含脂質的製品的製作方法

2023-06-11 04:51:26

專利名稱：含脂質的製品的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於施予基於核酸的治療劑的組合物和方法，例如締合複合物(association complex)，如脂質體和脂質複合物(lipoplexes)。

背景技術：
使用基於核酸的治療劑很有可能為目前常規醫藥不能解決的醫學問題提供解決方案。隨著越來越多的疾病相關基因位置和序列的確定，目前正在對針對多種疾病的基於核酸的治療劑進行臨床測試。
將核酸引入到細胞中的方法之一是使用直接顯微注射的機械方法。然而，該方法通常不能有效地向受試者全身給藥。
核酸治療劑的全身遞送需要將核酸傳送至靶細胞，隨後將核酸以能夠按治療方式起作用的形式完整地運送通過靶細胞膜。
在一些情況中，已經在臨床上成功地使用病毒載體施予基於核酸的治療劑。然而，儘管病毒載體具有將核酸運送通過細胞膜的固有能力，它們也會構成風險。此類風險之一涉及病毒基因序列隨機整合進入患者的染色體中，潛在地破壞其基因組並有可能誘發惡性轉化。另一個風險在於病毒載體可能通過突變或與野生型病毒的基因交換而回復成致病性基因型。
基於脂質的載體也已用於核酸治療劑，並已通過以下兩種方法之一進行配製。在一種方法中，將核酸引入到由陽離子脂質和中性脂質的混合物製成的預製脂質體或脂質複合物中。由此形成的複合物具有不確定的複雜結構，並且因血清的存在而使其轉染效率顯著下降。第二種方法包括使用不含中性脂質的單陽離子脂質或多陽離子脂質形成DNA複合物。這些複合物在乙醇存在的條件下製備，並且在水中不穩定。另外，這些複合物也受到血清的不利影響(參見，Behr，Acc.Chem.Res.26274-78(1993))。


發明內容
本發明描述了包括多胺化合物或本文所述脂質部分的新型製品。
在一些實施方案中，本發明描述了包含一種或多種化合物或其藥學上可接受的鹽的製品，其中每種所述化合物分別具有式(I)定義的結構，
式(I) 其中 Xa和Xb在每次出現時分別獨立地為C1-6亞烷基； n為0、1、2、3、4或5；各個R獨立地為H、
其中，在所述製品中，至少約50％的式(I)化合物分子(例如，至少約55％、至少約60％、至少約65％、至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約98％、至少約99％或基本全部)中的至少n+2個R基團不是H； m為1、2、3或4；Y為O、NR2或S； R1為烷基、烯基或炔基；其每一個任選被一個或多個取代基取代；和 R2為H、烷基、烯基或炔基；其每一個任選被一個或多個取代基取代； 前提是，如果n＝0，那麼至少n+3個R基團不是H。
在一些實施方案中，當R不是H時，R為Ra，例如當R不是H時，R在每次出現時均為Ra。
在一些實施方案中，當R不是H時，R為Rb，例如當R不是H時，R在每次出現時均為Rb。
在一些實施方案中，當R不是H時，R為Rc，例如當R不是H時，R在每次出現時均為Rc。
在一些實施方案中，當R不是H時，R為Rd，例如當R不是H時，R在每次出現時均為Rd。
在一些實施方案中，當R不是H時，R為Re，例如當R不是H時，R在每次出現時均為Re。
在一些實施方案中，式(I)中n+2個R基團不是H。在一些實施方案中，式(I)中n+3個R基團不是H。在一些實施方案中，式(I)中n+4個R基團不是H。
在一些實施方案中，式(I)中n+1個R基團不是H。
在一些實施方案中，n＞0，且式(I)中NR的至少一個R為H。
在一些實施方案中，式(I)中NR2的至少一個R為H。
在一些實施方案中，至少80％的分子為一種結構異構體。例如，式(I)中n+2個R基團不是H，或式(I)中n+3個R基團不是H，或式(I)中n+4個R基團不是H。
在一些實施方案中，n為2或0。
在一些實施方案中，Xa和Xb為C2亞烷基。
在一些實施方案中，n為0，且Xb為亞乙基或亞丙基。
在一些實施方案中，n＞0，至少有一次出現的Xa不同。
在一些實施方案中，當R不為H時，R為

例如，Y可以為O或NR2。在一些實施方案中，m為2。在一些實施方案中，Y為O或NR2，m為2。在一些實施方案中，m為1。在一些實施方案中，m為1，Y為O或NR2。
在一些實施方案中，R1在至少一次出現時為烷基，例如R1在每次出現時均為烷基。
在一些實施方案中，在至少一次出現時(例如在每次出現時)，R1為烷基，R2為H。
在一些實施方案中，在至少一次出現時(例如在每次出現時)，R1和R2為烷基。
在一些實施方案中，R1在至少一次出現時為烯基。
在一些實施方案中，R1在至少一次出現時為烯基。
在一些實施方案中，當R在至少一次出現時(例如在每次出現時)不是H時，R為Ra，Y為O或NH。在一些實施方案中，Y為O。在一些實施方案中，Y為NH。在一些實施方案中，R1為烷基，例如C10-30烷基或C12烷基。在一些實施方案中，n為2。在一些實施方案中，Xa在每次出現時均為C2亞烷基，Xb為C2亞烷基。在一些實施方案中，m為2。
在一些實施方案中，n為2，當R在至少一次出現時(例如在每次出現時)不是H時，R為Ra。在一些實施方案中，R1為烷基，例如C10-18烷基或C12烷基。在一些實施方案中，Y為O或Y為NH。在一些實施方案中，Xa在每次出現時均為C2亞烷基，Xb為C2亞烷基。在一些實施方案中，m為2。
在一些實施方案中，NR中的至少一個R為H，當R在至少一次出現時(例如在每次出現時)不是H時，R為Ra，Y為O或NH。在一些實施方案中，Y為O或Y為NH。在一些實施方案中，R1為烷基，例如C10-18烷基或C12烷基。在一些實施方案中，n為2。在一些實施方案中，Xa在每次出現時均為C2亞烷基，Xb為C2亞烷基。在一些實施方案中，m為2。
在一些實施方案中，n為2，NR中的至少一個R為H，當R在至少一次出現時(例如在每次出現時)不是H時，R為Ra，Y為O或NH。在一些實施方案中，R1為烷基，例如C10-18烷基或C12烷基。在一些實施方案中，Y為O或Y為NH。在一些實施方案中，Xa在每次出現時均為C2亞烷基，Xb為C2亞烷基。在一些實施方案中，m為2。
在一些實施方案中，NR2中的至少一個R為H，且R在至少一次出現時(例如在每次出現時)為Ra，且其中Y為O或NH。在一些實施方案中，Y為O或Y為NH。在一些實施方案中，R1為烷基，例如C10-30烷基、C10-18烷基或C12烷基。在一些實施方案中，n為2。在一些實施方案中，Xa在每次出現時均為C2亞烷基，Xb為C2亞烷基。在一些實施方案中，m為2。
在一些實施方案中，n為2，NR2中的至少一個R為H，且R在至少一次出現時(例如在每次出現時)為Ra，且其中Y為O或NH。在一些實施方案中，R1為烷基，例如C10-18烷基或C12烷基。在一些實施方案中，Y為O或Y為NH。在一些實施方案中，Xa在每次出現時均為C2亞烷基，Xb為C2亞烷基。在一些實施方案中，m為2。
在一些實施方案中，該製品包含下式之一或下式的混合物，其中除非在下式中另有說明，否則R不是H。

在一些實施方案中，該製品主要由下式之一或下式的混合物組成，

在一些實施方案中，各個R均為

在一些實施方案中，各個R均為

在一些實施方案中，R1為C10-18烷基(例如，C12烷基)或C10-30烯基。
在一些實施方案中，R為

在一些實施方案中，R1為C10-18烷基，例如，C12烷基。在一些實施方案中，R1為C12烷基，R2為H。
在一些實施方案中，n為0，X為亞丙基。在一些實施方案中，一個R為H，在一些實施方案中，當R在至少一次出現時(例如在每次出現時)不是H時，R為Ra。在一些實施方案中，R1為烷基，例如C10-30烷基或C12烷基。在一些實施方案中，Y為O或Y為NH。在一些實施方案中，m為2。
在一些實施方案中，式(I)為

在一些實施方案中，R為

在一些實施方案中，R1為C10-18烷基或C10-C30烯基。在一些實施方案中，R為

在一些實施方案中，R1為C10-18烷基或C10-C30烯基，R2為H。
在一些實施方案中， n為2； Xa在每次出現時均為C2亞烷基，Xb為C2亞烷基；且 其中 各個R在至少一次出現時(例如在每次出現時)為H或
m為2； Y為NH或O； R1為C12烷基。在一些實施方案中，至少80％的式(I)化合物分子為一種結構異構體。在一些實施方案中，Y為NH，例如其中至少80％的式(I)化合物分子為一種結構異構體。在一些實施方案中，R在5次出現時均為Ra。在一些實施方案中，在至少80％的式(I)化合物分子中，R在5次出現時均為Ra。在一些實施方案中，Y為NH。
在一些實施方案中，式(I)化合物為其無機鹽或有機鹽，例如其氫滷酸鹽(例如其鹽酸鹽)。在一些實施方案中，鹽酸鹽的範圍為從1當量HCl到n+2當量HCl。在一些實施方案中，式(I)化合物為有機酸鹽，例如乙酸鹽，如從1當量乙酸鹽到n+2當量乙酸鹽範圍的乙酸鹽；或甲酸鹽，例如如從1當量甲酸鹽到n+2當量甲酸鹽範圍的甲酸鹽。
在一些實施方案中，式(I)化合物為水合物的形式。
在一些實施方案中，R1在至少一次出現時(例如在每次出現時)包含烯基部分，例如R1包含順式雙鍵。
一方面，本發明描述了包含式(I)化合物和核酸(例如，RNA(如siRNA或dsRNA)或DNA)的製品。在一些實施方案中，該製品還包括其他脂質，例如膜融合脂質(fusogenic lipid)或PEG-脂質。
在一些實施方案中，該製品包含小於11重量％的下式(III)
式(III) 其中，X和n的定義與在上式(I)中類似。
在一些實施方案中，該製品包含小於90重量％的下式(IV)
式(IV) 其中，Y和R1的定義與在上式(I)中類似。
在一些實施方案中，該製品包含多種式(I)的化合物。
在一些實施方案中，該製品包含下式化合物的混合物
式(I′) 式(I″) 其中在式(I′)中，有5個R基團為Ra。在一些實施方案中，式(I′)和式(I″)以約1∶2至約2∶1的比例存在。
一方面，本發明描述了式(II)化合物的製備方法，
式(II) 其中 Xa和Xb在每次出現時分別獨立地為C1-6亞烷基； n為0、1、2、3、4或5；且 其中 R分別獨立地為H或
m為2； Y為O、NR2或S； R1為烷基或烯基； R2為H或C烷基或烯基； 所述方法包括在存在促進劑的條件下使式(III)的化合物
式(III) 與式(IV)的化合物
式(IV) 反應。
一方面，本發明描述了式(II)化合物的製備方法，
式(II) 其中 Xa和Xb在每次出現時分別獨立地為C1-6亞烷基； n為0、1、2、3、4或5；且 其中 R分別獨立地為H或
m為2； Y為O、NR2或S； R1為烷基或烯基； R2為H或C烷基或烯基； 所述方法包括在存在淬滅劑的條件下使式(III)的化合物
式(III) 與式(IV)的化合物
式(IV) 反應。
一方面，本發明描述了式(II)化合物的製備方法，
式(II) 其中 Xa和Xb在每次出現時分別獨立地為C1-6亞烷基； n為0、1、2、3、4或5；且 其中 R分別獨立地為H或
m為2； Y為O、NR2或S； R1為烷基或烯基； R2為H或烷基或烯基； 所述方法包括使式(III)的化合物
式(III) 與式(IV)的化合物反應，
式(IV) 其中，反應混合物包含約0.8～約1.2摩爾當量的式(III)的化合物，以及約3.8～約6.5摩爾當量的式(IV)的化合物。
在一些實施方案中，反應混合物包含約0.8～約1.2摩爾當量的式(III)的化合物，以及約5.5～約6.5摩爾當量的式(IV)的化合物。在一些實施方案中，反應混合物包含約1摩爾當量的式(III)的化合物，以及約6摩爾當量的式(IV)的化合物。在一些實施方案中，反應混合物包含約1摩爾當量的式(III)的化合物，以及約5摩爾當量的式(IV)的化合物。
一方面，本發明描述了式(II)化合物的製備方法，
式(II) 其中 Xa和Xb在每次出現時分別獨立地為C1-6亞烷基； n為0、1、2、3、4或5；且 其中 R分別獨立地為H或
m為2； Y為O、NR2或S； R1為烷基或烯基； R2為H或烷基或烯基； 所述方法包括在存在硼酸和水的條件下使式(III)的化合物
式(III) 與式(IV)化合物反應的兩步過程，
式(IV) 其中，第一步涉及包含約0.8～約1.2摩爾當量的式(III)化合物以及約3.8～約4.2摩爾當量的式(IV)化合物的反應混合物，而第二步涉及添加約0.8～1.2摩爾當量的式(IV)的化合物。
一方面，本發明描述了式(II)化合物的製備方法，
式(II) 其中 Xa和Xb在每次出現時分別獨立地為C1-6亞烷基； n為0、1、2、3、4或5；且 其中 各個R獨立地為H或
m為2； Y為O、NR2或S； R1為烷基或烯基； R2為H或烷基或烯基； 所述方法包括使式(III)的化合物
式(III) 與式(IV)的化合物反應，
式(IV) 並從反應混合物中分離至少一種式(II)的結構異構體，從而提供包含式(II)的結構異構體的基本純化的製品。
在一些實施方案中，使用色譜分離法從反應混合物中分離式(II)的結構異構體。在一些實施方案中，所述色譜分離法使用快速矽膠(flash silica gel)分離異構體。在一些實施方案中，所述色譜分離法為使用矽膠分離異構體的重力分離法。在一些實施方案中，所述色譜分離法使用移動床色譜分離異構體。在一些實施方案中，所述色譜分離法使用液相色譜(LC)分離異構體。在一些實施方案中，所述色譜分離法使用正相HPLC分離異構體。在一些實施方案中，所述色譜分離法使用反相HPLC分離異構體。
在一些實施方案中，基本純化的製品包含至少約80％的式(II)的結構異構體，例如至少約90％的式(II)的結構異構體，至少約95％的式(II)的結構異構體。
在另一方面，本發明描述了式(V)的化合物或其藥學上可接受的鹽的製備方法，
式(V) 其中 Xa和Xb在每次出現時分別獨立地為C1-6亞烷基； n為0、1、2、3、4或5；且 其中 R分別獨立地為H或
m為1； Y為O、NR2或S； R1為烷基或烯基； R2為H或烷基或烯基； 所述方法包括使式(III)的化合物
式(III) 與式(VI)的化合物反應，
Q＝Cl或Br或I 式(VI) 以提供式(V)的化合物或其藥學上可接受的鹽。
在一些實施方案中，所述其藥學上可接受的鹽為式(V)化合物的鹽酸鹽。
一方面，本發明描述了式(X)的化合物及其藥學上可接受的鹽，
式(X) 其中 R1和R2分別獨立地為H、任選被1-4個R5取代的C1-C6烷基、任選被1-4個R5取代的C2-C6烯基、或C(NR6)(NR6)2； R3和R4分別獨立地為烷基、烯基、炔基，且分別任選被氟、氯、溴、碘取代； L1和L2分別獨立地為-NR6C(O)-、-C(O)NR6-、-OC(O)-、-C(O)O-、-S-S-、-N(R6)C(O)N(R6)-、-OC(O)N(R6)-、-N(R6)C(O)O-、-O-N＝C-、OR、-OC(O)NH-N＝C-或-NHC(O)NH-N＝C-； L1-R3和L2-R4可共同形成縮醛、縮酮或原酸酯(orthoester)，其中R3和R4的定義如上所述並且也可以為H或苯基； R5為氟、氯、溴、碘、-OR7、-N(R8)(R9)、-CN、SR10、S(O)R10、S(O)2R10； R6為H、C1-C6烷基； R7為H或C1-C6烷基； R8和R9分別獨立地為H或C1-C6烷基； R10為H或C1-C6烷基； m為1、2、3、4、5或6； n為0、1、2、3、4、5或6。
在一些實施方案中，該化合物為其無機鹽，例如其氫滷酸鹽，如其鹽酸鹽。在一些實施方案中，該化合物為其有機鹽。
在一些實施方案中，R1和R2分別獨立地為C1-C3烷基。
在一些實施方案中，R1為甲基。
在一些實施方案中，R2為甲基。
在一些實施方案中，R1和R2均為甲基。
在一些實施方案中，R1為H、甲基、乙基、異丙基或2-羥乙基。
在一些實施方案中，R2為H。
在一些實施方案中，R2為H、甲基、乙基、丙基或異丙基。
在一些實施方案中，R1為H、甲基、乙基、異丙基或2-羥乙基，R2為H、甲基、乙基、丙基或異丙基。
在一些實施方案中，m為1。
在一些實施方案中，n為1。
在一些實施方案中，m和n均為1。
在一些實施方案中，L1為-NR6C(O)-或-C(O)NR6-。
在一些實施方案中，L1為-OC(O)-或-C(O)O-。
在一些實施方案中，L1為S-S-。
在一些實施方案中，L1為-N(R6)C(O)N(R6)-。
在一些實施方案中，L1為-OC(O)N(R6)-或-N(R6)C(O)O-。
在一些實施方案中，L1為-O-N＝C-。
在一些實施方案中，L1為-OC(O)NH-N＝C-或-NHC(O)NH-N＝C-。
在一些實施方案中，L2為-NR6C(O)-或-C(O)NR6-。
在一些實施方案中，L2為-OC(O)-或-C(O)O-。
在一些實施方案中，L2為S-S-。
在一些實施方案中，L2為-N(R6)C(O)N(R6)-。
在一些實施方案中，L2為-OC(O)N(R6)-或-N(R6)C(O)O-。
在一些實施方案中，L2為-O-N＝C-。
在一些實施方案中，L2為-OC(O)NH-N＝C-或-NHC(O)NH-N＝C-。
在一些實施方案中，L1和L2均為-NR6C(O)-或-C(O)NR6-。
在一些實施方案中，L1和L2均為-OC(O)-或-C(O)O-。
在一些實施方案中，L1和L2均為S-S-。
在一些實施方案中，L1和L2均為-N(R6)C(O)N(R6)-。
在一些實施方案中，L1和L2均為-OC(O)N(R6)-或-N(R6)C(O)O-。
在一些實施方案中，L1為-NR6C(O)-，L2為-S-S-。
在一些實施方案中，L1為-OC(O)-，L2為-S-S-。
在一些實施方案中，L1為-OC(O)N(R6)-或-N(R6)C(O)O-，L2為-S-S-。
在一些實施方案中，L1為-N(R6)C(O)N(R6)-，L2為-S-S-。
在一些實施方案中，L1-R3和L2-R4共同形成縮醛、縮酮或原酸酯。
在一些實施方案中，R3和R4分別獨立地為烷基。
在一些實施方案中，R3和R4分別獨立地為C6-C28烷基。
在一些實施方案中，L1和L2獨立地為-S-S-、-OC(O)N(R6)-或-N(R6)C(O)O-。
在一些實施方案中，R3為烷基。
在一些實施方案中，R4為烷基。
在一些實施方案中，R3為烯基。
在一些實施方案中，R4為烯基。
在一些實施方案中，R3和R4分別獨立地為烯基，例如R3和R4分別獨立地為C6-C30烯基或R3和R4分別為相同的烯基部分。
在一些實施方案中，R3和R4分別包括兩個雙鍵部分。在一些實施方案中，至少一個雙鍵具有Z構型。在一些實施方案中，兩個雙鍵均具有Z構型。在一些實施方案中，R3和R4中的至少一個為下式(II)，
式(II) 其中 x為1～8的整數；且 y為1～10的整數。在一些實施方案中，R3和R4均為式(II)。在一些實施方案中，至少一個雙鍵具有E構型，例如兩個雙鍵均具有E構型。在一些實施方案中，R1和R2中的至少一個為下式(III)
式(III) 其中 x為1～8的整數；且y為1～10的整數。
在一些實施方案中，R1和R2分別包括三個雙鍵部分。在一些實施方案中，至少一個雙鍵具有Z構型。在一些實施方案中，至少兩個雙鍵具有Z構型。在一些實施方案中，三個雙鍵均具有Z構型。在一些實施方案中，R1和R2中的至少一個為下式(IV)
式(IV) 其中 x為1～8的整數；且 y為1～10的整數。在一些實施方案中，R1和R2均為式(IV)。在一些實施方案中，至少一個雙鍵具有E構型。在一些實施方案中，至少兩個雙鍵具有E構型。在一些實施方案中，三個雙鍵均具有E構型。在一些實施方案中，R1和R2中的至少一個為下式(V)
式(V) 其中 x為1～8的整數；且y為1～10的整數。在一些實施方案中，R1和R2均為式(V)。
在一些實施方案中，R1和R2分別為C1-C6烷基(例如，甲基)，L1和L1分別為-OC(O)-，R3和R4分別為烯基。在一些實施方案中，R3和R4相同。在一些實施方案中，R3和R4均包含兩個雙鍵(例如具有順式連接)。在一些實施方案中，R3和R4為下式(II)，
式(II) 其中 x為1～8的整數，例如5；且y為1～10的整數，例如4。
另一方面，本發明描述了包含式(X)化合物的製品。
一方面，本發明描述了包含式(X)化合物和核酸(例如，RNA(如siRNA或dsRNA)或DNA)的製品。在一些實施方案中，該製品還包括其他脂質，例如膜融合脂質或PEG-脂質。
一方面，本發明描述了式(X)化合物的製備方法，
式(X) 其中 R1和R2分別獨立地為C1-C6烷基，其任選被1-4個R5取代； R3為烷基、烯基、炔基； L1為-OC(O)-； R5為-OR7、-N(R8)(R9)、-CN、SR10、S(O)R10、S(O)2R10； R6為H、C1-C6烷基； R7為H或C1-C6烷基； R8和R9分別獨立地為H或C1-C6烷基； R10為H或C1-C6烷基； m和n分別獨立地為1、2、3、4、5或6； 所述方法包括在存在偶聯劑的條件下使式(VI)的化合物
式(VI) 與式(VII)的化合物反應，
式(VII) 從而提供式(X)的化合物。
在一些實施方案中，所述偶聯劑為碳二亞胺，例如EDCI。
一方面，本發明描述了下式(XV)的化合物，
式(XV) 其中， L1和L2分別獨立地為連接鍵或C(O)； R1和R2分別獨立地為烷基、烯基或炔基；其每一個任選被一個或多個取代基取代； X為-C(O)NH-、C(S)NH、-C(O)C1-3烷基C(O)NH-；或-C(O)C1-3烷基C(O)O-； m為0～11的整數，和 n為1～500的整數。
在一些實施方案中，L1和L2均為連接鍵。
在一些實施方案中，L1和L2均為C(O)。
在一些實施方案中，R1和R2分別獨立地為烷基，例如C6-C28烷基，如C10-C18烷基，如C13烷基、C14烷基、C15烷基或C16烷基。在一些實施方案中，R1和R2均為烷基，例如長度相同的直鏈烷基，如C6-C28烷基，如C10-C18烷基，如C13烷基、C14烷基、C15烷基或C16烷基。在一些優選的實施方案中，R1和R2均為C14烷基。
在一些實施方案中，式XV代表外消旋混合物。
在一些實施方案中，式XV的化合物具有例如至少約65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的R對映異構體過量。在一些實施方案中，式XV代表光學純『R』異構體。
在一些實施方案中，式XV的化合物具有例如至少約65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的S對映異構體過量。在一些實施方案中，式XV代表光學純『S』異構體。
在一些實施方案中，R1和R2分別獨立地為烯基，例如R1和R2分別獨立地為C6-C30烯基，或R1和R2分別為相同的烯基部分。在一些實施方案中，R1和R2分別包含單個雙鍵，例如為E或Z構型的單個雙鍵。
在一些實施方案中，R1和R2分別包含兩個雙鍵部分。在一些實施方案中，至少一個雙鍵具有Z構型。在一些實施方案中，兩個雙鍵均具有Z構型。在一些實施方案中，R1和R2中的至少一個為下式(II)，
式(II) 其中 x為1～8的整數；且 y為1～10的整數。在一些實施方案中，R1和R2均為式(II)。在一些實施方案中，至少一個雙鍵具有E構型，例如兩個雙鍵均具有E構型。在一些實施方案中，R1和R2中的至少一個為下式(III)，
式(III) 其中 x為1～8的整數；且y為1～10的整數。
在一些實施方案中，R1和R2分別包括三個雙鍵部分。在一些實施方案中，至少一個雙鍵具有Z構型。在一些實施方案中，至少兩個雙鍵具有Z構型。在一些實施方案中，三個雙鍵均具有Z構型。在一些實施方案中，R1和R2中的至少一個為下式(IV)
式(IV) 其中 x為1～8的整數；且 y為1～10的整數。在一些實施方案中，R1和R2均為式(IV)。在一些實施方案中，至少一個雙鍵具有E構型。在一些實施方案中，至少兩個雙鍵具有E構型。在一些實施方案中，三個雙鍵均具有E構型。在一些實施方案中，R1和R2中的至少一個為下式(V)
式(V) 其中 x為1～8的整數；且 y為1～10的整數。在一些實施方案中，R3和R4均為式(V)。
在一些實施方案中，X為-C(O)NH-，從而提供下式(XV′)的化合物
式(XV′) 在一些實施方案中，R1和R2分別獨立地為烷基，例如C6-C28烷基，如C10-C18烷基，如C13烷基、C14烷基、C15烷基或C16烷基。在一些實施方案中，R1和R2均為烷基，例如長度相同的直鏈烷基，如C6-C28烷基，如C10-C18烷基，如C13烷基、C14烷基、C15烷基或C16烷基。在一些實施方案中，R1和R2均為C14烷基。
在一些實施方案中，X為-C(O)C1-3烷基C(O)O-。
在一些實施方案中，m為1～10的整數，例如2～4的整數，或整數2。
在一些實施方案中，n為1～500的整數，例如40～400的整數，100～350的整數，40～50的整數或42～47的整數。
在一些實施方案中，所述化合物為式(XV′)的化合物，
式(XV′) 其中，L1和L2均為連接鍵。在一些實施方案中，R1和R2分別獨立地為烷基，例如C6-C28烷基，如C10-C18烷基，如C14烷基、C15烷基或C16烷基。在一些實施方案中，R1和R2均為烷基，例如長度相同的直鏈烷基，如C6-C28烷基，如C10-C18烷基，如C14烷基、C15烷基或C16烷基。在一些優選的實施方案中，R1和R2均為C14烷基。在一些實施方案中，m為1～10的整數，例如2～4的整數，或整數2。在一些實施方案中，n為1～500的整數，例如40～400的整數或40～50的整數。
在一些實施方案中，該化合物為式(XV′)的化合物，其中L1和L2均為連接鍵，R1和R2均為烷基(例如C6-C28烷基，如C10-C18烷基，優選C14烷基)，n為約40～400的整數。
在一些實施方案中，該化合物具有下式(XVI)結構
式(XVI) 其中，重複PEG部分的平均分子量為2000，n值在42～47之間。
在一些實施方案中，式XV的化合物具有例如至少約65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的R對映異構體過量。在一些實施方案中，式XVI的化合物為具有優選的『R』絕對構型的立體異構體。
一方面，本發明描述了與膽固醇部分結合的PEG脂質。例如，下式(XX)的化合物
式(XX) X為-C(O)NH-、C(S)NH、-C(O)C1-3烷基C(O)NH-；或-C(O)C1-3烷基C(O)O-； m為0～11的整數，和 n為1～500的整數。
在一些實施方案中，與式(XX)中膽固醇相連的O為膽固醇的一部分。
在一些實施方案中，X為-C(O)NH-或-C(O)C1-3烷基C(O)O-。
在一些實施方案中，式(XX)的化合物為下式(XX′)。

