抗蟲性能增強的植物和涉及昆蟲抗性基因的構建體和方法與流程

2023-06-10 12:28:26 1

本
技術領域：
：涉及植物育種和基因學，並且具體地涉及用於賦予植物抗蟲害性能的重組dna構建體和植物蟲害的防治方法。發明背景許多昆蟲品種是玉米、大豆、豌豆、棉花、水稻和類似的糧食以及纖維作物等農作物的重要害蟲，害蟲的侵擾每年可以導致諸如作物損失或購買控制害蟲的昂貴殺蟲劑等巨大的經濟損失。在過去的幾個世紀中，控制這些害蟲的主要方法是使用化學合成的殺蟲化合物，然而由於化合物非選擇性以及昆蟲對化學製品的抗藥性的產生，化學化合物的廣泛應用造成了許多環境問題。近幾十年來生物技術的發展為通過基因工程控制害蟲提供了機遇，特別是植物遺傳學的發展，再加上昆蟲生長因子和自然發生的植物防禦化合物或試劑的鑑定，為創造能夠產生這些防禦試劑的轉基因作物提供了機遇，從此保護植物免受昆蟲攻擊。已知芽孢桿菌屬(bacillus)微生物的某些種對一系列昆蟲害蟲具有殺蟲活性，這些昆蟲包括鱗翅目(lepidoptera)、雙翅目(diptera)、鞘翅目(coleoptera)、半翅目(hemiptera)害蟲以及其他害蟲。蘇雲金芽孢桿菌(bacillusthuringiensis)(bt)和日本金龜子芽孢桿菌(bacilluspopilliae)是至今為止發現的最成功的生物防治劑的代表。昆蟲致病性也被認為是由幼蟲芽孢桿菌(b.larvae)、緩病芽孢桿菌(b.lentimorbus)、球形芽孢桿菌(b.sphaericus)和蠟樣芽孢桿菌(b.cereus)的菌株引起的。微生物殺昆蟲劑，特別是那些從芽孢桿菌菌株獲得的微生物殺昆蟲劑，在農業上作為害蟲化學防治的替代方案已起到重要的作用。編碼蘇雲金芽孢桿菌(bt)內毒素或植物蛋白酶抑制劑(pis)基因的轉基因植物能夠抵抗特定害蟲，例如能夠產生蘇雲金芽胞桿菌菌株的殺蟲蛋白的玉米和棉花已通過遺傳工程獲得，這些遺傳轉化的作物目前廣泛用於農業，並為農民提供了環境友好和商業吸引力的替代傳統昆蟲控制的方法。通常來說，與傳統廣譜的化學殺蟲劑相比，生物殺蟲劑的汙染和環境危害風險較低，且生物殺蟲劑具有較好的目標特異性。另外，生物殺蟲劑生產成本低，因此提高了各種作物的經濟產量。生物殺蟲劑已被證明是非常成功的商業化，這些轉基因抗蟲作物只對一個狹窄的範圍內的重要經濟害蟲具有抗性。在某些情況下，昆蟲對不同的殺蟲化合物產生抗性，這就需要鑑定出控制害蟲的可替代性生物控制試劑。仍然需要對昆蟲害蟲具有不同範圍殺昆蟲活性的新殺蟲蛋白，例如對鱗翅目和半翅目的多種昆蟲具有活性的殺昆蟲蛋白，所述多種昆蟲包括但不限於對現有殺蟲劑已產生抗性的昆蟲害蟲。發明概述一方面，本發明包括過量表達提高植物抗蟲性的多核苷酸，所述多核苷酸,包含：(a)一種多核苷酸，其核苷酸序列與seqidno：4和12的序列一致性至少為85％；(b)一種多核苷酸，其核苷酸序列與seqidno：5和13的序列一致性至少為85％；(c)一種多核苷酸，其編碼的多肽的胺基酸序列與seqidno：6和14的序列一致性至少為90％；或(d)(a)、(b)或(c)核苷酸序列的全長互補序列。核苷酸序列包含seqidno：4、seqidno：5、seqidno：12或seqidno：13；多肽的胺基酸序列包含seqidno：6或seqidno：14。另一方面，本發明包括重組dna構建體，其包含可操作連接至少一個調控序列的分離多核苷酸，其中所述多核苷酸包含(a)核苷酸序列與seqidno：4、5、12或13序列一致性至少為85％的多核苷酸；(b)編碼多肽的胺基酸序列與seqidno：6或14的序列一致性至少為90％的多核苷酸；或(c)(a)或(b)的核苷酸序列的全長互補序列；所述至少一個調控序列為植物中有功能的啟動子。另一方面，本發明包括一種包含重組dna構建體的植物或種子，所述重組dna構建體包含可操作連接至少一個調控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含(a)核苷酸序列與seqidno：4、5、12或13序列一致性至少為85％的多核苷酸；(b)編碼多肽的胺基酸序列與seqidno：6或14的序列一致性至少為90％的多核苷酸；或(c)(a)或(b)核苷酸序列的全長互補序列。另一方面，本發明包括基因組內包含重組dna構建體的植物，所述重組dna構建體包含可操作連接至少一個調控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含(a)核苷酸序列與seqidno：4、5、12或13序列一致性為85％的多核苷酸；(b)編碼多肽的胺基酸序列與seqidno：6或14的序列一致性至少為90％的多核苷酸；或(c)(a)或(b)核苷酸序列的全長互補序列；對照植物相比，所述轉基因植物顯示增強的抗蟲性。在另一個實施方案中，本發明包括本文中任意的植物，其中所述植物選自水稻、玉米、大豆、向日葵、高粱、加拿大油菜、小麥、苜蓿、棉花、大麥、粟、甘蔗和柳枝稷。在另一個實施方案中，本發明包括增強了抗蟲性，其中，所述抗蟲性針對選自下列目的昆蟲：鞘翅目、雙翅目、膜翅目、鱗翅目、禽蝨目、同翅目、半翅目、纓尾目、革翅目、等翅目、蝨目、蚤目和毛翅目等，特別是鱗翅目和鞘翅目。在另一實施方案中，提供了提高植物抗蟲性的方法，其包括：(a)向可再生植物細胞導入重組dna構建體，所述重組dna構建體包含可操作連接至少一個調控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼一個多肽，其胺基酸序列與seqidno：6或14序列一致性至少為50％；(b)由步驟(a)後的可再生細胞再生轉基因植物，其中轉基因植物在其基因組中包含重組dna構建體；和(c)由步驟(b)的轉基因植物獲得子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含重組dna構建體，與不包含重組dna構建體的對照植物相比，所述子代轉基因植物顯示增強的抗蟲性能。在另一個實施方案中，提供了評估植物抗蟲性的方法，其包括：(a)向可再生植物細胞導入重組dna構建體，所述重組dna構建體包含可操作連接至少一個調控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼的多肽的胺基酸序列與seqidno：6或14的序列一致性至少為50％；(b)由步驟(a)的可再生細胞再生轉基因植物，其中轉基因植物在其基因組中包含重組dna構建體；(c)由步驟(b)的轉基因植物獲得子代植物，其中子代植物的基因組中包含重組dna構建體；和(d)以不包含重組dna構建體的對照植物為對照，評估子代植物的抗蟲性能。在另一個實施方案中，本發明涉及一個重組dna構建體，其包含本發明中任意分離的多聚核苷酸，並與至少一個調控序列可操作連接；以及包含重組dna構建體的細胞、植物和種子。所述細胞包括真核細胞，如酵母、昆蟲或植物細胞；或原核細胞，如細菌。附圖簡述和序列表根據以下的發明詳述和附圖以及序列表，可更全面地理解本發明，以下的發明詳述和附圖以及序列表形成本申請的一部分。圖1為實時pcr分析測定的不同轉基因株系葉片中oscrk6基因的相對表達水平。zh11-tc葉片中基因的表達水平設置為1.00，每個轉基因株系表達量柱上面的數字表示與zh11-tc相比的變化倍數。zh11-tc為組織培養獲得的zh11，dp0158代表轉空載體的zh11。圖2為實時pcr分析測定的不同轉基因株系葉片中osmfs6基因的相對表達水平。zh11-tc葉片中基因的表達水平設置為1.00，每個轉基因株系表達量柱上面的數字表示與zh11-tc相比的變化倍數。zh11-tc為組織培養獲得的zh11，dp0158代表轉空載體的zh11。表1.序列表中核苷酸和胺基酸序列編號表2.玉米螟及粘蟲試驗打分的分級標準表3.ah43610幼苗在實驗室條件下的亞洲玉米螟試驗表4.ah29691幼苗在實驗室條件下的亞洲玉米螟試驗表5.實驗室條件下ah43610和ah29691幼苗的粘蟲試驗表6.實驗室條件下ah43610和ah29691幼苗水稻二化螟試驗表7.克隆抗蟲基因的引物表8.pcr反應混合液表9.克隆抗蟲基因的pcr循環狀況表10.oscrk6轉基因水稻在實驗室條件下亞洲玉米螟試驗(轉基因株系水平，第一次試驗)表11.oscrk6轉基因水稻在實驗室條件下亞洲玉米螟試驗(轉基因株系水平，第二次試驗)表12.oscrk6轉基因水稻在實驗室條件下粘蟲試驗(載體水平，第一次試驗)表13.oscrk6轉基因水稻在實驗室條件下粘蟲試驗(載體水平，第二次試驗)表14.oscrk6轉基因水稻在溫室條件下的水稻二化螟試驗(轉基因株系水平)表15.osmfs5轉基因水稻在實驗室條件下的亞洲玉米螟試驗(轉基因株系水平，第一次試驗)表16.osmfs5轉基因水稻在實驗室條件下的亞洲玉米螟試驗(轉基因株系水平，第二次試驗)表17.osmfs5轉基因水稻在實驗室條件下的粘蟲試驗(轉基因株系水平，第一次試驗)表18.osmfs5轉基因水稻植株在實驗室條件下粘蟲試驗(轉基因株系水平，第二次試驗)表19.osmfs5轉基因水稻在溫室中的水稻二化螟試驗(枯心率)表20.osmfs5轉基因水稻在溫室中的水稻二化螟試驗(水稻死亡率)表1.序列表中核苷酸和胺基酸序列編號序列描述以及關聯的序列表遵循如37c.f.r.§1.821-1.825中所列出的管理專利申請中的核苷酸和/或胺基酸序列公開的規則。序列表包含核苷酸序列字符的單字母碼以及胺基酸的三字母碼，如遵照iupac-iubmb標準所定義的，該標準在nucleicacidsres.13：3021-3030(1985)以及在biochemicalj.219(no.2)：345-373(1984)中有所描述，這兩篇文獻以引用的方式併入本文。用於核苷酸和胺基酸序列數據的符號和格式遵循37c.f.r.§1.822中列出的規則。seqidno：1為ah43610株系中t-dna右側(rb)側翼序列的核苷酸序列。seqidno：2為ah43610株系中t-dna左側(lb)側翼序列的核苷酸序列。seqidno：3為載體dp0158的核苷酸序列。seqidno：4為oscrk6基因cdna的核苷酸序列。seqidno：5為oscrk6基因cds的核苷酸序列。seqidno：6為oscrk6的胺基酸序列。seqidno：7為克隆oscrk6基因cdna的正向引物。seqidno：8為克隆oscrk6基因cdna的反向引物。seqidno：9為oscrk6基因的實時rt-pcr的正向引物。seqidno：10為oscrk6基因的實時rt-pcr的反向引物。seqidno：11為ah29691株系t-dna右側(rb)側翼序列的核苷酸序列。seqidno：12為osmfs5基因cdna的核苷酸序列。seqidno：13為osmfs5基因cds的核苷酸序列。seqidno：14為osmfs5的胺基酸序列。seqidno：15為克隆osmfs5基因cdna的正向引物。seqidno：16為克隆osmfs5基因cdna的反向引物。seqidno：17為osmfs5基因實時rt-pcr分析的正向引物。seqidno：18為osmfs5基因實時rt-pcr分析的反向引物。發明詳述本文中所列出的每篇參考文獻的公開內容的全文均以引用的方式併入本文。如本文所用的並在所附權利要求書中的單數形式「一個」和「所述」包括複數涵義，除非上下文中清楚地另有指明。因此，例如，「一株植物」的涵義包括多株該類植物。「一個細胞」的涵義包括一個或多個細胞及其本領域的技術人員已知的等同物，等等。如本文所用：「oscrk6」是半胱氨酸豐富的受體樣蛋白激酶6，涉及水稻基因loc_os03g16960.1編碼的能夠提高水稻耐蟲性的多肽。「crk6多肽」此處涉及oscrk6多肽和來源於其他植物的同源物。oscrk6多肽(seqidno:6)是水稻基因位點loc_os03g16960.1的編碼序列(cds)(seqidno：5)和核酸序列(seqidno：4)編碼的胺基酸序列。tigr(theinternetatplantbiologymsu.edu/index.shtml)中，該多肽的注釋為「半胱氨酸豐富的重複分泌蛋白55前提，推測，表達」，但是沒有在先的功能介紹。「osmfs5」是主要協助轉運蛋白超家族5，涉及水稻基因位點loc_os09g36600.1編碼的能夠提高水稻耐蟲性的多肽。「mfs5多肽」此處涉及osmfs5多肽和來源於其他植物的同源物。osmfs5多肽(seqidno:14)是水稻基因位點loc_os09g36600.1的編碼序列(cds)(seqidno：13)和核酸序列(seqidno：12)編碼的胺基酸序列。tigr(theinternetatplantbiologymsu.edu/index.shtml)中，該多肽的注釋為「根瘤素，推測，表達」，但是沒有在先的功能介紹。如本文所用，「耐蟲蛋白」和「抗蟲蛋白」是指能夠抑制、阻礙害蟲的生長和/或能夠殺死害蟲的多肽，包括但不限於鱗翅目、雙翅目、半翅目和鞘翅目的害蟲。本發明中的單子葉植物包括禾本科的植物；雙子葉植物包括十字花科、豆科和茄科的植物。「全長互補序列」是指給定核苷酸序列的互補序列，互補序列和核苷酸序列含有相同的核苷酸數，並且100％的互補。「表達序列標籤」(「est」)是得自cdna文庫的dna序列，並且因此是已經被轉錄的序列。est通常通過cdna插入序列單程測序獲取。將完整的cdna插入序列稱為「全長插入序列」(「fis」)。「重疊群」序列是由選自但不限於est、fis和pcr序列的兩個或更多個序列裝配成的序列。將編碼完整或功能性蛋白的序列稱為「完全基因序列」(「cgs」)，該序列可得自fis或重疊群。「轉基因的」指其基因組因異源核酸(如重組dna構建體)的存在而發生改變的任何細胞、細胞系、愈傷組織、組織、植物部分或植物，包括那些最初的轉基因事件以及從最初的轉基因事件通過有性雜交或無性生殖而產生的那些。如本文所用的術語「轉基因」不涵蓋通過常規植物育種方法或通過諸如隨機異花受精、非重組病毒感染、非重組細菌轉化、非重組轉座或自發突變之類的自然發生事件導致的基因組(染色體基因組或染色體外基因組)改變。「對照」、「對照植物」或「對照植物細胞」為測定受測試植物或植物細胞的表型變化提供參考，由於轉化，受測植物或植物細胞的基因組改變影響到目的基因，測試的植物或植物細胞可以是轉基因植物或轉基因植物細胞的子代。對照植物或對照植物細胞包括，例如：(a)用於基因改變產生受測植物或細胞的野生型植物或細胞；(b)相同基因組作為起始材料但是轉入空載體(如帶有標記基因的並對目標的性狀沒有影響的載體)的植物或植物細胞；(c)轉基因植物或植物細胞性狀分離，獲得的非轉基因的子代植物或植物細胞；(d)沒有暴露於可以誘導基因表達的條件或刺激下的，與轉基因植物或植物細胞基因組相同的植物或植物細胞；(e)特定的目標基因不表達情況下的，轉基因植物或者植物細胞本身。本發明中，zh11-tc和空載體植物指對照植物。zh11-tc代表通過組織培養zhonghua11獲得的水稻植株，空載體代表轉化空載dp0158獲得水稻植株。「基因組」在用於植物細胞時不僅涵蓋存在於細胞核中的染色體dna，而且還包括存在於細胞的亞細胞組分(如線粒體、質粒)中的細胞器dna。「植物」包括整個植株、植物器官、植物組織、種子和植物細胞以及同一植株的子代。植物細胞包括但不限於得自下列物質的細胞：種子、懸浮培養物、胚、分生區域、愈傷組織、葉、根、芽、配子體、孢子體、花粉和小孢子。「子代」包括植物的任何後續世代。「轉基因植物」包括在其基因組內包含異源多核苷酸的植物。例如異源多核苷酸能夠穩定地整合進基因組中，並遺傳連續的世代。異源多核苷酸可單獨地或作為重組dna構建體的部分整合進基因組中。t0植物直接源於轉化和再生過程，t0植物的子代為t1代(第一個子代)，t2代(第二個子代)等。針對序列而言的「異源」意指來自外來物種的序列，或者如果來自相同物種，則指通過蓄意的人為幹預而從其天然形式發生了組成和/或基因座的顯著改變的序列。「多核苷酸」、「核酸序列」、「核苷酸序列」或「核酸片段」可互換使用並且是任選含有合成的、非天然的或改變的核苷酸鹼基的單鏈或雙鏈rna或dna聚合物。核苷酸(通常以它們的5′-單磷酸形式存在)通過如下它們的單個字母名稱來指代：「a」為腺苷酸或脫氧腺苷酸(分別對應rna或dna)，「c」表示胞苷酸或脫氧胞苷酸，「g」表示鳥苷酸或脫氧鳥苷酸，「u」表示尿苷酸，「t」表示脫氧胸苷酸，「r」表示嘌呤(a或g)，「y」表示嘧啶(c或t)，「k」表示g或t，「h」表示a或c或t，「i」表示肌苷，並且「n」表示任何核苷酸。「多肽」、「肽」、「胺基酸序列」和「蛋白質」在本文中可互換使用，指胺基酸殘基的聚合物。該術語適用於其中一個或多個胺基酸殘基是相應的天然存在的胺基酸的人工化學類似物的胺基酸聚合物，以及適用於天然存在的胺基酸聚合物。術語「多肽」、「肽」、「胺基酸序列」和「蛋白質」還可包括修飾形式，包括但不限於糖基化、脂質連接、硫酸鹽化、穀氨酸殘基的γ羧化、羥化和adp-核糖基化。「信使rna(mrna)」指無內含子並且可通過細胞翻譯成蛋白質的rna。「cdna」指與mrna模板互補並且利用逆轉錄酶從mrna模板合成的dna。cdna可為單鏈的或者可用dna聚合成酶i的klenow片段轉化成雙鏈形式。「成熟」蛋白質指經翻譯後加工的多肽；即已經去除了存在於初級翻譯產物中的任何前肽或原肽的多肽。「前體」蛋白質指mrna的翻譯初級產物；即帶有前肽和原肽的蛋白質。前肽和原肽可為並且不限於細胞內定位信號。「分離的」指物質，例如核酸和/或蛋白質，該物質基本上不含在天然存在的環境中通常伴隨該物質或與其反應的組分，或者說是該物質被從所述組分移出。分離的多核苷酸可從它們天然存在的宿主細胞中純化。技術人員已知的常規核酸純化方法可用於獲得分離的多核苷酸。該術語也涵蓋重組多核苷酸和化學合成的多核苷酸。「重組體」指(例如)通過化學合成或者通過用基因工程技術操縱分離的核酸片段來實現的兩個原本分離的序列片段的人工組合。「重組體」也包括指已經通過引入異源核酸而進行了修飾的細胞或載體，或源於經這樣修飾的細胞的細胞，但不涵蓋由天然發生的事件(如自發突變、自然轉化/轉導/轉座)對細胞或載體的改變，例如沒有蓄意人為幹擾而發生的那些。「非基因組核酸序列」、「非基因組核酸分子」或「非基因組多核苷酸」指與天然或基因組核酸序列相比，存在一處或多處核酸序列改變的核酸分子。在某些實施方案中，天然或基因組核酸分子的改變包括但不限於：由於遺傳密碼的簡併性而產生的核酸序列變化；植物表達的核酸序列密碼子優化；與天然或基因組序列相比，至少一個胺基酸的替代、插入、刪除和/或添加而引起的核酸序列的變化；與基因組核酸序列相連的一個或多個內含子的移除；一個或多個異源內含子的插入；與基因組核酸序列相連一個或多個上遊或下遊調控區域的刪除，一個或多個異源上遊或下遊調控區域的插入；與基因組核酸序列相連的5』和/或3』非翻譯區的刪除；一個異源5』和/或3』非翻譯區的插入；和多聚腺苷酸位點的修飾。在一些實施方案中，非基因組核酸分子是cdna。在一些實施方案中，非基因組核酸分子為合成的核酸序列。「重組dna構建體」指在自然界中通常不會一起存在的核酸片段的組合。因此，重組dna構建體可包含源於不同來源的調控序列和編碼序列，或源於相同來源但以不同於通常天然存在的方式排列的調控序列和編碼序列。術語「入門克隆」和「入門載體」本文可互換使用。「調控序列」和「調控元件」可互換使用，指位於編碼序列的上遊(5′非編碼序列)、中間或下遊(3′非編碼序列)，並且影響相關編碼序列的轉錄、rna加工或穩定性或者翻譯的核苷酸序列。調控序列可包括但不限於啟動子、翻譯前導序列、內含子和多腺苷酸化識別序列。「啟動子」指能夠控制另一核酸片段轉錄的核酸片段。「植物啟動子功能」是能夠控制植物細胞中的轉錄的啟動子，無論其是否來源於植物細胞。「組織特異性啟動子」和「組織優選啟動子」可互換使用，並且指主要但非必須專一地在一種組織或器官中表達，而是也可在一種特定細胞中表達的啟動子。「發育調控啟動子」指其活性由發育事件決定的啟動子。術語「可操作地連接」指核酸片段連接成單一片段，使得其中一個核酸片段的功能受到另一個核酸片段的調控。例如，在啟動子能夠調節核酸片段的轉錄時，該啟動子與該核酸片段進行了可操作地連接。「表達」指功能產物的產生。