苷、 鳥苷、胞苷或其它天然或非天然核苷酸的變體。這可在反義化合物的任何位置進行。隨後利用本文所述的方法測定這些化合物以確定它們抑制靶核酸表達的能力。
在一些實施方案中，反義化合物與靶之間的同源性、序列同一性或互補性是從約 50%至約60%。在一些實施方案中，同源性、序列同一性或互補性是從約60%至約70%。在一些實施方案中，同源性、序列同一性或互補性是從約70%至約80%。在一些實施方案中，同源性、序列同一性或互補性是從約80%至約90%。在一些實施方案中，同源性、序列同一性或互補性是約90%、約92%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或約100%。
當反義化合物與靶核酸的結合幹擾靶核酸的正常功能以導致活性的喪失時，該化合物是可特異性雜交的，且在期望特異性結合的條件下存在足夠程度的互補性以避免反義化合物與非靶核酸序列的非特異性結合。這種條件包括，即，在體內測定或治療性治療的情形中的生理條件以及在體外測定的情形中進行測定的條件。
當反義化合物(無論是DNA、RNA、嵌合、取代的等等)與靶DNA或RNA分子的結合幹擾靶DNA或RNA的正常功能以導致效用的喪失時，該化合物是可特異性雜交的，且在期望特異性結合的條件下(即，在體內測定或治療性治療的情形中的生理條件下以及在體外測定的情形中進行測定的條件下)存在足夠程度的互補性以避免反義化合物與非靶序列的非特異性結合。
在實施方案中，DLGl的靶向包括但不限於，利用例如PCR、雜交等鑑定和擴展的反義序列、一種或多種如SEQ ID NO: 2所列的序列和調節DLGl表達或功能的類似物。在一個實施方案中，與對照相比表達或功能被上調。在實施方案中，與對照相比表達或功能被下調。
在實施方案中，寡核苷酸包括如SEQ ID NO:3至12所列的核酸序列，包括利用例如PCR、雜交等鑑定和擴展的反義序列。這些寡核苷酸可包括一種或多種修飾的核苷酸、更短或更長的片段、修飾的鍵和類似物。修飾的鍵或核苷酸間鍵合的實例包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或類似物。在實施方案中，核苷酸包括磷衍生物。可附加於本發明的修飾的寡核苷酸中的糖或糖類似物部分的磷衍生物(或修飾的磷酸酯基團)可以是單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、磷酸烷基酯、磷酸烷烴酯、硫代磷酸酯和類似物。上述磷酸酯類似物的製備和將其向核苷酸、修飾的核苷酸和寡核苷酸的併入本身是已知的，不必在此描述。
反義的特異性和靈敏性還由本領域技術人員利用以用於治療用途。反義寡核苷酸已在動物和人的疾病狀態的治療中用作治療部分。反義 寡核苷酸已經安全且有效地施用於人，目前正在進行許多臨床試驗。因此已經確定，寡核苷酸可以是有用的治療形態，可被配置以用於治療細胞、組織和動物(尤其是人)的治療方案。
在本發明的實施方案中，寡聚反義化合物，尤其是寡核苷酸，結合靶核酸分子並調節靶基因編碼的分子的表達和/或功能。待幹擾的DNA的功能包括，例如複製和轉錄。待幹擾的RNA功能包括所有重要功能，例如RNA向蛋白翻譯位置的移位，從RNA翻譯為蛋白， 剪接RNA以產生一種或多種mRNA種類以及可由RNA參與或促進的催化活性。取決於期望的功能，功能可被上調或抑制。
反義化合物包括反義寡聚化合物、反義寡核苷酸、外部指導序列(EGS)寡核苷酸、 可選剪接體、引物、探針以及與靶核酸的至少一部分雜交的其它寡聚化合物。因此，這些化合物可以單鏈、雙鏈、部分單鏈或環狀寡聚化合物的形式引入。
在本發明範疇中，將反義化合物靶向特定核酸分子可以是多步驟的過程。該過程通常開始於鑑定待調節其功能的靶核酸。這一靶核酸可以是，例如，其表達與特定病症或疾病狀態相關的細胞基因(或從基因轉錄的mRNA)或來自感染物的核酸分子。在本發明中， 靶核酸編碼盤狀大同系物I (DLGl)。
靶向過程通常還包括確定靶核酸中發生反義相互作用從而產生期望作用例如調節表達的至少一個靶區域、區段或位置。在本發明範疇中，術語〃區域〃定義為具有至少一種可鑑定結構、功能或特徵的靶核酸的一部分。靶核酸區域中是區段。"區段"定義為靶核酸中較小區域或區域的亞部分。本發明中使用的"位置"定義為靶核酸中的位置。
在實施方案中，反義寡核苷酸結合盤狀大同系物I(DLGl)的天然反義序列並調節 DLGl (SEQ ID NO:1)的表達和/或功能。反義序列的實例包括SEQ ID N0:2。