式(XX′) 一方面，本發明描述了與靶向部分(例如糖殘基)結合的PEG脂質。例如，使用靶向部分在OMe末端修飾式(XV)或(XX)的化合物。在一些實施方案中，靶向部分通過接頭(linker)與PEG部分結合。下式(XXI)和(XXII)提供了被靶向了的PEG脂質的實例。
在一些實施方案中，所述脂質為式(XXI)的化合物，
式(XXI) 其中， L1和L2分別獨立地為連接鍵或C(O)； R1和R2分別獨立地為烷基、烯基或炔基；其每一個任選被一個或多個取代基取代； X和X′分別獨立地為-C(O)NH-、-NHC(O)-、C(S)NH、C(S)NH、-C(O)C1-3烷基C(O)NH-、NHC(O)C1-3烷基C(O)-、-C(O)C1-3烷基C(O)O-、NHC(O)C1-3烷基-或C1-3烷基C(O)NH-； m為0～11的整數，和 n為1～500的整數； p為1～6的整數，例如p為3； T為如糖基部分的靶向部分(例如，糖殘基)。示例性的靶向部分包括
在一些實施方案中，L1和L2均為連接鍵。
在一些實施方案中，L1和L2均為C(O)。
在一些實施方案中，R1和R2分別獨立地為烷基，例如C6-C28烷基，如C10-C18烷基，如C14烷基、C15烷基或C16烷基。在一些實施方案中，R1和R2均為烷基，例如長度相同的直鏈烷基，如C6-C28烷基，如C10-C18烷基，如C14烷基、C15烷基或C16烷基。在一些實施方案中，R1和R2均為C14烷基。
在一些實施方案中，式(XXI)代表外消旋混合物。
在一些實施方案中，式(XXI)的化合物具有例如至少約65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的R對映異構體過量。在一些實施方案中，式(XXI)代表光學純『R』異構體。
在一些實施方案中，式(XXI)的化合物具有例如至少約65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的S對映異構體過量。在一些實施方案中，式(XXI)代表光學純『S』異構體。
在一些實施方案中，R1和R2分別獨立地為烯基，例如R1和R2分別獨立地為C6-C30烯基，或R1和R2分別為相同的烯基部分。在一些實施方案中，每個R1和R2包含單個雙鍵，例如為E構型或Z構型的單個雙鍵。
在一些實施方案中，R1和R2分別包含兩個雙鍵部分。在一些實施方案中，至少一個雙鍵具有Z構型。在一些實施方案中，兩個雙鍵均具有Z構型。在一些實施方案中，R1和R2中的至少一個為下式(II)
式(II) 其中 x為1～8的整數；且 y為1～10的整數。在一些實施方案中，R1和R2均為式(II)。在一些實施方案中，至少一個雙鍵具有E構型，例如兩個雙鍵均具有E構型。在一些實施方案中，R1和R2中的至少一個為下式(III)
式(III) 其中 x為1～8的整數；且y為1～10的整數。
在一些實施方案中，R1和R2分別包括三個雙鍵部分。在一些實施方案中，至少一個雙鍵具有Z構型。在一些實施方案中，至少兩個雙鍵具有Z構型。在一些實施方案中，三個雙鍵均具有Z構型。在一些實施方案中，R1和R2中的至少一個為下式(IV)，
式(IV) 其中 x為1～8的整數；且 y為1～10的整數。在一些實施方案中，R1和R2均為式(IV)。在一些實施方案中，至少一個雙鍵具有E構型。在一些實施方案中，至少兩個雙鍵具有E構型。在一些實施方案中，三個雙鍵均具有E構型。在一些實施方案中，R1和R2中的至少一個為下式(V)，
式(V) 其中 x為1～8的整數；且 y為1～10的整數。在一些實施方案中，R3和R4均為式(V)。
在一些實施方案中，p為3。
在一些實施方案中，L為NHC(O)C1-6烷基(例如NHC(O)C3烷基)。
在一些實施方案中，式(XXI)的化合物為下式(XXI′)的化合物。

式(XXI′) 在一些實施方案中，所述脂質為式(XXII)的化合物，
式(XXII) 其中， X和X′分別獨立地為-C(O)NH-、-NHC(O)-、C(S)NH、C(S)NH、-C(O)C1-3烷基C(O)NH-、NHC(O)C1-3烷基C(O)-、-C(O)C1-3烷基C(O)O-、NHC(O)C1-3烷基-或C1-3烷基C(O)NH-； m為0～11的整數，和 n為1～500的整數。
p為1～6的整數，例如p為3； T為如糖基部分的靶向部分(例如，糖殘基)。示例性的靶向部分包括
在一些優選的實施方案中，式(XXII)的化合物為下式(XXII′)的化合物。

式(XXII′) 一方面，本發明描述了締合複合物，其包含化合物製品和核酸，其中所述化合物製品包含本文所述的化合物(例如，式(I)的化合物或式(X)的化合物)，所述核酸為例如RNA(單鏈或雙鏈RNA，例如siRNA或dsRNA或DNA)。在一些實施方案中，所述締合複合物為脂質複合物或脂質體。在一些實施方案中，所述締合複合物包括一個或多個其他組分，例如靶向部分、膜融合脂質、聚乙二醇化脂質(例如本文所述的PEG-脂質，如式(XV)、(XV′)或(XVI)的PEG-脂質)或結構性組分。在一些實施方案中，PEG-脂質為如本文所述的被靶向了的PEG-脂質，例如式(XXI)、(XXI′)、(XXII)或(XXII′)的化合物。
一方面，本發明描述了形成脂質體的方法，該方法包括在存在緩衝劑的條件下使包含本文所述化合物(例如本文所述的脂質，如式(I)或式(X)的化合物)的脂質製品與治療劑相接觸，其中所述緩衝劑 具有足夠的強度以使式I分子中所有的氨基充分質子化； 以100～300mM存在； 其存在濃度提供的質子化作用顯著強於20mM的相同緩衝劑。
一方面，本發明描述了通過本文所述方法製備的脂質體。
一方面，本發明描述了形成脂質體的方法，該方法包括在包含至少約90％乙醇的混合物中使本文所述的脂質製品(例如包含式(I)化合物或式(X)化合物的脂質製品)與治療劑相接觸，並將所述脂質製品與治療劑快速混合以提供直徑小於約200uM的顆粒。在一些實施方案中，所述顆粒的直徑小於約50uM。
一方面，本發明描述了形成脂質體的方法，該方法包括在存在緩衝劑的條件下使本文所述脂質製品(例如包含式(I)化合物或式(X)化合物的脂質製品)與治療劑相接觸，其中所述緩衝劑的濃度為約100mM～約300mM。
一方面，本發明描述了包含本文所述製品(例如包含式(I)化合物或式(X)化合物的脂質製品)和核酸的脂質體。在一些實施方案中，所述製品還包括聚乙二醇化的脂質，例如本文所述的PEG-脂質，例如式(XV)、(XV′)或(XVI)的PEG-脂質。在一些實施方案中，PEG-脂質為如本文所述的被靶向了的PEG脂質，例如式(XXI)、(XXI′)、(XXII)或(XXII′)的化合物。在一些實施方案中，所述製品還包括結構性部分，例如膽固醇。在一些實施方案中，締合複合物的所述製品包括式(I)、(XV)的化合物和膽固醇。在一些實施方案中，所述核酸為siRNA，例如所述核酸為經修飾而具有降解抗性的siRNA，所述核酸為通過多糖骨架而被修飾的siRNA，或者所述siRNA靶向ApoB基因。
在一些實施方案中，所述脂質體還包含結構性部分和聚乙二醇化脂質(例如本文所述的PEG-脂質)，其中製品(例如包含式(I)化合物或式(X)化合物的脂質製品)、結構性部分(例如膽固醇)、聚乙二醇化脂質與核酸的重量比例為(8-22)∶(4-10)∶(4-12)∶(0.4-2.2)。在一些實施方案中，所述結構性部分為膽固醇。在一些實施方案中，所述比例為(10-20)∶(0.5-8.0)∶(5-10)∶(0.5-2.0)，例如15∶0.8∶7∶1。在一些實施方案中，脂質體的平均直徑在10nm～750nm之間，脂質體的平均直徑在30～200nm之間，或脂質體的平均直徑在50～100nm之間。在一些實施方案中，該製品小於未反應脂質的15重量％。在一些實施方案中，所述製品(例如包含式(I)化合物或式(X)化合物的脂質製品)、結構性部分(如膽固醇)和PEG脂質的比例為約42/48/10(摩爾比例)。在一些實施方案中，總脂質與核酸(例如siRNA)的比例為約7.5重量％。
在一些實施方案中，本文所述的締合複合物的總賦形劑與核酸的重量比為小於約15∶1，例如為約10∶1、約7.5∶1或約5∶1。
一方面，本文描述了包含多種脂質部分和治療劑的締合複合物的形成方法，所述方法包括在乙醇和NaOAc緩衝水溶液中混合多種脂質部分以提供顆粒物；向顆粒物中添加治療劑，從而形成締合複合物。
在一些實施方案中，所提供的所述脂質部分存在於100％的乙醇溶液中。
在一些實施方案中，所述多種脂質部分包括陽離子脂質。
在一些實施方案中，陽離子脂質為本文所述的脂質，例如所述陽離子脂質為以下脂質之一或其混合物。