例如，核酸片段的表達可指核酸片段的轉錄(如轉錄生成mrna或功能rna)和/或rna翻譯成前體或成熟蛋白質。「表型」意指細胞或生物體的可檢測的特徵。有關將核酸片段(例如重組dna構建體)插入細胞內的「導入」是指「轉染」或「轉化」或「轉導」，並且包括指將核酸片段整合進真核或原核細胞中，在該細胞中核酸片段可整合進細胞的基因組(如染色體、質粒、質體或線粒體dna)內，轉變成自主的複製子或瞬時表達(如轉染的mrna)。「轉化細胞」是將核酸片段(如重組dna構建體)導入其中的任何細胞。本文所用的「轉化」指穩定轉化和瞬時轉化兩者。「穩定轉化」指將核酸片段導入宿主生物體的基因組中，導致基因穩定遺傳。一旦穩定轉化，核酸片段穩定地整合進宿主生物體和任何連續世代的基因組中。「瞬時轉化」指將核酸片段導入宿主生物體的核中或包含dna的細胞器中，引起基因表達而沒有基因穩定遺傳。「等位基因」是佔據染色體上給定位點的基因的幾種供選擇形式的其中一種。當二倍體植物中一對同源染色體上給定基因座上存在的等位基因相同時，該植物在該基因座處是純合的。如果二倍體植物中一對同源染色體上給定基因座上存在的等位基因不同，則該植物在該基因座處是雜合的。如果轉基因存在於二倍體植物中一對同源染色體中的其中之一上，則該植物在該基因座處是半合子的。「葉綠體轉運肽」是與蛋白協同翻譯並將蛋白導向葉綠體或翻譯蛋白的細胞中存在的其它質體類型的胺基酸序列。「葉綠體轉運序列」指編碼葉綠體轉運肽的核苷酸序列。「信號肽」是一種與蛋白協同翻譯並將蛋白導向分泌器官的胺基酸序列(chrispeels，m.(1991)ann.rev.plantphys.plantmol.biol.42：21-53)。如果將所述蛋白導向液泡，可另外加上液泡靶向信號，或者如果將所述蛋白導向內質網，可加上內質網駐留信號。如果將蛋白導向細胞核，將移除任何存在的信號肽並用以核定位信號替代(raikhel(1992)plantphys.100：1627-1632)。「線粒體信號肽」是引導前體蛋白進入線粒體的胺基酸序列(zhang和glaser(2002)trendsplantsci7：14-21)。序列比對和同一性百分比可用設計用於檢測同源序列的多種比較方法來測定，這些方法包括但不限於生物信息計算包(inc.，madison，wi)的程序。除非另外說明，本文提供的序列的多重比對用clustalv比對方法(higgins和sharp，1989，cabios.5：151-153)採用默認參數(空位罰分＝10，空位長度罰分＝10)執行。用clustalv方法進行成對比對和蛋白質序列的同一性百分比計算的默認參數為ktuple＝1、空位罰分(gappenalty)＝3、窗口(window)＝5並且diagonalssaved＝5。而對於核酸，這些參數為ktuple＝2，空位罰分＝5，窗口＝4並且diagonalssaved＝4。用clustalv程序比對序列後，可通過查看同一程序中的「序列距離」表來獲得「同一性百分比」和「趨異」值。除非另外說明，本文提供的和申明的同一性百分比和趨異度是以該方式計算。本文使用的標準重組dna和分子克隆技術是本領域所熟知的並且在如下文獻中有更全面的描述：sambrook，j.，fritsch，e.f.和maniatis，t.，molecularcloning：alaboratorymanual；coldspringharborlaboratorypress：coldspringharbor，1989(下文稱為「sambrook」)。現在轉向實施方案：實施方案包括分離的多核苷酸和多肽、用於提供耐蟲害dna構建體、包含這些重組dna構建體的組合物(例如植物或種子)，以及利用這些重組dna構建體的方法。分離的多核苷酸和多肽：本發明包括如下分離的多核苷酸和多肽：在一些實施方案中，多核苷酸編碼crk6或mfs5多肽。在一些實施方案中，分離的多核苷酸包含：(i)編碼多肽的核酸序列，所述多肽具有的胺基酸序列在與seqidno：6或14進行比較時具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性；或(ii)(i)的核酸序列的全長互補序列，其中全長互補序列和(i)的核酸序列由相同數目的核苷酸組成並且是100％互補的。任一上述分離的多核苷酸可用於本發明的任何重組dna構建體。在一些實施方案中，分離的多肽，其胺基酸序列在與seqidno：6或14進行比較時具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性。所述多肽優選地為抗蟲多肽crk6或mfs5。在一些實施方案中，分離的多核苷酸，其包括：(i)核酸序列，所述核酸序列在與seqidno：4、5、12或13進行比較時具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性；或(ii)(i)的核酸序列的全長互補序列。任一上述分離的多核苷酸可用於本發明的任何重組dna構建體。分離的多核苷酸優選地編碼抗蟲蛋白。過表達抗蟲多肽增加了植物對害蟲的抗性。重組dna構建體在一方面，本發明包括重組dna構建體。在一個實施方案中，重組dna構建體包含可操作地連接至少一種調控序列(如，在植物中有功能的啟動子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括(i)核酸序列，所述核酸序列編碼的胺基酸序列與seqidno：6或者14進行比較時具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或者100％的序列一致性；或(ii)(i)的核酸序列的全長互補序列。在另一個實施方案中，重組dna構建體包含可操作地連接至少一種調控序列(如，在植物中有功能的啟動子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括(i)核酸序列，所述核酸序列在與seqidno：4、5、12或13進行比較時具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或者100％的序列一致性；或(ii)(i)的核酸序列的全長互補序列。在另一實施方案中，重組dna構建體包含可操作地連接至少一種調控序列(如，在植物中有功能的啟動子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼crk6或mfs5。這些多肽具有抗蟲害的活性，並可來自，例如水稻(oryzasativa)、野生稻(oryzaaustraliensis)、短舌野生稻(oryzabarthii)、非洲型稻(oryzaglaberrima)、闊葉稻(oryzalatifolia)、長雄野生稻(oryzalongistaminata)、南方野生稻(oryzameridionalis)、藥用野生稻(oryzaofficinalis)、斑點野生稻(oryzapunctata)、普通野生稻(oryzarufipogon)(紅稻)、印度野生稻(oryzanivara)、擬南芥(arabidopsisthaliana)、玉米(zeamays)、大豆(glycinemax)、煙豆(glycinetabacina)、野大豆(glycinesoja)和短絨野大豆(glycinetomentella)。應當理解(正如本領域技術人員將會理解的)，本發明不僅僅涵蓋這些具體的示例性序列。導致給定位點處產生化學上等價的胺基酸但不影響所編碼多肽的功能特性的核酸片段中的改變是本領域眾所周知的。例如，丙氨酸(一種疏水性胺基酸)的密碼子可被編碼另一個疏水性較弱的殘基(例如甘氨酸)或疏水性較強的殘基(例如纈氨酸、亮氨酸或異亮氨酸)的密碼子取代。類似地，導致一個帶負電荷的殘基替換為另一個帶負電荷的殘基(例如，天冬氨酸替代穀氨酸)或者一個帶正電荷的殘基替換為另一個帶正電荷的殘基(例如，賴氨酸替換精氨酸)的改變也可預期產生功能上等價的產物。導致多肽分子的n-末端和c-末端部分改變的核苷酸變化也將預計不會改變多肽的活性。所提出的修飾中的每一種均完全在本領域常規技術內，如測定所編碼的產物的生物活性的保留。「抑制dna構建體」是在轉化或穩定整合進植物基因組時，導致該植物中的靶基因「沉默」的重組dna構建體。對該植物來說，該靶基因可為內源性的或是轉基因的。如本文針對靶基因所使用的，「沉默」通常指在由靶基因表達的mrna或蛋白質/酶的水平上的抑制，和/或在酶活性或蛋白質功能性的水平上的抑制。本文中可交換使用的術語「抑制」、「抑制性」以及「沉默」包括降低、減少、減退、減小、抑制、消除或防止。「沉默」或「基因沉默」不特指機理並且包括但不限於反義、共抑制、病毒-抑制、髮夾抑制、莖-環抑制、基於rnai的方法以及基於小rnai的方法。抑制dna構建體可包含源自所關注的靶基因的區域並且可包含所關注的靶基因的有義鏈(或反義鏈)的核酸序列的全部或部分。取決於所要利用的方法，該區域可與所關注基因的有義鏈(或反義鏈)的全部或部分100％相同或者具有少於100％序列的一致性(如，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的一致性)。抑制dna構建體是本領域所熟知的，一旦選定所關注的靶基因就很容易構建，並且包括但不限於共抑制構建體、反義構建體、病毒-抑制構建體、髮夾抑制構建體、莖-環抑制構建體、產生雙鏈rna的構建體，以及更通常的是，rnai(rna幹擾)構建體和小rna構建體，例如sirna(短幹擾rna)構建體和mirna(微rna)構建體。「反義抑制」指產生能夠抑制靶基因或基因產物表達的反義rna轉錄物。「反義rna」指與靶初級轉錄物或mrna的全部或部分互補，並阻斷分離的靶核酸片段表達的rna轉錄物(美國專利號5,107,065)。反義rna可與特定基因轉錄物的任何部分，即5′非編碼序列、3′非編碼序列、內含子或編碼序列互補。「共抑制」指產生能夠抑制靶基因或基因產物表達的有義rna轉錄物。「有義」rna指包括mrna並且可在細胞內或體外翻譯成蛋白質的rna轉錄物。此前，已通過著眼於以有義方向過表達與內源mrna具有同源性的核酸序列(其導致與過表達的序列具有同源性的所有rna減少)設計出了植物中的共抑制構建體(參見vaucheret等人，plantj.，16：651-659(1998)；以及gura，nature404：804-808(2000))。另一種變型描述了將植物病毒序列用於引導對近端mrna編碼序列的抑制(於1998年8月20日公開的pct公開wo98/36083)。rna幹擾(rnai)是指由短幹擾性rna(sirna)介導的動物中序列特異性轉錄後基因沉默的過程(fire等人，nature391：8061998)。在植物中的對應過程通常稱為轉錄後基因沉默(ptgs)或rna沉默，並且在真菌中也稱為阻抑作用(quelling)。據信轉錄後基因沉默過程是用於防止外來基因表達的進化保守性細胞防禦機制，並且通常由不同植物區系和門所共有(fire等人，trendsgenet.15：358(1999))。小rna在控制基因表達中起重要作用。很多發育過程(包括開花)的調節是由小rna控制的。現在有可能通過使用在植物中產生小rna的轉基因構建體來以工程手段改變植物基因的基因表達。小rna似乎是通過與互補rna或dna靶序列鹼基配對來行使功能的。當與rna結合時，小rna或者引發靶序列的rna裂解或者引發翻譯抑制。當與dna靶序列結合時，據信小rna可介導靶序列的dna甲基化。無論具體機制是什麼，這些事件的後果是基因表達受到抑制。微rna(mirna)是長度為約19至約24個核苷酸(nt)的已經在動物和植物中鑑定出的非編碼rna(lagos-quintana等人，science294：853-8582001，lagos-quintana等人，curr.biol.12：735-739(2002)；lau等人，science294：858-862(2001)；lee和ambros，science294：862-864(2001)；llave等人，plantcell14：1605-1619(2002)；mourelatos等人，genes.dev.16：720-728(2002)；park等人，curr.biol.12：1484-1495(2002)；reinhart等人，genes.dev.16：1616-1626(2002))。它們是由大小為大約70至200nt較長的前體轉錄物加工生成的，並且這些前體轉錄物能夠形成穩定的髮夾結構。微rna(mirna)看起來通過與位於由這些基因產生的轉錄物中的互補序列結合來調節靶基因。看起來有可能mirna可進入至少兩條靶基因調控途徑：(1)翻譯抑制；和(2)rna裂解。進入rna裂解途徑的微rna類似於在動物中的rna幹涉作用(rnai)和植物中的轉錄後基因沉默(ptgs)期間生成的21-25nt的短幹涉rna(sirnsirna)，並且可能摻入了rna誘導沉默複合物(risc)，該複合物與rnai相似或相同。調控序列：本發明的重組dna構建體可包含至少一種調控序列。調控序列可為啟動子或增強子。多種啟動子可用於本發明的重組dna構建體中。可根據所需結果來選擇啟動子，並且可包括用於在宿主生物體中表達的組成型啟動子、組織特異性啟動子、誘導型啟動子或其他啟動子。一般將引起基因在多數細胞類型中在多數情況下表達的啟動子稱為「組成型啟動子」。雖然候選基因當通過組成型啟動子驅動表達時可預測其效應，但候選基因在35s或ubi啟動子控制下的高水平、組成型表達可具有多重效應。使用組織特異和/或脅迫特異啟動子可消除不需要的效應但保留抗蟲性的能力。在擬南芥屬中已經觀察到了該效應(kasuga等人(1999)naturebiotechnol.17：287-91)。適用於植物宿主細胞的組成型啟動子包括(例如)rsyn7啟動子的核心啟動子和在wo99/43838和美國專利6,072,050中公開的其他組成型啟動子；camv35s核心啟動子(odell等人，nature313：810-812(1985))；稻肌動蛋白(mcelroy等人，plantcell2：163-171(1990))；泛素啟動子(christensen)等人，plantmol.biol.12：619-632(1989)和christensen等人，plantmol.biol.18：675-689(1992))；pemu(last等人，theor.appl.genet.81：581-588(1991))；mas(velten等人，emboj.3：2723-2730(1984))；als啟動子(美國專利5,659,026)等。其他組成型啟動子包括例如在美國專利5,608,149、5,608,144、5,604,121、5,569,597、5,466,785、5,399,680、5,268,463、5,608,142和6,177,611中公開的那些啟動子。在選擇啟動子用於本發明方法時，可能有利的是使用組織特異性啟動子或發育調節啟動子。組織特異性啟動子或發育調節啟動子是這樣的dna序列，其調節dna序列選擇性地在對雄穗發育、結籽或兩者重要的植物細胞/組織中表達，並限制這種dna序列只在植物的雄穗發育或種子成熟期間表達。任何引起所需時空表達的可鑑定啟動子均可用於本發明的方法中。種子或胚特異性的並且可用於本發明的啟動子包括大豆kunitz胰蛋白酶抑制劑(kti3，jofuku和goldberg，plantcell1：1079-1093(1989))、patatin(馬鈴薯塊莖)(rocha-sosa，m.等人，1989，emboj.8：23-29)、convicilin、豌豆球蛋白和豆球蛋白(豌豆子葉)rerie，w.g.等人，1991，mol.gen.genet.259：149-157；newbigin，e.j.等人，1990，planta180：461-470；higgins，t.j.v.等人，1988，plant.mol.biol.11：683-695)、玉米蛋白(玉米胚乳)(schemthaner，j.p.等人，1988，emboj.7：1249-1255)、菜豆蛋白(菜豆子葉)(segupta-gopalan，c.等人，1985，proc.natl.acad.sci.u.s.a.82：3320-3324)、植物血球凝集素(菜豆子葉)(voelker，t.等人，1987，emboj.6：3571-3577)、b-伴球蛋白和大豆球蛋白(大豆子葉)(chen，z-l等人，1988，emboj.7：297-302)、谷蛋白(稻胚乳)、大麥醇溶蛋白(大麥胚乳)(marris，c.等人，1988，plantmol.biol.10：359-366)、麥谷蛋白和麥醇溶蛋白(小麥胚乳)(colot，v.等人，1987，emboj.6：3559-3564)和甘薯貯藏蛋白(sporamin)(甘薯塊根)(hattori，t.等人，1990，plantmol.biol.14：595-604)。可操作地連接至嵌合基因構建體異源編碼區的種子特異性基因的啟動子在轉基因植物中保持它們的時空表達模式。這樣的實施例包括在擬南芥和甘藍型油菜(brassicanapus)種子中表達腦啡肽的擬南芥屬2s種子儲藏蛋白基因啟動子(vanderkerckhove等人，bio/technology7：l929-932(1989))、表達螢光素酶的菜豆凝集素和β-菜豆蛋白啟動子(riggs等人，plantsci.63：47-57(1989))，以及表達氯黴素乙醯轉移酶的小麥谷蛋白啟動子(colot等人，emboj6：3559-3564(1987))。可誘導啟動子響應內源性或外源性刺激的存在，例如，通過化合物(化學誘導劑)，或響應環境、激素、化學信號和/或發育信號而選擇性表達可操縱連接的dna序列。可誘導的或受調控的啟動子包括(例如)受光、熱、脅迫、水澇或乾旱、植物激素、創傷或諸如乙醇、茉莉酮酸酯、水楊酸或安全劑之類的化學品調控的啟動子。用於本發明的啟動子包括以下啟動子：1)脅迫誘導型rd29a啟動子(kasuga等人，1999，naturebiotechnol.17：287-91)；2)大麥啟動子b22e；b22e的表達是發育中的玉米籽粒中的柄所特異性的(「primarystructureofanovelbarleygenedifferentiallyexpressedinimmaturealeuronelayers(在未成熟糊粉層中差異表達的新大麥基因的一級結構)」。klemsdal，s.s.等人，mol.gen.genet.228(1/2)：9-16(1991))；和3)玉米啟動子，zag2(「identificationandmolecularcharacterizationofzag1，themaizehomologofthearabidopsisfloralhomeoticgeneagamous」，schmidt，r.j.等人，plantcell5(7)：729-737(1993)；「structuralcharacterization，chromosomallocalizationandphylogeneticevaluationoftwopairsofagamous-likemads-boxgenesfrommaize」，theissen等人，gene156(2)：155-166(1995)；ncbigenbank登錄號x80206))。zag2轉錄物可在授粉前5天至授粉後(dap)7至8天被檢測到，並且引導ciml在發育中的雌花序的心皮中表達，ciml對發育中的玉米籽粒的籽仁而言是特異性的。ciml轉錄物在授粉前4至5天至授粉後6至8天被檢測到。其他可用的啟動子包括可源自其表達與發育中的雌小花母系相關的基因的任何啟動子。對於在發育種子組織中表達的多聚核苷酸，特殊的啟動子包括種子優選的啟動子，尤其是早期籽粒/胚胎啟動子和晚期籽粒/胚乳啟動子，授粉後籽粒的發育大致可以分為三個基本階段，籽粒生長的停滯期起始於授粉後0天到10-12天，在此期間，籽粒不再明顯的生長，但是決定籽粒活力的重要事件將在此期間發生(如細胞建成數目)。線性籽粒灌漿期起始於授粉後的10-12天並延續到授粉後的40天左右。在籽粒發育期間，籽粒達到最終的質量，並產生多種儲藏物質如澱粉、蛋白質和油等；最終的成熟期起始於授粉後大約40天到收穫，籽粒發育的這一過程中，籽粒開始休眠，變幹。