在實施方案中，反義寡核苷酸結合盤狀大同系物I(DLGl)多核苷酸的一個或多個區並調節DLGl的表達和/或功能。區段包括DLGl的有義或反義多核苷酸的至少五個連續核苷酸。
在實施方案中，反義寡核苷酸是對DLGl的天然反義序列有特異性，其中寡核苷酸對DLGl的天然反義序列的結合調節DLGl的表達和/或功能。
在實施方案中，寡核苷酸化合物包括如SEQ ID NO:3至12所列的序列、利用例如 PCR、雜交等鑑定和擴展的反義序列。這些寡核苷酸可包括一種或多種修飾的核苷酸、更短或更長的片段、修飾的鍵和類似物。修飾的鍵或核苷酸間鍵合的實例包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或類似物。在實施方案中，核苷酸包括磷衍生物。可附加於本發明的修飾的寡核苷酸中的糖或糖類似物部分的磷衍生物(或修飾的磷酸酯基團)可以是單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、磷酸烷基酯、磷酸烷烴酯、硫代磷酸酯和類似物。上述磷酸酯類似物 的製備和將其向核苷酸、修飾的核苷酸和寡核苷酸的併入本身是已知的，不必在此描述。
如本領域已知的，因為翻譯起始密碼子通常是5』 -AUG(在轉錄的mRNA分子中；在相應DNA分子中是5』 -ATG)，翻譯起始密碼子也稱為"AUG密碼子〃、〃起始密碼子〃或"AUG 起始密碼子"。少數基因具有具有RNA序列5』 -GUG、5』 -UUG或5』 -CUG的翻譯起始密碼子； 且5』 -AUA、5』 -ACG和5』 -CUG已顯示在體內起作用。因此，術語〃翻譯起始密碼子〃和〃起始密碼子"可涵蓋許多密碼子序列，儘管每種情形中的起始胺基酸通常是甲硫氨酸(真核細胞中)或甲醯甲硫氨酸(原核細胞中)。真核基因和原核基因可具有兩個或更多個替代性起始密碼子，其中的任何一個可在特定細胞類型或組織中或在特定條件設置下優先地用於翻譯起始。在本發明範疇中，"起始密碼子"和"翻譯起始密碼子"是指體內用於起始從編碼盤狀大同系物I (DLGl)的基因轉錄的mRNA的翻譯的一種或多種密碼子，而不論這種密碼子的序列。基因的翻譯終止密碼子(或"終止密碼子〃)可具有三種序列即5』 -UAA、 5』 -UAG 和 5』 -UGA 之一(相應的 DNA 序列分別是 5』 _TAA、5』 -TAG 和 5』 -TGA)。
術語〃起始密碼子區〃和〃翻譯起始密碼子區〃是指這種mRNA或基因的一部分， 涵蓋以任一方向(即，5』或3』)從翻譯起始密碼子的約25至約50個連續核苷酸。類似地， 術語〃終止密碼子區〃和〃翻譯終止密碼子區〃是指這種mRNA或基因的一部分，涵蓋以任一方向(即，5』或3』)從翻譯終止密碼子的約25至約50個連續核苷酸。因此，〃起始密碼子區〃(或"翻譯起始密碼子區〃)和"終止密碼子區〃(或"翻譯終止密碼子區〃)都是可用本發明的反義化合物有效地靶向的區域。
本領域已知開放讀碼框(ORF)或〃編碼區〃是指翻譯起始密碼子與翻譯終止密碼子之間的區域，也是可被有效地靶向的區域。在本發明範疇中，靶向的區域是涵蓋基因開放讀碼框(ORF)的翻譯起始或終止密碼子的基因內區域。
另一靶區域包括5』非翻譯區(5』 UTR)，本領域已知是指mRNA以5』方向從翻譯起始密碼子的部分，因此包括mRNA的5』帽位置與翻譯起始密碼子之間的核苷酸(或基因上相應的核苷酸)。又一靶區域包括3』非翻譯區(3』UTR)，本領域已知是指mRNA以3』方向從翻譯終止密碼子的部分，因此包括mRNA的翻譯終止密碼子與3』端之間的核苷酸(或基因上相應的核苷酸)。mRNA的5』帽位置包括經由5』 -5』三磷酸酯鍵合與mRNA的最5』殘基連接的N7-甲基化鳥苷殘基。認為mRNA的5』帽區域包括5』帽結構本身以及與帽位置相鄰的前50個核苷酸。本發明的另一靶區域是5』帽區域。
儘管一些真核mRNA轉錄物被直接翻譯，但是許多包含一個或多個稱為〃內含子" 的區域，在翻譯前從轉錄物切除。其餘(因此被翻譯的)區域稱為"外顯子"，被剪接在一起以形成連續的mRNA序列。在一個實施方案中，靶向剪接位置，即，內含子-外顯子結點或外顯子-內含子結點在其中疾病中牽涉異常剪接的情形或其中疾病中牽涉特定剪接產物的過度產生的情形尤其有用。由於重排或缺失的異常融合結點是靶位置的另一形式。由剪接來自不同基因來源的兩個(或更多個)mRNA的過程產生的mRNA轉錄物稱為"融合轉錄物"。利用靶向例如DNA或前體mRNA的反義化合物可有效地靶向內含子。