在一些優選的實施方案中，所述陽離子脂質為
在一些實施方案中，所述多種脂質部分包括PEG-脂質，例如具有以下結構的PEG-脂質
其中， L1和L2分別獨立地為連接鍵或C(O)； R1和R2分別獨立地為烷基、烯基或炔基；其每一個任選被一個或多個取代基取代； X為-C(O)NH-、C(S)NH、-C(O)C1-3烷基C(O)NH-；或-C(O)C1-3烷基C(O)O-； m為0～11的整數，和 n為1～500的整數。
在一些優選的實施方案中，PEG-脂質為式(XVI)的PEG脂質，其中重複PEG部分的平均分子量為2000(例如n值在42～47之間)，或為下述脂質
在一些實施方案中，所述多種脂質部分包括結構性脂質，例如所述結構性脂質為膽固醇。
在一些實施方案中，PEG-脂質為如本文所述的靶向PEG-脂質，例如式(XXI)、(XXI′)、(XXII)或(XXII′)的化合物。
在一些實施方案中，所述方法還包括擠出包含顆粒的脂質，例如在添加治療劑前進行擠出。
在一些實施方案中，所述治療劑為核酸，例如siRNA，如經修飾而具有降解抗性的siRNA，通過多糖骨架而被修飾的siRNA，或者與親脂部分結合的siRNA。在一些實施方案中，siRNA靶向ApoB基因。
在一些實施方案中，所述締合複合物包含陽離子脂質、結構性脂質、PEG-脂質和核酸。在一些實施方案中，所述陽離子脂質、結構性脂質、PEG-脂質和核酸的摩爾比為(36-48)∶(42-54)∶(6-14)，例如(38-46)∶(44-52)∶(8-12)或約42∶48∶10。在一些實施方案中，總賦形劑與核酸的重量比為小於約15∶1，例如約10∶1，約7.5∶1或約5∶1。在一些優選的實施方案中，所述陽離子脂質具有以下結構
PEG-脂質為式(XVI)的PEG脂質，其中重複PEG部分的平均分子量為2000(例如n值在42～47之間)，或具有以下結構
所述結構性脂質為膽固醇，例如，其中所述陽離子脂質、結構性脂質和PEG-脂質的摩爾比為(38-46)∶(44-52)∶(8-12)，例如約42∶48∶10。在一些優選的實施方案中，總賦形劑與核酸的重量比小於約15∶1，例如約10∶1，約7.5∶1或約5∶1。
另一方面，本發明描述了由本文所述方法製備的締合複合物。
另一方面，本發明描述了包含陽離子脂質、結構性脂質、PEG-脂質和核酸的締合複合物，其中所述陽離子脂質為以下脂質之一或其混合物
所述PEG-脂質為式(XVI)的PEG脂質，其中重複PEG部分的平均分子量為2000(例如n值在42～47之間)，或具有以下結構
所述結構性脂質為膽固醇。在一些優選的實施方案中，所述核酸為siRNA。
在一些優選的實施方案中，所述陽離子脂質具有下式的結構
在一些優選的實施方案中，所述陽離子脂質、結構性脂質(如膽固醇)、PEG-脂質和核酸的摩爾比為(36-48)∶(42-54)∶(6-14)，例如(38-46)∶(44-52)∶(8-12)或約42∶48∶10。在一些優選的實施方案中，總賦形劑與核酸的重量比小於約15∶1，例如為約10∶1，約7.5∶1或約5∶1。
在一些實施方案中，本文所述的締合複合物的平均直徑或粒徑小於約25000nm，例如約20～200nm，約60nm或約50nm。
在一些實施方案中，在本文所述締合複合物中施用的核酸的血清半衰期(例如，在體外)至少為約4小時，例如至少約6小時、至少約8小時、至少約12小時、至少約24小時、至少約2天、至少約3天、至少約4天、至少約1周、至少約2周或至少約3周。
一方面，本發明描述了包含本文所述製品的藥學上可接受的組合物。
一方面，本發明描述了包含本文所述脂質體的藥學上可接受的組合物。
一方面，本發明描述了哺乳動物的治療方法，該方法包括向所述哺乳動物施用治療量的藥學上可接受的組合物，例如締合複合物(如本文所述的脂質體)。
定義 術語「滷代」或「滷素」是指任意的氟、氯、溴或碘自由基。
術語「烷基」是指包含指定數量碳原子的直鏈或支鏈烴鏈。例如，C1-C36烷基是指該基團可以具有1～36(包括1和36)個碳原子。術語「滷代烷基」是指其一個或多個氫原子被滷素取代的烷基，並包括其所有氫原子均被滷素取代(例如，全氟烷基)的烷基部分。術語「芳基烷基」或「芳烷基」是指其烷基氫原子被芳基基團取代的烷基。芳烷基包括其多於一個氫原子被芳基基團取代的基團。「芳基烷基」或「芳烷基」的實例包括苯甲基、2-苯乙基、3-苯丙基、9-芴基、二苯甲基和三苯甲基基團。
術語「亞烷基」是指二價烷基，例如-CH2-、-CH2CH2-、-CH2CH2CH2-、-CH2CH2CH2CH2-、-CH2CH2CH2CH2CH2-和-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-。
術語「烯基」是指包含2～36個碳原子並具有一個或多個雙鍵的直鏈或支鏈的烴鏈。烯基基團的實例包括但不限於烯丙基、丙烯基、2-丁烯基、3-己烯基和3-辛烯基基團。構成雙鍵的碳原子之一可任選地為烯基取代基的連接點。術語「炔基」是指包含2～36個碳原子並以具有一個或多個三鍵為特徵的直鏈或支鏈的烴鏈。炔基基團的實例包括但不限於乙炔基、炔丙基和3-己炔基。構成三鍵的碳原子之一可任選地為炔基取代基的連接點。
術語「取代基」是指在烷基、環烷基、烯基、炔基、雜環基、雜環烯基、環烯基、芳基或雜芳基基團的任意原子位置進行「取代」的基團。任何原子均可被取代。適合的取代基包括但不限於烷基(例如C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12直鏈或支鏈烷基)，環烷基、滷代烷基(例如，諸如CF3的全氟烷基)，芳基、雜芳基、芳烷基、雜芳烷基、雜環基、烯基、炔基、環烯基、雜環烯基、烷氧基、滷代烷氧基(例如，諸如OCF3的全氟烷氧基)、滷代、羥基、羧基、羧酸酯、氰基、硝基、氨基、烷氨基、SO3H、硫酸酯、磷酸酯、亞甲二氧基(-O-CH2-O-，其中氧原子與同一碳原子相連(偕二取代，geminal substitution))、亞乙二氧基、氧代、硫代(例如C＝S)、亞氨基(烷基亞氨基、芳基亞氨基、芳烷基亞氨基)、S(O)n烷基(n為0-2)、S(O)n芳基(n為0-2)、S(O)n雜芳基(n為0-2)、S(O)n雜環基(n為0-2)、胺(單胺、二胺、烷基胺、環烷基胺、芳烷基胺、雜芳烷基胺、芳基胺、雜芳基胺及其組合)、酯(烷基酯、芳烷基酯、雜芳烷基酯、芳基酯、雜芳基酯)、醯胺(單醯胺、二醯胺、烷基醯胺、芳烷基醯胺、雜芳烷基醯胺、芳基醯胺、雜芳基醯胺及其組合)、磺醯胺(單磺醯胺、二磺醯胺、烷基磺醯胺、芳烷基磺醯胺、雜芳基磺醯胺及其組合)。一方面，基團上的取代基獨立地為上述取代基中任意一種或任意亞類。另一方面，取代基本身可被上述取代基中的任意一種取代。
本文所用術語「結構異構體」是指分子式相同但結構式不同的任意兩種或多種化學化合物，例如丙醇和異丙醇。
本文所用術語「幾何異構體」或「立體異構體」是指原子和連接鍵(即原子間的連接相同)的數量和種類相同，但原子空間排列不同的兩種或多種化合物，例如雙鍵的順式和反式異構體、對映結構體和非對映異構體。
為了方便起見，下文提供了本說明書、實施例和權利要求書中使用的特定術語和短語的含義。如果某術語在本說明書其它部分中的用法與本節中提供的定義之間有明顯差異，應以本節中的定義為準。
「G」、「C」、「A」和「U」通常分別代表包含作為鹼基的鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶的核苷酸。然而，應理解的是術語「核糖核苷酸」或「核苷酸」也可指如下文詳述的修飾核苷酸，或代用替換部分(surrogate replacementmoiety)。技術人員熟知可將鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶替換成其它部分而基本不改變包含具有此類替換部分的核苷酸的寡核苷酸的鹼基配對性質。例如但不限於包含作為其鹼基的次黃嘌呤的核苷酸可與包含腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶的核苷酸進行鹼基配對。因此，在本發明的核苷酸序列中，包含尿嘧啶、鳥嘌呤或腺嘌呤的核苷酸可被替換成包含如次黃嘌呤的核苷酸。包含此類替換部分的序列是本發明的實施方案。
本文所用的「靶序列」是指相應基因轉錄過程中形成的mRNA分子核苷酸序列中的連續部分，包括作為初級轉錄產物的RNA加工產物的mRNA。靶區域是指靶基因中與RNAi試劑的一部分互補的片段。
本文所用術語「包含序列的鏈」是指包含核苷酸鏈的寡核苷酸，其中通過以標準的核苷酸命名法表示的序列來闡述該核苷酸鏈。
除非另有說明，否則在用於描述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列的關係時，本文所用術語「互補」是指包含所述第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在某些條件下與包含所述第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸雜交並形成雙螺旋結構的能力，本領域技術人員可理解這一點。例如，此類條件可以是嚴格條件，其中所述嚴格條件可包括400mM NaCl、40mM PIPES(pH6.4)、1mM EDTA，在50℃或70℃下持續12-16小時，隨後進行清洗。也可應用其它條件，例如可能在生物體內遇到的生理相關條件。本領域技術人員能夠根據雜交核苷酸的最終應用決定最適合於兩序列互補試驗的系列條件。
這包括包含所述第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸與包含所述第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在第一和第二核苷酸序列的全長範圍內的鹼基配對。本文中，這些序列可被稱為彼此「完全互補」。然而，在本文中當提到所述第一序列與所述第二序列「基本互補」時，所述兩個序列可完全互補或在雜交時形成一個或多個，但通常不超過4個、3個或2個錯配鹼基對，同時保留在與其最終應用最相關的條件下的雜交能力。但是，考慮到互補的定義，當兩個寡核苷酸經設計而在雜交後形成一個或多個單鏈懸端時，這種懸端不應該被認做是錯配。例如，在包含一條長度為21個核苷酸的寡核苷酸和另一條長度為23個核苷酸的寡核苷酸的寡核苷酸試劑中，較長寡核苷酸包含與較短寡核苷酸完全互補的21個核苷酸的序列，在本發明的目的下，這種情況也被稱為「完全互補」。
只要其雜交能力能夠滿足上述需求，本文所用「互補」序列也可以包含或完全由非Watson-Crick鹼基對形成和/或由非天然和修飾核苷酸形成的鹼基對形成。
在本文中可以根據寡核苷酸試劑的正義鏈與反義鏈間的鹼基配對，或寡核苷酸試劑的反義鏈與靶序列間的鹼基配，使用術語「互補」、「完全互補」和「基本互補」，所述術語可根據其所處上下文進行理解。
本文所用的與信使RNA(mRNA)的「至少一部分基本互補」的多核苷酸是指於與目標mRNA的連續片段基本互補的多核苷酸。例如，如果多核苷酸的序列與編碼ApoB的mRNA中的非中斷片段基本互補，那麼所述多核苷酸與ApoB mRNA的至少一部分互補。
本文所用的「寡核苷酸試劑」是指相對其靶標為反義的核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA)的單鏈寡聚物或多聚物，或RNA和DNA二者的單鏈寡聚物或多聚物，或其修飾物。該術語包括由天然存在的核酸鹼基、糖和核苷間(骨架)共價連接構成的寡核苷酸，以及具有功能類似的非天然存在鹼基的寡核苷酸。此類修飾或取代的寡核苷酸由於具有期望的性質，例如增加細胞攝取、增強對核酸靶標的親和性，以及增強在核酸酶存在條件下的穩定性，因而通常優於天然形式。
寡核苷酸試劑包括靶向核酸(NAT)的寡核苷酸試劑和靶向蛋白質(PT)的寡核苷酸試劑。NAT和PT寡核苷酸試劑是指核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA)的單鏈寡聚物或多聚物，或RNA和DNA二者的單鏈寡聚物或多聚物，或其修飾物。該術語包括由天然存在的核酸鹼基、糖和核苷間(骨架)共價連接構成的寡核苷酸，以及具有功能類似的非天然存在鹼基的寡核苷酸。此類修飾或取代的寡核苷酸由於具有期望的性質，例如增加細胞攝取、增強對核酸靶標的親和性，和/或增強在核酸酶存在的條件下的穩定性，因而通常優於天然形式。所設計的結合特異RNA或DNA靶標的NAT與靶核酸中的10個、20個或30個或更多個鹼基基本互補，例如至少70％、80％、90％或100％互補，並且包括反義RNA、小RNA(microRNA)、antagomir和其他可調節表達的非雙鏈結構。其他NAT寡核苷酸試劑包括外部指導序列(external guide sequence，EGS)寡核苷酸(oligozymes)、脫氧核糖核酸酶(DNAzyme)和核酶。NAT寡核苷酸試劑可靶向任何核酸，例如miRNA、miRNA前體、mRNA前體、mRNA或DNA。這些NAT寡核苷酸試劑可能通過或可能不通過Watson-Crick互補與其靶標結合。PT寡核苷酸試劑優選通過三維相互作用的方式與蛋白質靶標結合，從而調節蛋白質活性。其包括誘餌(decoy)RNA和適體(aptamer)等。
儘管不希望被理論束縛，但寡核苷酸試劑可通過多種機制(包括依賴切割或不依賴切割的機制)中的一個或多個而發揮作用。基於切割的機制可以為RNAse H依賴性和/或可包括RISC複合物的功能。不依賴切割的機制包括基於佔據的轉錄休止(occupancy-based translational arrest)，例如可通過miRNA介導，或通過寡核苷酸試劑與蛋白質的結合(這與適體的行為類似)介導。也可通過改變對mRNA前體中剪接位點的選擇，將寡核苷酸試劑用於改變基因的表達。抑制剪接也可導致非正常加工的信使的降解，從而下調基因的表達。
本文所用術語「雙鏈RNA」或「dsRNA」是指核糖核酸分子的複合物，所述複合物具有雙鏈結構，其包含兩條反平行且如上所述的基本互補的核酸鏈。形成所述雙鏈結構的兩條鏈可以是同一條較大RNA分子的不同部分，或者是單獨的RNA分子。如果所述兩條鏈為單獨的RNA分子，在文獻中常將此類dsRNA稱為siRNA(「小幹擾RNA」)。如果所述兩條鏈為一個較大分子的部分，並且由此通過形成雙鏈結構的一條鏈的3』-末端與另一條鏈的5』-末端之間的非中斷核苷酸鏈相連接，那麼所述相連的RNA鏈被稱為「髮夾環」、「短髮夾RNA」或「shRNA」。如果所述兩條鏈通過形成雙鏈結構的一條鏈的3』-末端及相應另一條鏈的5』-末端之間的非中斷鏈之外的方式共價連接，那麼所述連接結構被稱為「接頭」。所述RNA鏈可具有相同或不同數量的核苷酸。鹼基對的最大數值為dsRNA中的最短鏈減去雙鏈中存在的任何懸端後的核苷酸數目。除雙鏈結構之外，dsRNA可包含一個或多個核苷酸懸端。此外，在本說明書中使用的「dsRNA」可包括對核糖核苷酸的化學修飾(包括對多個核苷酸的修飾，並包括本文公開的或本領域已知的所有修飾類型)。基於本說明書和權利要求書的目的，「dsRNA」涵蓋用於siRNA類型分子的所有此類修飾。
本文所用「核苷酸懸端」是指當dsRNA的一條鏈的3』末端超過另一條鏈的5』末端或反之時從dsRNA的雙鏈結構突出的一個或多個未配對核苷酸。「平端」或「平末端」是指在dsRNA的末端沒有未配對的核苷酸，即沒有核苷酸懸端。「平末端化的」dsRNA是指在其全長範圍均為雙鏈的dsRNA，即在此分子任一個末端均沒有核苷酸懸端。為清楚起見，在確定siRNA是否具有懸端或被平端化時，不考慮結合到siRNA的3′-末端或5′-末端的化學帽或非核苷酸的化學部分。
術語「反義鏈」是指dsRNA中的一條鏈，其包含與靶序列基本互補的區域。本文所用術語「互補區」是指反義鏈上與本文所定義的序列(例如靶序列)基本互補的區域。如果互補區與靶序列不完全互補，則最能容許的錯配發生在末端區域，並且如果存在錯配，則通常位於末端區域，或者例如5′和/或3′末端的6、5、4、3或2個核苷酸之內。
本文所用術語「正義鏈」是指dsRNA中的一條鏈，其包含與所述反義鏈的一個區域基本互補的區域。
當術語「沉默」和「抑制表達」是針對靶基因時，它們在本文指至少部分抑制所述基因的表達，通過與第二細胞或細胞群相比可以從第一細胞或細胞群中分離的轉錄自所述基因的mRNA數量的減少來表示，其中所述第一細胞或細胞群中轉錄所述基因但其已經被處理從而抑制所述基因的表達，所述第二細胞或細胞群與所述第一細胞或細胞群基本相同但其沒有作此處理(對照細胞)。抑制度通常用以下方式表示
或者，將抑制度表示為與基因轉錄在功能上相關的參數的減小，例如所述基因編碼的細胞分泌蛋白質的量，或顯示特定表型的細胞數量(例如凋亡細胞的數量)。理論上講，可以組成型地或通過基因工程方法或任意合適的試驗在表達所述靶標的任意細胞中測定基因沉默。然而，當需要參考以確定給定dsRNA是否以特定程度抑制所述基因的表達並因此屬於本發明的範圍時，以下實施例中提供的試驗可作為此類參考。
例如，在某些情況下，通過施用本發明的雙鏈寡核苷酸將所述基因的表達抑制至少約20％、25％、35％或50％。在一些實施方案中，通過施用本發明的雙鏈寡核苷酸將所述基因抑制至少約60％、70％或80％。在一些實施方案中，通過施用本發明的雙鏈寡核苷酸將所述基因抑制至少約85％、90％或95％。
本文所用術語「治療」(「treat」，「treatment」)等是指可通過下調特定基因而介導的病理過程的緩解或減輕。在本發明的上下文中只要它涉及下文陳述的其它任意病症(除可通過下調所述基因介導的病理過程之外的病症)，術語因而介導的病理過程的緩解或減輕。在本發明的上下文中只要它涉及下文陳述的其它任意病症(除可通過下調所述基因介導的病理過程之外的病症)，術語「治療」等表示緩解或減輕至少一種與所述病症相關的症狀，或者減緩或逆轉所述病症的進程。
本文所用短語「治療有效量」和「預防有效量」是指對可通過下調所述基因介導的病理過程或可通過下調所述基因介導的病理過程的一個明顯症狀的治療、預防或控制提供治療效果的量。治療有效的特定量可簡單地由普通醫務工作者來確定，並可根據本領域已知的因素進行改變，所述因素可以為例如可通過下調所述基因介導的病理過程的類型，患者的病史和年齡，可通過下調所述基因表達介導的病理過程的階段，以及對可通過下調所述基因表達介導的病理過程的抗性藥物的施用。在治療受試者的上下文中，有效量足以產生治療效果。本文所用術語「治療效果」是指在患有細胞增殖性疾病患者的醫療中，促進或增強受試者的健康狀態的任何效果。此類效果的非窮舉性實例包括使患者的生命延長任意一段時間，降低或延緩疾病向腫瘤的發展，減少增生，降低腫瘤生長，延緩轉移，減低癌細胞、腫瘤細胞或任何其他增生性細胞的增殖速度，在任何處理細胞中或受處理細胞影響的任何細胞中誘導凋亡，和/或減少受試者因所患病症而造成的疼痛。
本文所用「藥物組合物」包含藥理學有效量的寡核苷酸試劑和藥學上可接受的載體。本文所用「藥理學有效量」、「治療有效量」或「有效量」是指能夠產生有效的藥理學、治療性或預防性結果的RNA量。例如，如果認為使疾病或病症相關的可測量參數下降至少25％的給定臨床治療為有效治療，那麼用於治療所述疾病或病症的藥物的治療有效量是將所述參數減少至少25％時所必需的量。
術語「藥學上可接受的載體」是指施用治療劑所用的載體。此類載體包括但不限於鹽溶液、緩衝鹽溶液、葡萄糖、水、甘油、乙醇和其組合，並在下文中有詳細描述。所述術語明確地排除了細胞培養基。
以下附圖和闡述對本發明的一個或多個實施方案進行了詳細說明。本發明的其他特徵、目標和優點將體現於說明書、附圖和權利要求書中。



圖1顯示對多種ND98組合物的功效進行比較的柱形圖。
圖2顯示對多種ND98組合物的功效進行比較的柱形圖。
圖3顯示ND98的六尾化異構體(6-tailed isomer)功效的柱形圖。
圖4顯示對使用兩種不同方法製備的締合複合物的功效進行比較的柱形圖。
圖5顯示多種PEG脂質部分，包括鏈長度不同的那些PEG脂質部分。
圖6顯示對締合複合物的功效進行比較的柱形圖。
圖7顯示隨著脂質/siRNA比例的減小對複合物的耐受性進行比較的柱形圖。
圖8負載核酸的締合複合物製備方法的流程圖。
圖9顯示以FVII和ApoB為兩個靶標的siRNA功效的柱形圖。
圖10負載核酸的締合複合物製備方法的流程圖。
圖11顯示沉默試驗中締合複合物粒徑對核酸功效影響的柱形圖。
圖12a和圖12b對未經配製和配製形式的核酸治療劑的血清半衰期進行比較的柱形圖。
圖13比較具有不同鏈長度的PEG脂質的締合複合物功效的柱形圖。


發明內容
本文描述了用於施予基於核酸的治療劑(如siRNA)的脂質製品和給藥系統。
陽離子脂質化合物和脂質製品 多胺脂質製品 申請人:現已發現某些多胺脂質部分為核酸(如siRNA)的施予提供了期望的性質。例如，在一些實施方案中，使脂質部分與靶向VII因子的siRNA複合，並施用於如小鼠的動物。隨後對分泌的血清VII因子水平進行定量(施用後24小時)，其中VII因子的沉默程度表示siRNA體內遞送的程度。因此，優選提供增強的核酸(如siRNA)體內遞送的脂質。特別地，申請人現已發現具有本文所述取代的多胺可具有遞送siRNA的理想性質，例如生物利用度、生物降解性和耐受性。
在一個實施方案中，脂質製品包含具有多個取代基的多胺部分，例如與其相連的丙烯醯胺或丙烯酸酯取代基。例如，脂質部分可包括如下所示的多胺部分，
其中，例如使用取代基取代一個或多個氫原子，所述取代基包括長鏈的烷基、烯基或炔基部分，並且，在一些實施方案中對所述取代基進行進一步的取代。Xa和Xb為亞烷基。在一些實施方案中，Xa和Xb具有相同的鏈長度，例如Xa和Xb均為亞乙基。在其他實施方案中，Xa和Xb具有不同的鏈長度。在一些實施方案中，多胺包括多個Xa部分時，Xa隨一次或多次的出現而不同。例如，多胺為精胺時，Xa在一次出現時為亞丙基，而在另一次出現時為亞丁基，Xb為亞丙基。
申請人:現已發現在一些情況下需要對多胺進行相對較高程度的取代。例如在一些實施方案中，申請人現已發現在所述製品中，如果至少80％(例如，至少約85％、至少約90％、至少約95％，、至少約97％、至少約98％、至少約99％或基本全部)的多胺中有至少n+2個氫原子被取代基取代，那麼該多胺製品可提供期望的性質，例如用於核酸(如siRNA)的施用。
在一些情況下，需要(優選)多胺氮原子上的取代基存在一個或多個雜原子。
在一些實施方案中，製品包含式(I)的化合物或其藥學上可接受的鹽，
式(I) Xa和Xb在每次出現時分別獨立地為C1-6亞烷基；n為0、1、2、3、4或5；R分別獨立地為H，
其中，在所述製品中，至少約80％的式(I)化合物分子中的至少n+2個R基團不是H；m為1、2、3或4；Y為O、NR2或S；R1為任選被取代的烷基、烯基或炔基；和R2為任選被取代的H、烷基、烯基或炔基；前提是，如果n＝0，那麼至少n+3個R基團不是H。
如上所述，該製品包括含對稱和不對稱多胺衍生物的分子。因此，Xa在每次出現時均為獨立地，且Xb不受Xa的限制。例如，n＝2時，Xa既可以每次出現都相同，也可以每次出現都不同，或者在某些出現中相同而在一次或多次其他出現中不同。Xb不受Xa的限制，與每種多胺衍生物中Xa出現的次數無關。Xa不受Xb的限制，其每次出現時可以為亞甲基、亞乙基、亞丙基、亞丁基、亞戊基或亞己基。示例性的多胺衍生物包括衍生自N1，N1′-(乙烷-1，2-二基)二乙烷-1，2-二胺(N1，N1′-(ethane-1，2-diyl)diethane-1，2-diamine)、乙烷-1，2-二胺、丙烷-1，3-二胺、精胺、亞精胺、腐胺和N1-(2-氨基乙基)-丙烷-1，3-二胺的那些多胺。優選的多胺衍生物包括丙烷-1，3-二胺和N1，N1′-(乙烷-1，2-二基)二乙烷-1，2-二胺。
使用至少n+2個非H的R基團取代式(I)的多胺。通常每個非氫R基團包括烷基、烯基或炔基部分，其任選地被一個或多個取代基取代並通過接頭與多胺衍生物的氮相連。適合的接頭包括醯胺、酯、硫酯、碸、亞碸、醚、胺和硫醚。在很多情況下，接頭部分通過亞烷基部分(例如亞甲基、亞乙基、亞丙基或亞丁基)與多胺的氮相連。例如，醯胺或酯接頭通過亞甲基或亞乙基部分與多胺的氮相連。
優選的胺取代基的實例如下所示
在通過亞乙基基團連接胺和接頭-R1部分的情況下，可將1，4-共軛的前體丙烯酸酯或丙烯醯胺與多胺反應以提供取代的多胺。在通過亞甲基基團連接胺和接頭-R1部分的情況下，可將包含α-滷代取代基的醯胺或酯(例如α-氯代部分)與多胺反應以提供取代的多胺。在優選的實施方案中，R2為H。
非H的R基團均需要如上提供的R1部分。通常，R1部分為長鏈部分，例如C6-C32烷基、C6-C32烯基或C6-C32炔基。
在一些優選的實施方案中，R1為烷基部分。例如，R1為C10-C18烷基，如C12烷基。特別優選的R基團的實例如下所示
包含式(I)化合物的試劑可以是多種式(I)化合物的混合物。例如，該製品可包含多胺部分取代程度不同的式(I)化合物的混合物。然而經選擇，在本文所述製品中，至少約80％(例如，至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約97％、至少約98％、至少約99％或基本全部)式(I)化合物分子中的至少n+2個R基團不是H。
在一些實施方案中，製品包含具有兩個氨基基團的多胺部分，其中在該混合物中至少80％(例如，至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約97％、至少約98％、至少約99％或基本全部)的式(I)分子被3個非H的R基團取代。示例性的式(I)化合物如下所示
在一些優選的實施方案中，R為
在一些優選的實施方案中，R1為C10-18烷基或C10-C30烯基。
在一些實施方案中，製品包括具有三個或四個(如四個)氨基基團的多胺部分，其中至少約80％(例如，至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約97％、至少約98％、至少約99％或基本全部)的式(I)分子中有至少n+2個R基團不是H。下文中給出了具有4個氨基部分的式(I)化合物的實例。
所有(即n+4個)R基團都不是H的多胺部分的實例如下所示
在一些優選的實施方案中，R為
在一些優選的實施方案中，R1為C10-18烷基(例如，C12烷基)或C10-30烯基。
五個(即n+3個)R基團都不是H的多胺部分的實例如下所示
在一些優選的實施方案中，R為
在一些優選的實施方案中，R1為C10-18烷基(例如，C12烷基)或C10-30烯基。
四個(即n+2個)R基團都不是H的多胺部分的實例如下所示
在一些優選的實施方案中，R為
在一些優選的實施方案中，R1為C10-18烷基(例如，C12烷基)或C10-30烯基。
在一些優選的實施方案中，所述多胺為以下異構體(1)或(2)的化合物，優選異構體(1)的化合物。


異構體(1)

異構體(2) 在一些實施方案中，包含式(I)化合物的所述製品包含具有式(I)結構的分子的混合物。例如，該混合物可包含具有相同多胺核和不同R取代基(例如非H的R取代程度不同)的分子。
在一些實施方案中，本文所述製品包含具有單個多胺核的式(I)化合物，其中多胺核的各個R分別為R或如下的單個部分
因此，該製品包含具有式(I)結構的分子的混合物，其中所述混合物由具有不同數量的為H的R基團的式(I)多胺化合物和/或具有單個確定數量的非H的R基團的式(I)多胺化合物構成，其中所述式(I)化合物為多胺的結構異構體，例如上文所述的結構異構體。
在一些優選的實施方案中，所述製品包含式(I)的分子，其中至少約80％(例如，至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約97％、至少約98％、至少約99％或基本全部)的所述分子為一種結構異構體。
在一些實施方案中，所述製品包含兩種或更多種式(I)化合物的混合物。在一些實施方案中，所述製品為同一化學式的結構異構體的混合物。在一些實施方案中，所述製品為式(I)化合物的混合物，其中所述化合物的R取代基的化學性質不同。例如，所述製品可包含以下化合物的混合物
式(I) 其中n為0，且R分別獨立地為H或