本發明中的「早期籽粒/胚乳啟動子」指主要在種子發育的停滯期(也就是授粉第0天到授粉後第12天期間)驅動基因表達的啟動子；「後期籽粒/胚乳啟動子」主要驅動基因在授粉後12天到成熟過程中的種子中表達；表達窗口可能會有一些重疊，將根據使用的aba偶聯的序列和期望的表型選擇啟動子。早期籽粒/胚胎啟動子包括，cim1，授粉後第5天活躍在特定組織中(wo00/11177)；其它的早期籽粒/胚胎啟動子包括種子偏愛啟動子end1，在授粉後7-10天表達，和end2，授粉後9-14天在整個籽粒中表達，在授粉後10天在胚乳和果皮中表達(wo00/12733)。本發明中的特定方法使用的其它早期籽粒/胚乳啟動子包括種子偏愛啟動子ltp2(美國專利號5,525,716)；玉米zm40啟動子(美國專利號6,403,862)；玉米nuc1c(美國專利號6,407,315)；玉米ckx1-2啟動子(美國專利號6,921,815和美國專利申請公開號2006/0037103)；玉米lec1啟動子(美國專利號7,122,658)；玉米esr啟動子(美國專利號7,276,596)；玉米zap啟動子(美國專利申請公開號20040025206和20070136891)；玉米啟動子eep1(美國專利申請公開號20070169226)；和玉米啟動子adf4(美國專利申請號60/963,878，2007年8月7日申請)。本發明中調控核酸序列在植物中表達的其它啟動子是莖特異啟動子，包括苜蓿s2a啟動子(genbank登錄號ef030816；abrahams等(1995)plantmol.biol.27：513-528)和s2b啟動子(genbank登錄號ef030817)和類似的啟動子。啟動子可以整個源於天然基因，或者由源於不同的天然存在的啟動子的不同元件組成，或者甚至包括合成的dna片段。用於本發明的啟動子包括：rip2、mlip15、zmcor1、rab17、camv35s、rd29a、b22e、zag2、sam合成酶、泛素、camv19s、nos、adh、蔗糖合成酶、r-等位基因、維管組織優選啟動子s2a(genbank登錄號ef030816)和s2b(genbank登錄號ef030817)及來自玉米的組成型啟動子gos2。其他啟動子包括根優選的啟動子，例如玉米nas2啟動子、玉米cyclo啟動子(us2006/0156439，公開於2006年7月13日)、玉米rootmet2啟動子(wo05063998，公開於2005年7月14日)、crlbio啟動子(wo06055487，公開於2006年5月26日)、crwaq81(wo05035770，公開於2005年4月21日)和玉米zrp2.47啟動子(ncbi登錄號：u38790；gino.1063664)。本發明的重組dna構建體也可包括其他調控序列，包括但不限於翻譯前導序列、內含子和多腺苷酸化識別序列。在本發明的另一個實施方案中，本發明的重組dna構建體還包括增強子或沉默子。內含子序列可加至5』非翻譯區、蛋白編碼區或3』非翻譯區以增加積聚在胞漿中的成熟信息的量。已經顯示，在植物和動物兩者的表達構建體的轉錄單位中包含可剪接內含子可使基因表達在mrna和蛋白質水平上均增強高達1000倍。參見buchman和berg，mol.cellbiol.8：4395-4405(1988)；callis等人，genesdev.1：1183-1200(1987)。增強子或增強子元件指的是一個順式作用的轉錄調控元件，即順式元件，它可調控多核苷酸序列整體表達模式的一個方面，但通常不足以單獨驅動轉錄可操作連接的多核苷酸序列。分離的增強子元件可以與一個啟動子融合形成一個嵌合的啟動子順式元件，從而調節基因表達。本領域的技術人員均知道增強子，增強子包括sv40增強子區域、camv35s增強子元件等。一些增強子也可以改變普通調控元件的表達模式，例如，當沒有增強子時，導致調控元件組成型表達，當存在增強子時，同一調控元件在某一特定組織或某些特定組織表達。camv35s啟動子重複上遊區域顯示出大約增強10倍的表達量(kay,r.etal.,(1987)science236：1299-1302)。本發明中使用的增強子包括camv35s(benfey,etal.,(1990)emboj.9：1685-96)、4xb3p-camv.35增強子區域—四拷貝串聯b3區域(208到155)(美國專利號5,097,025)、4xas-1p—camv35s增強子區域-四拷貝串聯激活序列(83到62)(美國專利號5,097,025)、2xb1-b2p-camv35s增強子區域—二拷貝串聯b1-b2區域(148到90)(美國專利號5,097,025)、2xa1-b3p-camv35s增強子區域—二拷貝串聯a1-b3區域(208到46)(美國專利號5,097,025)、2xb1-b5p-camv35s增強子區域—二拷貝b1-b5區域(343到90)(美國專利號5,097,025)、歐米伽增強子或歐米伽基本增強子(gallie等(1989)molecularbiologyofrnaed.cech(liss,newyork)237-256和gallie等(1987)gene60:217-25)、美國專利號7,803,992的增強子和甘蔗棒狀病毒(scbv)增強子元件(wo2013130813)。任何植物都可以選擇用來鑑定將用於本發明重組dna構建體的調控序列和基因。適用於分離基因和調控序列的靶植物的實例應該包括但不限於苜蓿、蘋果、杏、擬南芥、洋薊、芝麻菜、蘆筍、鱷梨、香蕉、大麥、豆類、甜菜、黑莓、藍莓、西蘭花、抱子甘藍、捲心菜、加拿大油菜、香瓜、胡蘿蔔、木薯、蓖麻子、菜花、芹菜、櫻桃、菊苣、芫荽、柑桔、克萊門氏小柑橘、三葉草、椰子、咖啡、玉米、棉、蔓越莓、黃瓜、花旗松、茄子、菊苣、茅菜、桉樹、茴香、無花果、大蒜、葫蘆、葡萄、柚子樹、白蘭瓜、豆薯、獼猴桃、生菜、韭蔥、檸檬、酸橙、火炬松、亞麻子、芒果、甜瓜、蘑菇、油桃、堅果、燕麥、油棕、油菜、秋葵、橄欖樹、洋蔥、橙、觀賞植物、棕櫚、木瓜樹、歐芹、歐洲防風草、豌豆、桃樹、花生、梨樹、胡椒、柿樹、松樹、菠蘿、車前草、李樹、石榴樹、白楊、馬鈴薯、南瓜、溫柏、輻射松、紅菊苣、蘿蔔、油菜、樹莓、稻、黑麥、高粱、南方松、大豆、菠菜、南瓜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甘薯、楓香樹、柑橘、茶、菸草、蕃茄、黑小麥、草皮草、蕪菁、葡萄樹、西瓜、小麥、薯蕷和西葫蘆。組合物：本發明的組合物是其基因組中包含本發明的任何重組dna構建體(例如上面所討論的任何一種構建體)的植物。組合物也包括任何植物的子代，以及獲取自植物或其子代的任何種子，其中所述子代或種子在其基因組中包含重組dna構建體。子代包括通過植物的自花授粉或異型雜交而獲得的連續世代。子代也包括雜交種和自交系。在雜交種子繁殖的農作物中，成熟的轉基因植物可自花授粉而產生純合的自交系植物。該自交系植物產生含有新導入的重組dna構建體的種子。這些種子可生長而產生將會表現出改變的農學特性的植物，或者可用於育種程序以產生雜交種子，這些雜交種子可生長而產生將會表現出如改變的農學特性的植物。所述種子可為玉米種子或水稻種子。植物可為單子葉植物或雙子葉植物，例如玉米或大豆植物，如玉米雜種植物或玉米自交系植物。植物還可為向日葵、高梁、油菜、小麥、苜蓿、棉花、水稻、大麥或黍。重組dna構建體可穩定地整合進植物的基因組中。實施方案包括但不限於以下實施方案：1.在基因組中包含重組dna構建體的植物(例如水稻、玉米或大豆植物)，所述重組dna構建體包含可操作地連接至少一種異源調控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽的胺基酸序列在與seqidno：6或14進行比較時具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性並且其中所述植物在與不包含所述重組dna構建體的對照植物進行比較時表現出增加的耐蟲害性。2.實施方案1的轉基因植物，其中多聚核苷酸編碼crk6或mfs5多肽，所述crk6或mfs5多肽可來自水稻(oryzasativa)、野生稻(oryzaaustraliensis)、短舌野生稻(oryzabarthii)、非洲型稻(oryzaglaberrima)、闊葉稻(oryzalatifolia)、長雄野生稻(oryzalongistaminata)、南方野生稻(oryzameridionalis)、藥用野生稻(oryzaofficinalis)、斑點野生稻(oryzapunctata)、普通野生稻(oryzarufipogon)(紅稻)、印度野生稻(oryzanivara)、擬南芥(arabidopsisthaliana)、鷹嘴豆(cicerarietinum)、馬鈴薯(solanumtuberosum)、甘藍(brassicaoleracea)、玉米(zeamays)、大豆(glycinemax)、煙豆(glycinetabacina)、野大豆(glycinesoja)和短絨野大豆(glycinetomentella)。3.實施方案1或2中任意轉基因植物，其中轉基因植物進一步包括至少一種編碼殺蟲多肽的多核苷酸。4.實施方案1或2中任意轉基因植物，其中轉基因植物進一步包括至少一種編碼關注的多肽的重組多核苷酸5.實施方案1-4中所述任意植物的子代，實施方案1-4中所述任意植物的種子，實施方案1-4中所述任意植物子代的種子，和來源於實施方案1-4中任意植物和所述植物子代的細胞。前述實施方案1-5中的任意一項或本發明公開的其他實施方案中，重組dna構建體還包括至少一個異源的在植物中有功能的啟動子作為調控序列。此處所用「殺蟲蛋白」指一種對一種或多種害蟲有毒害作用的多肽或其同源蛋白，所述害蟲包括但不限於，鱗翅目、雙翅目、半翅目和鞘翅目成員或線蟲動物門。殺蟲蛋白分離自有機體包括，例如，芽孢桿菌屬(bacillussp.)、假單胞菌屬(pseudomonassp.)、發光桿菌屬(photorhabdussp.)、致病桿菌屬(xenorhabdussp.)雙酶桿菌屬(clostridiumbifermentans)和日本金龜子芽孢桿菌屬(paenibacilluspopilliae)。殺蟲蛋白包括但不限於來源於假單胞菌屬(pseudomonassp.)的殺蟲蛋白，如pseen3174(monalysin；(2011)plospathogens7：1-13)、源於假單胞菌屬(pseudomonasprotegens)的菌株cha0和pf-5(previouslyfluorescens)的殺蟲蛋白(pechy-tarr，(2008)environmentalmicrobiology10：2368-2386；genbank登錄號eu400157)、源於黃山假單胞菌(pseudomonastaiwanensis)的殺蟲蛋白(liu等(2010)j.agric.foodchem.,58：12343-12349)和源於假單胞產鹼菌屬(pseudomonaspseudoalcligenes)的殺蟲蛋白(zhang等(2009)annalsofmicrobiology59：45-50andli等(2007)plantcelltiss.organcult.89：159-168)；來源於發光桿菌屬(photorhabdussp.)和致病桿菌(xenorhabdussp.)的殺蟲蛋白(hinchliffe等(2010)theopentoxicologyjournal,3：101-118andmorgan,等(2001)appliedandenvir.micro.67：2062-2069)；美國專利號6,048,838和美國專利號6,379,946，美國公開號us2014008054的pip-1多肽，美國系列號13/800233的afip-1a和/或afip-1b多肽，美國系列號13/839702的phi-4多肽和δ-內毒素。所述δ-內毒素包括但不限於，δ-內毒素基因的cry1、cry2、cry3、cry4、cry5、cry6、cry7、cry8、cry9、cry10、cry11、cry12、cry13、cry14、cry15、cry16、cry17、cry18、cry19、cry20、cry21、cry22、cry23、cry24、cry25、cry26、cry27、cry28、cry29、cry30、cry31、cry32、cry33、cry34、cry35、cry36、cry37、cry38、cry39、cry40、cry41、cry42、cry43、cry44、cry45、cry46、cry47、cry49、cry51、cry55、cry56、cry57、cry58、cry59、cry60、cry61、cry62、cry63、cry64、cry65、cry66、cry67、cry68、cry69、cry70、cry71和cry72類，和蘇雲金芽孢桿菌(b.thuringiensis)細胞溶解的cyt1和cyt2基因。蘇雲金芽孢桿菌殺蟲蛋白的成員包括，但不限於cry1aa1(登錄號aaa22353)、cry1aa2(登錄號aaa22552)、cry1aa3(登錄號baa00257)、cry1aa4(登錄號caa31886)、cry1aa5(登錄號baa04468)、cry1aa6(登錄號aaa86265)、cry1aa7(登錄號aad46139)、cry1aa8(登錄號i26149)、cry1aa9(登錄號baa77213)、cry1aa10(登錄號aad55382)、cry1aa11(登錄號caa70856)、cry1aa12(登錄號aap80146)、cry1aa13(登錄號aam44305)、cry1aa14(登錄號aap40639)、cry1aa15(登錄號aay66993)、cry1aa16(登錄號hq439776)、cry1aa17(登錄號hq439788)、cry1aa18(登錄號hq439790)、cry1aa19(登錄號hq685121)、cry1aa20(登錄號jf340156)、cry1aa21(登錄號jn651496)、cry1aa22(登錄號kc158223)、cry1ab1(登錄號aaa22330)、cry1ab2(登錄號aaa22613)、cry1ab3(登錄號aaa22561)、cry1ab4(登錄號baa00071)、cry1ab5(登錄號caa28405)、cry1ab6(登錄號aaa22420)、cry1ab7(登錄號caa31620)、cry1ab8(登錄號aaa22551)、cry1ab9(登錄號caa38701)、cry1ab10(登錄號a29125)、cry1ab11(登錄號i12419)、cry1ab12(登錄號aac64003)、cry1ab13(登錄號aan76494)、cry1ab14(登錄號aag16877)、cry1ab15(登錄號aao13302)、cry1ab16(登錄號aak55546)、cry1ab17(登錄號aat46415)、cry1ab18(登錄號aaq88259)、cry1ab19(登錄號aaw31761)、cry1ab20(登錄號abb72460)、cry1ab21(登錄號abs18384)、cry1ab22(登錄號abw87320)、cry1ab23(登錄號hq439777)、cry1ab24(登錄號hq439778)、cry1ab25(登錄號hq685122)、cry1ab26(登錄號hq847729)、cry1ab27(登錄號jn135249)、cry1ab28(登錄號jn135250)、cry1ab29(登錄號jn135251)、cry1ab30(登錄號jn135252)、cry1ab31(登錄號jn135253)、cry1ab32(登錄號jn135254)、cry1ab33(登錄號aas93798)、cry1ab34(登錄號kc156668)、cry1ab-like(登錄號aak14336)、cry1ab-like(登錄號aak14337)、cry1ab-like(登錄號aak14338)、cry1ab-like(登錄號abg88858)、cry1ac1(登錄號aaa22331)、cry1ac2(登錄號aaa22338)、cry1ac3(登錄號caa38098)、cry1ac4(登錄號aaa73077)、cry1ac5(登錄號aaa22339)、cry1ac6(登錄號aaa8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8；美國專利號8,236,757中axmi-027、axmi-036和axmi-038；美國專利號7,923,602中axmi-031、axmi-039、axmi-040、axmi-049；wo2006/083891中axmi-018、axmi-020和axmi-021；wo2005/038032中axmi-010；wo2005/021585中axmi-003；美國專利申請公開號2004/0250311中axmi-008；美國專利申請公開號2004/0216186中axmi-006；美國專利申請公開號2004/0210965中axmi-007；美國專利申請號2004/0210964中axmi-009；美國專利申請公開號2004/0197917中axmi-014；美國專利申請公開號2004/0197916中axmi-004；wo2006/119457中axmi-028和axmi-029；wo2004/074462中axmi-007、axmi-008、axmi-0080rf2、axmi-009、axmi-014和axmi-004；us專利號8,084,416中axmi-150；美國專利申請公開號2011/0023184中axmi-205；美國專利申請公開號2011/0263488中axmi-011、axmi-012、axmi-013、axmi-015、axmi-019、axmi-044、axmi-037、axmi-043、axmi-033、axmi-034、axmi-022、axmi-023、axmi-041、axmi-063和axmi-064；美國專利申請公開號2010/0197592中axmi-r1和相關蛋白；wo2011/103248中axmi221z、axmi222z、axmi223z、axmi224z和axmi225z；wo2011/103247中axmi218、axmi219、axmi220、axmi226、axmi227、axmi228、axmi229、axmi230和axmi231；美國專利號8,334,431中axmi-115、axmi-113、axmi-005、axmi-163和axmi-184；美國專利申請公開號2010/0298211中axmi-001、axmi-002、axmi-030、axmi-035和axmi-045；美國專利申請公開號2009/0144852中axmi-066和axmi-076；美國專利號8,318,900中axmi128、axmi130、axmi131、axmi133、axmi140、axmi141、axmi142、axmi143、axmi144、axmi146、axmi148、axmi149、axmi152、axmi153、axmi154、axmi155、axmi156、axmi157、axmi158、axmi162、axmi165、axmi166、axmi167、axmi168、axmi169、axmi170、axmi171、axmi172、axmi173、axmi174、axmi175、axmi176、axmi177、axmi178、axmi179、axmi180、axmi181、axmi182、axmi185、axmi186、axmi187、axmi188、axmi189；美國專利申請公開號2010/0005543中axmi079、axmi080、axmi081、axmi082、axmi091、axmi092、axmi096、axmi097、axmi098、axmi099、axmi100、axmi101、axmi102、axmi103、axmi104、axmi107、axmi108、axmi109、axmi110、axmi111、axmi112、axmi114、axmi116、axmi117、axmi118、axmi119、axmi120、axmi121、axmi122、axmi123、axmi124、axmi1257、axmi1268、axmi127、axmi129、axmi164、axmi151、axmi161、axmi183、axmi132、axmi138、axmi137；美國專利申請公開號201400962281中axmi232、axmi233和axmi249；美國專利號8,319,019中cry蛋白例如具有修飾蛋白水解位點的cry1a和cry3a；美國專利申請公開號2011/0064710中源於蘇雲金芽孢桿菌(bacillusthuringiensis)菌株vbts2528的cry1ac、cry2aa和cry1ca毒素蛋白。