在實施方案中，反義寡核苷酸結合靶多核苷酸的編碼區和/或非編碼區並調節靶分子的表達和/或功能。
在實施方案中，反義寡核苷酸結合天然反義多核苷酸並調節靶分子的表達和/或功能。
在實施方案中，反義寡核苷酸結合有義多核苷酸並調節靶分子的表達和/或功倉泛。
可從DNA的相同基因組區域產生可選RNA轉錄物。這些可選轉錄物通常稱為〃變體"。更具體地，〃前體mRNA變體〃是從相同基因組DNA產生的轉錄物，在其起始或終止位置與從相同基因組DNA產生的其它轉錄物不同，並包含內含子序列和外顯子序列兩者。
在剪接期間切除一個或多個外顯子或內含子區域或其部分後，前體mRNA變體產生更小的"mRNA變體〃。因此，mRNA變體是加工的前體mRNA變體，且每個獨特的前體mRNA 變體必定因為剪接而產生獨特的mRNA變體。這些mRNA變體還稱為〃可選剪接變體〃。如果不進行前體mRNA變體的剪接，則前體mRNA變體與mRNA變體相同。
變體可經由使用可選信號產生以起始或終止轉錄。前體mRNA和mRNA可具有多於一個起始密碼子或終止密碼子。來源於使用可選起始密碼子的前 體mRNA或mRNA的變體稱為該前體mRNA或mRNA的"可選起始變體"。使用可選終止密碼子的那些轉錄物稱為該前體mRNA或mRNA的〃可選終止變體"。一種特定類型的可選終止變體是〃聚腺苷酸變體"， 其中產生的多個轉錄物由"聚腺苷酸終止信號"之一被轉錄機制可選選擇所致，從而產生在獨特聚腺苷酸位點終止的轉錄物。在本發明範疇中，本文所述的變體類型也是靶核酸的實施方案。
靶核酸上與反義化合物雜交的位置定義為活性反義化合物靶向的靶區域的至少 5-核苷酸長的部分。
儘管本文列出了某些示例性靶區段的具體序列，但是本領域技術人員將理解這些用於闡釋和描述於本發明範圍中的具體實施方案。本領域普通技術人員考慮到本公開內容可容易地鑑定另外的靶區段。
認為包括選自示例性優選的靶區段中的至少五(5)個連續核苷酸的段的長度為5-100個核苷酸的靶區段也適合於靶向。
靶區段可包括包括從示例性優選的靶區段之一的5』 -末端的至少5個連續核苷酸的DNA或RNA序列(其餘核苷酸為從靶區段5』 -末端的緊鄰上遊開始的相同DNA或RNA的連續段並延伸直到DNA或RNA包含約5至約100個核苷酸)。類似地優選的靶區段由包括從示例性優選的靶區段之一的3』 -末端的至少5個連續核苷酸的DNA或RNA序列代表(其餘核苷酸為從靶區段3』 -末端的緊鄰下遊開始的相同DNA或RNA的連續段並延伸直到DNA 或RNA包含約5至約100個核苷酸)。藉助本文所示例的靶區段的本領域技術人員將能夠鑑定另外的優選的靶區段而不需過度試驗。
已經鑑定出一種或多種靶區域、區段或位置後，選擇與靶足夠地互補，S卩，充分良好並以足夠特異性雜交的反義化合物以獲得期望作用。
在本發明的實施方案中，寡核苷酸結合特定靶的反義鏈。寡核苷酸長度為至少5 個核苷酸並可合成以使每個寡核苷酸靶向重疊序列，從而寡核苷酸被合成以覆蓋靶多核苷酸的整個長度。靶還包括編碼區以及非編碼區。
在一個實施方案中，將反義寡核苷酸靶向特定核酸是優選的。將反義化合物靶向特定核酸是多步驟的過程。該過程通常開始於鑑定待調節其功能的核酸序列。這一核酸序列可以是，例如，其表達與特定病症或疾病狀態相關的細胞基因(或從基因轉錄的mRNA)、 或非編碼多核苷酸，例如非編碼RNA(ncRNA)。
RNA可分為⑴信使RNA (mRNA)，其被翻譯為蛋白，和⑵非蛋白編碼RNA (ncRNA)。 ncRNA包括微RNA、反義轉錄物和包含高密度終止密碼子和缺少任何廣泛的〃開放讀碼框" 的其它轉錄單位(TU)。許多ncRNA表現為從蛋白-編碼基因座的3』非翻譯區(3』UTR)中的起始位點開始。ncRNA通常是罕見的，已被FANTOM財團測序的ncRNA的至少一半似乎不是多腺苷酸化的。出於明顯的原因，大多數研究者集中於被加工並輸出到細胞質的多腺苷酸化mRNA。最近，顯示非多腺苷酸化的核RNA的組可能是非常大的，且許多這樣的轉錄物來源於所謂的基因間區。ncRNA可調節基因表達的機制是通過與靶轉錄物的鹼基配對。通過鹼基配對起作用的RNA可分為(I)順式編碼的RNA，其在它們所作用的RNA的相同遺傳位置但在相對鏈上被編碼，因此與其靶展示極佳的互補性，和(2)反式編碼的RNA，其在不同於它們所作用的RNA的染色體位置被編碼，通常不與其靶展示極佳的鹼基-配 對可能。