和
式(I) 其中n為2，R分別獨立地為H或
在一些實施方案中，式(I)化合物為鹽的形式，例如藥學上可接受的鹽。例如，可在陰離子和本文所述化合物上的帶正電的取代基(如氨基)之間形成鹽。適合的陰離子包括氟化物、氯化物、溴化物、碘化物、硫酸根、硫酸氫根、硝酸根、磷酸根、檸檬酸根、甲磺酸根、三氟乙酸根、乙酸根、延胡索酸根、油酸根、戊酸根、馬來酸根、草酸根、異煙酸根、乳酸根、水楊酸根、酒石酸根、丹寧酸根、泛酸根、酒石酸氫根、抗壞血酸根、琥珀酸根、龍膽酸根(gentisinate)、葡糖酸根、葡糖二酸根(glucaronate)、糖酸根、甲酸根、苯甲酸根、穀氨酸根、乙磺酸根、苯磺酸根、對甲苯磺酸根和雙羥萘酸根(pamoate)。在一些優選的實施方案中，式(I)的化合物為氫滷酸鹽，例如鹽酸鹽。
式(I)的化合物也可以以水合物(例如，(H2O)n)和溶劑化物的形式存在，這也包含在本公開的範圍之內。
可生物切割的陽離子脂質 申請人:現已發現可將包含一個或多個生物可切割部分的某些陽離子脂質(例如脂質體)用作締合複合物中的組分，以遞送核酸治療劑(例如，dsRNA)。例如，本文公開了在體內可被切割的陽離子脂質，例如通過如酯酶、醯胺酶或二硫化物切割酶(disulfide cleaving enzyme)的酶而被切割。在一些情況下，對所述脂質進行化學切割，例如通過酸不穩定部分(如縮醛或縮酮)的水解進行化學切割。在一些實施方案中，所述脂質包含在體外被水解並隨後被酯酶、醯胺酶或二硫化物切割酶中的一種或多種酶切割的部分。這可發生於如內涵體的細胞囊泡室中。另一種酸敏感性的可切割連接為在內涵體的酸性環境中被切割的β-硫代丙酸酯連接(Jeong等人，Bioconjugate chem.2003，4，1426)。
在一些實施方案中，本發明描述了式(X)的化合物或其藥學上可接受的鹽，
式(X) 其中 R1和R2分別獨立地為H、任選地被1-4個R5取代的C1-C6烷基、任選地被1-4個R5取代的C2-C6烯基、或C(NR6)(NR6)2； R3和R4分別獨立地為烷基、烯基、炔基，並任選地被氟、氯、溴或碘取代； L1和L2分別獨立地為-NR6C(O)-、-C(O)NR6-、-OC(O)-、-C(O)O-、-S-S-、-N(R6)C(O)N(R6)-、-OC(O)N(R6)-、-N(R6)C(O)O-、-O-N＝C-、OR-OC(O)NH；或 L1-R3和L2-R4可共同形成縮醛或縮酮； R5為氟、氯、溴、碘、-OR7、-N(R8)(R9)、-CN、SR10、S(O)R10、S(O)2R10； R6為H、C1-C6烷基； R7為H或C1-C6烷基； R8和R9分別獨立地為H或C1-C6烷基； R10為H或C1-C6烷基； m為1、2、3、4、5或6； n為0、1、2、3、4、5或6。
在一些實施方案中，R1為H、低級烷基(例如甲基、乙基、丙基或異丙基)或取代烷基(例如2-羥乙基)。
在一些實施方案中，R2為H或低級烷基，例如甲基、乙基、丙基或異丙基。
在一些實施方案中，R1或R2與式(X)的氮形成quanadine部分。
L1-R3和L2-R4或其組合提供至少一個在體內被切割的部分。在一些實施方案中，L1-R3和L2-R4均可被生物切割。例如，L1-R3和L2-R4可獨立地被酶切割(例如，被酯酶、醯胺酶或二硫化物切割酶切割)。在一些實施方案中，L1和L2為相同的化學部分，例如酯、醯胺或二硫化物。在其他情況下，L1和L2不同，例如，L1或L2之一為酯，而L1或L2中的另一個為二硫化物。
在一些實施方案中，L1-R3和L2-R4共同形成在體內被水解的縮醛或縮酮部分。
在一些實施方案中，L1-R3或L2-R4之一被酶切割。例如，L1-R3或L2-R4之一在體內被酶切，從而在脂質上提供可與剩餘的L1-R3或L2-R4部分發生化學反應的游離羥基部分或游離胺。以下提供了示例性的實施方案
在一些優選的實施方案中，包含氨基甲酸酯或脲部分與醯胺、酯或二硫化物部分的組合。例如，所述脂質包含的酯部分在切割(例如酶切)後可與氨基甲酸酯或脲部分發生化學反應。L1和L2的一些優選組合包括兩個醯胺、兩個酯、醯胺和酯、兩個二硫化物、醯胺和二硫化物、酯和二硫化物、氨基甲酸酯和二硫化物，以及脲和二硫化物。以下提供了示例性的實施方案 具有Z構型(兩個雙鍵)的醯胺和酯的連接
R′＝H、Me、Et、丙基、異丙基或2-羥乙基，R″＝H；I＝1～6，m＝1～8，n＝1～10 R′＝H、Me、Et、丙基、異丙基或2-羥乙基，R″＝Me；I＝1～6，m＝1～8，n＝1～10 R′＝H、Me、Et、丙基、異丙基或2-羥乙基，R″＝Et；I＝1～6，m＝1～8，n＝1～10 R′＝H、Me、Et、丙基、異丙基或2-羥乙基，R″＝丙基；I＝1～6，m＝1～8，n＝1～10 R′＝H、Me、Et、丙基、異丙基或2-羥乙基，R″＝異丙基；I＝1～6，m＝1～8，n＝1～10 具有Z構型(三個雙鍵)的醯胺和酯的連接
R′＝H、Me、Et、丙基、異丙基或2-羥乙基，R″＝H；I＝1～6，m＝1～8，n＝1～10 R′＝H、Me、Et、丙基、異丙基或2-羥乙基，R″＝Me；I＝1～6，m＝1～8，n＝1～10 R′＝H、Me、Et、丙基、異丙基或2-羥乙基，R″＝Et；I＝1～6，m＝1～8，n＝1～10 R′＝H、Me、Et、丙基、異丙基或2-羥乙基，R″＝丙基；I＝1～6，m＝1～8，n＝1～10 R′＝H、Me、Et、丙基、異丙基或2-羥乙基，R″＝異丙基；I＝1～6，m＝1～8，n＝1～10 具有E構型(兩個雙鍵)的醯胺和酯的連接
R′＝H、Me、Et、丙基、異丙基或2-羥乙基，R″＝H；I＝1～6，m＝1～8，n＝1～10 R′＝H、Me、Et、丙基、異丙基或2-羥乙基，R″＝Me；I＝1～6，m＝1～8，n＝1～10 R′＝H、Me、Et、丙基、異丙基或2-羥乙基，R″＝Et；I＝1～6，m＝1～8，n＝1～10 R′＝H、Me、Et、丙基、異丙基或2-羥乙基，R″＝丙基；I＝1～6，m＝1～8，n＝1～10 R′＝H、Me、Et、丙基、異丙基或2-羥乙基，R″＝異丙基；I＝1～6，m＝1～8，n＝1～10 具有E構型(三個雙鍵)的醯胺和酯的連接
R′＝H、Me、Et、丙基、異丙基或2-羥乙基，R″＝H；I＝1～6，m＝1～8，n＝1～10 R′＝H、Me、Et、丙基、異丙基或2-羥乙基，R″＝Me；I＝1～6，m＝1～8，n＝1～10 R′＝H、Me、Et、丙基、異丙基或2-羥乙基，R″＝Et；I＝1～6，m＝1～8，n＝1～10 R′＝H、Me、Et、丙基、異丙基或2-羥乙基，R″＝丙基；I＝1～6，m＝1～8，n＝1～10 R′＝H、Me、Et、丙基、異丙基或2-羥乙基，R″＝異丙基；I＝1～6，m＝1～8，n＝1～10 二硫化物的連接
R′＝H、Me、Et、丙基、異丙基或2-羥乙基，R″＝H；I＝1～6，m＝6～28 R′＝H、Me、Et、丙基、異丙基或2-羥乙基，R″＝Me；I＝1～6，m＝6～28 R′＝H、Me、Et、丙基、異丙基或2-羥乙基，R″＝Et；I＝1～6，m＝6～28 R′＝H、Me、Et、丙基、異丙基或2-羥乙基，R″＝丙基；I＝1～6，m＝6～28 R′＝H、Me、Et、丙基、異丙基或2-羥乙基，R″＝異丙基；I＝1～6，m＝6～28 具有不飽和烴基鏈、E構型和Z構型的二硫化物的連接
R′＝H、Me、Et、丙基、異丙基或2-羥乙基，R″＝H；I＝1～6，m＝1～8，n＝1～10 R′＝H、Me、Et、丙基、異丙基或2-羥乙基，R″＝Me；I＝1～6，m＝1～8，n＝1～10 R′＝H、Me、Et、丙基、異丙基或2-羥乙基，R″＝Et；I＝1～6，m＝1～8，n＝1～10 R′＝H、Me、Et、丙基、異丙基或2-羥乙基，R″＝丙基；I＝1～6，m＝1～8，n＝1～10 R′＝H、Me、Et、丙基、異丙基或2-羥乙基，R″＝異丙基；I＝1～6，m＝1～8，n＝1～10 具有飽和烴基鏈和不飽和烴基鏈的醯胺和二硫化物的連接
R′＝H、Me、Et、丙基、異丙基或2-羥乙基，R″＝H；I＝1～6，m＝6～28 R′＝H、Me、Et、丙基、異丙基或2-羥乙基，R″＝Me；I＝1～6，m＝6～28 R′＝H、Me、Et、丙基、異丙基或2-羥乙基，R″＝Et；I＝1～6，m＝6～28 R′＝H、Me、Et、丙基、異丙基或2-羥乙基，R″＝丙基；I＝1～6，m＝6～28 R′＝H、Me、Et、丙基、異丙基或2-羥乙基，R″＝異丙基；I＝1～6，m＝6～28
R′＝H、Me、Et、丙基、異丙基或2-羥乙基，且R″＝H；I＝1～6，m＝1～8，n＝1～10 R′＝H、Me、Et、丙基、異丙基或2-羥乙基，且R″＝Me；I＝1～6，m＝1～8，n＝1～10 R′＝H、Me、Et、丙基、異丙基或2-羥乙基，且R″＝Et；I＝1～6，m＝1～8，n＝1～10 R′＝H、Me、Et、丙基、異丙基或2-羥乙基，且R″＝丙基；I＝1～6，m＝1～8，n＝1～10 R′＝H、Me、Et、丙基、異丙基或2-羥乙基，且R″＝異丙基；I＝1～6，m＝1～8，n＝1～10 具有飽和烴基鏈和不飽和烴基鏈的酯和二硫化物的連接
R′＝H、Me、Et、丙基、異丙基或2-羥乙基，R″＝H；I＝1～6，m＝6～28 R′＝H、Me、Et、丙基、異丙基或2-羥乙基，R″＝Me I＝1～6，m＝6～28 R′＝H、Me、Et、丙基、異丙基或2-羥乙基，R″＝Et；I＝1～6，m＝6～28 R′＝H、Me、Et、丙基、異丙基或2-羥乙基，R″＝丙基；I＝1～6，m＝6～28 R′＝H、Me、Et、丙基、異丙基或2-羥乙基，R″＝異丙基；I＝1～6，m＝6～28
R′＝H、Me、Et、丙基、異丙基或2-羥乙基，R″＝H；I＝1～6，m＝1～8，n＝1～10 R′＝H、Me、Et、丙基、異丙基或2-羥乙基，R″＝Me；I＝1～6，m＝1～8，n＝1～10 R′＝H、Me、Et、丙基、異丙基或2-羥乙基，R″＝Et；I＝1～6，m＝1～8，n＝1～10 R′＝H、Me、Et、丙基、異丙基或2-羥乙基，R″＝丙基；I＝1～6，m＝1～8，n＝1～10 R′＝H、Me、Et、丙基、異丙基或2-羥乙基，R″＝異丙基；I＝1～6，m＝1～8，n＝1～10 具有烷基鏈的氨基甲酸酯或脲和二硫化物的連接
R′＝H、Me、Et、丙基、異丙基或2-羥乙基，R″＝H；I＝1～6，m＝6～28 R′＝H、Me、Et、丙基、異丙基或2-羥乙基，R″＝Me；I＝1～6，m＝6～28 R′＝H、Me、Et、丙基、異丙基或2-羥乙基，R″＝Et；I＝1～6，m＝6～28 R′＝H、Me、Et、丙基、異丙基或2-羥乙基，R″＝丙基；I＝1～6，m＝6～28 R′＝H、Me、Et、丙基、異丙基或2-羥乙基，R″＝異丙基；I＝1～6，m＝6～28 具有不飽和烴基鏈的氨基甲酸酯或脲和二硫化物的連接
R′＝H、Me、Et、丙基、異丙基或2-羥乙基，R″＝H；I＝1～6，m＝6～28 R′＝H、Me、Et、丙基、異丙基或2-羥乙基，R″＝Me；I＝1～6，m＝6～28 R′＝H、Me、Et、丙基、異丙基或2-羥乙基，R″＝Et；I＝1～6，m＝6～28 R′＝H、Me、Et、丙基、異丙基或2-羥乙基，R″＝丙基；I＝1～6，m＝6～28 R′＝H、Me、Et、丙基、異丙基或2-羥乙基，R″＝異丙基；I＝1～6，m＝6～28 具有不飽和烴基鏈的氨基甲酸酯或脲和二硫化物的連接
R′＝H、Me、Et、丙基、異丙基或2-羥乙基，R″＝H；I＝1～6，m＝6～28 R′＝H、Me、Et、丙基、異丙基或2-羥乙基，R″＝Me；I＝1～6，m＝6～28 R′＝H、Me、Et、丙基、異丙基或2-羥乙基，R″＝Et；I＝1～6，m＝6～28 R′＝H、Me、Et、丙基、異丙基或2-羥乙基，R″＝丙基；I＝1～6，m＝6～28 R′＝H、Me、Et、丙基、異丙基或2-羥乙基，R″＝異丙基；I＝1～6，m＝6～28 具有不飽和烴基鏈的氨基甲酸酯和脲的連接
R′＝H、Me、Et、丙基、異丙基或2-羥乙基，R″＝H；I＝1～6，m＝1～10，n＝1～10 R′＝H、Me、Et、丙基、異丙基或2-羥乙基，R″＝Me；I＝1～6，m＝1～10，n＝1～10 R′＝H、Me、Et、丙基、異丙基或2-羥乙基，R″＝Et；I＝1～6，m＝1～10，n＝1～10 R′＝H、Me、Et、丙基、異丙基或2-羥乙基，R″＝丙基；I＝1～6，m＝1～10，n＝1～10 R′＝H、Me、Et、丙基、異丙基或2-羥乙基，R″＝異丙基；I＝1～6，m＝1～10，n＝1～10 在一些實施方案中，所述脂質包含可被酸切割的肟或腙。
R3和R4通常為長鏈疏水部分，例如烷基、烯基或炔基。在一些實施方案中，R3或R4被滷代部分取代，例如以提供全氟烷基或全氟烯基部分。R3和R4彼此獨立。在一些實施方案中，R3和R4二者相同。在一些實施方案中，R3和R4不同。
在一些實施方案中，R3和/或R4為烷基。例如R3和/或R4中的一個為C6～C30烷基或兩者均為C6～C30烷基，例如為C10～C26烷基、C12～C20烷基或C12烷基。
在一些實施方案中，R3和/或R4為烯基。在一些優選的實施方案中，R3和/或R4包含2或3個雙鍵。例如，R3和/或R4包含2個雙鍵，或R3和/或R4包含3個雙鍵。雙鍵可分別獨立地具有Z或E構型。以下提供了示例性的烯基部分
其中，x為1～8的整數；且y為1～10的整數。在一些優選的實施方案中，R3和/或R4為C6～C30烯基，例如C10～C26烯基、C12～C20烯基或C17烯基，例如具有兩個雙鍵，如具有Z構型的兩個雙鍵。R3和/或R4可相同或不同。在一些優選的實施方案中，R3和R4相同。
在一些實施方案中，R3和/或R4為炔基。例如，C6～C30炔基，如C10～C26炔基、C12～C20炔基。R3和/或R4可具有1～3個三鍵，例如一個、兩個或三個三鍵。
在一些實施方案中，式(X)化合物為鹽的形式，例如藥學上可接受的鹽。例如，可在陰離子和本文所述化合物上的帶正電的取代基(如氨基)之間形成鹽。適合的陰離子包括氟化物、氯化物、溴化物、碘化物、硫酸根、硫酸氫根、硝酸根、磷酸根、檸檬酸根、甲磺酸根、三氟乙酸根、乙酸根、延胡索酸根、油酸根、戊酸根、馬來酸根、草酸根、異煙酸根、乳酸根、水楊酸根、酒石酸根、丹寧酸根、泛酸根、酒石酸氫根、抗壞血酸根、琥珀酸根、龍膽酸根(gentisinate)、葡糖酸根、葡糖二酸根(glucaronate)、糖酸根、甲酸根、苯甲酸根、穀氨酸根、乙磺酸根、苯磺酸根、對甲苯磺酸根和雙羥萘酸根(pamoate)。在一些優選的實施方案中，式(X)的化合物為氫滷酸鹽，例如為鹽酸鹽。
式(X)的化合物也可以以水合物(例如，(H2O)n)和溶劑化物的形式存在，這也包含在本發明的公開範圍之內。
PEG-脂質化合物 本申請人現已發現某些包含PEG的脂質部分可為核酸試劑(例如單鏈或雙鏈的核酸，如siRNA)的施用提供理想的性質。例如，將包含PEG的脂質(如本文所述的脂質)和核酸部分(如siRNA)配製成締合複合物中並施用於受試者時，所述脂質可提供增強的核酸部分的遞送。例如，可通過基因沉默試驗(例如FVII的沉默)評估所述增強的遞送。特別地，本申請人現已發現式(XV)的PEG-脂質可具有用於遞送siRNA的理想性質，包括改進的生物利用度、生物降解性和耐受性。
在一些實施方案中，PEG通過接頭部分與包含兩個疏水部分(如長鏈烷基部分)的結構相連。示例性的PEG-脂質如上所示，例如式(XV)、(XV′)和(XVI)所涵蓋的那些。在一些優選的實施方案中，所述PEG-脂質具有如下結構
其中，手性中心的優選立體化學構型為『R』，重複PEG部分的總平均分子量為約2000道爾頓。
在一些實施方案中，本文所述PEG脂質與靶向部分相連，例如糖基部分，如