本領域技術人員熟知的其他cry蛋白(見crickmore等「蘇雲金芽孢桿菌(bacillusthuringiensis)毒素系統命名法」(2011),atwww.lifesci.sussex.ac.uk/home/neil_crickmore/bt/)。本領域技術人員熟知cry蛋白的殺蟲活性(詳見綜述，vanfrannkenhuyzen,(2009)j.invert.path.101:1-16)。本領域技術人員熟知cry蛋白作為轉基因植物性狀，cry-轉基因植物已經得到調控許可，這些轉基因植物包括但不限於表達cry1ac、cry1ac+cry2ab、cry1ab、cry1a.105、cry1f、cry1fa2、cry1f+cry1ac、cry2ab、cry3a、mcry3a、cry3bb1、cry34ab1、cry35ab1、vip3a、cry9c和cbi-bt的植物(詳見sanahuja,(2011)plantbiotechjournal9:283-300和轉基因作物資料庫中心的環境風險評估gmcropdatabasecenterforenvironmentalriskassessment(2010)(cera),ilsi研究基金會,華盛頓特區www.cera-gmc.org/index.php？action＝gm_crop_database)。本領域技術人員熟知的在植物中表達的殺蟲蛋白包括，例如vip3ab&cry1fa(us2012/0317682)，cry1be&cry1f(us2012/0311746)，cry1ca&cry1ab(us2012/0311745)，cry1&cryca(us2012/0317681)，cry1da&cry1be(us2012/0331590)，cry1da&cry1fa(us2012/0331589)，cry1ab&cry1be(us2012/0324606)，cry1fa&cry2aa和cry1i&cry1e(us2012/0324605)，cry34ab/35ab和cry6aa(us20130167269)，cry34ab/vcry35ab&cry3aa(us20130167268)，和cry3a和cry1ab或vip3aa(us20130116170)。殺蟲蛋白也包括殺蟲脂肪酶，其包括美國專利號7,491,869的脂醯基水解酶,和諸如源於鏈黴菌的膽固醇氧化酶(purcell等(1993)biochembiophysrescommun15：1406-1413)。殺蟲蛋白也包括美國專利號5,877,012、6,107,279、6,137,033、7,244,820、7,615,686、8,237,020等的vip(vegetativeinsecticidalprotein，植物殺蟲蛋白)毒素。本領域技術人員熟知的其他vip蛋白見lifesci.sussex.ac.uk/home/neil_crickmore/bt/vip.html。殺蟲蛋白也包括源於嗜線蟲致病桿菌屬(xenorhabdus)、初生型發光桿菌屬(photorhabdus)和類芽孢桿菌(paenibacillus)的毒素複合物(toxincomplex(tc))(見美國專利號7,491,698和8,084,418)。一些tc蛋白具有「獨立」的殺昆蟲活性，其他tc蛋白增強了同一給定有機體產生的獨立tc蛋白的活性，「獨立」tc蛋白的活性(例如，源於發光桿菌、致病桿菌或芽孢桿菌)能夠被一種或多種來源不同種屬有機體tc蛋白「增強劑」所增強。主要有三種類型tc蛋白，此處所指的是類型a蛋白(「蛋白質a」)是單體毒素。類型b蛋白(「蛋白質b」)和類型c蛋白(「蛋白質c」)增強類型a蛋白的毒性。類型a蛋白的例子有tcba、tcda、xpta1和xpta2，類型b蛋白的例子有tcac、tcdb、xptb1xb和xptc1wi，類型c蛋白的例子有tccc、xptc1xb和xptb1wi。殺蟲蛋白也包括蜘蛛、蛇和蠍毒蛋白。蜘蛛毒肽的例子包括但不限於lycotoxin-1肽及其突變體(美國專利號8,334,366)。下面的例子描述了一些代表性的方法和技術用於模擬植物昆蟲飼餵條件和/或評估植物在該條件下的抗性狀況。1.轉化的植物的子代，該轉化的植物對於重組dna構建體來說是半合子的，該子代分離成包含或不包含該dna構建體的植株：包含該重組dna構建體的子代將通常相對於不包含該重組dna構建體的子代來進行測量(即，不包含該重組dna構建體的子代是對照或參照植物)。2.重組dna構建體基因滲入至近交系中，例如在玉米中，或基因滲入進變種中，例如在大豆中：基因滲入品系將通常相對於親本近交系或變種品系進行測量(即，親本近交系或品種品系是對照或參照植物)。3.雙雜交系，其中第一雜交系由兩個親本近交系產生，而第二雜交系由相同的兩個親本近交系產生，不同的是其中一個親本近交系含有重組dna構建體：第二雜交系通常將相對於第一雜交系進行測量(即第一雜交係為對照植物或參照植物)。4.包含重組dna構建體的植物：該植株可以相對於這樣的對照植物進行評價或測量，該對照植物不包含重組dna構建體，但具有與該植株相當的遺傳背景(例如，與包含重組dna構建體的植株相比較，該遺傳物質具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性)。存在許多可用於分析、比較和表徵植物遺傳背景的實驗室的技術；其中這些技術是同工酶電泳、限制性片段長度多態性(rflps)、隨機擴增多態性dna(rapds)、任何引物聚合成酶鏈式反應(ap-pcr)、dna擴增指紋(daf)、序列特異擴增區域(scars)、擴增片段長度多態性和也稱為微衛星的簡單序列重複(ssrs)。此外，本領域的普通技術人員將容易認識到，評價或測量轉基因植物的農學特性或表型時合適的對照或參照植物將不包括先前已經針對所需的農學特性或表型，通過誘變或轉化而選擇的植物。「害蟲」包括但不限於昆蟲、真菌、細菌、線蟲類、蟎、蝨等。昆蟲害蟲包括選自以下各目的昆蟲：鞘翅目、雙翅目、膜翅目、鱗翅目、禽蝨、同翅目、半翅目、直翅目、纓尾目、革翅目、等翅目、蝨目、蚤目、毛翅目等，特別是鱗翅目和鞘翅目。本領域技術人員認識到，並非所有的化合物都能有效的對付所有害蟲，本實施例的化合物能夠對付昆蟲害蟲，這些害蟲包括經濟重要的農業、林業、溫室、苗圃花卉、食品和纖維、公眾和動物健康、家庭和商業結構、家庭和倉儲害蟲。鱗翅目的幼蟲包括但不限於夜蛾科(noctuidae)的粘蟲、切根蟲、尺蠖和heliothine：秋粘蟲(spodopterafrugiperdajesmith，fallarmyworm)；甜菜夜蛾(s.exiguahübner，beetarmyworm)；斜紋夜蛾(s.liturafabhcius，tobaccocutworm，clustercaterpillar)；蓓帶夜蛾(mamestraconfiguratawalker，berthaarmyworm)；甘藍夜蛾(m.brassicaelinnaeus，cabbagemoth)；黑切根蟲(agrotisipsilonhufnagel，blackcutworm)；西部切根蟲(a.orthogoniamorrison，westerncutworm)；顆粒夜蛾(a.subterraneafabricius，granulatecutworm)，木棉蟲(alabamaargillaceahübner，cottonleafworm)；粉紋夜蛾(trichoplusianihübner，cabbagelooper)；大豆夜蛾(pseudoplusiaincludenswalker，soybeanlooper)；黧豆夜蛾(anticarsiagemmatalishübner，velvetbeancaterpillar)；苜蓿綠夜蛾(hypenascabrafabricius，greencloverworm)；煙芽夜蛾(heliothisvirescensfabricius，tobaccobudworm)；一星粘蟲(pseudaletiaunipunctahaworth,armyworm)；粗皮夜蛾(athetismindarabarnesandmcdunnough，roughskinnedcutworm)；暗緣地老虎(euxoamessoriaharris，darksidedcutworm)；埃及金鋼鑽(eariasinsulanaboisduval，spinybollworm)；翠紋金鋼鑽(e.vittellafabricius，spottedbollworm)；美洲棉鈴蟲(helicoverpaarmigerahübner，americanbollworm)；谷實夜蛾(h.zeaboddie，cornearworm或cottonbollworm)；紋蝶毛蟲(melanchrapictaharris，zebracaterpillar)；柑橘夜蛾(egira(xylomyges)curialisgrote，citruscutworm)；mythimnaseparate(orientalarmyworm)；草螟科(crambidae)的鑽蛀蟲、鞘蛾幼蟲、結網毛蟲、球果蛾以及草蛾：亞洲玉米螟(ostriniafurnacalis，asiancornborer)；歐洲玉米螟(ostrinianubilalis，europeancornborer)和；螟蛾科(pyralidae)歐洲玉米螟(ostrinianubilalishübner，europeancornborer)的食葉蟲(skeletonizers)；臍橙螟(amyeloistransitellawalker，navalorangeworm)；地中海粉斑螟(anagastakuehniellazeller，mediterraneanflourmoth)；乾果斑螟(cadracautellawalker，almondmoth)；二化螟(chilosuppressaliswalker，ricestemborer)；斑禾草螟(c.partellus，sorghumborer)；米蛾(corcyracephalonicastainton，ricemoth)；玉米根結網毛蟲(crambuscaliginosellusclemens，cornrootwebworm)；藍草結網毛蟲(c.teterrelluszincken，bluegrasswebworm)；稻縱卷葉野螟(cnaphalocrocismedinalisguenee，riceleafroller)；葡萄卷葉蟲(desmiafuneralishübner，grapeleaffolder)；甜瓜野螟(diaphaniahyalinatalinnaeus，melonworm)；泡菜蟲(d.nitidalisstoll，pickleworm)；西南玉米螟(diatraeagrandioselladyar，southwesterncornborer)；小蔗螟(d.saccharalisfabricius，surgarcaneborer)；墨西哥水稻螟(eoreumaloftinidyar，mexicanriceborer)；菸草粉螟(ephestiaelutellahübner，tobacco(cacao)moth)；蠟螟(galleriamellonellalinnaeus，greaterwaxmoth)；野螟(herpetogrammalicarsisaliswalker，sodwebworm)；向日葵斑螟(homoeosomaelectellumhulst，sunflowermoth)；南美玉米苗斑螟(elasmopalpuslignoselluszeller，lessercornstalkborer)；小蠟螟(achroiagrisellafabricius，lesserwaxmoth)；草地螟(loxostegesticticalislinnaeus，beetwebworm)；茶樹螟(orthagathyrisaliswalker，teatreewebmoth)；豆野螟(marucatestulalisgeyer，beanpodborer)；印度谷螟(plodiainterpunctellahübner，indianmealmoth)；三化螟(scirpophagaincertulaswalker，yellowstemborer)；溫室螟(udearubigalisguenee，celeryleaftier)；以及卷蛾科(tortricidae)的卷葉蟲、蚜蟲、種實蟲以及果實蟲：黑頭捲葉蛾(aclerisgloveranawalsingham，westernblackheadedbudworm)；黑頭長翅卷蛾(a.varianafernald，easternblackheadedbudworm)；果樹黃卷蛾(archipsargyrospilawalker，fruittreeleafroller)；歐洲捲葉蛾(a.rosanalinnaeus，europeanleafroller)；以及其他的黃卷蛾屬(archips)物種：棉褐帶卷蛾(adoxophyesoranafischervonsummerfruittortrixmoth)；條紋向日葵螟(cochylishospeswalsingham，bandedsunflowermoth)；榛小卷蛾(cydialatiferreanawalsingham，filbertworm)；蘋果蠹蛾(c.pomonellalinnaeus，codingmoth)；雜色捲葉蛾(platynotaflavedanaclemens，variegatedleafroller)；荷蘭石竹小卷蛾(p.stultanawalsingham，omnivorousleafroller)；歐洲葡萄小捲葉蛾(lobesiabotranadenis&schiffermüller，europeangrapevinemoth)；蘋白小卷蛾(spilonotaocellanadenis&schiffermüller，eyespottedbudmoth)；萄果實蛀蟲(endopizaviteanaclemens，grapeberrymoth)；女貞細卷蛾(eupoeciliaambiguellahübner，vinemoth)；巴西蘋果捲葉蛾(bonagotasalubricolameyrick，brazilianappleleafroller)；梨小食心蟲(grapholitamolestabusck，orientalfruitmoth)；向日葵芽蛾(suleimahelianthanariley，sunflowerbudmoth)；條卷蛾(argyrotaeniaspp.)；尾蛺蝶(choristoneuraspp.)。鱗翅目的所選其它農藝害蟲包括但不限於：秋星尺蠖(alsophilapometariaharris，fallcankerworm)；桃枝麥蛾(anarsialineatellazeller，peachtwigborer)；犀額蛾(anisotasenatoriaj.e.smith，orangestripedoakworm)；柞蠶(antheraeapernyiguerin-meneville，chineseoaktussahmoth)；家蠶(bombyxmorilinnaeus，silkworm)；棉潛蛾(bucculatrixthurberiellabusck，cottonleafperforator)；苜蓿黃蝶(coliaseurythemeboisduval，alfalfacaterpillar)；胡桃黃蝶(datanaintegerrimagrote&robinson，walnutcaterpillar)；落葉松毛蟲(dendrolimussibiricustschetwerikov，siberiansilkmoth)；白尺蠖(ennomossubsignariahübner，elmspanworm)；菩提尺蠖(erannistiliariaharris，lindenlooper)；黃毒蛾(euproctischrysorrhoealinnaeus，browntailmoth)；黑擬蛉蛾(harrisinaamericanaguerin-meneville，grapeleafskeletonizer)；範圍毛蟲飛蛾(hemileucaoliviaecockrell，rangecaterpillar)；美國白蛾(hyphantriacuneadrury，fallwebworm)；番茄蠹蛾(keiferialycopersicellawalsingham，tomatopinworm)；二尾蛺蝶(lambdinafiscellariafiscellariahulst，easternhemlocklooper)；西部鐵杉尺蠖(l.fiscellarialugubrosahulst，westernhemlocklooper)；柳毒蛾(leucomasalicislinnaeus，satinmoth)；舞毒蛾(lymantriadisparlinnaeus，gypsymoth)；番茄天蛾(manducaquinquemaculatahaworth，fivespottedhawkmoth，tomatohornworm)；菸草天蛾(m.sextahaworth，tomatohornworm，tobaccohornworm)；冬尺蠖(operophterabrumatalinnaeus，wintermoth)；春尺蠖(paleacritavernatapeck，springcankerworm)；大鳳蝶(papiliocresphontescramer，giantswallowtail，orangedog)；加州株蟲(phryganidiacalifornicapackard，californiaoakworm)；柑橘潛葉蛾(phyllocnistiscitrellastainton，citrusleafminer)；斑幕潛葉蛾(phyllonorycterblancardellafabricius，spottedtentiformleafminer)；大菜粉蝶(pierisbrassicaelinnaeus，largewhitebutterfly)；小菜粉蝶(p.rapaelinnaeus，smallwhitebutterfly)；暗脈菜粉蝶(p.napilinnaeus，greenveinedwhitebutterfly)；洋薊羽蛾(platyptiliacarduidactylariley，artichokeplumemoth)；菱斑餓(plutellaxylostellalinnaeus，diamondbackmoth)；棉紅鈴蟲(pectinophoragossypiellasaunders，pinkbollworm)；南方菜蛾(pontiaprotodiceboisduval&leconte，southerncabbageworm)；雜食尺蠖(sabulodesaegrotataguenee，omnivorouslooper)；康辛蠊(schizuraconcinnaj.e.smith，redhumpedcaterpillar)；麥蛾(sitotrogacerealellaolivier，angoumoisgrainmoth)；松異帶蛾(thaumetopoeapityocampaschiffermuller，pineprocessionarycaterpillar)；結網衣蛾(tineolabisselliellahummel，webbingclothesmoth)；番茄斑潛蠅(tutaabsolutameyrick，tomatoleafminer)；蘋果巢蛾(yponomeutapadellalinnaeus，erminemoth)；heliothissubflexaguenee；天幕毛蟲(malacosomaspp)；以及毒蛾(orgyiaspp)。