不希望受限於理論，反義多核苷酸被本文所述的反義寡核苷酸的擾動可改變相應有義信使RNA的表達。然而，這一調節可以是不一致的(反義敲低導致信使RNA升高)或一致的(反義敲低導致相伴的信使RNA減少)。在這些情形中，反義寡核苷酸可靶向於反義轉錄物的重疊或非重疊部分，導致其敲低或隔離。編碼以及非編碼反義可以相同方式靶向， 任一種類能夠調節相應的有義轉錄物-以一致的或不一致的方式。鑑定針對靶使用的新寡核苷酸中採用的策略可基於反義RNA轉錄物被反義寡核苷酸的敲低或調節期望靶的任何其它手段。
策略1:在不一致調節的情形下，敲低反義轉錄物升高常規(有義)基因的表達。 如果後者基因編碼已知或推測的藥物靶，則其反義對應物的敲低能夠可設想地模擬受體激動劑或酶刺激劑的作用。
策略2 :在一致調節的情形下，人們可以協同地敲低反義轉錄物和有義轉錄物兩者，從而實現常規(有義)基因表達的協同減少。例如，如果反義寡核苷酸用來實現敲低，則這一策略可用來施加靶向有義轉錄物的一種反義寡核苷酸和靶向相應反義轉錄物的另一反義寡核苷酸，或同時靶向重疊的有義轉錄物和反義轉錄物的單個有力地對稱的反義寡核苷酸。
根據本發明，反義化合物包括反義寡核苷酸、核酶、外部指導序列(EGS)寡核苷酸、siRNA化合物、單鏈或雙鏈RNA幹擾(RNAi)化合物例如siRNA化合物以及雜交於靶核酸的至少一部分並調節其功能的其它寡聚化合物。因此，它們可以是DNA、RNA、DNA-樣、 RNA-樣或其混合物，或可以是一種或多種這些的模擬物。這些化合物可以是單鏈、雙鏈、環狀或髮夾寡聚化合物，並可包含結構元件，例如內部凸出或末端凸出、錯配或環。常規線性地製備反義化合物，但可被連接或以其它方式製備為環狀和/或分支的。反義化合物可包括構建體，例如，兩條鏈雜交以形成完全或部分雙鏈的化合物或者具有足夠自互補性的單鏈以允許雜交和形成完全或部分雙鏈的化合物。兩條鏈可在內部被連接，留下游離的3』或 5』末端，或可被連接以形成連續的髮夾結構或環。髮夾結構可包含在5』或3』末端的突出， 產生單鏈特徵的延伸段。雙鏈化合物任選地可包括在末端的突出。進一步的修飾可包括附加於末端之一、所選的核苷酸位置、糖位置或核苷間鍵合之一的綴合物基團。可選地，兩條鏈可經由非核酸部分或接頭基團連接。當僅由一條鏈形成時，dsRNA可採取自互補髮夾型分子的形式，其與自身對摺以形成雙鏈體。因此，dsRNA可以是完全或部分雙鏈的。基因表達的特異性調節可通過在轉基因細胞系中穩定表達dsRNA髮夾來實現,然而,在一些實施方案中，基因表達或功能被上調。當由兩條鏈或採取與自身對摺以形成雙鏈體的自互補髮夾型分子形式的單鏈形成時，兩條鏈(或單鏈的雙鏈體形成區)是以Watson-Crick方式鹼基配對的互補RNA鏈。
被引入系統中後，本發明的化合物可引發一種或多種酶或結構蛋白的作用以實現靶核酸的裂解或其它修飾，或可經由基於佔位性的機製作用。通常，核酸(包括寡核苷酸) 可描述為"DNA-樣〃(即，通常具有一個或多個2』 -脫氧糖，且通常具有T而不是U鹼基)或 "RNA-樣〃(即，通常具有一個或多個2』 -羥基或2』 -修飾的糖，且通常具有U而不是T鹼基)。核酸螺旋可採用多於一種類型的結構，最通常是A-和B-形式。通常認為，具有B-形式-樣結構的寡核苷酸是"DNA-樣〃，且具有A-形式樣結構的是"RNA-樣〃。在一些(嵌合)實施方案中，反義化合物可包含A-形式區域和B-形式區域兩者。
在實施方案中，期望寡核苷酸或反義化合物包括以下至少一種反義RNA、反義DNA、嵌合反義寡核苷酸、包括修飾的鍵合的反義寡核苷酸、幹擾RNA(RNAi)、短幹擾 RNA (siRNA)、微幹擾 RNA (miRNA)、時序調節小 RNA (stRNA)或短髮夾 RNA (shRNA)、小 RNA-誘導的基因活化(RNAa)、小活化RNA(saRNA)或其組合。
dsRNA還可活化基因表達，這是已被稱為〃小RNA-誘導的基因活化〃或RNAa的機制。dsRNA靶向基因啟動子誘導相關基因的有效的轉錄活化。RNAa在人細胞中利用合成的 dsRNA證實，稱為〃小活化RNA〃 (saRNA)。目前未知RNAa在其它生物體中是否是保守的。
已發現小雙鏈RNA (dsRNA)，例如小幹擾RNA (siRNA)和微RNA (miRNA)是稱為RNA 幹擾(RNAi)的進化保守機制的觸發物。RNAi不變性經由重建染色質導致基因沉默，從而阻遏轉錄、降解互補mRNA或阻斷蛋白翻譯。然而在以下實施例部分詳細描述的情況中，寡核苷酸顯示增加盤狀大同系物I (DLGl)多核苷酸和其編碼的產物的表達和/或功能。dsRNA還可作為小活化RNA(saRNA)作用。不希望受理論束縛，通過靶向基因啟動子中的序列，saRNA將以稱為dsRNA-誘導的轉錄活化(RNAa)的現象誘導靶基因表達。