在一些實施方案中，靶向部分通過接頭與PEG-脂質相連，例如通過本文所述的接頭。被靶向了的PEG脂質化合物的實例為本文所述的式(XXI)、(XXI′)、(XXII)和(XXII′)的化合物。此類脂質的製備方法描述於例如實施例42和43中。
陽離子脂質化合物和包含陽離子脂質的製品的製備方法 本文所述的化合物可由商業渠道(例如，Asinex，俄羅斯莫斯科；Bionet，Camelford，英格蘭；ChemDiv，SanDiego，CA；Comgenex，Budapest，匈牙利；Enamine，Kiev，烏克蘭；IF Lab，烏克蘭；Interbioscreen，俄羅斯莫斯科；Maybridge，Tintagel，UK；Specs，荷蘭；Timtec，Newark，DE；Vitas-M Lab，俄羅斯莫斯科)獲得，或使用可商購的起始原料和試劑通過如下所述的常規方法合成。
多胺脂質的製備方法 在一些實施方案中，可通過如下所示的式(III)多胺與式(IV)1，4-共軛系統的反應製備式(I)的化合物，
式(III) 其中Xa、Xb和n的定義如上所述，
式(IV) 其中Y和R1的定義如上所述。
在一些實施方案中，將式(III)和(IV)的化合物一起反應(在無溶劑的條件下反應)。例如，在高溫下(例如，至少約60℃、至少約65℃、至少約70℃、至少約75℃、至少約80℃、至少約85℃或至少約90℃)將純的式(III)和(IV)的化合物一起反應，優選約90℃下反應。
在一些實施方案中，在溶劑中(例如極性非質子溶劑，如乙腈或DMF)將式(III)和(IV)的化合物一起反應。例如，在約50℃～約120℃高溫下將式(III)和(IV)的化合物在溶劑中一起反應。
在一些實施方案中，在存在自由基淬滅劑或清除劑(例如氫醌)的條件下將式(III)和(IV)的化合物一起反應。包含自由基淬滅劑的反應條件可以為無溶劑(neat)或在溶劑(例如極性非質子溶劑，如乙腈或DMF)中。反應可在高溫(例如，無溶劑時在如90℃的高溫；有溶劑時在如約50℃～約120℃的高溫)下進行。本文所用術語「自由基淬滅劑」或「自由基清除劑」是指可吸收反應混合物中的自由基的化學部分。自由基淬滅劑/清除劑的實例包括氫醌、抗壞血酸、甲酚、硫胺、3，5-二叔丁基-4-羥基甲苯、叔丁基-4-羥基苯甲醚和包含硫醇的部分。
在一些實施方案中，在存在反應促進劑(例如，水或麥可加成反應促進劑(如乙酸、硼酸、檸檬酸、苯甲酸、對甲苯磺酸、五氟苯酚、苦味酸芳香酸)，鹽(如重碳酸鹽、重硫酸鹽、一氫或二氫磷酸鹽)，酚類、全滷代酚、硝基酚、磺酸、PTTS等)的條件下將式(III)和(IV)的化合物一起反應，所述反應促進劑優選硼酸，例如飽和硼酸水溶液。包含反應促進劑的反應條件可以為無溶劑或在溶劑中，例如極性非質子溶劑，如乙腈或DMF。反應可在高溫(例如，無溶劑時在如90℃的高溫；有溶劑時在如約50℃～約120℃的高溫)下進行。本文所用術語「反應促進劑」是指在反應混合物中使用時可促進/增加反應速率的化學部分。
可改變式(III)化合物與式(IV)化合物的比例，以提供在式(III)的多胺上進行取代的可變性。通常，優選至少約50％的氫部分被非氫部分取代的多胺。因此，可選擇式(III)化合物/式(IV)化合物的比例以提供具有相對較高的游離胺取代程度(例如至少約50％、至少約55％、至少約60％、至少約65％、至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約97％、至少約99％或基本全部)的產物。在一些優選的實施方案中，在式(III)的多胺中n為0，式(III)化合物與式(IV)化合物的比例為約1∶3至約1∶5，優選為約1∶4。在一些優選的實施方案中，在式(III)的多胺中n為2，式(III)化合物與式(IV)化合物的比例為約1∶3至約1∶6，優選為約1∶5。
在一些實施方案中，式(III)化合物和(IV)化合物在兩步反應過程中進行反應。例如，第一步的過程包括含有約0.8～約1.2摩爾當量的式(III)化合物和約3.8～約4.2摩爾當量的式(IV)化合物的反應混合物，而第二步的過程包括向所述反應混合物中添加約0.8～1.2摩爾當量的式(IV)的化合物。
反應完成後，可從所述反應混合物中分離得到具有式(I)結構的一種或多種產物。例如，可將式(I)化合物作為單個產物(例如一種結構異構體)或作為混合產物(例如多種結構異構體和/或多種式(I)的化合物)進行分離。在一些實施方案中，可使用色譜法(例如快速色譜(flash chromatography)、重力色譜法(例如使用矽膠對異構體進行重力分離)、柱色譜法(例如正相HPLC或RPHPLC)或移動床色譜法))分離和/或純化一種或多種反應產物。在一些實施方案中，純化反應產物以提供包含至少約80％(例如至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約97％、至少約99％)的一種化合物(如一種結構異構體)的製品。
在一些實施方案中，使用如HCl的酸處理游離胺產物以提供該產物的胺鹽(例如鹽酸鹽)。在一些實施方案中，與相應的游離胺產物相比，鹽產物具有改進的性質，例如操作性和/或貯存性。在一些實施方案中，與相應的游離胺相比，鹽產物可阻止或降低分解產物(如N-氧化物或N-碳酸鹽)的形成速率。在一些實施方案中，與相應的游離胺相比，鹽產物可在治療製品的應用中具有改進的性質。
在一些實施方案中，例如對反應混合物進一步處理，以純化一種或多種產物或除去雜質(如未反應的起始原料)。在一些實施方案中，使用可捕獲未反應的丙烯醯胺的固定化(如與聚合物結合)硫醇部分來處理反應混合物。在一些實施方案中，可對分離產物進行處理以進一步除去雜質，例如可使用捕獲未反應的丙烯醯胺的固定化硫醇部分處理分離產物。
在一些實施方案中，可使用固定化(如與聚合物結合)的異硫氰酸鹽處理反應產物。例如，可使用固定化異硫氰酸鹽處理包含叔胺的反應產物，以從該產物中除去伯胺和/或仲胺。
在一些實施方案中，可通過如下所示的式(III)化合物與式(VI)化合物的反應來製備式(I)的化合物，
式(III) 其中Xa、Xb和n的定義如上所述，
式(VI) 其中Q為Cl、Br或I，Y和R1的定義如上所述。
在一些實施方案中，在無溶劑的條件下將式(III)和(VI)的化合物一起反應。在一些實施方案中，在存在一種或多種溶劑(例如極性非質子溶劑，如乙腈或DMF)的條件下將式(III)和(VI)的化合物一起反應。在一些實施方案中，使反應物(式(III)和(VI)的化合物)在高溫下(例如，至少約50℃、至少約60℃、至少約70℃、至少約80℃、至少約90℃、至少約100℃)一起反應。
在一些實施方案中，該反應混合物還包括鹼，例如碳酸鹽，如K2CO3。
在一些實施方案中，反應混合物還包含催化劑。
在一些實施方案中，通過胺部分與活化酸(如酸酐或酸性滷化物(如酸性氯化物))的反應提供(VI)的化合物，從而製備(VI)的化合物。
可改變式(III)化合物與式(VI)化合物的比例，以提供在式(III)多胺上取代的可變性。通常，優選至少約50％的氫部分被非氫部分取代的多胺。因此，可選擇式(III)化合物/式(VI)化合物的比例以提供具有相對較高的游離胺取代程度(例如至少約50％、至少約55％、至少約60％、至少約65％、至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約97％、至少約99％或基本全部)的產物。在一些優選的實施方案中，在式(III)的多胺中n為0，式(III)化合物與式(VI)化合物的比例為約1∶3至約1∶5，優選為約1∶4。在一些優選的實施方案中，式(III)的多胺中n為2，且式(III)化合物與式(VI)化合物的比例為約1∶3至約1∶6，優選為約1∶5。
在一些實施方案中，式(III)化合物和(VI)化合物在兩步反應過程中進行反應。例如，第一步的過程包括具有約0.8～約1.2摩爾當量的式(III)化合物和約3.8～約4.2摩爾當量的式(VI)化合物的反應混合物，而第二步的過程包括向所述反應混合物中添加約0.8～1.2摩爾當量的式(VI)的化合物。
在一些實施方案中，在式(III)的多胺與式(IV)或式(VI)的化合物反應之前，使用保護基團選擇性地保護式(III)中一個或多個胺部分，從而使終產物合成中的選擇性提高。例如，在與式(IV)或式(VI)的化合物反應之前保護式(III)多胺的一個或多個伯胺，從而提供使式(IV)或式(VI)的化合物與仲胺反應的選擇性。可採用其他保護基團的策略以提供對伯胺的選擇性，例如使用可被選擇性地除去的正交保護基團(orthogonal protectinggroup)。
反應完成後，可從所述反應混合物中分離得到具有式(I)結構的一種或多種產物。例如，可將式(I)化合物作為單個產物(例如一種結構異構體)或作為產物的混合物(例如多種結構異構體和/或多種式(I)的化合物)進行分離。在一些實施方案中，可使用色譜法(例如快速色譜、重力色譜法(例如使用矽膠對異構體進行重力分離)、柱色譜法(例如正相HPLC或RPHPLC)或移動床色譜法)分離和/或純化一種或多種反應產物。在一些實施方案中，純化反應產物以提供包含至少約80％(例如至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約97％、至少約99％)的單個化合物(如一種結構異構體)的製品。
在一些實施方案中，使用如HCl的酸來處理游離胺產物以提供該產物的胺鹽(例如鹽酸鹽)。在一些實施方案中，與相應的游離胺產物相比，鹽產物具有改進的性質，例如操作性和/或貯存性。在一些實施方案中，與相應的游離胺相比，鹽產物可阻止或降低分解產物(如N-氧化物或N-碳酸鹽的形成)的形成速率。在一些實施方案中，與相應的游離胺相比，鹽產物可在治療製品的應用中具有改進的性質。
在一些實施方案中，可使用區域選擇性合成法製備多胺陽離子脂質。區域選擇性合成法為在多胺骨架的氮上進行位點特異性烷基化提供了便利的方法，從而能夠合成特異烷基化的目標衍生物。通常，首先使式(I)的化合物與選擇性地與伯胺或末端胺反應的試劑發生反應，從而封閉或幹擾伯胺或末端胺參與其他反應，並且可在目標化合物合成期間的適當階段選擇性地除去這些封閉物。在對式(I)化合物的末端胺進行封閉後，通過使用恰當摩爾比例的反應物和恰當的反應條件可利用正交胺保護基團選擇性地封閉一個或多個仲胺。選擇性的烷化、隨後對封閉胺進行的選擇性脫保護和對重新產生的胺的進一步烷化，以及所述反應順序的恰當重複，可產生特異的目標產物。例如，在恰當的反應條件下使用伯胺特異性保護基團(如三氟乙醯胺)選擇性地封閉三乙烯四胺(1)的末端胺，隨後在存在鹼(例如二異丙基乙胺)的條件下與過量的正交胺保護基團(例如，(Boc)2O)反應以封閉所有的末端胺(例如Boc)。選擇性地除去末端保護基團，隨後使用如丙烯醯胺烷化末端胺以提供化合物1的所有末端胺均被烷基化的衍生物。脫去對中間胺的保護，隨後使用如計算量的丙烯醯胺進行烷基化，可獲得部分烷基化的產物7。化合物7的另一種製備方法是使末端受保護的化合物1與計算量的正交胺保護基團(例如，(Boc)2O)反應以獲得部分被保護的化合物1的衍生物。除去部分選擇性地被保護的化合物1的末端胺保護基團，隨後使用如丙烯醯胺烷化所有未受保護的胺，可獲得所需的化合物7。
具有可生物切割部分的脂質的製備方法 在一些實施方案中，可通過式(XI)化合物與式(XII)化合物的反應製備式(X)的化合物，
式(XI)
式(XII) 其中，R1、R2和R3的定義如上所述。
在一些實施方案中，在存在偶聯劑(例如，碳二亞胺，如水溶性碳二亞胺，如EDCI)的條件下進行式(XI)化合物與式(XII)化合物的反應。
可使用其他化學反應和起始原料以提供具有兩個連接基團L1和L2的式(X)的化合物。例如，可將式(XI)的羥基部分置換成胺部分以提供醯胺或脲連接基團的前體。
反應完成後，可從所述反應混合物中分離得到具有式(X)結構的一種或多種產物。例如，可將式(X)化合物作為單個產物(例如一種結構異構體)或作為產物的混合物(例如多種結構異構體和/或多種式(X)的化合物)進行分離。在一些實施方案中，可使用色譜法(例如快速色譜、重力色譜法(例如使用矽膠對異構體進行重力分離)、柱色譜法(例如正相HPLC或RPHPLC)或移動床色譜法)分離和/或純化一種或多種反應產物。在一些實施方案中，純化反應產物以提供包含至少約80％(例如至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約97％、至少約99％)的單個化合物(如一種結構異構體)的製品。
在一些實施方案中，使用如HCl的酸處理游離胺產物以提供該產物的胺鹽(例如鹽酸鹽)。在一些實施方案中，與相應的游離胺產物相比，鹽產物具有改進的性質，例如操作性和/或貯存性。在一些實施方案中，與相應的游離胺相比，鹽產物可阻止或降低分解產物(如N-氧化物或N-碳酸鹽的形成)的形成速率。在一些實施方案中，與相應的游離胺產物相比，鹽產物可在治療製品的應用中具有改進的性質。
PEG-脂質的製備方法 例如，可在適當的條件下進行甘油酯部分(例如，二肉豆蔻基甘油酯、二棕櫚基甘油酯、或二硬脂酸甘油脂)與活化部分的反應以提供活化的中間產物，隨後使活化的中間產物與具有反應性部分(例如胺或羥基基團)的PEG組分反應以獲得PEG-脂質，從而製備PEG-脂質化合物。例如，首先在存在鹼(例如三乙胺)的條件下使二烷基甘油酯(例如二肉豆蔻基甘油酯)與N，N』-二琥珀醯亞胺基碳酸酯反應，隨後在存在鹼(例如吡啶)的條件下使所形成的中間產物與PEG-胺(例如mPEG2000-NH2)反應以產生目標PEG-脂質。在這些條件下，PEG組分通過氨基甲酸酯連接與脂質部分相連。在另一個實例中，可通過例如將甘油酯部分(例如，二肉豆蔻基甘油酯、二棕櫚基甘油酯、二硬脂酸甘油酯、二肉豆蔻醯甘油酯、二棕櫚醯甘油酯、或二硬脂醯甘油酯)與琥珀酸酐反應，隨後活化產生的羧基，再通過活化中間產物與如具有胺或羥基基團的PEG組分的反應來獲得PEG-脂質，從而製備PEG-脂質。在一個實施例中，在存在鹼(如DMAP)的條件下使二肉豆蔻基甘油酯與琥珀酸酐反應，從而獲得半琥珀酸酯。使用標準的羧基活化試劑(例如HBTU和二異丙基乙胺)活化由此獲得的半琥珀酸酯的游離羧基部分，隨後使活化羧基與如mPEH2000-NH2反應，從而獲得PEG-脂質。在此方法中，PEG組分通過琥珀酸酯橋與脂質組分相連。
締合複合物 本文所述的脂質化合物和脂質製品可用作締合複合物(例如脂質體或脂質複合物)的組分。此類締合複合物可用於施予基於核酸(例如，RNA，如單鏈或雙鏈RNA，如dsRNA)的治療劑。
本文公開的締合複合物可用於包裹(package)寡核苷酸試劑，其中所述寡核苷酸製品能夠通過靶向並結合核酸來改變基因的表達。寡核苷酸試劑可以為單鏈或雙鏈，並可包含，例如dsRNA、mRNA前體、mRNA、小RNA(miRNA)、mi-RNA前體(pre-miRNA)、質粒或DNA，或與蛋白質相連(toa protein)。本文所述的寡核苷酸試劑可以為，例如dsRNA、小RNA、反義RNA、antagomir、誘餌RNA、DNA、質粒和適體。
締合複合物可包含多個組分。在一些實施方案中，締合複合物(如脂質體)可包含如核酸治療劑(例如寡核苷酸式試劑，如dsRNA)的活性成分，如本文所述脂質的陽離子脂質。在一些實施方案中，所述締合複合物可包含多種治療劑，例如靶向不止一個基因或靶向相同基因的不同區域的兩種或三種單鏈或雙鏈核酸部分。締合複合物中也可包含其他組分，包括PEG-脂質(如本文所述的PEG-脂質)或結構性組分(如膽固醇)。在一些實施方案中，所述締合複合物還包含膜融合脂質或組分和/或靶向分子。在一些優選的實施方案中，所述締合複合物為包含寡核苷酸試劑(如dsRNA)、本文所述的脂質(如式(I)或式(X)的化合物)、PEG-脂質(如本文所述的PEG-脂質，例如式(XV)的PEG-脂質)，以及結構性組分(如膽固醇)的脂質體。
單鏈核糖核酸 寡核苷酸試劑包括小RNA(MicroRNA，miRNA)。小RNA為非編碼小RNA分子，其可通過抑制翻譯或通過降解靶mRNA導致細胞中特定基因的轉錄後沉默。miRNA可與靶核酸完全互補或具有非互補區，從而在非互補區形成「突起」。非互補區(突起)的側翼可以為充分互補區(regions of sufficientcomplementarity)，優選為完全互補，以形成雙鏈。優選互補區的長度為至少8～10個核苷酸(例如，長度為8個、9個或10個核苷酸)。miRNA可通過抑制翻譯而抑制基因表達，例如當小RNA與靶核酸不完全互補時；或者通過引發靶RNA降解而抑制基因表達，這被認為只有在miRNA與其靶標完全互補時才能發生。本發明還可包括在與其靶標結合時可能或可能不形成突起的miRNA的雙鏈前體。
在優選的實施方案中，本文所述的寡核苷酸試劑能夠靶向內源miRNA或miRNA前體。本文所述的寡核苷酸試劑可包含天然存在的核酸鹼基、糖和核苷間(骨架)共價連接，以及具有功能類似的非天然存在部分的寡核苷酸。此類修飾或取代的寡核苷酸由於具有期望的性質，例如增加細胞攝取、增強對外源miRNA靶標的親和性，和/或增強在核酸酶存在的條件下的穩定性，因而通常優於天然形式。經設計以結合特異外源miRNA的寡核苷酸試劑與靶miRNA中至少10個、20個或25個或更多的鹼基基本互補，例如至少70％、80％、90％或100％互補。
miRNA或miRNA前體的長度可以為18～100個核苷酸，更優選長度為18～80個核苷酸。成熟的miRNA的長度可以為19～30個核苷酸，優選21～15個核苷酸，特別是21個、22個、23個、24個或25個核苷酸。小RNA前體的長度可以為70～100個核苷酸，並具有發卡構象。可通過將長miRNA前體特異加工為功能性miRNA的酶(被稱為Dicer和Drosha)在體內由miRNA前體產生小RNA。可通過基於細胞的系統在體內合成，或可通過化學合成本發明所述的小RNA或miRNA前體。所合成的小RNA可包含修飾以使其具有所需的特性。例如，修飾可提高穩定性、與靶核酸雜交的熱力學，對特定組織或細胞類型的靶向性或細胞穿透性(例如，通過依賴內吞或不依賴內吞的機制)。修飾還能夠提高序列特異性，並由此減少脫靶(off-site targeting)。以下對合成方法和化學修飾進行更加詳細的描述。
對於給定的正義鏈序列(例如，cDNA分子的正義鏈序列)，可根據Watson-Crick鹼基配對法則設計miRNA。所述miRNA可與RNA(例如，miRNA、miRNA前體、mRNA前體或mRNA)的某部分互補。例如，miRNA可與mRNA或mRNA前體的編碼區或非編碼區(例如，mRNA前體或mRNA翻譯起始位點的周邊區域，如5′-UTR)互補。例如，miRNA寡核苷酸的長度可為約12～30個核苷酸，優選長度為約15～28個核苷酸(例如長度為16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個核苷酸)。
特別地，本發明所述miRNA或miRNA前體可在與靶核酸不互補的內部區域(即非末端區域)中的核苷酸上具有化學修飾。例如，可將修飾核苷酸引入到形成突起的miRNA的所述區域中。所述修飾可包括如通過接頭(例如，參見下文OT-I～OT-IV的圖表)與miRNA相連的配體。例如，所述修飾可改進治療性miRNA的藥物動力學或穩定性，或改進miRNA與靶核酸的雜交性(例如雜交熱力學)。在一些實施方案中，優選引入或束縛(tethered)到miRNA突起區域的修飾或配體的定位使其佔據突起區域中的空間。例如，所述修飾可包括在核苷酸鏈上的修飾鹼基或糖，或發揮嵌入劑(intercalator)作用的配體。這些修飾都優選定位於突起中。所述嵌入劑可以為芳族，例如多環芳族化合物或雜環芳族化合物。多環嵌入劑可具有堆疊能力，並可包含具有2、3或4個稠環的系統。可將下文所述的通用鹼基引入到miRNA中。在一些實施方案中，優選引入或束縛到miRNA突起區域的修飾或配體的定位使其佔據突起區域中的空間。這種定位有助於提高miRNA的雜交性質或者其他期望性質。
在一個實施方案中，miRNA或miRNA前體可包括氨基糖苷配體，其可使miRNA具有提高的雜交性質或提高的序列特異性。示例性的氨基糖苷包括糖基化聚賴氨酸、半乳糖苷化聚賴氨酸、新黴素B、妥布黴素(tobramycin)、卡那黴素A以及氨基糖苷的吖啶結合物(acridine conjugate)，例如新黴素-N-吖啶、新黴素-S-吖啶、新黴素-C-吖啶、妥布黴素-N-吖啶、和卡那黴素A-N-吖啶。使用吖啶類似物可提高序列特異性。例如，與DNA相比，新黴素B對RNA具有高親和性和低序列特異性。吖啶類似物新黴素-S-吖啶對HIVRev-響應元件(RRE)具有提高的親和性。在一些實施方案中，將氨基糖苷配體的胍類似物(胍基糖苷)束縛到寡核苷酸試劑上。在胍基糖苷中，胺基酸上的氨基基團被交換為胍基基團。胍基類似物的結合可增強寡核苷酸試劑的細胞穿透性。
在一個實施方案中，所述配體可包含通過切割靶核酸造成靶基因抑制的剪切基團(cleaving group)。優選以某種方式將剪切基團束縛到miRNA上以使其定位於突起區域內，從而使其能夠接近並切割靶RNA。所述剪切基團可以為，例如博來黴素(例如，博來黴素-A5、博來黴素-A2、或博來黴素-B2)、芘、菲咯啉(例如鄰菲咯啉)、多胺、三肽(例如lys-tyr-lys三肽)或金屬離子螯合基團。金屬離子螯合基團可包括，例如Lu(III)或EU(III)大環複合物，Zn(II)2，9-二甲基菲咯啉衍生物，Cu(II)三聯吡啶或吖啶，其可通過游離金屬離子(如Lu(III))促進在突起位點對靶RNA的選擇性切割。在一些實施方案中，可將肽配體束縛到miRNA或miRNA前體上，從而促進對靶RNA的切割，例如在突起區域進行切割。例如，可將1，8-二甲基-1，3，6，8，10，13-六氮雜環十四烷(cyclam)與肽結合(例如通過胺基酸衍生物)以促進對靶RNA的切割。本文所述的方法和組合物包括通過依賴切割或不依賴切割的機制來抑制靶基因表達的miRNA。
可設計併合成miRNA或miRNA前體，使其含有的不互補區域(例如，長度為3、4、5或6個核苷酸的區域)的側翼為充分互補的區域從而形成雙鏈(例如，長度為7、8、9、10或11個核苷酸的區域)。
為了增加核酸酶抗性和/或對靶標的結合親和性，miRNA序列可包含2′-O-甲基、2′-氟、2′-O-甲氧基乙基、′-O-氨基丙基、2′-氨基和/或硫代磷酸酯連接。引入鎖核酸(LNA)、2-硫代嘧啶(例如2-硫代-U)、2-氨基-A、G-clamp修飾以及亞乙基核酸(ENA，例如2′-4′-乙烯橋接核酸)，也可增加對靶標的結合親和性。在寡核苷酸骨架中引入呋喃糖也能減少核酸內切。可通過引入3′-陽離子基團或通過使用3′-3′連接調轉3′-末端的核苷酸來進一步修飾miRNA或miRNA前體。在另一種選擇中，可使用氨基烷基基團(如3′C5-氨基烷基dT)封閉3′-末端。其他3′-結合物可抑制3′-5′核酸外切。儘管不受理論的束縛，3′-結合物(如萘普生或布洛芬)可通過空間位阻阻斷核酸外切酶與寡核苷酸3′-末端的結合，從而抑制核酸外切。即便是小烷基鏈、芳基基團或雜環結合物或修飾糖(D-核糖、脫氧核醣、葡萄糖等)也能夠阻斷3′-5′核酸外切酶。
可使用氨基烷基基團(例如5′-O-烷基氨基取代基)封閉5′-末端。其他5′-結合物可抑制5′-3′核酸外切。儘管不受理論的束縛，5′-結合物(如萘普生或布洛芬)可通過空間位阻阻斷核酸外切酶與寡核苷酸5′-末端的結合，從而抑制核酸外切。即便是小烷基鏈、芳基基團或雜環結合物或修飾糖(D-核糖、脫氧核醣、葡萄糖等)也能夠阻斷3′-5′核酸外切酶。
在一個實施方案中，miRNA或miRNA前體包含提高靶向性的修飾，例如本文所述的靶向修飾。使miRNA分子靶向特定細胞類型的修飾的實例包括碳水化合物糖類，如半乳糖、N-乙醯半乳糖胺、甘露糖；維生素，如葉酸；其他配體，如RGD和RGD模仿物；以及小分子，包括萘普生、布洛芬或其他已知的蛋白質結合分子。
可使用化學合成和/或使用本領域已知的方法通過酶連接反應構建miRNA或miRNA前體。例如，可使用天然存在的核苷酸化學合成miRNA或miRNA前體，或者可使用經設計以增加分子的生物學穩定性或增加miRNA或miRNA前體與靶核酸間形成的雙鏈的物理穩定性的多種修飾核酸，例如硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。本文描述了其他適合的核酸修飾。也可使用表達載體由生物產生miRNA或miRNA前體，其中已將核酸反向亞克隆到所述表達載體中(即，插入核酸轉錄的RNA與目標靶核酸成反向)。