鞘翅目的幼蟲和成蟲包括長角象鼻蟲科(anthribidae)、豆象科(bruchidae)以及象甲科(curculionidae)的象鼻蟲(包括但不限於：棉鈴象甲(anthonomusgrandisboheman，bollweevil)；稻水象甲(lissorhoptrusoryzophiluskuschel，ricewaterweevil)；谷象(sitophilusgranariuslinnaeus，granaryweevil)；米象(s.oryzaelinnaeus，riceweevil)；車軸草葉象蟲(hyperapunctatafabricius，cloverleafweevil)；向日葵莖象甲(cylindrocopturusadspersusleconte，sunflowerstemweevil)；紅色葵花籽象甲蟲(smicronyxfulvusleconte，redsunflowerseedweevil)；灰色葵花籽象甲蟲(s.sordidusleconte，graysunflowerseedweevil)；玉米象蟲(sphenophorusmaidischittenden，maizebillbug)；葉甲科(chrysomelidae)的跳騷甲蟲、黃瓜葉甲蟲、根蟲、葉甲蟲、馬鈴薯葉甲以及潛葉蟲(包括但不限於：科羅拉多州馬鈴薯甲蟲(leptinotarsadecemlineatasay，coloradopotatobeetle)；玉米根螢葉甲(diabroticavirgiferavirgiferaleconte，westerncornrootworm)；巴氏根葉甲(d.barberismith&lawrence，northerncornrootworm)；南方玉米根蟲(d.undecimpunctatahowardibarber，southerncornrootworm)；玉米跳甲(chaetocnemapulicariamelsheimer，cornfleabeetle)；十字花科蔬菜跳甲(phyllotretacruciferaegoeze，cruciferfleabeetle)；黃曲條跳甲(phyllotretastriolata，strippedfleabeetle)；葡萄肖葉甲(colaspisbrunneafabricius，grapecolaspis)；黑角負泥蟲(oulemamelanopuslinnaeus，cerealleafbeetle)；向日葵葉甲(zygogrammaexclamationisfabricius，sunflowerbeetle))；瓢蟲科(coccinellidae)的甲蟲(包括但不限於：墨西哥豆瓢蟲(epilachnavarivestismulsant，mexicanbeanbeetle)；蜣螂科(scarabaeidae)的金龜子和其他的甲蟲(包括但不限於：日本金龜子(popilliajaponicanewman，japanesebeetle)；北方圓頭犀金龜(cyclocephalaborealisarrow，northernmaskedchafer，whitegrub)；南方圓頭犀金龜(c.immaculataolivier，southernmaskedchafer，whitegrub)；歐洲金龜(rhizotrogusmajalisrazoumowsky，europeanchafer)；蠐螬(phyllophagacrinitaburmeister，whitegrub)；胡蘿蔔甲蟲(ligyrusgibbosusdegeer，carrotbeetle))；皮蠹科(dermestidae)的地毯圓皮蠹；叩甲科(elateridae)的線蟲：偽金針蟲(eleodesspp.)、梳抓叩頭蟲(melanotusspp.)、單葉叩甲(conoderusspp.)、金針蟲(limoniusspp.)、錐尾叩甲(agriotesspp.)、叩甲屬(cteniceraspp.)、aeolusspp.；小蠹科(scolytidae)的小蠹蟲以及擬步甲科(tenebrionidae)的甲蟲。雙翅目的成蟲和幼蟲包括：諸如玉米斑潛葉蠅(agromyzaparvicornisloew，cornblotchleafminer)的潛葉蠅；蚊(包括但不限於：高粱癭蚊(contariniasorghicolacoquillett，sorghummidge)；黑森癭蚊(mayetioladestructorsay，hessianfly)；麥紅吸漿蟲(sitodiplosismosellanagehin，wheatmidge)；葵花籽蚊(neolasiopteramurtfeldtianafelt，sunflowerseedmidge))；果蠅(實蠅科(tephritidae))，瑞典稈蠅(oscinellafritlinnaeus，fritflies)；蛆(包括但不限於：灰地種蠅(deliaplaturameigen，seedcornmaggot)；麥種蠅(d.coarctatafallen，wheatbulbfly)；以及其它地種蠅(deliaspp.)，美洲稈蠅(meromyzaamericanafitch，wheatstemmaggot)；舍蠅(muscadomesticalinnaeus，houseflies)；夏廁蠅(fanniacanicularislinnaeus)，小舍蠅(f.femoralisstein，lesserhouseflies)；廄螫蠅(stomoxyscalcitranslinnaeus，stableflies))；秋家蠅、角蠅、麗蠅、金蠅(chrysomyaspp.)；伏蠅(phormiaspp.)；以及其他的苔蘚蠅害蟲，馬蠅，虻(tabanusspp.)；胃蠅(gastrophilusspp.)；狂蠅(oestrusspp.)；牛蛆蠅(hypodermaspp.)；斑虻(chrysopsspp.)；綿羊蝨蠅(melophagusovinuslinnaeus，keds)；以及其他的短角亞目(brachycera)，蚊子，伊蚊(aedesspp.)；按蚊(anophelesspp.)；庫蚊(culexspp.)；黑蠅，原蚋(prosimuliumspp.)；蚋(simuliumspp.)；咬蠓、白蛉、尖眼蕈蚊和其他長角亞目(nematocera)。半翅目和同翅目的成蟲和若蟲包括昆蟲，諸如但不限於：球蚜科(adelgidae)的球蚜、盲蝽科(miridae)的盲蝽、蟬科(cicadidae)的蟬、葉蟬科(cicadellidae)的葉蟬、小綠葉蟬(empoascaspp.)；大葉禪科(cicadellidae)的大葉青禪，菱飛蝨科(cixiidae)、蛾蠟蟬科(flatidae)、蠟蟬總科(fulgoroidea)、圓飛蝨科(issidae)以及稻蝨科(delphacidae)的飛蝨；角蟬科(membracidae)的角蟬；木蝨科(psyllidae)的木蝨；粉蝨科(aleyrodidae)的粉蝨；蚜科(aphididae)的蚜蟲；根瘤蚜科(phylloxeridae)的根瘤蚜；粉蚧科(pseudococcidae)的粉蚧；鏈介殼蟲科(asterolecanidae)、軟介殼蟲科(coccidae)、洋紅蚧科(dactylopiidae)、盾介殼蟲科(diaspididae)、絨蚧科(eriococcidae)、旌介殼蟲科(ortheziidae)、刺葵介殼蟲科(phoenicococcidae)以及碩介殼蟲科(margarodidae)的介殼蟲；綱蝽科(tingidae)的網蝽；蝽科(pentatomidae)的九香蟲；長蝽科(lygaeidae)的麥長蝽，長椿(blissusspp.)；以及其他的蝽類(seedbugs)，沫蟬科(cercopidae)的沫蟬、緣蝽科(coreidae)的南瓜緣蝽、以及紅蝽科(pyrrhocoridae)的秋恙蟎和棉蝽。同翅目中農藝上重要的成員還包括但不限於：豌豆蚜(acyrthisiphonpisumharris，peaaphid)；豇豆蚜(aphiscraccivorakoch，cowpeaaphid)；黑豆蚜(a.fabaescopoli，blackbeanaphid)；棉蚜(a.gossypiiglover，cottonaphid，melonaphid)；玉米根蚜(a.maidiradicisforbes，cornrootaphid)；蘋果黃蚜(a.pomidegeer，appleaphid)；繡線菊蚜(a.spiraecolapatch，spireaaphid)；茄溝無網蚜(aulacorthumsolanikaltenbach，foxgloveaphid)；草莓釘蚜(chaetosiphonfragaefoliicockerell，strawberryaphid)；麥雙尾蚜(diuraphisnoxiakurdjumov/mordvilko，russianwheataphid)；玫瑰蘋果蚜(dysaphisplantagineapaaserini，rosyappleaphid)；蘋果綿蚜(eriosomalanigerumhausmann，woollyappleaphid)；甘藍蚜(brevicorynebrassicaelinnaeus，cabbageaphid)；桃粉大尾蚜(hyalopterusprunigeoffroy，mealyplumaphid)；蘿蔔蚜(lipaphiserysimikaltenbach，turnipaphid)；麥無網長管蚜(metopolophiumdirrhodumwalker，cerealaphid)；大戟長管蚜(macrosiphumeuphorbiaethomas，potatoaphid)；煙桃蚜(myzuspersicaesulzer，peach-potatoaphid，greenpeachaphid)；萵苣蚜(nasonoviaribisnigrimosley，lettuceaphid)；癭綿蚜(pemphigusspp.，rootaphids和gallaphids)；玉米蚜(rhopalosiphummaidisfitch，cornleafaphid)；禾穀縊管蚜(r.padilinnaeus，birdcherry-oataphid)；麥二叉蚜(schizaphisgraminumrondani，greenbug)；黃色甘蔗蚜(siphaflavaforbes，yellowsugarcaneaphid)；麥長管蚜(sitobionavenaefabricius，englishgrainaphid)；苜蓿斑蚜(therioaphismaculatabuckton,spottedalfalfaaphid)；黑色柑橘蚜(toxopteraaurantiiboyerdefonscolombe,blackcitrusaphid)以及褐色桔蚜(t.citricidakirkaldy,browncitrusaphid)；球蚜(adelgesspp.,adelgids)；長山核桃根瘤蚜(phylloxeradevastatrixpergande,pecanphylloxera)；甘薯粉蝨(bemisiatabacigennadius,tobaccowhitefly,sweetpotatowhitefly)；銀葉粉蝨(b.argentifoliibellows&perring,silverleafwhitefly)；柑桔粉蝨(dialeurodescitriashmead,citruswhitefly)；煙粉蝨(trialeurodesabutiloneus,bandedwingedwhitefly)以及溫室白粉蝨(t.vaporariorumwestwood,greenhousewhitefly)；馬鈴薯小綠葉蟬(empoascafabaeharris,potatoleafhopper)；灰飛蝨(laodelphaxstriatellusfallen,smallerbrownplanthopper)；紫菀葉蟬(macrolestesquadrilineatusforbes,asterleafhopper)；黑尾葉蟬(nephotettixcinticepsuhler,greenleafhopper)；二條黑尾葉蟬(n.nigropictusstal,riceleafhopper)；褐飛蝨(nilaparvatalugensstal,brownplanthopper)；玉米飛蝨(peregrinusmaidisashmead,cornplanthopper)；白背飛蝨(sogatellafurciferahorvath,white-backedplanthopper)；稻飛蝨(sogatodesorizicolamuir,ricedelphacid)；蘋果白葉蟬(typhlocybapomariamcatee,whiteappleleafhopper)；葡萄葉蟬(erythroneouraspp.,grapeleafhoppers)；十七年蟬(magicicadaseptendecimlinnaeus,periodicalcicada)；吹綿蚧(iceryapurchasimaskell,cottonycushionscale)；梨園盾蚧(quadraspidiotusperniciosuscomstock,sanjosescale)；柑桔臀紋粉蚧(planococcuscitririsso,citrusmealybug)；粉蚧的種(pseudococcusspp.)(其他的粉蚧系群)；梨木蝨(cacopsyllapyricolafoerster,pearpsylla)；柿木蝨(triozadiospyriashmead,persimmonpsylla)。半翅目中農藝上重要的物種包括但不限於：稻綠蝽(acrosternumhilaresay,greenstinkbug)；南瓜緣蝽(anasatristisdegeer,squashbug)；麥長蝽(blissusleucopterusleucopterussay,chinchbug)；方翅網蝽(corythucagossypiifabricius,cottonlacebug)；番茄蝽(cyrtopeltismodestadistant,tomatobug)；棉蝽(dysdercussuturellusherrich-schaffer,cottonstainer)；褐臭蝽(euschistusservussay,brownstinkbug)；一斑臭蝽(e.variolariuspalisotdebeauvois,one-spottedstinkbug)；長蝽(graptostethusspp.)(果實蝽系群(complexofseedbugs))；松葉根蝽(leptoglossuscorculussay,leaf-footedpineseedbug)；美國牧草盲蝽(lyguslineolarispalisotdebeauvois,tarnishedplantbug)；豆莢草盲蝽(l.hesperusknight,westerntarnishedplantbug)；牧草盲蝽(l.pratensislinnaeus,commonmeadowbug)；長毛草盲蝽(l.rugulipennispoppius,europeantarnishedplantbug)；長綠盲蝽(lygocorispabulinuslinnaeus,commongreencapsid)；水稻稻綠蝽(nezaraviridulalinnaeus,southerngreenstinkbug)；稻蝽(oebaluspugnaxfabricius,ricestinkbug)；突角長蝽(oncopeltusfasciatusdallas,largemilkweedbug)；棉盲蝽(pseudatomoscelisseriatusreuter,cottonfleahopper)。半翅目中包括的害蟲包括：草莓蝽(calocorisnorvegicusgmelin,strawberrybug)；orthopscampestrislinnaeus；蘋盲蝽(plesiocorisrugicollisfallen,applecapsid)；番茄蝽(cyrtopeltismodestusdistant,tomatobug)；菸草小盲蝽(cyrtopeltisnotatusdistant,suckfly)；白斑盲蝽(spanagonicusalbofasciatusreuter,whitemarkedfleahopper)；皂莢蝽(diaphnocorischlorionissay,honeylocustplantbug)；洋蔥蝽(labopidicolaalliiknight,onionplantbug)；棉盲蝽(pseudatomoscelisseriatusreuter,cottonfleahopper)；苜蓿褐盲蝽(adelphocorisrapidussay,rapidplantbug)；四線盲蝽(poecilocapsuslineatusfabricius,four-linedplantbug)；擬麥長蝽(nysiusericaeschilling,falsechinchbug)；茶黃薊馬(nysiusraphanushoward,falsechinchbug)；稻青蝽(nezaraviridulalinnaeus,southerngreenstinkbug)；扁盾蝽(eurygasterspp.)；緣蝽(coreidaespp.)；紅蝽(pyrrhocoridaespp.)；谷蛾(tinidaespp.)；負子蝽(blostomatidaespp.)；獵蝽(reduviidaespp.)；以及臭蝽(cimicidaespp.)。蟎(acari)(蟎(mites)目的成蟲和幼蟲包括：小麥卷葉蟎(aceriatosichellakeifer,wheatcurlmite)；褐色小麥蟎(petrobialatensmüller,brownwheatmite)；葉蟎科(tetranychidae)的蛛蟎和恙蟎，歐洲葉蟎(panonychusulmikoch,europeanredmite)；二斑葉蟎(tetranychusurticaekoch,twospottedspidermite)；邁葉蟎(t.mcdanielimcgregor,mcdanielmite)；硃砂葉蟎(t.cinnabarinusboisduval,carminespidermite)；土耳其斯坦葉蟎(t.turkestaniugarov&nikolski,strawberryspidermite)；細須蟎科(tenuipalpidae)的扁平蟎，葡萄短鬚蟎(brevipalpuslewisimcgregor,citrusflatmite)；癭蟎科(eriophyidae)的鏽蟎和芽廮蟎以及其他的食葉蟎和對人類和動物健康重要的蟎，即蜻科(epidermoptidae)中的鏽蟎，蠕形蟎科(demodicidae)中的毛囊蟲，食甜蟎科(glycyphagidae)的谷蟎，硬蜱科(ixodidae)的扁蝨，黑腳硬蜱(ixodesscapularissay,deertick)；全環硬蜱(i.holocyclusneumann,australianparalysistick)；美國狗壁蝨(dermacentorvariabilissay,americandogtick)；美洲壁蝨(amblyommaamericanumlinnaeus,lonestartick)；以及癢蟎科(psoroptidae)、蒲蟎科(pyemotidae)和疥蟎科(sarcoptidae)的癢蟎和疥蟎。纓尾目(thysanura)中的昆蟲害蟲是值得關注的，諸如西洋衣魚(lepismasaccharinalinnaeus,silverfish)；小灶衣魚(thermobiadomesticapackard,firebrat)。