在進一步的實施方案中，本文鑑定的〃優選的靶區段〃可用於篩選調節盤狀大同系物I (DLGl)多核苷酸表達的另外的化合物。"調節劑"是減少或增加編碼DLGl的核酸分子表達的那些化合物，且包括與優選的靶區段互補的至少5-核苷酸部分。篩選方法包括以下步驟將編碼DLGl的有義或天然反義多核苷酸的核酸分子的優選的靶區段與一種或多種候選調節劑接觸，並選擇減少或增加編碼DLGl多核苷酸的核酸分子(例如SEQ ID NO: 3 至12)的表達的一種或多種候選調節劑。顯示一種或多種候選調節劑能夠調節(例如，減少或增加)編碼DLGl多核苷酸的核酸分子的表達後，隨後調節劑可用於DLGl多核苷酸功能的進一步研究性研究，或用作根據本發明的研究劑、診斷劑或治療劑。
靶向天然反義序列優選地調節靶基因的功能。例如，DLGl基因(例如，登錄號 NM_004087)。在實施方案中，靶是DLGl基因的反義多核苷酸。在實施方案中，反義寡核苷酸靶向DLGl多核苷酸(例如，登錄號NM_004087)的有義和/或天然反義序列、變體、等位基因、同種型、同系物、突變體、衍生物、片段及其互補序列。優選地寡核苷酸是反義分子且靶包括反義和/或有義DLGl多核苷酸的編碼區和非編碼區。
本發明優選的靶區段還可與本發明的其各自的互補反義化合物組合以形成穩定的雙鏈(雙鏈體)寡核苷酸。
在本領域中，這種雙鏈寡核苷酸部分已顯示經由反義機制調節靶表達和調節翻譯以及RNA加工。而且，可對雙鏈部分進行化學修飾。例如，這種雙鏈部分已經顯示通過雙鏈體的反義鏈與靶經典雜交，從而觸發靶的酶促降解來抑制靶。
在實施方案中，反義寡核苷酸靶向盤狀大同系物I (DLGl)多核苷酸(例如，登錄號 NM_004087)、變體、等位基因、同種型、同系物、突變體、衍生物、片段及其互補序列。優選地寡核苷酸是反義分子。
根據本發明的實施方案，靶核酸分子不限於僅DLG1，還延伸到DLGl分子的同種型、受體、同系物和類似物的任一種。
在實施方案中，寡核苷酸靶向DLGl多核苷酸的天然反義序列，例如，如SEQ ID N0:2所列的多核苷酸，和任何變體、等位基因、同系物、突變體、衍生物、片段及其互補序列。 反義寡核苷酸的實例列在SEQ ID N0:3至12。
在一個實施方案中，寡核苷酸與DLGl反義的核酸序列互補或結合，包括但不限於 DLGl多核苷酸相關的非編碼有義和/或反義序列，並調節DLGl分子的表達和/或功能。
在實施方案中，寡核苷酸與如SEQ ID NO: 2所列的DLGl天然反義的核酸序列互補或結合，並調節DLGl分子的表達和/或功能。
在實施方案中，寡核苷酸包 括SEQ ID N0:3至12的至少5個連續核苷酸的序列， 並調節DLGl分子的表達和/或功能。
多核苷酸靶包括DLGl，包括其家族成員、DLGl的變體；DLG1的突變體，包括SNP ； DLGl的非編碼序列；DLG1的等位基因；物種變體、片段和類似物。優選地寡核苷酸是反義分子。
在實施方案中，靶向DLGl多核苷酸的寡核苷酸包括反義RNA、幹擾RNA(RNAi)JS 幹擾RNA(siRNA);微幹擾RNA(miRNA);時序調節小RNA (stRNA);或短髮夾RNA (shRNA);小 RNA誘導的基因活化(RNAa);或小活化RNA(saRNA)。
在實施方案中，用寡核苷酸靶向盤狀大同系物I(DLGl)多核苷酸(例如SEQ ID NO:1和此類DLG同種型的天然反義序列例如SEQ ID NO: 2)調節這些靶的表達或功能。在一個實施方案中，與對照相比表達或功能被上調。在實施方案中，與對照相比表達或功能被下調。
在實施方案中，反義化合物或調節劑包括如SEQ ID N0:3至12所列的序列。這些寡核苷酸可包括一種或多種修飾的核苷酸、更短或更長片段、修飾的鍵和類似物。
在實施方案中，SEQ ID NO: 3至12包括一種或多種LNA核苷酸。表I示出可用於本發明方法中的示例性反義寡核苷酸。
表1:
權利要求
1.一種調節生物系統中盤狀大同系物(DLG)多核苷酸的功能和/或表達的方法，所述方法包括將所述系統與長度為5至30個核苷酸的至少一種反義寡核苷酸接觸，其中所述至少一種寡核苷酸與盤狀大同系物(DLG)多核苷酸的天然反義的反向互補序列具有至少 50%序列同一性；從而調節盤狀大同系物(DLG)多核苷酸的功能和/或表達。