反義型寡核苷酸試劑 本文所述的單鏈寡核苷酸試劑包括反義核酸。「反義」核酸包括與編碼基因表達產物的「正義」核酸互補的核苷酸序列，例如與雙鏈cDNA分子的編碼鏈互補的序列，或與RNA序列(例如mRNA前體、mRNA、miRNA或miRNA前體)互補的序列。因此，反義核酸可與正義靶核酸形成氫鍵。
對於給定的編碼鏈序列(例如，cDNA分子的正義鏈序列)，可根據Watson-Crick鹼基配對法則設計反義核酸。反義核酸分子可與RNA(例如mRNA前體或mRNA)編碼或非編碼區的一部分互補。例如，反義寡核苷酸可與mRNA前體或mRNA翻譯起始位點的周邊區域(如5′-UTR)互補。例如，反義寡核苷酸的長度可為約10～25個核苷酸(例如長度為11、12、13、14、15、16、18、19、20、21、22、23或24個核苷酸)。反義寡核苷酸也可與mRNA或mRNA前體互補。
可使用化學合成和/或使用本領域已知的方法通過酶連接反應構建反義核酸。例如，可使用天然存在的核苷酸化學合成反義核酸(例如，反義寡核苷酸)，或者可使用經設計以增加分子的生物學穩定性或增加反義核酸與靶核酸間形成的雙鏈的物理穩定性的多種修飾核酸，例如硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。本文描述了其他適合的核酸修飾。或者，可使用表達載體由生物產生反義核酸，其中已將核酸反向亞克隆到所述表達載體中(即，插入核酸轉錄的RNA與目標靶核酸成反向)。
反義試劑可僅包含核糖核酸，僅包含脫氧核糖核酸(例如寡聚脫氧核糖核酸)或既包含脫氧核糖核酸又包含核糖核酸。例如，僅由核糖核酸組成的反義試劑可與互補的RNA雜交，並阻止翻譯器(translation machinery)接近靶RNA轉錄本，從而阻止蛋白質合成。僅包含脫氧核糖核酸的反義分子，或包含脫氧核糖核酸和核糖核酸的反義分子(例如，在反義試劑DNA序列的5′和3′末端的側翼為RNA序列)可與互補的RNA雜交，並且隨後對靶RNA進行酶切(例如使用RNAse H降解靶RNA)。靶RNA的降解阻止翻譯的進行。側翼RNA序列可包含2′-O-甲基化的核苷酸以及硫代磷酸酯連接，而內部DNA序列可包含硫代磷酸酯核苷酸間連接。需要通過RNAseH活性進行靶向時，內部DNA序列的長度優選為至少5個核苷酸。
為增加核酸酶抗性，可通過使用3′-3′連接調轉3′-末端的核苷酸來進一步修飾反義試劑。在另一個選擇中，可使用氨基烷基基團封閉3′-末端。
在一個實施方案中，反義寡核苷酸試劑包含提高靶向性的修飾，例如本文所述的靶向修飾。
誘餌型寡核苷酸試劑 本文所述寡核苷酸試劑可以為誘餌核酸，例如誘餌RNA。誘餌核酸類似於天然核酸，但誘餌核酸的修飾方式使其抑制或幹擾天然核酸的活性。例如，誘餌RNA可模仿針對配體的天然結合域。因此，誘餌RNA與天然結合靶競爭與特異配體的結合。天然結合靶可以為內源核酸，例如miRNA前體、miRNA、mRNA前體、mRNA或DNA。例如，現已發現過表達的HIV轉錄激活應答(TAR)RNA可充當「誘餌」並有效結合HIV tat蛋白，從而抑制其與HIV RNA中編碼的TAR序列的結合。
在一個實施方案中，誘餌RNA包括提高靶向性的修飾，例如本文所述的靶向修飾。
上文以及本文中其他部分所述的對miRNA和反義RNA的化學修飾也適合用於誘餌核酸。
適體型寡核苷酸試劑 本文所述的寡核苷酸試劑可以為適體。適體與非核酸配體(例如有機小分子或蛋白質，例如轉錄或反義因子)結合，隨後改變(例如抑制)其活性。適體可摺疊成特異的結構以介導對非核酸配體上靶向性結合位點的識別。適體可包含本文所述的任何修飾。
在一個實施方案中，適體包括提高靶向性的修飾，例如本文所述的靶向性修飾。
上文以及本文中其他部分所述的對miRNA和反義RNA的化學修飾也適合用於誘餌核酸。
以下附圖和闡述對本發明的一個或多個實施方案進行了詳細說明。本發明的其他特徵和優點將體現於說明書、附圖和權利要求書中。基於所有目的，本申請通過引用整體併入所有的引用文獻、專利和專利申請。
一方面，本發明描述了antagomir。Antagomir為靶向小RNA的單鏈、雙鏈、部分雙鏈以及發卡結構的經化學修飾的寡核苷酸。
Antagomir包含與內源miRNA基本互補的至少12個或更多個連續核苷酸或基本由與內源miRNA基本互補的至少12個或更多個連續核苷酸組成，更具體地說，antagomir為包含與miRNA或miRNA前體核苷酸序列的靶序列基本互補的12個或更多個連續核苷酸的試劑。優選本發明所述的antagomir包括與miRNA靶序列充分互補以與其雜交的核苷酸序列，所述核苷酸序列為約12～25個核苷酸，優選為約15～23個核苷酸。更優選地，所述靶序列與表1中所示序列的差別不超過1、2或3個核苷酸，並且在一個實施方案中，antagomir為表2a-e中所示的試劑。在一個實施方案中，antagomir包括非核苷酸部分，例如膽固醇部分。所述非核苷酸部分可與例如寡核苷酸試劑的3′或5′末端相連。在優選的實施方案中，膽固醇部分與寡核苷酸試劑的3′末端相連。
例如，通過引入修飾(如核苷酸修飾)使antagomir對核酸降解保持穩定。在另一個實施方案中，antagomir在核苷酸序列3′或5′末端的至少第一個、第二個或第三個核苷酸間連接內含有硫代磷酸酯。在再一個實施方案中，antagomir包含2′-修飾核苷酸，例如2′-脫氧、2′-脫氧-2′-氟、2′-O-甲基、2′-O-甲氧基乙基(2′-O-MOE)、2′-O-氨基丙基(2′-O-AP)、2′-O-二甲基氨基乙基(2′-O-DMAOE)、2′-O-二甲基氨基丙基(2′-O-DMAP)、2′-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2′-O-DMAEOE)或2′-O-N-甲基乙醯氨基(2′-O-NMA)。在特別優選的實施方案中，antagomir包含至少一個2′-O-甲基修飾的核苷酸，並且在一些實施方案中，antagomir中的所有核苷酸均包含2′-O-甲基修飾。
例如在miRNA活性的異常或不良，或者與內源miRNA雜交的靶mRNA的活性不足與疾病或病變相關的情況下，可將與miRNA核苷酸序列基本互補的antagomir遞送到細胞或人體中，以抑制或降低內源miRNA的活性。在一個實施方案中，本文所述的antagomir具有與miR-122(參見表1)基本互補的核苷酸序列，其與包括醛縮酶A mRNA、N-myc下遊調控基因(Ndrg3)mRNA、包含IQ基序的GTPase活化蛋白-1(Iqgap1)mRNA、HMG-CoA-還原酶(Hmgcr)mRNA以及檸檬酸合酶mRNA等在內的多種RNA雜交。在優選的實施方案中，與miR-122基本互補的antagomir為antagomir-122(表2a-e)。現已發現醛縮酶A缺陷與包括溶血性貧血、先天多發性關節攣縮症(arthrogryposis complex congenita)、垂體異位症、橫紋肌溶解症、高鉀血症在內的多種病變相關。患醛縮酶A缺陷的病人還具有以下症狀，包括生長發育延遲、臉面中部發育不全、肝腫大以及肌病性症狀。因此，患有或經診斷為患有任意的這些病變或症狀的病人為接受使用與miR-122雜交的antagomir治療的候選人。
雙鏈核糖核酸(dsRNA) 在一個實施方案中，本發明提供了包裹於締合複合物(如脂質體)中，用於抑制細胞或哺乳動物中基因表達的雙鏈核糖核酸(dsRNA)分子，其中所述dsRNA包含具有互補區的反義鏈，所述互補區與該基因表達過程中形成的mRNA的至少一部分互補，並且所述互補區的長度小於30個核苷酸，通常為19-24個核苷酸，並且所述dsRNA在與表達所述基因的細胞接觸時，可將所述基因的表達抑制至少40％。所述dsRNA包含兩條充分互補從而雜交形成雙鏈結構的RNA鏈。所述dsRNA中的一條鏈(反義鏈)包含與靶基因基本互補，或通常為完全互補的互補區，而另一條鏈(正義鏈)包含與所述反義鏈互補的區域，這樣當在適當的條件下混合時所述兩條鏈就會雜交並形成雙鏈結構，其中所述靶基因衍生自基因表達期間形成的mRNA序列。通常，所述雙鏈結構的長度為15-30個鹼基對，更常見18-25個，還更常見19-24個，最常見為19-21個鹼基對。類似地，與靶序列互補的區域的長度為15-30個鹼基對，更常見18-25個，還更常見19-24個，最常見為19-21個鹼基對。本發明的dsRNA還可以包含一個或多個單鏈核苷酸懸端。可通過下文進一步討論的本領域已知的標準方法合成所述dsRNA，例如使用自動DNA合成儀(例如，可商購自Biosearch，Applied Biosystems，Inc)。
適合包裹進入本文所述締合複合物的dsRNA可包含18～25個鹼基對(例如21個鹼基對)的雙鏈結構。在一些實施方案中，dsRNA至少包含長度至少為21nt的一條單鏈。在其他實施方案中，dsRNA至少包含至少為15、16、17、18、19、20個或更多連續核苷酸的一個單鏈。
適合包裹進入本文所述締合複合物的dsRNA可以包含與靶序列的一個或多個錯配。在一個優選實施方案中，本發明的dsRNA包含不超過3個錯配。如果所述dsRNA的反義鏈包含與靶序列的錯配，則優選所述錯配區域不位於互補區的中心。如果所述dsRNA的反義鏈包含與靶序列的錯配，則優選所述錯配區域被限定為自任一末端開始的5個核苷酸，例如在互補區5′-或3′-末端開始的5、4、3、2或1個核苷酸。
在一個實施方案中，dsRNA的至少一個末端具有1-4個，通常1個或2個核苷酸的單鏈核苷酸懸端。通常，所述單鏈懸端位於反義鏈的3′-末端，或者，可選擇地位於正義鏈的3′-末端。所述dsRNA也可以具有平端，通常位於反義鏈的5′-末端。此類dsRNA具有提高的穩定性和抑制活性，因此能夠以低劑量施用，即每天施用小於5mg/kg受體體重。通常，所述dsRNA的反義鏈在3′-末端具有核苷酸懸端，而5′-末端為平端。在另一個實施方案中，懸端中的一個或多個核苷酸被替代為核苷硫代磷酸酯。
在再一個實施方案中，對包裹在本文所述締合複合物(例如脂質體)內的dsRNA進行化學修飾以增強穩定性。可通過本領域的常規方法合成和/或修飾此類核酸，例如那些描述於″Current protocols in nucleic acid chemistry″，Beaucage，S.L.et al.(Edrs.)，John Wiley & Sons，Inc.，New York，NY，USA中的方法，以上文獻通過引用併入本文。所述化學修飾可包括但不限於2′-修飾，對寡核苷酸中其它鹼基或糖位點的修飾，向寡核苷酸鏈中引入非天然鹼基，與配體或化學部分的共價連接以及將核苷酸間磷酸連接替換成如硫代磷酸酯的其它連接。可使用不只一種此類修飾。
可通過任意的多種熟知技術完成兩條單獨dsRNA鏈的化學連接，例如通過引入共價鍵、離子鍵或氫鍵、疏水相互作用、範德華或堆積相互作用；通過金屬離子配位的方式或通過使用嘌呤類似物完成所述化學連接。此類經化學連接的dsRNA適合包裹在本文所述的締合複合物中。通常，可用來修飾dsRNA的化學基團包括但不限於亞甲基藍；雙官能團，通常為雙-(2-氯乙基)胺；N-乙醯-N′-(對乙醛醯苯甲醯基)胱胺；4-硫尿嘧啶和補骨脂素。在一個實施方案中，所述接頭是六乙二醇接頭。在這種情況下，可通過固相合成製備所述dsRNA，並根據標準方法(例如，Williams，D.J.和K.B.Hall，Biochem.(1996)3514665-14670)併入六乙二醇接頭。在特定的實施方案中，通過六乙二醇接頭化學連接反義鏈的5′-末端和正義鏈的3′-末端。在另一個實施方案中，所述dsRNA中的至少一個核苷酸包含硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯基團。所述dsRNA末端的化學鍵通常通過三螺旋鍵形成。
在再一個實施方案中，可對兩條單鏈中一個或兩個末端的核苷酸進行修飾以防止或抑制細胞酶(例如，但不限於某些核酸酶)的降解活性。本領域中抑制細胞酶對核酸降解活性的已知技術包括但不限於2′-氨基修飾、2′-氨基糖修飾、2′-F糖修飾、2′-F修飾、2′-烷基糖修飾、2′-O-烷氧基烷基修飾(如2′-O-甲氧基乙基修飾)、無電荷和帶電的骨架修飾、嗎啉基修飾、2′-O-甲基修飾和氨基磷酸酯(參見，例如Wagner，Nat.Med.(1995)11116-8)。因此，所述dsRNA中核苷酸的至少一個2′-羥基基團被化學基團取代，通常被取代為2′-F或2′-O-甲基基團。同樣，可對至少一個核苷酸進行修飾以形成鎖核苷酸。此類鎖核苷酸包含連接核糖的2′-氧和核糖的4′-碳的亞甲基橋。包含所述鎖核苷酸的寡核苷酸描述於Koshkin，A.A.，et al.，Tetrahedron(1998)，543607-3630)和Obika，S.et al.，Tetrahedron Lett.(1998)，395401-5404)。向寡核苷酸中引入鎖核苷酸可提高對互補序列的親和力，並將解鏈溫度提高若干度(Braasch，D.A.and D.R.Corey，Chem.Biol.(2001)，81-7)。
將配體與dsRNA結合可增強其細胞吸收性以及對特定組織的靶向性或由特定類型細胞的(例如，肝細胞)攝取。在某些情況下，使疏水性配體與dsRNA相結合從而促進對細胞膜的直接穿透或經肝細胞的吸收。或者，與dsRNA結合的配體是受體介導的內吞作用的底物。現已將這些方法用於促進反義寡核苷酸和dsRNA試劑的細胞穿透。例如，現已將膽固醇與多種反義寡核苷酸結合，從而產生與其非結合類似物相比更具活性的化合物。參見M.Manoharan Antisense & Nucleic Acid Drug Development 2002，12，103。與寡核苷酸結合的其它親脂性化合物包括1-芘丁酸、1，3-雙-O-(十六烷基)甘油和甲醇。用於受體介導的內吞作用的配體的一個實例是葉酸。葉酸通過葉酸受體介導的內吞作用進入細胞。帶有葉酸的dsRNA化合物可通過葉酸受體介導的內吞作用被有效地運輸到細胞中。Li及其同事報導將葉酸結合到寡核苷酸的3′-末端導致所述寡核苷酸的細胞攝取增加8倍(Li，S.；Deshmukh，H.M.；Huang，L.Pharm.Res.1998，15，1540)。與寡核苷酸結合的其它配體包括聚乙二醇、糖簇(carbohydrate cluster)、交聯劑、卟啉結合物、運載肽和例如膽固醇的脂質。對siRNA的其他化學修飾已描述於Manoharan，M.RNAinterference and chemically modified small interfering RNAs.Current Opinion inChemical Biology(2004)，8(6)，570-579。
在某些情況下，陽離子配體與寡核苷酸的結合提高了對核酸酶的抗性。陽離子配體的代表性實例是丙基銨和二甲基丙基銨。令人感興趣的是，有報導稱當陽離子配體分散於整個寡核苷酸時，所述寡核苷酸保持了其對mRNA的高結合親和力。參見M.Manoharan Antisense & Nucleic Acid DrugDevelopment 2002，12，103及其參考文獻。
可使用具有反應性官能團側鏈(pendant reactive functionality)的dsRNA(例如，將連接分子連接到dsRNA而得到的dsRNA)來合成與配體結合的本發明dsRNA。這種反應性寡核苷酸可直接與商購的配體反應，其中所述配體經合成而具有多種保護基團，或該配體具有與其結合的連接部分。在一些優選實施方案中，本發明的方法通過使用已經適當地與配體結合併且可進一步結合固體支持物的核苷單體來促進與配體結合的dsRNA的合成。可根據本發明方法的一些優選實施方案，通過選定的血清結合配體與位於核苷或寡核苷酸5′-位的連接部分之間的反應來製備此類任意結合到固體支持物上的配體-核苷結合物。在某些情況下，首先通過長鏈氨基烷基基團將單體構件單元(monomer building block)共價結合到可控孔度玻璃支持物上，從而製備3′-末端結合有芳烷基配體的dsRNA。隨後，通過標準固相合成技術使結合在固體支持物上的單體構件單元與核苷酸相結合。所述單體構件單元可以是核苷或適合於固相合成的其它有機化合物。
可通過熟知的固相合成技術便捷且常規製備用於本發明結合物內的dsRNA。有多個供貨商銷售用於此類合成的設備，包括例如AppliedBiosystems(Foster City，CA)。可額外地或任選地採用其它本領域已知的合成技術。還已知使用類似技術製備其它寡核苷酸，例如硫代磷酸酯和烷基化衍生物。
可在以下美國專利中找到關於合成特定修飾寡核苷酸的教導美國專利第5,138,045號和第5,218,105號，涉及結合多胺的寡核苷酸；美國專利第5,212,295號，涉及用於製備具有手性磷連接的寡核苷酸的單體；美國專利第5,378,825號和第5,541,307號，涉及具有修飾骨架的寡核苷酸；美國專利第5,386,023號，涉及骨架經修飾的寡核苷酸和其通過還原性偶聯的製備方法；美國專利第5,457,191號，涉及基於3-氮雜嘌呤環系統的修飾核鹼基及其合成方法；美國專利第5,459,255號，涉及基於N-2取代嘌呤的修飾核鹼基；美國專利第5,521,302號，涉及具有手性磷連接的寡核苷酸的製備方法；美國專利第5,539,082號，涉及肽核酸；美國專利第5,554,746號，涉及具有β-內醯胺骨架的寡核苷酸；美國專利第5,571,902號，涉及合成寡核苷酸的方法和材料；美國專利第5,578,718號，涉及具有烷硫基基團的核苷，其中所述基團可用作接頭以與結合至所述核苷其它各位點的部分連接；美國專利第5,587,361號和第5,599,797號，涉及具有高手性純度的硫代磷酸酯鍵的寡核苷酸；美國專利第5,506,351號，涉及製備2′-O-烷基鳥嘌呤核苷和包括2，6-二氨基嘌呤化合物的相關化合物的方法；美國專利第5,587,469號，涉及具有N-2取代嘌呤的寡核苷酸；美國專利第5,587,470號，涉及具有3-氮雜嘌呤的寡核苷酸；美國專利第5,223,168號和美國專利第5,608,046號，均涉及結合有4′-去甲基核苷的類似物；美國專利第5,602,240號和第5,610,289號，涉及骨架經修飾的寡核苷酸類似物；美國專利第6,262,241號和第5,459,255號，特別涉及2′-氟-寡核苷酸的合成方法。
在本發明的與配體結合的dsRNA以及具有序列特異性連接核苷的配體分子中，可使用標準核苷酸或核苷前體，或者已經具有連接部分的核苷酸或核苷結合物前體，已經具有連接分子的配體-核苷酸或核苷-結合物前體，或者具有配體的非核苷構件單元在合適的DNA合成儀上組裝寡核苷酸和寡聚核苷。
在使用已經具有連接部分的核苷酸結合物前體時，通常要完成序列特異性連接核苷的合成，隨後使配體分子與連接部分反應以形成結合有配體的寡核苷酸。先前已描述過具有多種分子(例如，類固醇、維生素、脂質和報告分子)的寡核苷酸結合物(參見Manoharan等人，PCT申請WO 93/07883)。在優選的實施方案中，通過使用衍生自配體-核苷結合物的亞磷醯胺以及可商購併常規用於寡核苷酸合成的標準亞磷醯胺和非標準亞磷醯胺在自動合成儀上合成本發明的寡核苷酸或連接核苷。
包裹在本文所述締合複合物中的dsRNA可包含一個或多個經修飾的核苷，例如核苷中的2′-O-甲基、2′-O-乙基、2′-O-丙基、2′-O-烯丙基、2′-O-氨基烷基或2′-脫氧-2′-氟代基團。此類修飾可增強與所述寡核苷酸的雜交性質。此外，包含硫代磷酸酯骨架的寡核苷酸具有增強的核酸酶穩定性。因此，官能化的連接核苷可進一步包括硫代磷酸酯骨架和2′-O-甲基、2′-O-乙基、2′-O-丙基、2′-O-氨基烷基、2′-O-烯丙基或2′-脫氧-2′-氟代基團中的一種或兩種。例如，可在PCT公開WO 200370918中找到本領域已知的一些寡核苷酸修飾的總結表。
在一些實施方案中，使用DNA合成儀製備在5′-末端具有氨基基團的官能化核苷序列，並隨後與選定配體的活性酯衍生物反應。所述活性酯衍生物為本領域技術人員所熟知。代表性的活性酯包括N-羥基琥珀醯亞胺酯、四氟酚酯、五氟酚酯和五氯酚酯。所述氨基基團與所述活性酯發生反應生成寡核苷酸，其中所述選定配體通過連接基團結合到5′-位點。5′-末端的氨基基團可使用5′-氨基-修飾劑C6試劑製備。在一個實施方案中，可通過使用配體-核苷亞磷酸醯胺將配體分子結合到寡核苷酸的5′-位點，其中所述配體直接地或通過接頭間接地連接到5′-羥基基團。通常在自動合成程序結束時使用此類配體-核苷亞磷酸醯胺以獲得在5′-末端具有配體的配體結合的寡核苷酸。
修飾的核苷間連接鍵或骨架的實例包括，例如，硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其它烷基膦酸酯(包括3′-亞烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、亞膦酸酯、氨基磷酸酯(包括3′-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯)、硫羰基氨基磷酸酯、硫羰基膦酸烷基酯、硫羰基烷基磷酸三酯和具有正常3′-5′連接鍵的硼烷磷酸酯及其2′-5′連接的類似物，以及具有反極性的那些類似物(其中相鄰核苷單位配對的連接由3′-5′變成5′-3′或由2′-5′變成5′-2′)。還包括各種鹽、混合鹽和游離酸形式。
涉及製備上述含磷原子連接鍵的代表性美國專利包括但不限於美國專利第3,687,808號、第4,469,863號、第4,476,301號、第5,023,243號、第5,177,196號、第5,188,897號、第5,264,423號、第5,276,019號、第5,278,302號、第5,286,717號、第5,321,131號、第5,399,676號、第5,405,939號、第5,453,496號、第5,455,233號、第5,466,677號、第5,476,925號、第5,519,126號、第5,536,821號、第5,541,306號、第5,550,111號、第5,563,253號、第5,571,799號、第5,587,361號、第5,625,050號和第5,697,248號，所述各專利均通過引用併入本文。
其中(即，寡聚核苷中)不包含磷原子的經修飾的核苷間連接鍵或骨架的實例具有通過短鏈烷基或環烷基糖間連接鍵、混合的雜原子和烷基或環烷基糖間連接鍵，或者一個或多個短鏈雜原子或雜環糖間連接鍵形成的骨架。這些骨架包括具有嗎啉代連接鍵(部分由核苷的糖部分形成)的骨架；矽氧烷骨架；硫化物、亞碸和碸骨架；formacetyl和thioformacetyl骨架；methyleneformacetyl和thioformacetyl骨架；含有烯烴的骨架；氨基磺酸酯骨架；亞甲基亞胺和亞甲基肼基骨架；磺酸酯和磺醯胺骨架；醯胺骨架；和其它具有混合的N、O、S和CH2組成部分的骨架。
與上述寡聚核苷的製備相關的代表性美國專利包括但不限於美國專利第5,034,506號、第5,166,315號、第5,185,444號、第5,214,134號、第5,216,141號、第5,235,033號、第5,264,562號、第5,264,564號、第5,405,938號、第5,434,257號、第5,466,677號、第5,470,967號、第5,489,677號、第5,541,307號、第5,561,225號、第5,596,086號、第5,602,240號、第5,610,289號、第5,602,240號、第5,608,046號、第5,610,289號、第5,618,704號、第5,623,070號、第5,663,312號、第5,633,360號、第5,677,437號和第5,677,439號，所述各專利均通過引用併入本文。