所涵蓋的其他節肢害蟲包括蜘蛛目(araneae)中的蜘蛛，如棕色隱遁蜘蛛(loxoscelesreclusagertsch&mulaik,brownreclusespider)；和黑寡婦蜘蛛(latrodectusmactansfabricius,blackwidowspider)；和蚰蜒目(scutigeromorpha)的蜈蚣，如蚰蜒(scutigeracoleoptratalinnaeus,housecentipede)。所關注的昆蟲害蟲包括蝽象總科和其他相關昆蟲的總科，包括但不限於蝽象科(稻綠蝽(nezaraviridula),茶翅蝽(halyomorphahalys),璧蝽(piezodorusguildini),褐臭蝽(euschistusservus),擬緣蝽(acrosternumhilare),大豆褐蝽(euschistusheros),euschistustristigmus,dichelopsfurcatus,dichelopsmelacanthus,and菘蝽(bagradahilaris))、龜蝽科(篩豆龜蝽-豆圓蝽(megacoptacribraria-beanplataspid)和土蝽科(根椿象(scaptocoriscastanea-rootstinkbug))的物種；以及鱗翅目的物種，包括但不限於菜蛾(diamond-backmoth)，如美洲棉鈴蟲(helicoverpazeaboddie)；大豆尺蠖(soybeanlooper)，如大豆夜蛾；以及黧豆毛蟲(velvetbeancaterpillar)，如黧豆夜蛾(anticarsiagemmatalishübner)。線蟲包括寄生性線蟲，例如根結、胞囊和病變線蟲，包括胞囊線蟲屬物種(heteroderaspp.)、根結線蟲屬物種(meloidogynespp.)和球異皮線蟲屬物種(globoderaspp.)；特別是胞囊線蟲的成員，包括但不限於，大豆胞囊線蟲(heteroderaglycines，soybeancystnematode)；甜菜胞囊線蟲(heteroderaschachtii，beetcystnematode)；禾穀胞囊線蟲(heteroderaavenae，cerealcystnematode)以及馬鈴薯金線蟲(globoderarostochiensis)和馬鈴薯白線蟲(globoderapailida，potatocystnematodes)。病變線蟲包括短體線蟲屬物種(pratylenchusspp.)。用於測量殺蟲活性的方法是本領域熟知的。參見例如，czaplaandlang，(1990)j.econ.entomol.83：2480-2485；andrews等，(1988)biochem.j.252：199-206；marrone等，(1985)j.ofeconomicentomology78：290-293以及美國專利號5,743,477，所有這些文獻全文以引用方式併入本文。一般來講，將蛋白混合併用於攝食測定。參見例如marrone等(1985)j.ofeconomicentomology78：290-293。此類測定法可包括將植物與一種或多種害蟲接觸以及測定植物存活和/或促使害蟲死亡的能力。如本文所用，「殺蟲活性」是指生物體或物質(諸如，例如蛋白)的活性，不管生物體活物質是有有毒或抑制，其測量可以通過但不限於，害蟲死亡率、害蟲體重減少、害蟲驅避性(repellency)、害蟲生長發育遲緩以及進食和暴露適當長時間後害蟲的其它行為和物理變化。因而，具有殺蟲活性的生物體或物質不利地影響至少一種可測量的害蟲健康參數。同樣，「殺昆蟲活性」是指害蟲是昆蟲時的「殺蟲活性」。「阻礙生長發育」是指大於50％按重量的生長抑制。例如，「殺蟲蛋白」是自身顯示或與其它蛋白組合顯示殺蟲活性的蛋白。監測殺昆蟲活性的一般程序包括將試驗性化合物或生物體添加到密封容器中的食物來源中。評價殺蟲活性的試驗是本領域熟知的。參見例如美國專利號6,570,005和6,339,144，文獻全文以引用方式併入本文。所關注的昆蟲用於測試殺昆蟲活性的最佳發育階段是幼蟲或不成熟的昆蟲。昆蟲可以在完全黑暗、20～30℃和30％～70％的相對溼度下飼養。生物測定可以根據czapla和lang(1990)j.econ.entomol.83(6)：2480-2485的描述進行操作。飼養昆蟲幼蟲的方法和生物測定的方法是本領域的普通技術人員熟知的。殺昆蟲蛋白的毒性和抑制作用包括但不限於，與取食野生植物相比，取食轉基因植物阻礙幼蟲生長發育、殺死蟲卵或者幼蟲、減輕成蟲或者幼蟲的體重；誘導昆蟲取食、築巢或育種的迴避行為。植物的抗昆蟲性可以有將編碼殺昆蟲蛋白的核酸序列引入有機體或對有機體(如植物或植物的一部分)施用殺昆蟲物質而賦予，其中殺昆蟲物質包括但不限於殺昆蟲蛋白。正如本文所用，「控制害蟲群體」或「控制害蟲」指限制害蟲造成的損害的對害蟲的任意影響。控制害蟲包括但不限於，殺死害蟲、抑制害蟲發育、改變害蟲的育性或發育以致害蟲對植物產生更小的損害，減少害蟲產生後代的數量、產生發育不良的害蟲，產生的害蟲更容易受到捕食者攻擊或阻止害蟲取食植物。方法：方法包括但不限於：用於增強植物抗蟲性的方法、用於評價植物抗蟲性的方法、用於控制昆蟲種群的方法，用於殺死昆蟲種群的方法，用於控制昆蟲種群對殺昆蟲多肽抗性的方法，和用於製備種子的方法。所述植物可為單子葉植物或雙子葉植物，例如水稻、玉米、擬南芥或大豆植物。植物還可以是向日葵、高梁、加拿大油菜、小麥、苜蓿、棉花、大麥或黍。所述種子可為水稻、玉米、擬南芥或大豆種子，例如玉米雜交種子或玉米自交系種子。方法包括但不限於如下方法：轉化細胞的方法包括用本發明的任何分離的多核苷酸轉化細胞。也包括通過這種方法轉化的細胞。在具體實施方案中，所述細胞是真核細胞，例如酵母、昆蟲或植物細胞，或原核細胞例如細菌細胞。產生轉基因植物的方法，其包括用本發明的任何分離的多核苷酸或重組dna構建體來轉化植物細胞並由轉化的植物細胞再生轉基因植物。本發明也涉及由該方法製備的轉基因植物，以及從該轉基因植物中獲取的轉基因種子。用於從細胞或細胞培養基中分離本發明多肽的方法，其中所述細胞包含具有本發明多核苷酸的重組dna構建體，所述重組dna構建體包含本發明的多核苷酸可操作地連接到至少一種調控序列，並且其中轉化的宿主細胞在適於重組dna構建體表達的條件下生長。改變宿主細胞中本發明多肽表達水平的方法，包括：(a)用本發明的重組dna構建體轉化宿主細胞；以及(b)在適於表達所述重組dna構建體的條件下使轉化的細胞生長，其中重組dna構建體的表達導致轉化的宿主細胞中的本發明多肽含量改變。增強植物抗蟲性的方法，包括(a)將重組dna構建體導入到可再生的植物細胞中，所述重組dna構建體包含可操作地連接至少一種調控序列(例如在植物中有功能的啟動子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述所述多肽具有的胺基酸序列在與seqidno：6或14進行比較時具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性；和(b)在步驟(a)之後，由所述可再生的植物細胞再生轉基因植物，其中所述轉基因植物在其基因組中包含所述重組dna構建體並且在與不包含所述重組dna構建體的對照植物進行比較時表現出增強的抗蟲性。所述方法還可包括(c)獲得來源於所述轉基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含重組dna構建體並且在與不包含所述重組dna構建體的對照植物進行比較時表現出增強的抗蟲性。增強植物抗蟲性的方法，包括(a)將重組dna構建體導入到可再生的植物細胞中，所述重組dna構建體包含可操作地連接至少一種異源調控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含編碼具有抗蟲活性的多肽crk6或mfs5；和(b)由步驟(a)的再生植物細胞再生轉基因植物，其中轉基因植物在其基因組中包含dna構建體，轉基因植物中crk6或mfs5多肽的表達增加，並且當與不包含dna構建體的對照植物相比時顯示增強的抗蟲性。該方法還進一步包括(c)獲得源於轉基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含dna構建體，具有表達量增加的crk6或mfs5多肽，並且與不含dna構建體的對照植物相比顯示增加的抗蟲性。在一些實施方案中，控制害蟲的方法包括在植物中過表達crk6或mfs5多肽，在一些實施方案中，控制害蟲的方法包括用本發明的dna構建體轉化植物或植物細胞。在一些實施方案中，殺死害蟲的方法包括在植物中過表達crk6或mfs5多肽。在一些實施方案中，殺死害蟲的方法包括用本發明的dna構建體轉化植物或植物細胞。評估植物抗蟲性的方法包括：(a)將重組dna構建體導入到可再生植物細胞中，所述重組dna構建體包含可操作地連接至少一個調控序列(例如植物中有功能的啟動子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼的多肽的胺基酸序列在與seqidno：6或14比較時，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性；和(b)在步驟(a)之後，由所述可再生的植物細胞再生轉基因植物，其中所述轉基因植物在其基因組中包含所述重組dna構建體；和(c)與不包含dna構建體的對照植物相比評估轉基因植物抗蟲性。該方法可進一步包括(d)獲得源於轉基因植物的子代植物，其中子代植物在其基因組中包含重組dna構建體；和(e)與不包含重組dna構建體的對照植物相比評估子代植物的抗蟲性。產生種子的方法，該方法包括任一上述的方法，並且還包括從所述子代植物獲得種子，其中所述種子在其基因組中包含所述重組dna構建體。在一些實施方案中，本發明中的種子在其基因組中包含本發明的重組dna構建體種子處理：為了保護並提高產率產量和性狀技術，種子處理劑選項可提供另外的作物計劃靈活性以及對於昆蟲、雜草和病害的有效成本控制。可用一種或多種本文批露的殺昆蟲蛋白或多肽處理種子材料，例如用上述種子處理劑應用於種子，該種子含有轉基因性狀的轉基因玉米、大豆、芸苔、棉花或水稻。將本文披露的一種或多種殺昆蟲蛋白或多肽與其他傳統色種子處理劑組合是預期的。可用包含化學或生物除草劑、除草劑安全劑、殺昆蟲劑、殺真菌劑、萌發抑制劑和增強劑、營養素、植物生長調節劑和活化劑、殺細菌劑、殺線蟲劑、殺鳥劑和/或殺軟體動物劑的組合的組合物，對種子材料進行處理，通常進行表面處理。這些化合物通常與在配製領域中慣常使用的其他載體、表面活性劑或促進施用的助劑一起配製。包衣可以通過用液體製劑浸漬繁殖材料或通過用混合的溼或幹製劑塗覆來實施。可用作種子處理劑的各種類型化合物的例子在由英國農作物保護委員會(britishcropproductioncouncil)出版的thepesticidemanual：aworldcompendium，c.d.s.tomlined.(《殺蟲劑手冊：世界綱要》，c.d.s.tomlin編輯)中提供，該文獻據此以引用方式併入。可用於作物種子上的一些種子處理劑包括但不限於如下的一種或多種：脫落酸、阿拉酸式苯-s-甲基、阿維菌素、殺草強、氧環唑、固氮螺菌、印楝素、嘧菌酯、芽孢桿菌屬物種(包括蠟樣芽孢桿菌、堅強芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、球形芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和/或蘇雲金芽孢桿菌中的一種或多種)、慢生根瘤菌屬物種(bradyrhizobiumspp.)(包括甜菜慢生根瘤菌、加那利慢生根瘤菌、埃氏慢生根瘤菌、西表島慢生根瘤菌、大豆慢生根瘤菌、遼寧慢生根瘤菌、地瓜慢生根瘤菌和/或圓明園慢生根瘤菌中的一種或多種)、克菌丹、萎鏽靈、殼聚糖、噻蟲胺、銅、氰蟲醯胺、苯醚甲環唑、土菌靈(etidiazole)、氟蟲腈、咯菌腈、氟嘧菌酯、氟喹唑、解草胺、氟草肟、超敏蛋白、抑黴唑、吡蟲啉、種菌唑、異黃酮(isoflavenoids)、脂殼寡糖、代森錳鋅、錳、代森錳、精甲霜靈、甲霜靈、葉菌唑、腈菌唑、pcnb、戊苯吡菌胺、青黴屬、吡噻菌胺、氯菊酯、啶氧菌酯、丙硫菌唑、唑菌胺酯、氯蟲醯胺、s-異丙甲草胺、皂草苷、環苯吡菌胺、tcmtb、戊唑醇、噻苯噠唑、噻蟲嗪、硫雙威、福美雙、甲基立枯磷、三唑醇、木黴、肟菌酯、滅菌唑和/或鋅。pcnb種子包衣是指epa註冊號00293500419，含有五氯硝基苯和依得利。tcmtb是指2-(硫氰基甲基硫代)苯並噻唑。可測試具有特定轉基因性狀的種子品種和種子以確定哪種種子處理劑選項和施用速率可補充此類品種和轉基因性狀以提高產量。例如，具有良好產量潛力但存在絲黑穗病易感性的品種可受益於提供防絲黑穗病的保護的種子處理劑的使用，具有良好產量潛力但存在胞囊線蟲易感性的品種可受益於提供防胞囊線蟲的保護的種子處理劑的使用，以此類推。同樣地，涵蓋賦予昆蟲抗性的轉基因性狀的品種可受益於種子處理劑所賦予的第二作用模式，涵蓋賦予除草劑抗性的轉基因性狀的品種可受益於種子處理劑和增強植物對該除草劑的抗性的安全劑，等等。此外，由種子處理劑的適當使用所引起的良好根系建成和提早出苗可使得在與種子處理劑結合時包含特定性狀的一個品種或多個品種更有效地使用氮、抵禦乾旱的能力更佳、以及產量潛力總體增加。在前述任意的方法中或本文其他實施方案披露的任意方法中確定轉基因植物農藝性狀改變的步驟，如果適當，可包括確定在可變的環境條件下，與不包含重組dna構建體的對照植物相比，轉基因植物是否顯示至少一種農藝性狀的變化。在前述任意的方法中或本文其他實施方案披露的任意方法中確定轉基因子代植物農藝性狀改變的步驟，如果適當，可包括確定在可變的環境條件下，與不包含重組dna構建體的對照植物相比，轉基因子代植物是否顯示至少一種農藝性狀的變化。在前述任意的方法中或本文其他實施方案披露的任意方法中，所述引入步驟中所述再生植物細胞可包括愈傷細胞、胚胎愈傷細胞、配子細胞、分生細胞、或不成熟的胚胎細胞。可再生植物細胞可源於近交玉米植株。在前述任意方法或本文披露的其他實施方案中的任意方法中，所述再生步驟可包括：(i)在含有胚促激素培養基上培養所述轉化的植物細胞直至長出愈傷組織；(ii)將步驟(i)所述的轉化植物細胞轉移至含有組織促激素的第一培養基上；和(iii)將步驟(ii)所述轉化植物細胞接種到第二培養基上，使其莖伸長、根發育或兩者均發育。在前述任意方法或本文披露的其他實施方案的任意方法中，存在將重組dna構建體導入再生植物細胞的可替代方法，所述重組dna構建體包含可操作地與至少一個調節序列連接的多核苷酸。例如，將調控序列(諸如一個或多個增強子、可作為轉座元件的一部分)導入再生植物細胞中，然後篩選調控序列可操作地與即時披露的編碼多肽的內源基因連接的轉基因事件。將本文披露的重組dna構建導入植物的適當的技術，包括，但不限於直接dna吸收、化學處理、電穿孔、微注射、細胞融合、轉染、載體介導dna轉移、轟擊、或農桿菌介導的轉化。植物轉化和再生的技術在國際專利公開號wo2009/006276中描述，其全部內容併入作為參考。另外，也有修飾或改變宿主內源基因組dna的方法，包括改變宿主天然dna序列或調控元件、編碼或非編碼序列等前體轉基因序列。這些方法也可以用於將核酸序列靶向到基因組中改造目標識別序列。例如本文中轉基因修飾的細胞或植物使用傳統的基因工程核酸酶如產生修飾植物基因組的歸位核酸內切酶產生(例如wo2009/114321；gao等(2010)plantjournal1：176-187)。其他的位點定向工程是通過使用鋅指結構域識別偶聯的限制性內切酶的限制性特點修飾內源基因(例如urnov等(2010)natrevgenet.11(9)：636-46；shukla等(2009)nature459(7245)：437-41)。轉錄激活因子類似-dna修飾酶(transcriptionactivator-likeeffector-dnamodifyingenzyme，tale或talen)可用於基因工程修飾植物基因組，參見例如us20110145940,cermak等(2011)nucleicacidsres.39(12)和boch等(2009),science326(5959)：1509-12。植物基因組定點修飾也可以使用細菌ii型crispr(成簇的規律的間隔的短回文的重複序列，clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)/cas(crispr關聯蛋白，crispr-associated)系統，參考例如belhaj等(2013),plantmethods9:39.crispr/cas系統可以允許可定製的小的非編碼rna引導的基因組dna靶向切割。本領域的技術人員熟悉將編碼期望多肽的基因轉化植物和培育再生植物的方法。再生植物可以自花授粉產生純合子轉基因植物，或者將再生植物的花粉與種子長出的農藝重要的植物雜交，或者農藝重要的植物的花粉與再生的轉基因植物雜交。本領域的技術人員熟知培育本文披露的含有期望多肽的轉基因植物的方法。轉基因植物中性狀的堆疊轉基因植物可包含本文所公開的一個或多個殺昆蟲多核苷酸與一個或多個另外的多核苷酸的堆疊，從而導致多個多肽序列的產生或抑制。包含多核苷酸序列的堆疊的轉基因植物可通過傳統育種方法或通過遺傳工程方法中的一者或兩者來獲得。這些方法包括但不限於培育各自包含所關注多核苷酸的單獨品系，用後續基因轉化包含本文所公開的基因的轉基因植物，以及將基因共轉化進單個植物細胞中。如本文所用，術語「堆疊」包括具有存在於同一植物中的兩種或更多種性狀(例如，兩種性狀均摻入核基因組中，一種性狀摻入核基因組中且一種性狀摻入質體的基因組中，或者兩種性狀均摻入質體的基因組中)。在一個非限制性例子中，「堆疊性狀」包含序列彼此物理相鄰的分子堆疊。如本文所用的性狀是指衍自特定序列或序列群組的表型。可使用包含多個基因的單個轉化載體或單獨地攜帶於多個載體上的基因進行基因的共轉化。如果序列通過遺傳轉化植株來堆疊，則所關注的多核苷酸序列可在任何時間以任何順序進行組合。可以用共轉化方案將性狀與所關注多核苷酸同時引入，所述多核苷酸由轉化盒的任何組合提供。例如，如果將要引入兩條序列，則可將該兩條序列包含在單獨的轉化盒中(反式)或包含在同一轉化盒中(順式)。可通過相同啟動子或不同啟動子驅動所述序列表達。在某些情況中，可能期望引入會抑制所關注多核苷酸的表達的轉化盒。這可以與其他抑制盒或過表達盒的任何組合進行組合以在植物中生成所需的性狀組合。還認識到可使用位點特異性重組系統在所需的基因組位置堆疊多核苷酸序列。參見，例如，wo1999/25821、wo1999/25854、wo1999/25840、wo1999/25855和wo1999/25853，上述專利均以引用的方式併入本文。實施例本文的具體實施進一步在下列實例中示明。在這些實例中，除非特別說明，採用攝氏/公制。在這些實例中，僅用舉例說明具體的實施過程。通過上述討論和具體事例，本領域的專業人員可以查明本發明的基本特徵，經過各種改變和修改將本發明應用於各種用途和條件，並不偏離本發明主體和範圍。因此，除了本專利表述和討論的各種修改外，本領域內的專業人員所做的不偏離本發明主題的修改也將落入本專利的權力要求範圍內。實施例1.水稻激活標籤突變體庫的構建本研究使用含有4xcamv35s增強子的t-dna插入雙元載體，採用林擁軍和張啟發描述的農桿菌介導法轉化中花11號水稻(oryzasatival.)(linandzhang((2005)plantcellrep.23:540-547)，構建水稻激活標籤突變體庫。中花11號水稻是中國農業科學院作物研究所培育的，我們從北京未名凱拓農業生物技術公司獲得第一批種子。使用t-dna插入雙元載體轉化中花11號水稻胚誘導的愈傷組織，產生轉基因株系苗，收穫的轉基因種子構成突變體庫。實施例2.篩選以鑑定實驗室條件下亞洲玉米螟(ostriniafurnacalis)抗性增強的幼苗株系亞洲玉米螟(acb，ostriniafurnacalis(guenée))是亞洲玉米的重要昆蟲害蟲，分布在中國大陸、澳大利亞以及所羅門島嶼。在其北部區域，每年蛾會產生一到幾代，在熱帶區域，世代之間是連續並重疊的。毛蟲通過損害籽粒和取食穗、葉和莖導致玉米產量損失嚴重，毛蟲主要在植物的生殖器官部分存活和生長。其它受為害的經濟作物包括辣椒、生薑和高粱。