2.根據權利要求1的調節生物系統中盤狀大同系物I(DLGl)多核苷酸的功能和/或表達的方法，所述方法包括將所述生物系統與長度為5至30個核苷酸的至少一種反義寡核苷酸接觸，其中所述至少一種寡核苷酸與包括SEQ ID NO:2的天然反義轉錄物核苷酸I至 1706中的5至30個連續核苷酸的多核苷酸的反向互補序列具有至少50%序列同一'丨生；從而調節盤狀大同系物I (DLGl)多核苷酸的功能和/或表達。
3.一種體內或體外調節患者細胞或組織中盤狀大同系物(DLG)多核苷酸的功能和/或表達的方法，所述方法包括將所述細胞或組織與長度為5至30個核苷酸的至少一種反義寡核苷酸接觸，其中所述寡核苷酸與盤狀大同系物(DLG)多核苷酸的反義寡核苷酸具有至少50%序列同一性；從而體內或體外調節患者細胞或組織中盤狀大同系物(DLG)多核苷酸的功能和/或表達。
4.根據權利要求3的調節患者細胞或組織中盤狀大同系物I(DLGl)多核苷酸的功能和/或表達的方法，所述方法包括將所述生物系統與長度為5至30個核苷酸的至少一種反義寡核苷酸接觸，其中所述至少一種寡核苷酸與包括SEQ ID N0:2的天然反義轉錄物核苷酸I至1706中的5至30個連續核苷酸的多核苷酸的反向互補序列具有至少50%序列同一性；從而調節盤狀大同系物I (DLGl)多核苷酸的功能和/或表達。
5.一種調節生物系統中盤狀大同系物(DLG)多核苷酸的功能和/或表達的方法，所述方法包括將所述系統與靶向盤狀大同系物(DLG)多核苷酸的天然反義寡核苷酸的區域的至少一種反義寡核苷酸接觸；從而調節盤狀大同系物(DLG)多核苷酸的功能和/或表達。
6.如權利要求5所述的方法，其中所述盤狀大同系物(DLG)的功能和/或表達相對於對照體內或體外增加。
7.如權利要求5所述的方法，其中所述至少一種反義寡核苷酸靶向盤狀大同系物 I (DLGl)多核苷酸的天然反義序列。
8.如權利要求5所述的方法，其中所述至少一種反義寡核苷酸靶向包括盤狀大同系物 I (DLGl)多核苷酸的編碼核酸序列和/或非編碼核酸序列的核酸序列。
9.如權利要求5所述的方法，其中所述至少一種反義寡核苷酸靶向盤狀大同系物 I (DLGl)多核苷酸的重疊序列和/或非重疊序列。
10.如權利要求5所述的方法，其中所述至少一種反義寡核苷酸包括選自以下的一種或多種修飾至少一種修飾的糖部分、至少一種修飾的核苷間鍵合、至少一種修飾的核苷酸及其組合。
11.如權利要求10所述的方法，其中所述一種或多種修飾包括選自以下的至少一種修飾的糖部分2』 -O-甲氧基乙基修飾的糖部分、2』 -甲氧基修飾的糖部分、2』 -O-烷基修飾的糖部分、二環的糖部分及其組合。
12.如權利要求10所述的方法，其中所述一種或多種修飾包括選自以下的至少一種修飾的核苷酸間鍵合硫代磷酸酯、2』 -O甲氧基乙基(MOE)、2』 -氟、膦酸烷基酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、乙醯胺酯、羧甲基酯及其組合。
13.如權利要求10所述的方法，其中所述一種或多種修飾包括選自以下的至少一種修飾的核苷酸肽核酸(PNA)、鎖核酸(LNA)、阿拉伯糖-核酸(FANA)、類似物、衍生物及其組合
14.如權利要求1所述的方法,其中所述至少一種寡核苷酸包括如SEQID NO:3至12 所列的至少一種寡核苷酸序列。
15.一種體內或體外調節哺乳動物細胞或組織中盤狀大同系物I (DLGl)基因的功能和 /或表達的方法，所述方法包括將所述細胞或組織與長度為5至30個核苷酸的至少一種短幹擾RNA(SiRNA)寡核苷酸接觸，所述至少一種siRNA寡核苷酸對盤狀大同系物I (DLGl) 多核苷酸的反義多核苷酸有特異性，其中所述至少一種siRNA寡核苷酸與盤狀大同系物 I (DLGl)多核苷酸的反義核酸分子和/或有義核酸分子的至少約五個連續核酸的互補序列具有至少50%序列同一性；以及體內或體外調節哺乳動物細胞或組織中盤狀大同系物 I (DLGl)的功能和/或表達。
16.如權利要求15所述的方法,其中所述寡核苷酸與盤狀大同系物I(DLGl)多核苷酸的反義核酸分子和/或有義核酸分子互補的至少約五個連續核酸的序列具有至少80%序列同一I"生。
17.一種體內或體外調節哺乳動物細胞或組織中盤狀大同系物I(DLGl)的功能和/或表達的方法，所述方法包括將所述細胞或組織與長度為約5至30個核苷酸的至少一種反義寡核苷酸接觸，所述至少一種反義寡核苷酸對盤狀大同系物I(DLGl)多核苷酸的有義和 /或天然反義鏈的非編碼序列和/或編碼序列有特異性，其中所述至少一種反義寡核苷酸與如SEQ ID NO:1和2所列的至少一種核酸序列具有至少50%序列同一性；以及體內或體外調節哺乳動物細胞或組織中盤狀大同系物I (DLGl)的功能和/或表達。