在某些情況下，可通過非配體基團修飾締合複合物(如脂質體)中包含的寡核苷酸。現已將多種非配體分子與寡核苷酸結合以改善所述寡核苷酸的活性、細胞分布或細胞攝取，而且可從科技文獻中獲得進行此類結合的方法。這些非配體部分包括脂質部分，例如膽固醇(Letsinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1989，866553)，膽酸(Manoharan等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.，1994，41053)；硫醚，例如己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.，1992，660306；Manoharan等人，Bioorg.Med.Chem.Let.，1993，32765)；硫代膽固醇(Oberhauser等人，Nucl.Acids Res.，1992，20533)；脂肪族鏈，例如，十二烷基二醇或十一烷基殘基(Saison-Behmoaras等人，EMBOJ.，1991，10111；Kabanov等人，FEBS Lett.，1990，259327；Svinarchuk等人，Biochimie，1993，7549)；磷脂，例如二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙基銨1，2-二-O-十六烷基-外消旋-甘油-3-H-磷酸酯(Manoharan等人，Tetrahedron Lett.，1995，363651；Shea等人，Nucl.Acids Res.，1990，183777)；多胺或聚乙二醇鏈(Manoharan等人，Nucleosides & Nucleotides，1995，14969)或金剛烷乙酸(Manoharan等人，Tetrahedron Lett.，1995，363651)；棕櫚基部分(Mishra等人，Biochim.Biophys.Acta，1995，1264229)或十八胺或己胺-羰基氧基膽固醇部分(Crooke等人，Pharmacol.Exp.Ther.，1996，277923)。上文已經列出了教導此類寡核苷酸結合物的製備方法的代表性美國專利。典型的結合方法包含合成在序列中一個或多個位點具有氨基接頭的寡核苷酸。隨後，使用合適的偶聯劑或活化試劑使氨基基團與將要被結合的分子反應。所述結合反應可在寡核苷酸仍結合在固體支持物時進行，或者在寡核苷酸被切割至溶液相後進行。通常通過HPLC純化寡聚核苷酸結合物以獲得純的結合物。
上述修飾適合用於本文所述的寡核苷酸試劑。
膜融合脂質 術語「膜融合」(fusogenic)是指脂質或其他給藥系統與細胞膜融合的能力。所述膜可以為質膜或環繞細胞器(如內涵體、細胞核等)的膜。適合的膜融合脂質的實例包括，但不限於二油醯磷脂醯乙醇胺(DOPE)、DODAC、DODMA、DODAP或DLinDMA。在一些實施方案中，締合複合物包含與脂質相連的小分子(如咪唑部分)，以用於如內涵體的釋放。
PEG或PEG-脂質 在陽離子脂質和膜融合脂質之外，締合複合物還包含雙層穩定性組分(BSC)，例如ATTA-脂質或PEG-脂質。示例性的脂質如下例如WO05/026372所述的與二烷氧基丙基偶聯的PEG(PEG-DAA)，如美國專利申請第20030077829號和第2005008689號所述的與二醯基甘油偶聯的PEG(PEG-DAG)，與磷脂醯乙醇胺(PE)偶聯的PEG(PEG-PE)或與神經醯胺結合的PEG，或其混合物(參見美國專利第5,885,613號)。在優選的實施方案中，所述締合複合物包括本文所述的PEG-脂質，例如式(XV)、(XV′)或(XVI)的PEG-脂質。在一個優選的實施方案中，BSC為抑制SPLP聚集的結合脂質。適合的結合脂質包括，但不限於PEG-脂質結合物、ATTA-脂質結合物、陽離子聚合物-脂質結合物(CPL)或其混合物。在一個優選的實施方案中，SPLP包含PEG-脂質結合物或ATTA-脂質結合物以及CPL。
PEG為聚乙二醇，是帶有兩個末端羥基基團的乙烯基PEG重複單元的水溶性聚合物。通過其分子量對PEG進行分類，例如PEG 2000的平均分子量為約2,000道爾頓，而PEG 5000的平均分子量為約5,000道爾頓。PEG可商購自Sigma Chemical Co.及其他公司，並且包括例如以下單甲氧基聚乙二醇(MePEG-OH)、單甲氧基聚乙二醇-琥珀酸酯(MePEG-S)、單甲氧基聚乙二醇-琥珀醯亞胺琥珀酸酯(MePEG-S-NHS)、單甲氧基聚乙二醇-胺(MePEG-NH2)、單甲氧基聚乙二醇-三氟乙基磺酸酯(MePEG-TRES)和單甲氧基聚乙二醇-咪唑基-羰基(MePEG-IM)。此外，單甲氧基聚乙二醇-乙酸(MePEG-CH2COOH)特別適合用於製備PEG-脂質結合物(包括，例如PEG-DAA結合物)。
在優選的實施方案中，PEG的平均分子量為約550道爾頓～約10,000道爾頓，更優選為約750道爾頓～約5,000道爾頓，更優選為約1,000道爾頓～約5,000道爾頓，更優選為約1,500道爾頓～約3,000道爾頓，且再更優選為約2,000道爾頓，或約750道爾頓。PEG可任選地被烷基、烷氧基、醯基或芳基基團取代。PEG可與脂質直接結合或通過接頭部分與脂質相連。可使用適合偶聯PEG和脂質的任何接頭部分，其包括，例如不含酯的接頭部分以及含酯的連頭部分。在優選的實施方案中，接頭部分為不含酯的接頭部分。本文所用術語「不含酯的接頭部分」是指不包含羧酸酯鍵(--OC(O)--)的接頭部分。適合的不含酯的接頭部分包括，但不限於醯胺(--C(O)NH--)、氨基(--NR--)、羰基(--C(O)--)、氨基甲酸酯(--NHC(O)O--)、脲(--NHC(O)NH--)、二硫化物(--S--S--)、醚(--O--)、琥珀醯(--(O)CCH2CH2C(O)--)、琥珀醯亞胺(--NHC(O)CH2CH2C(O-)NH--)、醚、二硫化物等以及其組合(例如包含氨基甲酸酯接頭部分和醯胺接頭部分的接頭)。在優選的實施方案中，使用氨基甲酸酯接頭將PEG與脂質偶聯。
在其他實施方案中，使用含酯的接頭部分將PEG與脂質偶聯。適合的含酯的接頭部分包括，例如碳酸酯(--OC(O)O--)、琥珀醯、磷酸酯(--O--(O)POH--O--)、磺酸酯及其組合。
靶向試劑 在一些實施方案中，所述締合複合物包含靶向試劑。例如，靶向製品可包含在締合複合物(如脂質體)的表面，從而有助於將締合複合物導向到體內的靶區域。靶向試劑的實例為半乳糖、甘露糖和葉酸。靶向試劑的其他實例包括小分子受體、肽和抗體。在一些實施方案中，靶向試劑與治療劑部分(如寡核苷酸試劑)結合。在一些實施方案中，靶向部分與締合複合物的脂質組分直接相連。在一些實施方案中，靶向部分通過PEG與脂質組分直接相連，優選使用平均分子量為2000amu的PEG。在一些實施方案中，靶向試劑是未結合的，例如在締合複合物的表面上。
結構性組分 在一些實施方案中，所述締合複合物包含改進複合物(如脂質體)結構的一種或多種組分。在一些實施方案中，可使治療劑(如dsRNA)與親脂性化合物(如膽固醇)相連(如結合)，從而為dsRNA提供親脂性錨(lipophilicanchor)。在一些實施方案中，dsRNA與親脂性部分(如膽固醇)的結合可改進締合複合物的包裹效率。
締合複合物的性質 締合複合物(如脂質體)通常為水動力學直徑(hydrodynamic diameter)在約25nm～500nm範圍內的顆粒。在一些優選的實施方案中，締合複合物的水動力學直徑小於500nm，例如約25～約400nm，例如約25nm～約300nm，優選為約120nm或以下。
在一些實施方案中，締合複合物中全部賦形劑與RNA的重量比小於約20∶1，例如約15∶1。在一些優選的實施方案中，該重量比小於10∶1，例如約7.5∶1。
在一些實施方案中，締合複合物的pKa使該締合複合物在內涵體的環境發生質子化(例如，促進複合物的破裂)，但在生理環境中不會發生質子化。
在一些實施方案中，締合複合物提高了寡核苷酸(如dsRNA)的體內遞送。可使用基因沉默試驗，例如測量VII因子沉默的試驗，來測量寡核苷酸的體內遞送。
VII因子的體內沉默試驗 對C57BL/6小鼠進行生理鹽水或多種脂質製品的尾靜脈注射。以10μL/g動物體重的注射體積施用用脂質配製的不同劑量siRNA(Lipid-formulatedsiRNA)。施用24小時後，通過眼球後放血(retroorbital bleed)收集血清樣品。根據製造商所述的方法，使用顯色診斷試劑盒(Coaset Factor VII Assay Kit，DiaPharma)測定血清內VII因子的濃度。
締合複合物的製備方法 在一些實施方案中，通過在存在溶劑和緩衝劑的條件下使治療劑(如寡核苷酸)和脂質接觸來製備締合複合物。在一些實施方案中，溶劑中包含多種脂質，例如一種或多種陽離子脂質(例如含多胺的脂質或包含本文所述生物可切割部分的脂質)、PEG-脂質、靶向性脂質或膜融合脂質。
在一些實施方案中，所述緩衝劑的強度足以使含胺脂質(例如本文所述的脂質，如式(I)或式(X)的脂質)中幾乎所有的胺發生質子化。
在一些實施方案中，所述緩衝劑為乙酸鹽緩衝劑，例如乙酸鈉(pH約為5)。在一些實施方案中，緩衝劑在溶液中存在的濃度為約100mM～約300mM。
在一些實施方案中，所述溶劑為乙醇。例如，在一些實施方案中，混合物包含至少約90％的乙醇，或100％的乙醇。
在一些實施方案中，所述方法包括將混合物擠出，從而提供粒徑為水動力學直徑小於約500nm(例如約25nm～約300nm的尺寸，例如在一些優選的實施方案中，粒徑在約40-120nm的範圍)的締合複合物。在一些實施方案中，該方法不包括混合物的擠出。
在一個實施方案中，使本文所述脂質的溶液與含膽固醇、PEG、乙醇和25mM乙酸鹽緩衝劑的溶液混合以提供pH約為5的混合物，從而製備脂質體。將該混合物溫和渦旋振蕩，並向該混合物中添加蔗糖。隨後，再將混合物渦旋振蕩直至蔗糖溶解。向該混合物中添加含siRNA的乙酸鹽緩衝劑溶液，溫和渦旋振蕩約20分鐘。隨後，通過至少一個濾器(例如兩個200nm濾器)在40℃擠出該混合物(例如，至少約10次，例如11次或以上)，並使用PBS在pH 7.4、室溫下透析約90分鐘。
在一個實施方案中，製備脂質體時不需要擠出脂質體混合物。在100％乙醇、水和濃度為約100mM～約300mM的乙酸鹽緩衝劑(pH約為5)中，將本文所述的脂質與膽固醇、PEG和siRNA組合。將該組合物在90％乙醇中快速混合。完成後，使用濃度為約100mM～約300mM的乙酸鹽緩衝劑(pH約為5)對混合物進行透析(或進行超濾處理)以除去乙醇，隨後使用PBS進行透析(或進行超濾處理)以改變緩衝條件。
可在不存在治療劑(如單鏈或雙鏈核酸)的條件下形成締合複合物，並在形成後使用一種或多種具有治療活性的單鏈或雙鏈核酸部分對其進行處理以提供負載的締合複合物，即負載有治療活性核酸的締合複合物。核酸可被捕獲至締合複合物內部或吸附到締合複合物的表面，或同時出現上述兩種情況。例如，可使用上述締合複合物(如脂質體)的製備方法形成不含治療劑(例如核酸，如單鏈或雙鏈RNA，如siRNA)的締合複合物。在形成締合複合物後，使用治療劑(如siRNA)處理該複合物以提供負載的締合複合物。
在一個實施方案中，提供包含陽離子脂質、膽固醇和PEG-脂質的乙醇(例如，100％乙醇)，並使其與緩衝水溶液(例如NaOAc水溶液)組合，以提供無負載的締合複合物，其中，所述陽離子脂質如式(I)所示的脂質，優選下式的陽離子脂質
所述PEG-脂質例如本文所述的PEG-脂質，如以下PEG-脂質
緩衝水溶液隨後，任選地擠出締合複合物，以使締合複合物的粒徑分布更均勻。隨後，使用溶於乙醇(例如35％乙醇)的治療劑(例如siRNA)處理該締合複合物，從而提供負載的締合複合物。在一些實施方案中，隨後通過除去乙醇的方法(例如透析)處理該締合複合物。
締合複合物的表徵 通過類似的方式表徵由任意上述方法製備的締合複合物。首先通過目視檢查表徵締合複合物。通常，優選的締合複合物為沒有凝聚物或沉澱物的淺白色透明溶液。使用Malvern Zetasizer Nano ZS(Malvern，USA)通過動態光散射測量脂質-納米顆粒的粒徑和粒徑分布。優選顆粒的粒徑為20-300nm，更優選為40-100nm。在一些優選的實施方案中，粒徑呈單峰分布。使用染料排斥試驗評估製品中總siRNA的濃度，以及被捕獲的片段。在存在或不存在分解製品的表面活性劑(0.5％Triton-X100)的條件下，將配製的siRNA樣品與結合RNA的染料Ribogreen(Molecular Probes)一起溫育。參照標準曲線，通過含表面活性劑的樣品的信號來測定製品中的總siRNA。從總siRNA含量中減去「游離」siRNA含量(通過不含表面活性劑的信號測量)測定被捕獲的片段。被捕獲的siRNA的百分數通常＞85％。
締合複合物的使用方法以及包含該締合複合物的組合物 包含寡核苷酸試劑的藥物組合物 組裝到締合複合物中的寡核苷酸試劑能夠以單鏈或雙鏈的構型被施用於，例如細胞或人。雙鏈構型的寡核苷酸試劑與基本互補的寡核苷酸鏈結合。以雙鏈的構型遞送寡核苷酸試劑可賦予寡核苷酸某些優點，例如增強其對核酸酶的抗性。
在一個實施方案中，本發明提供了包含如本文所述的包裹在締合複合物(如脂質體)中的寡核苷酸試劑和藥學上可接受的載體的藥物組合物。所述包含所包裹的寡核苷酸試劑的藥物組合物可用於治療與靶基因的表達或活性相關的疾病或病變，例如可通過下調基因表達而介導的病理過程。可基於給藥方式配製此類藥物組合物。一個實例是配製成通過非腸道給藥遞送至特定器官/組織(例如肝臟)的組合物。
以足夠抑制靶基因表達的劑量施用本發明所述的藥物組合物。
通常，所包裹的寡核苷酸試劑的合適劑量為所遞送的寡核苷酸製品為每天0.01～5.0mg/kg受體體重，通常為每天1μg/kg體重～1mg/kg體重。藥物組合物可以每天施用一次，或者可以在一天內以適當的間隔分兩個、三個或多個亞劑量施用寡核苷酸試劑，或者通過連續輸注或通過控釋製品遞送給藥。在這種情況下，每個亞劑量中所包含的寡核苷酸試劑必須相對較少以達到每天的總劑量。也可將劑量單位組合以用於數天的給藥，例如使用常規持續釋放製品以在數天內提供所包裹的寡核苷酸試劑的持續釋放。持續釋放製品是本領域所熟知的技術。
熟練的技術人員可以理解某些因素可能影響有效治療受試者所需要的劑量和時間，所述因素包括但不限於疾病或病變的嚴重程度、先期治療、受試者的綜合健康度和/或年齡以及存在的其它疾病。此外，使用治療有效量的組合物對受試者進行的治療可以包括單次治療或一系列治療。如本文其它部分所述，可以使用常規方法學或者使用合適的動物模型在體內檢測的基礎上評估包裹於締合複合物中的單個寡核苷酸試劑的有效量和體內半衰期。
隨著小鼠遺傳學的進展，已經產生了用於研究多種人類疾病的多種小鼠模型。此類模型可用於包裹於親脂性組合物中的寡核苷酸試劑的體內檢測以及確定治療有效劑量。
可使用任何方法向哺乳動物施用包裹於締合複合物(例如脂質體)中的寡核苷酸試劑。例如，可直接服用、口服或經胃腸外(例如，通過皮下、心室內、肌肉或腹膜內注射或通過靜脈點滴)施用。可快速施用(例如，通過注射)或在一段時間內進行施用(例如，通過慢速輸注或施用緩釋製品)。
可將包裹於締合複合物中的寡核苷酸試劑製備成組合物，例如滅菌和未滅菌的水溶液、在常規溶劑(例如，醇類)中的非水溶液、或者液態或固態油基質中的溶液。此類溶液也可包含緩衝劑、稀釋劑和其它適合的添加劑。在經胃腸外、鞘內或心室內施用時，可將寡核苷酸試劑製備成組合物(例如滅菌水溶液)，所述組合物也可包含緩衝劑、稀釋劑和其它適合的添加劑(例如，促透劑、載體化合物和其它藥學上可接受的載體)。
可在藥學上可接受的載體或稀釋劑中製備包裹於締合複合物中的寡核苷酸試劑。所述「藥學上可接受的載體」(本文中也稱為「賦形劑」)為藥學上可接受的溶劑、懸浮劑或任意其它藥學上的惰性載體。所述藥學上可接受的載體可以是液體或固體，並可根據所計劃的施用方式進行選擇以提供所需的體積、稠度和其它相關的輸送性質和化學性質。通常的藥學上可接受的載體包括但不限於例如水、鹽溶液、粘合劑(例如，聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基甲基纖維素)、填料(例如，乳糖和其它糖、明膠或硫酸鈣)、潤滑劑(例如，澱粉、聚乙二醇或乙酸鈉)、崩解劑(例如，澱粉或澱粉乙醇酸鈉)和溼潤劑(例如，十二烷基硫酸鈉)。
實施例 實施例1化合物3、4和4、5的合成和純化在麥可加成反應條件下對三乙烯四胺進行烷基化——方法1(路線1) 路線1a
a(i)90℃，無溶劑，5天 在350mL的耐壓瓶中裝入N-十二烷基丙烯醯胺1(84g，0.35mol)[Slee，Deborah H.；Romano，Suzanne J.；Yu，Jinghua；Nguyen，Truc N.；John，Judy K.；Raheja，Neil K.；Axe，Frank U.；Jones，Todd K.；Ripka，William C.Journal ofMedicinal Chemistry(2001)，44(13)，2094-2107]，並通過溫和加熱容器在氬氣氛中熔化該固體。向該熔化物化物中添加三乙烯四胺2(10.2g，0.07mol)，並將該混合物在90℃加熱5天。在無溶劑條件下，三乙烯四胺2與丙烯醯胺1的麥可加成反應產生兩種五烷基化產物和一種六烷基化產物，以及少量低烷基化產物。通過以CH2Cl2∶MeOH∶NEt3(90∶5∶5)為洗脫劑的TLC分析反應混合物。TLC顯示起始丙烯醯胺1幾乎完全被消耗。將反應混合物溶解於二氯甲烷(40mL)，裝載到預填矽膠柱中，並使用洗脫劑CH2Cl2∶MeOH∶NEt3(48∶1∶1至8∶1∶1)分離該混合物。為了實現完全分離，可使用相同條件的多個柱，並獲得下列純產物。將所需的五加成產物3和4與六加成產物5一起分離。在對粗反應混合物的TLC和LC-MS中，還檢測到該反應混合物中的一些較低的加成產物。
N-十二烷基-3-((2-十二烷基氨基甲醯基-乙基)-{2-[(2-十二烷基氨基甲醯基-乙基)-2-{(2-十二烷基氨基甲醯基-乙基)-[2-(2-十二烷基氨基甲醯基-乙基氨基)-乙基]-氨基}-乙基-氨基)丙醯胺。分離得到淺黃色泡沫狀的兩種五烷基化衍生物之一，即化合物3(異構體I)(12g，13％)。MS m/z 672(M+2H/2)，448(M+3H/3).1H NMR CDCl3δ0.87(t，J＝6.5Hz，15H)，1.20-1.39(m，92H)，1.46-1.57(m，12H)，2.20-2.50(m，16H)，2.60-2.78(m，10H)，3.10-3.25(m，12H)，6.98(bs，3H)，7.41(bs，1H)，7.63(bs，1H)，8.85(bs，1H).13C NMR CDCl3δ14.33，22.90，27.37，29.59，29.67，29.88，29.89，29.92，32.13，39.74，172.77。
(3-[(2-{2-[{2-雙-(2-十二烷基氨基甲醯基-乙基)-氨基]-乙基}-(2-十二烷基氨基甲醯基-乙基)-氨基]-乙基氨基}-乙基)-(2-十二烷基氨基甲醯基-乙基)-氨基]-N-十二烷基-丙醯胺)。分離得到白色粉末狀第二種五烷基化衍生物，即化合物4(異構體II)(13.7g，14％)。MS m/z 672(M+2H/2)，448(M+3H/3).1HNMRδCDCl3δ0.87(t，J＝6.5Hz，15H)，1.20-1.39(m，92H)，1.44-1.54(m，12H)，2.30-2.45(m，8H)，2.46-2.54(m，8H)，2.55-2.85(m，10H)，3.15-3.30(m，12H)，6.98(bs，3H)，7.41(bs，1H)，7.63(bs，1H)，8.85(bs，1H).13C NMR CDCl3δ14.33，22.89，27.28，27.38，29.59，29.69，29.88，29.89，29.92，32.13，39.65，39.74，50.84，172.63，172.75，172.81。
與此同時，還分離得到化合物3和4(11.6g，12％)比例為2∶3(3∶4)的純混合物。
3-[{2-[{2-[雙-(2-十二烷基氨基甲醯基-乙基)-氨基]-乙基}-(2-十二烷基氨基甲醯基-乙基)-氨基]-乙基}-(2-十二烷基氨基甲醯基-乙基)-氨基]-乙基}-(2-十二烷基氨基甲醯基-乙基)-氨基]-N-十二烷基-丙醯胺。分離得到奶油色粉(cream powder)狀的六烷基化產物5(16.3g，17％)。MS m/z 792(M+2H/2)，528(M+3H/3).1H NMR DMSO-d6δ0.87(t，J＝7Hz，18H)，1.15-1.40(m，112H)，1.45-1.53(m，12H)，2.20-2.35(m，12H)，2.37-2.50(m，12H)，2.64-2.78(m，12H)，3.10-3.25(m，12H)，7.26(bs，4H)，7.64(bs，2H).13C NMR CDCl3δ14.32，22.89，27.34，27.38 29.59，29.69，29.90，29.92，32.13，39.77，50.85，172.80。
實施例2化合物3、4和4的合成和純化在麥可加成反應條件下對三乙烯四胺進行烷基化——方法2(路線2) 在另一個試驗中，為了防止原料丙烯醯胺1在高溫下聚合，向反應混合物中添加自由基淬滅劑苯醌。
路線2a
a(i)90℃，催化量(15mg)的苯醌，5天 在該方法中，採用與方法1(實施例1)類似的反應，區別在於向反應混合物中添加自由基淬滅劑苯醌。在150mL的耐壓瓶中裝入N-十二烷基丙烯醯胺1(24g，100mmol)，並加入15mg苯醌，並通過溫和加熱容器在氬氣氛中熔化固體丙烯醯胺。向該熔化物化物中添加三乙烯四胺2(2.9g，20mmol)，並將該混合物在90℃加熱5天。通過以CH2Cl2∶MeOH∶NEt3(90∶5∶5)為洗脫劑的TLC分析反應混合物。TLC顯示起始丙烯醯胺1幾乎完全被消耗。將反應混合物溶解於二氯甲烷(40mL)中，並按照實施例1的描述分離所需產物3、4和5。此時觀察到六加成產物的量略有增加。
化合物3分離得到淺黃色泡沫狀的五加成產物，即異構體I(3.4g，13％)。該化合物的分析數據和光譜數據與方法1獲得的化合物3的數據相同。
化合物4分離得到白色粉末狀五加成產物，即異構體II(3.9g，14％)。該化合物的分析數據和光譜數據與方法1獲得的化合物4的數據相同。還分離可異構體3和4的純混合物(1.9g，7％)。
化合物5分離得到奶油色粉狀的六加成產物5(6.9g，26％)。該化合物的分析數據和光譜數據與方法1獲得的化合物5的數據相同。
實施例3化合物3、4和4的合成和純化在麥可加成反應條件下對三乙烯四胺進行烷基化——方法3(路線3) 在該方法中，在存在如硼酸的促進劑的條件下進行麥可加成反應(Chaudhuri，Mihir K.；Hussain，Sahid；Kantam，M.Lakshmi；Neelima，B.Tetrahedron Letters(2005)，46(48)，8329-8331.)，以提高反應速率。
路線3a
a(i)90℃，硼酸水溶液，2天 在該方法中，採用與方法1(實施例1)類似的反應，區別在於向反應混合物中添加麥可加成反應促進劑，即飽和硼酸水溶液。通過溫和加熱容器在氬氣氛中熔化150mL耐壓瓶中的N-十二烷基-丙烯醯胺1(24g，100mmol)，並加入3mL硼酸水溶液。向該熔化物化物中添加三乙烯四胺2(2.9g，20mmol)，並將該混合物在90℃加熱2天。通過以CH2Cl2∶MeOH∶NEt3(90∶5∶5)為洗脫劑的TLC分析反應混合物。TLC顯示起始丙烯醯胺1幾乎完全被消耗。將反應混合物溶解於二氯甲烷(100mL)中，攪拌溶液和固體碳酸氫鈉，並在旋轉蒸發器中過濾並濃縮有機層。使用CH2Cl2∶MeOH∶NEt3(48∶1∶1至8∶1∶1)通過柱色譜(矽膠)純化該粗產物。為了實現完全分離，可使用相同條件的多個柱，並獲得下列純產物。在該反應條件下，增加了化合物4(異構體II)和六加成產物5的產量。
化合物3分離得到淺黃色泡沫狀五加成產物3，即異構體I(3.1g，11％)。該化合物的分析數據和光譜數據與方法1獲得的化合物3的數據相同。
化合物4分離得到白色粉末五加成產物4，即異構體II(5.7g，20％)。該化合物的分析數據和光譜數據與方法1獲得的化合物4的數據相同。還分離得到異構體3和4的純混合物(2.1g，7％)。
化合物5分離得到奶油色粉狀六加成產物5(7.6g，28％)。該化合物的分析數據和光譜數據與方法1獲得的化合物5的數據相同。