近來，亞洲玉米螟似乎已成為棉花的重要害蟲，一些野生雜草也成為亞洲玉米螟的宿主(d.m.nafusa和i.h.schreinera.2012.reviewofthebiologyandcontroloftheasiancornborer,ostriniafurnacalis(lep：pyralidae)tropicalpestmanagement.37:41-56)。亞洲玉米螟被用於鑑定可以抑制幼蟲發育的水稻atl，acb飼養種群來自中國農科院植物保護研究所室內飼養種群，在室內溫度25～27℃，相對溼度60％～80％，光周期16l:8d條件下飼養10代以上。幼蟲用人工飼料飼養(周大榮,葉志華,王振營，1995)，成蟲產卵後，將卵紙保存於27℃培養箱中孵化，以初孵幼蟲作為試蟲。除其他說明外，t2代轉基因種子(在綠色螢光燈下發紅光的種子)被用於昆蟲抗性試驗。每個激活標籤株系(atl)取150粒種子，於32℃800ppm多菌靈消毒8h後，衝洗3～5次，然後將種子置於鋪上一層溼紗布的培養皿中(12x12cm)。發芽的種子用蒸餾水在28℃培養10天時，苗高8～10cm即可用於試驗。篩選方法：以32孔板(每孔4cmx4cmx2cm，pitman,n.j.usa-609-582-2392)作為實驗器材，在每孔中加入1％的瓊脂保溼，瓊脂量約為1/3孔體積。32-孔板分成8個區域，每個區域4個孔，插入同一個atl幼苗。20株水稻幼苗去除根和種子後插入到每個孔的瓊脂中，然後使用毛筆將6頭玉米螟初孵幼蟲接入幼苗中，蓋上特殊的膜蓋(pitman,n.j.usa-609-582-2392)。zh11-tc(組織培養的zh11)用作對照，對照水稻苗隨機置於32孔板的不同區域。將裝有水稻幼苗和亞洲玉米螟幼蟲的32孔板，放置於27℃，相對溼度60％的環境下培養，從第二天開始每天將32-孔板旋轉90度。5天後，目測觀察acb的發育狀態，並計算抗性值。5天後，每株系每孔取3頭最大的幼蟲，和對照zh11-tc孔中幼蟲相比，根據表2給出抗性值。如果對照孔發育至三齡，atl孔中幼蟲發育狀態正常，那麼atl的抗性值為0；如果atl孔中發育至二齡，幼蟲比對照幼蟲比較小，那麼atl的抗性值為1；如果atl孔中幼蟲發育至一齡，atl孔中幼蟲很小，那麼atl的抗性值為2。幼蟲生長抑制率是亞洲玉米螟抗性試驗的一個指標，是指抑制數除以統計總蟲數的百分比，其中抑制數是將4個孔中12頭試蟲的觀測值相加的總和；統計總蟲數是指觀察到的所有蟲的數量與一齡幼蟲的數量相加的總和。使用卡方測驗進行統計學分析，p<0.01時記為亞洲玉米螟抗性陽性。表2.玉米螟及粘蟲試驗打分的分級標準第一輪篩選中亞洲玉米螟抗性陽性株系會進一步篩選(第二輪篩選和第三輪篩選)，每輪兩次重複，三次篩選為陽性的atls被認為是亞洲玉米螟抗性株系。篩選結果：1)ah43610幼苗亞洲玉米螟初孵幼蟲接種到水稻幼苗5天後，zh11-tc幼苗明顯被acb損害，而ah43610幼苗被損害的程度較輕，且取食ah43610幼苗的幼蟲比取食zh11-tc的幼蟲小。如表3所示，在第一輪篩選中，取食ah43610株系水稻幼苗的玉米螟中10頭髮育到二齡期，幼蟲生長受到抑制，幼蟲生長抑制率為83.33％；而對照zh11-tc抑制率為8.33％。ah43610的幼蟲生長抑制率顯著大於對照(p<0.01)，這些結果表明ah43610幼苗抑制了亞洲玉米螟幼蟲的發育。二篩做了兩次重複，ah43610幼苗第一次重複的幼蟲生長抑制率為41.67％，第二次的生長抑制率為66.67％，而對照的幼蟲生長抑制率均為0，因此ah43610中幼蟲生長抑制率顯著高於對照zh11-tc幼苗。三篩的一次重複中，ah43610顯示了同樣的趨勢，在另一個重複中ah43610幼苗顯示稍高的幼蟲生長抑制率。綜上所述，ah43610幼苗阻礙了亞洲玉米螟幼蟲向成蟲的發育。表3.ah43610幼苗在實驗室條件下的亞洲玉米螟試驗2)ah29691幼苗亞洲玉米螟初孵幼蟲接種到水稻幼苗5天後，zh11-tc幼苗明顯被亞洲玉米螟損害，而ah29691幼苗被損害的程度較輕，且取食ah29691幼苗的幼蟲比取食zh11-tc的幼蟲小。表4展示了ah29691幼苗三輪試驗的篩選結果，在第一輪篩選中，取食ah29691水稻幼苗的玉米螟中6頭髮育到二齡期，而取食zh11-tc幼苗的12頭幼蟲正常發育到三齡期。ah29691幼苗(50％)的幼蟲生長抑制率顯著高於zh11-tc幼苗(p<0.01)。結果表明ah29691幼苗抑制了亞洲玉米螟幼蟲的發育。第二輪篩選中，兩次重複中ah29691的幼蟲生長抑制率分別為50％和66.67％，顯著高於相應對照zh11-tc幼蟲生長抑制率。第三輪試驗中，ah29691幼苗在兩次重複中的幼蟲生長抑制率均顯著高於相應的對照zh11-tc幼苗。上述結果清楚一致的表明，ah29691幼苗能夠阻礙亞洲玉米螟幼蟲的發育，ah29691是亞洲玉米螟抗性株系。表4.ah29691幼苗在實驗室條件下的亞洲玉米螟試驗實施例3.實驗室條件下粘蟲(mythimnaseparata)交叉驗證亞洲玉米螟抗性的atl株系粘蟲(oaw，mythimnaseparata)用於殺昆蟲活性的交叉驗證試驗。oaw屬於鱗翅目夜蛾科的雜食性昆蟲害蟲。粘蟲蟲卵購自中國農科院植物保護研究所，在27℃培養箱中孵化，以初孵幼蟲作為試蟲。atl水稻植株的培養方法和實驗設計參見實施例2。5天後，取出所有存活的幼蟲，並目測觀察，根據表2給出相應的抗性值。幼蟲生長抑制率作為抗性試驗的一個參數，指抑制數除以統計總蟲數的百分比，其中，抑制數是指一次重複中所有4個孔中觀測到的抗性值的總和，統計總蟲數是指觀測到的總蟲數和處於一齡期蟲數的總和。採用卡方統計原始數據，p<0.01時，認為測定的株係為粘蟲抗性陽性株系。篩選結果：表5展示來了ah43610和ah29691幼苗的粘蟲篩選結果。在ah43610幼苗的孔中，所有觀察到的22頭幼蟲均沒有發育到三齡期，其中15頭幼蟲發育到二齡期，7頭幼蟲發育到一齡期；而取食zh11-tc的幼蟲中，9頭正常發育到三齡期，34頭髮育到二齡期，2頭髮育到一齡期。ah43610幼苗的幼蟲生長抑制率為100％，顯著高於zh11-tc對照(80.85％)。取食ah29691幼苗的粘蟲幼蟲中，找到了17頭幼蟲，其中1頭髮育到了一齡期，10頭髮育到二齡期；而取食zh11-tc幼苗的幼蟲，1頭髮育到一齡期，20頭髮育到二齡期，ah29691幼苗的幼蟲生長抑制率稍高於zh11-tc幼苗。上述結果表明ah43610幼苗能夠抑制粘蟲幼蟲的生長發育，ah29691幼苗也顯示了對粘蟲幼蟲一定程度的抗性。表5.實驗室條件下ah43610和ah29691幼苗的粘蟲試驗實施例4.實驗室條件下水稻二化螟交叉驗證亞洲玉米螟抗性株系水稻二化螟(rsb，chilosuppressalis)屬於鱗翅目螟蛾科，是非常重要的水稻害蟲，寄生於幼苗到成熟期的植物中。雖然廣泛分布在世界各地，水稻二化螟在亞洲、中東和地中海地區特別具有危害性。水稻二化螟的蟲卵購自中國農科院植物保護研究所養蟲室，在27℃培養箱中孵化，初孵幼蟲作為試蟲。atl幼苗培養於溫室中，溫室中設置比例為1:1的鈉燈和金屬滷化物燈作為光源，光照/黑暗時間為16h/8h，光源設置在苗床上部大約1.5m處，晴天時，高於苗床30cm處的光強度為10,000～20,000lx，陰天時為6,000～10,000lx；溫室相對溼度為30％～90％，溫度為20～35℃。改良的irri營養液培養40天後的分櫱幼苗用於本試驗中。篩選方法：40日齡的每個atl或者zh11-tc植株取兩株，將主莖剪成7-8cm長的2段，插入帶有瓊脂的100ml三角瓶中，然後用毛筆將10頭二化螟初孵幼蟲接到莖頂端，蓋好封口膜。放入27.5℃，rh70％的培養箱中培養。zh11-tc的主莖用作對照，本試驗設置六次重複。二化螟接種7天後，調查死亡率和幼蟲生長抑制率。死亡率指死亡幼蟲數除以接種總蟲數的百分比，幼蟲生長抑制率是指死亡蟲數、一齡蟲數和二齡蟲數的總和除以接種的總蟲數的百分比。採用卡方分析原始數據，當p<0.01時，測試的株系被認為是二化螟抗性陽性株系。篩選結果：1)ah43610主莖取食ah43610主莖的30頭二化螟幼蟲中，14頭死亡，5頭幼蟲發育至一齡期，6頭幼蟲發育至二齡期，而取食zh11-tc主莖的幼蟲中，6頭死亡，15頭髮育到二齡期，6頭髮育到一齡期；取食另一對照，ah43610分離的不發光種子(ah43610-n)主莖的幼蟲中，2頭死亡，4頭髮育到二齡期，5頭髮育到三齡期。ah43610主莖導致的幼蟲死亡率為46.67％，幼蟲生長抑制率為83.33％；zh11-tc對照主莖導致的幼蟲死亡率和幼蟲生長抑制率分別為15％和60％；ah43610-n對照主莖導致的幼蟲死亡率和幼蟲生長抑制率分別為6.67％和36.67％。上述結果清楚的表明ah43610能夠顯著抑制二化螟幼蟲的生長發育。2)ah29691主莖取食ah29691主莖的二化螟幼蟲中，17頭死亡，2頭髮育到一齡期，7頭髮育到二齡期；而取食對照zh11-tc主莖的幼蟲中，8頭死亡，5頭髮育到二齡期。ah29691主莖導致的幼蟲死亡率和幼蟲生長發育抑制率高於zh11-tc主莖導致的幼蟲死亡率和幼蟲生長抑制率，表明ah29691幼苗能夠抑制二化螟幼蟲的生長。表6.實驗室條件下ah43610和ah29691幼苗水稻二化螟試驗ah43610和ah29691幼苗能夠顯著抑制亞洲玉米螟、粘蟲和水稻二化螟的生長發育，表明這兩個株系幼苗具有潛在的廣譜的殺昆蟲活性。根據上述結果，分離了能夠提高ah43610和ah29691幼苗抗蟲性基因。實施例5.激活標籤基因的鑑定本研究使用如下標準程序鑑定抗蟲性ah43610和ah29691水稻株系中t-dna插入位點側翼基因，(1)質粒拯救法(friedrichj.behringer和junei.medford.(1992)，plantmolecularbiologyreportervol.10，2：190-198)和(2)反向pcr法(m.j.mcpherson和philipquirke.(1991)pcr：apracticalapproach，137-146)。對於複雜和多聚t-dna插入的株系，質粒拯救和反向pcr不能有效鑑定候選基因，這種情況下，其它的程序如tailpcr(liu等(1995)，plantj.8：457-463)可以鑑定t-dna插入位點附近的候選基因。成功的測序結果是其中單個dna片段含有t-dna邊界序列和水稻側翼基因組序列，一旦獲得t-dna插入位點的側翼基因組序列標籤，可以通過與公開的水稻基因組序列比對，鑑定候選基因。具體的講，最靠近camv35s增強子元件/t-dnarb的注釋基因是激活的候選基因。為了證實鑑定的基因確實是鄰近t-dna，並排除dna片段是嵌合偽克隆的可能性，用一個t-dna中寡核苷酸和一個基因組dna特異的寡核苷酸片段對基因組dna進行診斷pcr分析。可以擴增產生pcr產物的基因組樣品被認為有t-dna的插入。這個分析也可以確認同一個株系中含有不止一個t-dna插入位點的狀況。例如，質粒拯救和/或反向pcr分析鑑定是否有多個不同的基因組片段。採用ctab法(murray，m.g.和w.f.thompson.(1980)nucleicacidsres.8：4321-4326)從ah43610和ah29691水稻株系葉片中提取基因組dna。t-dna插入位點側翼序列通過分子技術獲得。ah43610水稻中，串聯t-dna插入3號染色體9419566-9419587bp之間(msu7.0http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)，ah43610中t-dna右側和左側的側翼序列的核苷酸序列如seqidno：1或2所示。ah29691水稻中，t-dna插入9號染色體的21101049bp附近(msu7.0http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)，ah29691中t-dna右側側翼序列的核苷酸序列如seqidno：11所示。oscrk6基因鄰近ah43610水稻株系的t-dna插入位點，osmfs5基因鄰近ah29691水稻株系的t-dna插入位點，因此該兩個基因被克隆，並驗證其功能是否為提高抗蟲性和其他農藝性狀。實施例6.抗蟲基因的克隆和過表達載體的構建根據基因idloc_os03g16960.1和loc_os09g36600.1的序列信息，設計引物，並克隆水稻抗蟲基因。表7展示了引物序列和期望的擴增基因的長度。以超優1號水稻葉、莖和根混合的cdna庫為模板克隆oscrk6cdna，以zh11水稻葉、莖和根混合的cdna庫為模板克隆osmfs5cdna。pcr反應混合液和pcr程序如表8和9所示。表7.克隆抗蟲基因的引物表8.pcr反應混合液表9.克隆抗蟲基因的pcr循環狀況pcr擴增產物在瓊脂糖凝膠電泳分離後採用柱式試劑盒回收，並與ta克隆載體連接。通過測序確定pcr產物的核酸序列和在構建體中的方向，然後將基因克隆到植物雙元載體dp0158(pcambia1300-dsred，seqidno:3)中。dp0482載體中克隆的核苷酸序列和oscrk6的編碼序列如seqidno：4和5所示，oscrk6的胺基酸序列如seqidno：6所示；dp1191載體中克隆的核苷酸序列和osmfs5的編碼序列如seqidno：12和13所示，osmfs5的胺基酸序列如seqidno：14所示。實施例7.轉化獲得轉基因水稻過表達載體和空載體(dp0158)採用林擁軍和張啟發((2005)plantcellrep.23:540-547)描述的農桿菌介導的方法轉化入中花11號水稻。轉化實驗室獲得的t0代轉基因幼苗移栽至田間水田中獲得t1種子，t1和t2代種子儲藏在4℃冷庫中。過表達載體含有dsred和hyg基因，t1和t2代種子在綠色螢光燈下發紅色螢光的為轉基因種子，並用於下列抗蟲試驗。轉基因水稻植株中基因表達分析：採用標準的實時rt-pcr程序諸如源於的反轉錄試劑盒和實時rt-pcr(sybrrpremixextaqtm,寶生物)分析轉基因水稻植株中基因的表達水平。ef1α基因用作內參顯示轉基因水稻和對照植物的擴增和上樣量類似。ef1αmrna水平用於規範基因表達量。dp0428水稻植株中oscrk6基因表達水平採用下面的引物測定，如圖1所示，zh11-tc水稻中基因的表達水平設置為1.00，dp0158對照水稻中基因的表達水平與zh11-tc水稻中類似，oscrk6基因在所有12個轉基因株系中過量表達。dp0482-f1：5'-gccactaccgacatgacaaag-3'(seqidno：9)dp0482-r1：5'-gcatgcacatcaccatgtatg-3'(seqidno：10)dp1191水稻植株中osmfs5基因表達水平採用下面的引物測定，如圖2所示，zh11-tc水稻中基因的表達水平設置為1.00，dp0158對照水稻中基因的表達水平與zh11-tc水稻中類似，osmfs5基因在所有12個轉基因株系中過量表達。dp1191-f1：5'-gttcggtttggatgtcttgc-3'(seqidno：17)dp1191-r1：5'-ctctgcctcttgctctcatg-3'(seqidno：18)實施例8oscrk6轉基因水稻植株在實驗室條件下的亞洲玉米螟試驗為了調查oscrk6轉基因水稻能否重現ah43610t-dna插入突變體的抗蟲性狀，oscrk6轉基因水稻首先用於亞洲玉米螟試驗。玉米螟的飼養方法如實施例2所述。dp0482載體產生的t2代植株用於該試驗，進行三次試驗，每次4個重複，zh11-tc和dp0158幼苗用作對照。本試驗驗證12個轉基因株系，每個株系取450粒種子，參照實施例2水培養10天。重現試驗採用隨機區組設計，每個株系的幼苗插入32-孔板的兩個孔中，zh11-tc和dp0158幼苗插入同一板的四個不同孔中。玉米螟抗性試驗的的一個指標為幼蟲生長抑制率,指幼蟲的抑制數除以幼蟲統計數的百分比，其中幼蟲抑制數指8個孔中抗性值的總和，幼蟲統計數指所觀測到的幼蟲數和一齡期幼蟲的總和。本試驗採用隨機區組設計，同一構建體的12個轉基因株系在一個試驗單元中進行驗證，通過sasprocglimmix考慮載體、轉基因株系和環境效應評價基因功能。如果轉基因水稻植株的幼蟲生長抑制率在載體水平和轉基因株系水平顯著高於對照(p<0.05)，則該基因被認為具有亞洲玉米螟抗性功能。亞洲玉米螟篩選結果：1)第一次驗證試驗的結果亞洲玉米螟初孵幼蟲接種水稻幼苗5天後，zh11-tc和dp0158水稻幼苗明顯受玉米螟損害，而oscrk6轉基因幼苗受損較輕，與取食zh11-tc和dp0158對照幼苗的幼蟲相比，取食oscrk6轉基因株系幼苗的幼蟲相對較小。12個oscrk6轉基因株系放置在一個32-孔板上，同時進行四次重複。oscrk6轉基因水稻幼苗共接種了576頭玉米螟初孵幼蟲，共培養5天後，觀測到414頭幼蟲，其中14頭處於一齡期，171頭處於二齡期；zh11-tc幼苗的孔中，觀測到69頭幼蟲，其中2頭處於一齡期，23頭處於二齡期；dp0158幼苗獲得類似的結果，觀測到的79頭幼蟲中，3頭處於一齡期，17頭處於二齡期。oscrk6轉基因水稻、zh11-tc對照和dp0158對照的幼蟲生長抑制率分別為46.50％、38.03％和28.05％。oscrk6轉基因水稻的幼蟲生長抑制率高於zh11-tc對照(p值＝0.1617)並顯著高於dp0158對照(p值＝0.0032)。這些結果表明過量表達oscrk6可以顯著提高轉基因水稻在載體水平的玉米螟抗性。轉基因株系水平進一步的分析結果展示在表10中。與zh11-tc和dp0158對照相比，10個轉基因株系顯示出較高的幼蟲生長抑制率，6個株系的幼蟲生長抑制率顯著高於dp0158對照幼苗。這些結果進一步表明與對照相比oscrk6能夠在轉基因株系水平提高水稻玉米螟抗性。表10.oscrk6轉基因水稻在實驗室條件下亞洲玉米螟試驗(轉基因株系水平，第一次試驗)2)第二次驗證試驗的結果同樣的12個oscrk6轉基因株系用於第二次驗證驗證中，dp0158幼苗用作對照。初孵幼蟲接種後，共培養5天，oscrk6轉基因水稻的孔中，共觀測到504頭幼蟲，其中6頭處於一齡期，223頭處於二齡期；dp0158幼苗孔中，共觀測到88頭幼蟲，其中2頭處於一齡期，21頭幼蟲處於二齡期。oscrk6轉基因水稻和dp0158的幼蟲生長抑制率分別為46.08％和27.78％，oscrk6轉基因水稻幼蟲生長抑制率顯著高於dp0158對照(p值＝0.0026)，這些結果表明在水稻中過量表達oscrk6能夠提高轉基因水稻在載體水平的玉米螟抗性。轉基因株系水平的分析結果展示在表11中，11個轉基因株系的幼蟲生長抑制率高於dp0158幼苗對照，且其中9個轉基因株系的幼蟲生長抑制率顯著高於dp0158對照。dp0482.38的幼蟲生長抑制率為65％。本次試驗的結果與第一次驗證試驗的結果趨勢相同。這些結果進一步表明與對照相比，oscrk6在提高水稻玉米螟抗性中起作用。表11.oscrk6轉基因水稻在實驗室條件下亞洲玉米螟試驗(轉基因株系水平，第二次試驗)實施例9oscrk6轉基因水稻在實驗室條件下粘蟲試驗oscrk6轉基因水稻的粘蟲試驗參照實施例3的描述進行。幼蟲生長抑制率作為粘蟲抗性試驗的一個參數，指幼蟲抑制數除以幼蟲統計數的百分比，其中幼蟲抑制數指八個孔中所觀測到的抗性值的總和，幼蟲統計數指所觀測到的所有幼蟲和一齡期幼蟲數的總和。粘蟲篩選結果：用於亞洲玉米螟試驗的12個轉基因株系用於本試驗，這12個株系放置在一個32-孔板中，同時進行四次重複。接種粘蟲並共培養5天後，取食oscrk6轉基因水稻的488頭幼蟲中，3頭髮育到一齡期，113頭髮育到二齡期，oscrk6轉基因水稻的粘蟲幼蟲生長抑制率為24.24％；取食zh11-tc的90頭幼蟲中，1頭髮育到一齡期，20頭髮育到二齡期，zh11-tc幼苗的幼蟲生長抑制率為24.18％；取食dp0158幼苗的90頭幼蟲中，1頭髮育到一齡期，15頭髮育到二齡期，dp0158幼苗的幼蟲生長抑制率為18.68％。oscrk6轉基因水稻的幼蟲生長抑制率高於zh11-tc和dp0158對照，但差別沒有達到顯著水平。