18.一種合成的、修飾的寡核苷酸，所述寡核苷酸包括至少一種修飾，其中所述至少一種修飾選自至少一種修飾的糖部分；至少一種修飾的核苷酸間鍵合；至少一種修飾的核苷酸及其組合；其中所述寡核苷酸是與盤狀大同系物I(DLGl)基因雜交並與正常對照相比體內或體外調節其功能和/或表達的反義化合物並且所述寡核苷酸與互補於盤狀大同系物I(DLGl)多核苷酸和等位基因、同系物、同種型、變體、衍生物、突變體、片段或其組合的反義和/或有義核酸分子的至少約5個連續核酸的序列具有至少50%序列同一'丨生。
19.如權利要求18所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的長度為5至30個核苷酸且與 DLGl基因的天然反義轉錄物中5至30個連續核苷酸的反向互補序列具有至少50%序列同一性。
20.如權利要求19所述的寡核苷酸，其中所述至少一種修飾包括選自以下組成的組的核苷酸間鍵合硫代磷酸酯、膦酸烷基酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、乙醯胺酯、羧甲基酯及其組合。
21.如權利要求19所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括至少一種硫代磷酸酯核苷酸間鍵合。
22.如權利要求19所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括硫代磷酸酯核苷酸間鍵合的主鏈。
23.如權利要求19所述的寡核苷酸,其中所述寡核苷酸包括至少一種修飾的核苷酸，所述修飾的核苷酸選自肽核酸、鎖核酸(LNA)、類似物、衍生物及其組合。
24.如權利要求19所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括多種修飾，其中所述修飾包括選自以下的修飾的核苷酸硫代磷酸酯、膦酸烷基酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、 氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、乙醯胺酯、羧甲基酯及其組合。
25.如權利要求19所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括多種修飾，其中所述修飾包括選自以下的修飾的核苷酸肽核酸、鎖核酸(LNA)、類似物、衍生物及其組合。
26.如權利要求19所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括選自以下的至少一種修飾的糖部分2』 -O-甲氧基乙基修飾的糖部分、2』 -甲氧基修飾的糖部分、2』 -O-烷基修飾的糖部分、二環的糖部分及其組合。
27.如權利要求19所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括多種修飾，其中所述修飾包括選自以下的修飾的糖部分2』 -O-甲氧基乙基修飾的糖部分、2』 -甲氧基修飾的糖部分、2』 -O-烷基修飾的糖部分、二環的糖部分及其組合。
28.如權利要求19所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸長度為至少約5至30個核苷酸並與盤狀大同系物I(DLGl)多核苷酸的反義和/或有義鏈雜交，其中所述寡核苷酸與盤狀大同系物I (DLGl)多核苷酸的反義和/或有義編碼和/或非編碼核酸序列的至少約五個連續核酸的互補序列具有至少約60%序列同一性。
29.如權利要求19所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸與盤狀大同系物I(DLGl)多核苷酸的反義和/或有義編碼和/或非編碼核酸序列的至少約五個連續核酸的互補序列具有至少約80%序列同一性。
30.如權利要求19所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸與至少一種盤狀大同系物 I (DLGl)多核苷酸雜交並與正常對照相比體內或體外調節其表達和/或功能。
31.如權利要求19所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括如SEQID NO: 3至12所列的序列。
32.—種藥物組合物，所述藥物組合物包括對根據權利要求18的一種或多種盤狀大同系物I (DLGl)多核苷酸有特異性的一種或多種寡核苷酸和藥學上可接受的賦形劑。
33.如權利要求32所述的組合物，其中所述寡核苷酸與如SEQIDNO:3至12所列的任一種核苷酸序列相比具有至少約40%序列同一性。
34.如權利要求32所述的組合物，其中所述寡核苷酸包括如SEQIDNO:3至12所列的核苷酸序列。
35.如權利要求34所述的組合物，其中如SEQID NO:3至12所列的寡核苷酸包括一種或多種修飾或取代。
36.如權利要求35所述的組合物，其中所述一種或多種修飾選自硫代磷酸酯、膦酸甲酯、肽核酸、鎖核酸(LNA)分子及其組合。
37.一種預防或治療至少一種盤狀大同系物I(DLGl)多核苷酸和/或至少一種其編碼的產物相關的疾病的方法，所述方法包括向患者施用治療有效劑量的結合所述至少一種盤狀大同系物I(DLGl)多核苷酸的天然反義序列並調節所述至少一種盤狀大同系物 I (DLGl)多核苷酸的表達的至少一種反義寡核苷酸；從而預防或治療至少一種盤狀大同系物I (DLGl)多核苷酸和/或至少一種其編碼的產物相關的疾病。
38.如權利要求37所述的方法，其中至少一種盤狀大同系物I(DLGl)多核苷酸相關的疾病選自與DLGl的異常功能和/或表達相關的疾病或病症、癌症、與細胞增殖相關或特徵在於細胞增殖的疾病或疾患、由致瘤人病毒引起的疾病或病症、與細胞命運特化相關的疾病或病症、與細胞抑制受損、眼部癌發生、導管癌、宮頸瘤形成、惡性纖維組織細胞瘤相關的疾病或病症、與DLGl的突變或異常表達或功能相關的疾病或病症、與細胞周期缺陷相關的疾病或病症、與PDZ功能失常接合相關的疾病或病症、與T細胞活化受損相關的疾病或病症、免疫系統的疾病或病症、人免疫缺陷病毒-1感染性、神經髓鞘形成的軸突刺激受損、神經髓鞘形成受損、施萬細胞髓鞘形成的膜內穩態受損、神經病學疾病或病症、精神分裂症、帕金森病、智力遲鈍、孤獨症、進行性腓骨肌萎縮、與心臟Kv4和Kvl. 5通道調節受損相關的疾病或病症或疾患、與GluRl在CF/Purkinje細胞突觸的轉運和插入受損相關的疾病或病症或疾患、與突觸發生受損相關的疾病或病症或疾患、與突觸功能相關的疾病或病症或疾患、與突觸強度減少相關的疾病或病症或疾患、視網膜損傷、與角質形成細胞分化和 /或傷口癒合相關的疾病或病症、與跨膜受體從ER至質膜的運輸受損相關的疾病或病症或疾患、泌尿生殖發育受損、腎盂積水、泌尿道異常、與平滑肌取向受損相關的疾病或病症或疾患、與骨骼肌和神經肌肉接頭的運動神經元組件受損相關的疾病或病症或疾患、腎臟疾病或病症和顎裂。
39.根據權利要求所述37的方法，其中所述天然反義轉錄物具有SEQID N0:2。
40.一種治療與細胞分布、完整性或極性相關的疾病或疾患的方法,其包括向需要相應治療的患者施用長度為約5至30個核苷酸的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸靶向DLGl基因或其同種型的天然反義序列並且與DLGl基因或其同種型的天然反義序列至少50%互補。
41.根據權利要求所述40的方法，其中所述天然反義序列選自SEQID NO: 2。
42.根據權利要求所述40的方法，其中所述疾病或疾患選自與組織相關的疾病、疾患或創傷。
43.一種鑑定和選擇對於DLGl基因的天然反義轉錄物具有選擇性的至少一種寡核苷酸作為用於體內施用的所選靶多核苷酸的的方法，所述方法包括鑑定包括與所選靶多核苷酸或與所選靶多核苷酸的反義多核苷酸至少部分互補的至少五個連續核苷酸的至少一種寡核苷酸；測量反義寡核苷酸和所述靶多核苷酸或與所選靶多核苷酸反義的多核苷酸在嚴格雜交條件下的雜合體的熱熔點；和基於所獲得的信息選擇用於體內施用的至少一種寡核苷酸。
全文摘要
本發明涉及調節盤狀大同系物(DLG)的表達和/或功能的反義寡核苷酸，尤其是通過靶向盤狀大同系物(DLG)的天然反義多核苷酸。本發明還涉及這些反義寡核苷酸的鑑定和它們在治療DLG表達相關的疾病和病症中的用途。
文檔編號C12N15/113GK103068982SQ201180038798
公開日2013年4月24日 申請日期2011年7月13日 優先權日2010年7月14日
發明者J·克拉德, O·霍克瓦舍曼, C·科伊託 申請人:庫爾納公司