表12.oscrk6轉基因水稻在實驗室條件下粘蟲試驗(載體水平，第一次試驗)第二次粘蟲試驗的結果如表13所示，粘蟲接種並共培養5天後，oscrk6轉基因水稻孔中的449頭幼蟲中，31頭髮育到一齡期，88頭幼蟲發育到二齡期，粘蟲幼蟲生長抑制率為31.25％；而zh11-tc幼苗孔中，檢測到88頭幼蟲，其中6頭髮育到一齡期，15頭幼蟲發育到二齡期，zh11-tc幼苗的幼蟲生長抑制率為28.72％；dp0158幼苗的孔中，共觀測到84頭幼蟲，其中4頭髮育到一齡期，18頭髮育到二齡期，dp0158幼苗的幼蟲生長抑制率為29.55％。結果表明oscrk6轉基因水稻的粘蟲幼蟲生長抑制率高於zh11-tc和dp0158對照。表13.oscrk6轉基因水稻在實驗室條件下粘蟲試驗(載體水平，第二次試驗)實施例10oscrk6轉基因水稻在溫室條件下的水稻二化螟試驗水稻二化螟試驗用於調查oscrk6基因是否有水稻二化螟抗性功能。二化螟蟲卵購自中國農科院植物保護研究所養蟲室，卵在27℃培養箱中孵化，以初孵幼蟲作為試蟲。5個在亞洲玉米螟試驗中表現較好抗性的oscrk6轉基因株系用於二化螟試驗，在溫室中培養。溫室中提供比例為1：1的鈉燈和金屬滷化物燈作為光源，光源放置在苗床上部約1.5米處，光照時間為16h/8h白天/黑夜；晴天時，苗床上部30cm處光強度為10,000～20,000lx，陰天時的光照強度為6,000～10,000lx，溫室的相對溼度為30％～90％，溫度為20～35℃。實驗材料在溫室使用irri營養液培養40天，分櫱的材料待用。篩選方法：每個轉基因株系的96株材料用於測試，培養40天時，每棵水稻植株的新葉上接種一頭二化螟初孵幼蟲，用紗網籠罩上，避免蛾進入溫室中。30～35℃培養28天後,統計水稻苗的枯心率。採用一維方差分析(anova)進行統計學分析，p≤0.05時，轉基因水稻記為二化螟抗性陽性材料。枯心的水稻植株被認為是受水稻二化螟破壞的植株。枯心率是指受破壞枯心的植株數除以總植株數的百分比。篩選結果：5個轉基因株系用於該試驗，經過水稻二化螟28天的取食後，對照zh11-tc有63株水稻枯心。如表14所示，5個轉基因株系水稻的枯心率均低於對照zh11-tc的枯心率，且兩個株系的枯心率顯著低於zh11-tc。由此推測oscrk6d轉基因水稻有一定的二化螟抗蟲功能。表14.oscrk6轉基因水稻在溫室條件下的水稻二化螟試驗(轉基因株系水平)綜上所述，oscrk6轉基因水稻能夠抑制亞洲玉米螟和粘蟲幼蟲的生長發育，已獲得了亞洲玉米螟和粘蟲抗性；oscrk6轉基因水稻也能夠提高水稻二化螟的抗性。這些結果表明oscrk6轉基因水稻能夠顯著抑制亞洲玉米螟、粘蟲和水稻二化螟的生長發育，進一步表明oscrk6具有潛在的廣譜殺昆蟲活性。實施例11osmfs5轉基因水稻植株在實驗室條件下的亞洲玉米螟試驗為了調查osmfs5轉基因水稻能否重現ah29691t-dna插入株系的抗蟲性狀，osmfs5轉基因水稻用於亞洲玉米螟的抗蟲試驗中，試驗方法如實施例8中描述。亞洲玉米螟驗證結果：1)第一次驗證試驗的結果將亞洲玉米螟初孵幼蟲接種到水稻幼苗上5天後，可以發現zh11-tc和dp0158幼苗被亞洲玉米螟幼蟲明顯的破壞，而osmfs5轉基因水稻幼苗的破壞程度較輕，且取食osmfs5轉基因水稻幼苗的acb與取食zh11-tc和dp0158對照幼苗的acb相比較小。將12個osmfs5轉基因株系放置在一個32-孔板中，同時進行六次重複。osmfs5轉基因水稻接種玉米螟初孵幼蟲培養5天後，觀測到551頭幼蟲，其中一齡幼蟲17頭，二齡幼蟲252頭，osmfs5轉基因水稻的玉米螟生長抑制率為50.35％；zh11-tc幼苗中，檢測到117頭幼蟲，其中3頭幼蟲處於一齡期，41頭幼蟲處於二齡期；dp0158對照水稻幼苗中，檢測到98頭幼蟲，其中4頭處於一齡期，44幼蟲處於二齡期，zh11-tc幼苗和dp0158幼苗的幼蟲生長抑制率分別為為39.17％和50.98％。osmfs5轉基因水稻的幼蟲生長抑制率顯著高於zh11-tc對照(p值＝0.0080)。上述結果表明，過表達osmfs5增強了轉基因水稻在載體水平的玉米螟抗性。轉基因株系水平的分析結果展示在表15中，其中兩個轉基因株系的幼蟲生長抑制率大於70％，顯著高於zh11-tc和dp0158幼苗的幼蟲生長抑制率，4個株系顯示出比zh11-tc顯著高且比dp0158稍高的幼蟲生長抑制率。這些結果一致表明osmfs5轉基因水稻顯示了對玉米螟生長的抑制作用，osmfs5可在載體水平和株系水平增強轉基因水稻幼苗的玉米螟抗性。表15.osmfs5轉基因水稻在實驗室條件下的亞洲玉米螟試驗(轉基因株系水平，第一次試驗)2)第二次驗證試驗結果同樣的12個osmfs5轉基因株系放置在一個32-孔板上，同時進行六次重複。osmfs5轉基因水稻的孔中共觀測到691頭幼蟲，其中一齡幼蟲1頭，二齡幼蟲308頭，osmfs5轉基因水稻的玉米螟生長抑制率為44.80％；插入zh11-tc幼苗的孔中，檢測到127頭幼蟲，其中43頭幼蟲處於二齡期，zh11-tc幼苗的幼蟲生長抑制率為33.86％。osmfs5轉基因水稻的幼蟲生長抑制率顯著高於zh11-tc對照(p值＝0.0147)。這些結果表明過表達osmfs5在載體水平上增強了轉基因水稻的玉米螟抗蟲性。轉基因株系水平的分析結果展示在表16中，10個轉基因株系的幼蟲生長抑制率高於zh11-tc對照；3個株系的幼蟲生長抑制率顯著高於zh11-tc對照。其中兩個株系(dp1191.03和dp1191.06)在兩次試驗中展示出最高的幼蟲生長抑制率。第三次實驗結果顯示相同的趨勢。上述結果表明osmfs5轉基因水稻抑制玉米螟的acb生長，且osmfs5可在載體水平和株系水平增強轉基因水稻幼苗的玉米螟抗性。表16.osmfs5轉基因水稻在實驗室條件下的亞洲玉米螟試驗(轉基因株系水平，第二次試驗)實施例12osmfs5轉基因水稻植株在實驗室條件下粘蟲試驗osmfs5轉基因水稻的粘蟲試驗按照實施例9的描述進行操作，試驗結果如下。用於亞洲玉米螟試驗的12個osmfs5轉基因水稻株系用於粘蟲試驗。12個轉基因株系放置在一個32-孔板上，同時進行四次重複。粘蟲接種5天後，osmfs5轉基因水稻的孔中，檢測到452頭幼蟲，其中一齡幼蟲2頭，二齡幼蟲169頭；而取食zh11-tc的85頭幼蟲中，22頭幼蟲處於二齡期；取食dp0158對照水稻的83頭幼蟲中，31幼蟲處於二齡期。osmfs5轉基因水稻、zh11-tc幼苗和dp0158對照幼苗的幼蟲生長抑制率分別為38.11％、25.88％和37.35％。osmfs5轉基因水稻的粘蟲生長抑制率顯著高於zh11-tc對照(p值＝0.0452)。表17為轉基因株系分析結果。7個株系的幼蟲生長抑制高於zh11-tc和dp0158兩個對照，3個株系的幼蟲生長抑制率顯著高於zh11-tc對照。上述結果表明與zh11-tc對照相比，osmfs5轉基因水稻提高了幼苗期粘蟲抗性。表17.osmfs5轉基因水稻在實驗室條件下的粘蟲試驗(轉基因株系水平，第一次試驗)osmfs5轉基因水稻再次進行粘蟲試驗的驗證，在第二次試驗中，粘蟲初孵幼蟲接種到水稻苗，共培養5天後，osmfs5轉基因水稻的孔中，共觀測到336頭幼蟲，其中一齡幼蟲11頭，二齡幼蟲182頭，osmfs5轉基因水稻的粘蟲幼蟲生長抑制率為58.79％；而zh11-tc幼苗的孔中，檢測到54頭幼蟲，其中1頭幼蟲處於一齡期，29頭幼蟲處於二齡期；dp0158轉基因水稻中，檢測到62頭幼蟲，其中23幼蟲處於二齡期。osmfs5轉基因水稻的幼蟲生長抑制率稍高於zh11-tc對照，顯著高於dp0158對照(p值＝0.0032)。這些結果表明osmfs5轉基因水稻在載體水平顯示粘蟲幼蟲抗性。轉基因株系水平的分析顯示4個株系的幼蟲生長抑制率大於60％，顯著高於dp0158對照，第三次試驗顯示類似的趨勢。上述這些結果進一步確認過量表達osmfs5提高了轉基因水稻的粘蟲抗性，osmfs5可以增加粘蟲抗性。表18.osmfs5轉基因水稻植株在實驗室條件下粘蟲試驗(轉基因株系水平，第二次試驗)實施例13osmfs5轉基因水稻植株在溫室條件下的水稻二化螟試驗osmfs5轉基因水稻的水稻二化螟試驗按照實施例10的描述進行操作，試驗結果如下。5個在亞洲玉米螟和粘蟲試驗中表現較好抗性的株系用於水稻二化螟試驗。水稻二化螟幼蟲接種28天後，98株dp0158水稻植株中，有66株已經枯心，而96株dp1191.02的轉基因水稻中，只有34株表現出枯心。所有5個osmfs5轉基因株系的枯心率均低於dp0158對照的枯心率(表19)。繼續培養12天後，即接種幼蟲40天後，計算了水稻植株的死亡率。如表20所示，5個轉基因株系表現出比dp0158低的水稻植株死亡率，且3個水稻株系的水稻植株死亡率顯著低於對照植株。上述結果一致表明osmfs5轉基因水稻已獲得提高的水稻二化螟抗性。表19.osmfs5轉基因水稻在溫室中的水稻二化螟試驗(枯心率)表20.osmfs5轉基因水稻在溫室中的水稻二化螟試驗(水稻死亡率)osmfs5轉基因水稻植株抑制亞洲玉米螟和粘蟲幼蟲的生長，且osmfs5提高了轉基因水稻幼苗的亞洲玉米螟和粘蟲抗性；osmfs5轉基因水稻植株也顯示了對水稻二化螟的抗性提高。上述結果表明osmfs5轉基因水稻對亞洲玉米螟、粘蟲和水稻二化螟昆蟲的生長發育顯示顯著的抑制作用，表明osmfs5具有潛在的廣譜殺昆蟲活性。sequencelisting未名生物農業集團有限公司先鋒海外公司抗蟲性能增強的植物和涉及昆蟲抗性基因的構建體和方法rts22593a18patentinversion3.51649dna水稻1gccttcggaggccatgacactcgcctgctgaggtttgtcacgtacggcctgaagacgacg60cttgtgttgtgcagtgcagtgttcggtctttcctggagcccacgagctcccatttgtgcg120tgcgggcgcagccgccagagtcggcagaccggggaggtggcgcgcatgcacgcggtgacc180actcctcctgcctccacgtacgtttgcctctggctttccctgctcattgctcatcgtcat240cgtcatcggtgaggatgtctccggccggttcgggccgagcaagcagcaggttgcacggcc300cacacatgtaaggcctgtcacgtatgggctcggagaacggtttctttagcaggccgaata360tccaggccctttttcactttttgccaaacactcaactgggccgcagcatcctcaactgca420gctgcaagggtgaacatctgacctagctagatagatgctgccatagtgccatggcatatt480ggcatggagtcgacgggatgaggtcaagatagtggacgtcgttggctcgttgcaagttgc540aactggccaatcgtgctatagaaatcggtgctgattgggcggtatatccggttggatcgc600tcctaactccgaaattttgttaggtatgtcacgtcgtttccgcaactag6492683dna水稻2ctacaccgtcgtctacgtcaaggacgtcgccaagtcggccgccttctactccgccgcgtt60cggctacaccgtccgccgcctcgaccaatcccacaagtaaaccatcctcggttaatattt120tttttccccgtcttaaatttttaactggctgcttgaaagtacttcctgatgcgtgtgacg180tgtaatgaattataaggtgggcggagctggagagcgggacgacgacgatcgcgttcacgc240cgctgcaccagagggagacggacgcgctgacgggcgcggtgcagctgccggactcggccg300gcgagcgggggcccgtggagatctgcttcgactacgcggacgtcgacgcggcgtaccggc360gggccgtggacagcggcgccgtgccggtgagcccgccggagcagaagagctggggccaga420aggtcgggtacgtcagggacatcgacgggatcatcgtgcgcatgggcagccacgtccgcg480cgtagcggccatgcgcctgctcggttgggggattttagccgtgtatgttcaataatgtga540actgttctccactgatctgttgatatatggaataaaactgtgatctcgttggttgtggtc600tgtactccaaagtccaaacgagaaaaaatggccatgtttgatgtatgatgtgttcaatca660tgaatcacatgggtaaggatagg683311934dna合成序列載體dp0158的核苷酸序列3gaattctctagtcccgatctagtaacatagatgacaccgcgcgcgataatttatcctagt60ttgcgcgctatattttgttttctatcgcgtattaaatgtataattgcgggactctaatca120taaaaacccatctcataaataacgtcatgcattacatgttaattattacatgcttaacgt180aattcaacagaaattatatgataatcatcgcaagaccggcaacaggattcaatcttaaga240aacgcggccgcttcagttgtggcccagcttggaggtcgactcgcgaggatctctgcagag300agatagatttgtagagagagactggtgatttcagcgtgtcctctccaaatgaaatgaact360tccttatatagaggaagggtcttgcgaaggatagtgggattgtgcgtcatcccttacgtc420agtggagatatcacatcaatccacttgctttgaagacgtggttggaacgtcttctttttc480cacgatgctcctcgtgggtgggggtccatctttgggaccactgtcggcagaggcatcttg540aacgatagcctttcctttatcgcaatgatggcatttgtaggtgccaccttccttttctac600tgtccttttgatgaagtgacagatagctgggcaatggaatccgaggaggtttcccgatat660taccctttgttgaaaagtctcaatagccctttggtcttctgagactgtatctttgatatt720cttggagtagacgagagtgtcgtgctccaccatgttcacatcaatccacttgctttgaag780acgtggttggaacgtcttctttttccacgatgctcctcgtgggtgggggtccatctttgg840gaccactgtcggcagaggcatcttgaacgatagcctttcctttatcgcaatgatggcatt900tgtaggtgccaccttccttttctactgtccttttgatgaagtgacagatagctgggcaat960ggaatccgaggaggtttcccgatattaccctttgttgaaaagtctcaatagccctttggt1020cttctgagactgtatctttgatattcttggagtagacgagagtgtcgtgctccaccatgt1080tgccaagctgctctaagctttggcggccgcattcgcaaaacacacctagactagatttgt1140tttgctaacccaattgatattaattatatatgattaatatttatatgtatatggatttgg1200ttaatgaaatgcatctggttcatcaaagaattataaagacacgtgacattcatttaggat1260aagaaatatggatgatctctttctcttttattcagataactagtaattacacataacaca1320caactttgatgcccacattatagtgattagcatgtcactatgtgtgcatccttttatttc1380atacattaattaagttggccaatccagaagatggacaagtctaggttaaccatgtggtac1440ctacgcgttcgaatatccatgggccgctacaggaacaggtggtggcggccctcggtgcgc1500tcgtactgctccacgatggtgtagtcctcgttgtgggaggtgatgtccagcttggcgtcc1560acgtagtagtagccgggcagctgcacgggcttcttggccatgtagatggacttgaactcc1620accaggtagtggccgccgtccttcagcttcagggccttgtgggtctcgcccttcagcacg1680ccgtcgcgggggtacaggcgctcggtggaggcctcccagcccatggtcttcttctgcatc1740acggggccgtcggaggggaagttcacgccgatgaacttcaccttgtagatgaagcagccg1800tcctgcagggaggagtcctgggtcacggtcgccacgccgccgtcctcgaagttcatcacg1860cgctcccacttgaagccctcggggaaggacagcttcttgtagtcggggatgtcggcgggg1920tgcttcacgtacaccttggagccgtactggaactggggggacaggatgtcccaggcgaag1980ggcagggggccgcccttcgtcaccttcagcttcacggtgttgtggccctcgtaggggcgg2040ccctcgccctcgccctcgatctcgaactcgtggccgttcacggtgccctccatgcgcacc2100ttgaagcgcatgaactcggtgatgacgttctcggaggaggccatggtggcgaggatctac2160tcggctacactcacacgctcgctctcgcagttgcaggtgtaagtttctagctagggcact2220cacggggtacgtatttgtagccagccacgcacggtctgagctcgccatgtgccgccatgc2280atgcgggggcacgtcgccagcgtacgcggccatcgtcgctgacgaaggtagcgcattcaa2340gtccggtcggtagaggtcagctgggtcgttcgccgatggtagttgccgcccggactcagt2400gggcggtaggcgaaggctagcaagcagacgactccattcatgcgcatcatccaaaggtga2460tgcaaagccttccaaacgcgattgtctcatgatgtttccgtctcttgttacgaggagtac2520aattttttcttatacacgaacgttactttatgtcacatttccatgccatgaacaccttgg2580cttcaaataagtgagtgttttttttcacattctgtggcataaacagaatttctagagtgg2640catttgtgatacattgtgaaagctaagagtggtaaaagtaaaataaaattgttttgcttt2700tgccgcggaatggaaattatttgtcaaaacctaagagtggcaaaactgaaatgtcaaaac2760ctagagtgacataaacaaaatttacccatcactaaatgagcacaaaatatttcaccacaa2820tggaggtatgtgaggtccgatgtactactagagctcatcggaaaagcatcctcttgatga2880gtaaacctcttgaagtactgtaccaccacattttatttatcctcatcggcttatttttag2940gccacggttattctcacgaagagacggttaa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