實施例4化合物3和4的合成和純化在麥可加成反應條件下對三乙烯四胺進行烷基化——方法4(路線4) 在另一個試驗中，為了使六加成產物5的形成最小化，嘗試使用了溶劑。
路線4a
a(i)90℃，乙腈或DMF，5天 在該方法中，採用與方法1(實施例1)和方法2(實施例2)類似的反應，區別在於在存在溶劑的條件下，在90℃攪拌進行反應。在150mL的耐壓瓶中，將N-十二烷基-丙烯醯胺1(10g，41.8mmol)溶解於20mL乙腈或DMF中。向該溶液中添加三乙烯四胺2(1g，6.8mmol)，並將該混合物在90℃加熱5天。通過以CH2Cl2∶MeOH∶NEt3(90∶5∶5)為洗脫劑的TLC分析反應混合物。TLC顯示僅形成少量的所需五加成產物。該反應的主要產物為四加成產物和高極性的較低加成產物的混合物。
實施例5從反應混合物和/或分離產物3、4和5中分離未反應的丙烯醯胺 為了從反應混合物中除去未反應的丙烯醯胺1，使用乙酸乙酯或DMF稀釋反應混合物，並與聚苯乙烯或帶有硫醇(thiol或mercaptan)的聚合物一起攪拌以捕獲所有的丙烯醯胺。向溶液中添加固定化的硫醇，在室溫下溫和搖動並濾去固體。固定化硫醇與丙烯醯胺的麥可加成反應可捕獲所有未反應的丙烯醯胺。也可在分離各個所需異構體後，在同一條件下完全除去作為汙染物的痕量丙烯醯胺。將分離產物3(或4或5)溶解於DMF或乙酸乙酯，並與固定的丙烯醯胺淬滅劑一起溫和搖動，過濾並在真空中蒸發濾液，從而產生不含丙烯醯胺汙染的純化合物3(或4或5)。
實施例6從化合物5中分離伯胺和仲胺汙染物 在對化合物5進行柱色譜分離後，為了除去痕量的伯胺和仲胺汙染物，將所述化合物溶解於乙酸乙酯或DMF中，並在室溫下與固定或結合於固體的異硫氰酸酯一起攪拌過夜。過濾除去固體並蒸發濾液，從而獲得不含任何伯胺或仲胺汙染的純化合物5。
實施例7從化合物3和4分離伯胺汙染物 反應完成後，在三乙胺的二氯甲烷溶液中，使用四氯苯酐在室溫下處理反應混合物，蒸發溶劑並將殘留物與乙酸乙酯一起攪拌，濾去固體並濃縮濾液以獲得不含伯胺汙染物的產物。
表1 產物3和4的合成方法 實施例8產物3、4和5的鹽酸鹽的製備方法 為了改進操作簡便性並增加上述化合物的穩定性，將其轉化成其對應的鹽酸鹽6、7和8。
化合物3的鹽酸鹽(6)將胺3(9.4g)溶解於100mL熱的無水1，4-二噁烷中，並加入100mL含4M HCl的二噁烷，將混合物在室溫下攪拌過夜。向混合物中通入氮氣1小時以除去過量的HCl，並將剩餘的溶液濃縮至～10mL。向此非均勻混合物中添加100mL EtOAc∶己烷(1∶1)，並過濾沉澱產物，使用乙酸乙酯(50mL)和己烷(100mL)清洗，並在真空中乾燥所得粉末，以獲得奶油色粉狀的純產物6(9.99g，96％)。1H NMR CDCl3δδ0.83(t，J＝6.5Hz，15H)，1.20-1.39(m，92H)，2.64-2.70(m，8H)，2.90-3.10(m，16H)，3.25-3.45(m，12H)，3.46-3.64(m，4H)，5.20-6.0(bs，2H)，8.05-8.15(m，5H)，10.(bs，3H).13C NMR CDCl3δ13.83，22.04，26.48，28.69，28.79，28.90，29.04，31.26，38.71，168.38，168.53。元素分析C81H163N9O5·4HCl·3H2O計算值C，63.05；H，11.30；N，8.17；Cl，9.19。實測值C，63.13；H，11.06；N，8.21；Cl，9.21。
路線5a
a(i)含4M HCl的1，4-二噁烷，室溫，12小時 化合物7 使用與上述由化合物3獲得化合物6類似的方法將胺4(13.7g，10.2mmol)轉化成對應的鹽酸鹽7。分離得到白色粉末狀四鹽酸7(14.6，96％)。1H NMR CDCl3δ0.82(t，J＝6.5Hz，15H)，1.20-1.41(m，92H)，2.52-2.72(m，8H)，2.90-3.10(m，16H)，3.25-3.45(m，12H)，3.46-3.64(m，4H)，5.20-6.0(bs，2H)，8.05-8.15(m，5H)，10.(bs，3H).13C NMR CDCl3δ8.42，13.84，22.04，26.48，28.69，28.79，29.00，31.26，45.44，168.53，168.60.元素分析C81-H163N9O5·4HCl·2H2O計算值C，63.79；H，11.30；N，8.17；Cl，9.34.實測值C，63.78；H，11.04；N，8.40；Cl，9.73。
路線6a
a(i)含4M HCl的1，4-二噁烷，室溫，12小時 化合物8 使用與上述獲得化合物6類似的方法將胺5(13.7g，1.2mmol)轉化成對應的鹽酸鹽8。分離白色粉末狀四鹽酸鹽8(1.3g，96％)。1H NMR DMSO-d6δ0.87(t，J＝7Hz，18H)，1.13-1.30(m，112H)，1.35-1.53(m，12H)，2.10-2.25(m，12H)，2.30-2.40(m，12H)，2.60-2.76(m，12H)，3.10-3.25(m，12H)，7.26(bs，4H)，7.64(bs，2H)，10.1(bs，4H)。
路線7a
a(i)含4M HCl的1，4-二噁烷，室溫，12小時 實施例9選擇性保護三乙烯四胺上的氨基基團以定向合成化合物3和4 步驟1化合物10的製備在連續攪拌下，在冰浴上冷卻含三乙烯四胺2(20.55g，140.52mmol，購自於Sigma-Aldrich)的乙腈(500mL)。向攪拌的溶液中添加三氟乙酸乙酯(35.20mL，295.09mmol)並攪拌20小時。減壓除去溶劑和揮發物，並在高真空下乾燥獲得白色固體狀化合物9(44.4g，94％)。由此獲得的產物可不經進一步純化而用於下一步的反應(Wender P.A.et al.Organic Letters，2005 7，4815)。
將粗化合物9(23.70g，70mmol)溶解於乙腈(400mL)中，並在冰浴上攪拌。向反應混合物中添加N-(苯甲氧基羰基氧基)琥珀酸酯(Z-OSu，43.73g，175mmol，購自Novabiochem)和三乙胺(23.40mL，210mmol)，並攪拌過夜。除去溶劑並將殘留物萃取到二氯甲烷(DCM)中，連續使用水(兩次)和鹽水清洗，使用無水硫酸鈉乾燥。在真空中除去溶劑，並通過矽膠柱色譜(梯度洗脫，30-70％EtOAc/己烷)純化由此獲得的殘留物，從而獲得白色固體狀化合物10(38.2g，89％)。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)＝9.60-9.50(m，2H)，7.40-7.20(m，10H)，5.02(s，4H)，3.40-3.20(m，12H).MSC26H28F6N4O6計算值606.19，實測值607.2(M+)。
步驟2化合物11的製備在室溫下將化合物10(12.60g，20.78mmol)懸浮在甲醇(MeOH，150mL)中，並在連續攪拌下向懸浮液中添加含8M甲胺的乙醇溶液(40ml)。在室溫下攪拌1小時後所有固體均溶入溶液中，將混合物加熱至50℃並攪拌8小時。通過TLC監測反應。減壓除去所有溶劑，並通過矽膠柱色譜(梯度洗脫，10％MeOH/DCM至10∶10∶80MeOH∶TEA∶DCM)純化殘留物，獲得淺黃色粘性液體狀產物11(7.80g，91％)。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ＝7.80-7.40(m，10H)，5.02-4.94(m，4H)，3.45-3.05(m，8H)，2.70-2.55(m，4H)，2.20(bs，4H).MSC22H30N4O4計算值414.23，實測值415.20(M+)。
步驟3化合物13的製備按照步驟1關於合成化合物9的描述，通過與1.1摩爾當量三氟乙酸乙酯(8.80mL，77.10mmol)反應，由三乙烯四胺100(10.25g，70.09mmol)製備化合物12。將由此獲得的粗品12溶解於無水DCM(400ml)中並冷卻至0℃。添加(Boc)2O(53.53mmol，245.31mmol)和三乙胺(48ml，350mmol)，並將反應混合物攪拌過夜。通過TLC監測反應的進程。在真空中除去溶劑，將殘留物萃取到DCM中，用水和鹽水清洗，並乾燥。除去DCM並通過矽膠色譜(梯度洗脫，50％EtOAc/己烷至EtOAc)純化殘留物，從而獲得白色固體狀所需產物13(34.20g，92％)。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ＝9.51-9.38(m，1H)，6.82(bs，1H)，3.30-3.00(m，12H)，1.58-1.30(s，27H).MSC23H41F3N4O7計算值542.29，實測值543.4(M+)。
步驟4化合物14的製備在存在水(1mL)的條件下，將含化合物13(25g，47.32mmol)的MeOH(200mL)溶液與K2CO3(50g)一起在50℃攪拌過夜。通過TLC監測反應的進程。濾去固體K2CO3，用MeOH清洗，合併洗液，並在真空中除去溶劑。通過矽膠柱色譜純化所得殘留物，從而獲得白色固體狀所需產物14(10.2g，50％)。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ＝6.83(bs，1H)，2.95-3.30(m，12H)，2.62-2.50(m，2H)，1.25-1.45(m，27H).MSC21H42N4O6計算值446.31，實測值447.4(M+)。
路線8a
a選擇性地保護三乙烯四胺的氮 步驟5化合物15的製備將化合物9(23.0g，68.02mmol)溶解於乙腈/二氯甲烷(1∶1，300mL)的混合物中，並冷卻至0℃。向溶液中添加Z-Osu(17.00g，69mmol)並攪拌10分鐘。隨後向反應混合物中添加三乙胺(23.40mL，210mmol)並攪拌過夜。在真空中除去溶劑和三乙胺並將殘留物萃取到DCM中，用水(兩次)和鹽水清洗，並乾燥。除去溶劑後，通過矽膠柱色譜(先後使用20-60％EtOAc/己烷，和5％MeOH/DCM進行洗脫)純化殘留物，從而獲得白色固體狀所需產物15(13.3g)以及副產物10(8.5g)。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ＝9.60(bs，1H)，9.30(bs，1H)，7.40-7.28(m，5H)，5.01(s，2H)，3-40-3.10(m，8H)，2.70-2.50(m，4H).MSC18H22F6N4O4計算值472.15，實測值473.1(M+)。
步驟6化合物16的製備根據步驟2的描述，使用甲胺(50ml，含8M甲胺的EtOH溶液)處理化合物15(13.4g，28.38mmol)，從而獲得無色液體狀化合物16(6.10g，79％)。由此獲得的產物無需進一步的純化即可用於下一步的反應。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ＝7.45-7.20(m，6H)，5.07(s，2H)，3.45-2.90(m，8H)，2.60-2.30(m，4H).MSC14H24N4O2計算值280.19實測值281.2(M+)。
路線9a
a選擇性封閉三乙烯四胺的單個仲氮 實施例10五烷基化單異構體4的合成——方法1 步驟1化合物11與N-十二烷基丙烯醯胺的反應將二胺11(1.00g，2.41mmol)和N-十二烷基丙烯醯胺(3.47g，14.50mmol)一起裝入壓力管中，並在90℃加熱5天。通過TLC監測反應。一旦反應結束，將混合物溶解於二氯甲烷中並通過快速色譜進行純化，從而獲得產物17、18和19。
步驟2化合物20的製備將化合物19(2.00g，1.46mmol)溶解於乙酸乙酯和甲醇的混合物(1∶2，15ml)中，並向其中添加2當量的乙酸。在壓力(50psi)下，以鈀/碳(0.200g，10％wt)為催化劑氫化混合物，從而獲得所需的產物20。
步驟3單個異構體4的製備將化合物20(1.50g，1.36mmol)和丙烯醯胺1(0.325mmol，1.36mmol)溶解於甲苯(4mL)並在90℃加熱數天，以形成化合物4。通過TLC監測反應的進程。反應完成後，將混合物冷卻至室溫，溶解於DCM並通過快速矽膠柱色譜純化，從而獲得所需產物4。
路線10
實施例11五烷基化的單個異構體4的合成——方法2 步驟1化合物21的製備將化合物16(1.0g，3.56mmol)和N-十二烷基丙烯醯胺(6.00g，7當量)一起裝入壓力管中，並加熱以獲得化合物21。通過TLC監測反應的進程。在反應完成後，將混合物溶解於DCM中，並通過快速矽膠柱色譜純化，從而獲得所需產物21。
步驟2由化合物21製備化合物4將化合物21(2.00g，1.35mmol)溶解於乙酸乙酯和甲醇的混合物(1∶2，15ml)中，並向其中添加2當量的乙酸。壓力(50psi)下在鈀-碳(0.200g，10％wt)上氫化混合物，從而獲得所需的單個異構體4。
路線11
實施例12五烷基化一種異構體3的合成——方法1 步驟1化合物22的製備將化合物14(5.06g，11.30mmol)和N-十二烷基丙烯醯胺(2.94g，12.43mmol)加入甲苯中，並在90℃加熱5天。檢查TLC，結果表明形成了產物。將反應混合物直接裝載到預填矽膠柱中，並通過快速色譜(5％MeOH/DCM)純化以獲得化合物22(4.82g，62％)。1HNMR(DMSO-d6，400MHz)δ＝8.17(bs，1H)，6.60(bs，1H)，3.30-2.95(m，12H)，2.70(t，J＝5.80Hz，2H)，2.60(t，J＝6.00Hz，2H)，2.18(t，J＝6.40Hz，2H)，1.35(m，29H)，1.26-1.15(m，18H)，0.83(t，J＝6.00Hz，3H).MSC36H71N5O7計算值685.54，實測值686.5(M+)。
步驟2化合物23的製備將化合物22(4.75g，6.92mmol)溶解於二氯甲烷(100mL)中，並冷卻至0℃。向溶液中添加Z-Osu(2.59g，1.5當量)並攪拌10分鐘。隨後將反應混合物與三乙胺(2.82mL，20.76mmol)一起攪拌過夜。在真空中除去溶劑和三乙胺，並將殘留物萃取到二氯甲烷中，連續使用水(兩次)和鹽水清洗，並使用無水硫酸鈉乾燥。除去溶劑後，通過快速矽膠柱色譜(5-10％MeOH/DCM)純化殘留物，從而獲得所需的化合物23(5.33g，94％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)＝7.49-7.25(m，5H)，5.11(s，2H)，3.60-3.02(m，14H)，2.45-45(m，4H)，1.50-1.35(m，27H)，1.24-1.20(m，18H)，0.87(t，J＝6.00Hz，3H).MSC44H77N5O9計算值819.57，實測值820.7(M+)。
步驟3化合物24的製備向含化合物23(5.30g，6.50mmol)的二噁烷(100ml)溶液中添加含4MHCl的二噁烷(50mL)。隨後將反應混合物攪拌過夜。產物在反應過程中沉澱。在真空中除去溶劑和HCl以獲得白色固體。將殘留物加入含過量三乙胺的MeOH中，並將懸浮液攪拌1小時以獲得均質溶液。在真空中除去溶劑並將殘留物與EtOAc一起研磨，濾去三乙胺鹽酸鹽。在真空中蒸發合併的濾液，從而獲得粘性液體24(3.30g，98％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ＝7.37-7.28(m，5H)，5.05(s，2H)，3.60-3.20(m，4H)，3.10-2.70(m，10H)，2.40-2.20(m，4H)，1.40-1.30(m，2H)，1.25-1.17(m，18H)，0.81(t，J＝6.00Hz，3H).MSC29H53N5O3計算值519.41，實測值520.4(M+)。
步驟4化合物25的製備將化合物24(1.00g，1.925mmol)和N-十二烷基丙烯醯胺(3.70g，8當量)一起裝入壓力管中，並在高溫下加熱以形成所需的化合物25。通過TLC監測產物的形成，隨後通過快速矽膠柱色譜純化以獲得純化合物25。
步驟5化合物3的製備將化合物25(2.00g，1.35mmol)溶解於乙酸乙酯和甲醇的混合物(1∶2，15ml)中，並向其中添加2當量的乙酸。壓力50psi)下，在鈀-碳(0.200g，10％wt)上(氫化混合物，從而獲得所需產物3。
路線12
實施例13五烷基化單個異構體3的合成——方法2 步驟1化合物26的製備向含化合物22(4.80g，7.00mmol)和K2CO3(9.67g，10當量)的DMF(100mL)懸浮液中添加苄基溴(1.25ml，1.5當量)並將混合物攪拌過夜。通過TLC監測反應的進程。濾除固體，使用MeOH和乙酸乙酯清洗。減壓濃縮合併的濾液，並通過矽膠柱色譜(50-100％EtOAc/己烷)純化由此獲得的殘留物，從而獲得所需的產物26(3.30g，61％)。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ＝7.77(bs，2H)，7.28-7.23(m，5H)，6.85-6.70(m，1H)，3.59(s，2H)，3.20-2.20(m，18H)，1.35(s，27H)，1.30-1.23(m，2H)，1.20-1.15(m，18H)，6.81(t，J＝6.00Hz，3H).MSC43H77N5O7計算值775.58，實測值776.5(M+)。
步驟2化合物27的製備將含化合物26(3.30g，4.25mmol)的二噁烷(50ml)與含4M HCl的二噁烷(50mL)攪拌過夜。在反應的過程中發現形成白色沉澱物。在真空中除去溶劑和酸，並將由此獲得的白色殘留物復溶於含過量三乙胺的甲醇中。隨後減壓蒸發均質溶液以獲得白色殘留物。將殘留物與EtOAc一起研磨，並濾去三乙胺鹽酸鹽。在真空中蒸發濾液以獲得粘性液體狀所需化合物27(2.36g，99％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ＝8.05(t，J＝5.5Hz，1H)，7.40-7.20(m，5H)，3.58(s，2H)，3.10-2.30(m，18H)，1.40-1.30(m，2H)，1.25-1.15(m，18H)，0.82(t，J＝6.00Hz，3H).MSC28H53N5O計算值475.43，實測值498.4(M+Na)。
步驟3化合物28的製備在壓力管中混合無溶劑的化合物27(1.00g，2.10mmol)和N-十二烷基丙烯醯胺(4.0g，8當量)，加熱至高溫以形成化合物28。通過TLC和LC-MS檢測化合物28的形成。在反應完成後，通過色譜純化分離產物，從而獲得純的化合物28。
步驟4由化合物28製備化合物3將化合物28(2.00g，1.40mmol)溶解於乙酸乙酯和甲醇的混合物(1∶2，15ml)中，並向其中添加6當量的乙酸。在壓力(50psi)下，在鈀-碳(0.200g，10％wt)上氫化混合物，從而獲得化合物3。
路線13
實施例14異構體3的匯集合成(convergent)——方法1 步驟1化合物30、31和32的製備在5mL水中加入乙二胺29(0.978ml，14.63mmol)、N-十二烷基丙烯醯胺(7.00g，29.26mmol)和硼酸(100mg)，並在90℃加熱4天。通過TLC分析確認丙烯醯胺的徹底消耗。將反應混合物溶於DCM，用水和碳酸氫鹽清洗，並使用硫酸鈉乾燥。除去DCM並通過矽膠柱色譜(2∶2∶96至10∶10∶80％MeOH/TEA/DCM)純化殘留物，從而得到化合物30(1.86g)，1H NMR(CDCl3，400MHz)δ＝7.05(bs，2H)，3.21(q，J＝6.30Hz，4H)，2.87(t，J＝6.00Hz，4H)，2.73(s，4H)，2.34(t，J＝6.00Hz，4H)，1.57(bs，2H)，1.49-1.45(m，4H)，1.28-1.19(m，40H)，0.87(t，J＝6.8Hz，6H)MSC32H66N4O2計算值538.52，實測值539.50(M+)；化合物31(3.50g)，1HNMR(DMSO-d6，400MHz)δ＝8.20(bs，1H)，3.20-2.15(m，22H)，1.36-1.30(m，6H)，1.25-1.15(m，30H)，0.81(t，J＝6.00Hz，9H)，MSC47H95N5O3計算值777.74，實測值778.7(M+)；和化合物32(1.75g)，1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ＝3.23-2.15(m，28H)，1.35-1.45(m，8H)，1.26-1.15(m，40H)，0.82(t，J＝6.00Hz，12H).MSC62H124N6O4計算值1016.97，實測值1018.0(M+)。
步驟2化合物33的製備將化合物31(1.55g，2mmol)和K2CO3(2.76g，20mmol)加入DMF中。向其中添加氯乙醛縮二甲醇(0.453ml，4.00mmol)並攪拌24小時。通過TLC監測反應，濾去K2CO3，並用MeOH清洗。減壓除去溶劑並對殘留物進行色譜純化，從而獲得化合物33。
步驟3化合物34的製備將化合物33(2.00g，2.31mmol)加入MeOH和DCM的混合物中，向其中添加PTSA(2.0當量)，並將混合物攪拌過夜。使用碳酸氫鈉溶液中和該溶液，用DCM萃取並乾燥。通過色譜分離純化化合物，從而獲得所需產物34。
步驟4從化合物34製備單個異構體3將化合物34(2.00g，2.43mmol)和化合物30(1.31g，2.43mmol)加入DCM中，向其中添加活化的分子篩並攪拌3小時。通過TLC監測反應。反應一旦結束，立即除去溶劑。將殘留物溶解於THF中，並加入三乙醯氧基硼氫化鈉(5當量)和乙酸，並攪拌過夜。除去溶劑並用DCM萃取，對殘留物進行色譜分離，從而獲得純異構體3。
路線8
實施例15異構體3的匯集合成——方法2 也可通過以下方式製備所需的單異構體3通過選擇性地保護化合物30中的一個氮原子以獲得化合物35。隨後，在還原性條件下使化合物35與醛34反應以獲得化合物36。對化合物36進行酸處理，從而獲得所需的化合物3。
路線15
實施例16異構體3的匯集合成——方法3 還可以由單苄基乙二胺37製備所需的單異構體3。使用化合物1對化合物37進行烷基化，從而獲得化合物38、39和40的混合物。在還原性條件下使化合物40與醛34反應，從而獲得化合物41。對化合物41進行氫解，從而獲得所需的化合物3。
路線16
實施例17異構體4的匯集合成——方法1 步驟1化合物43的製備通過溫和加熱容器在氬氣氛中熔化150mL耐壓瓶中的N-十二烷基-丙烯醯胺1(16.4g，68.8mmol)，並加入3mL硼酸水溶液。向該熔化物化物中添加Boc-保護的乙二胺42(5g，31.2mmol)，並將該混合物在90℃加熱過夜。通過以CH2Cl2∶MeOH∶NEt3(90∶5∶5)為洗脫劑的TLC分析反應混合物。TLC顯示起始丙烯醯胺1幾乎完全被消耗。將反應混合物溶解於二氯甲烷(100mL)中，攪拌溶液和固體碳酸氫鈉，並在旋轉蒸發器中過濾並濃縮有機層。使用CH2Cl2∶MeOH∶NEt3(48∶1∶1至8∶1∶1)通過柱色譜(矽膠)純化該粗產物。該反應的主要產物為雙加成產物43。還發現少量的單加成物。
步驟2化合物44的製備在二噁烷(50mL)中加入化合物43(2.00g，3.13mmol)，向其中添加HCl(20mL，含4M HCl的二噁烷溶液)，並攪拌過夜。除去溶劑，從而獲得化合物44。
步驟3從化合物34和化合物44製備單異構體4將化合物34(2.00g，2.43mmol)和化合物44(1.31g，2.43mmol)加入DCM中，向其中添加活化的分子篩並攪拌3小時。通過TLC監測反應。反應一旦結束，立即除去溶劑。將殘留物溶解於THF中，加入三乙醯氧基硼氫化鈉(5當量.)和乙酸，並攪拌過夜。除去溶劑，用DCM萃取，對殘留物進行色譜分離，從而獲得純異構體4。
路線17
實施例18將N-十二烷基丙烯醯胺對1，3-二氨基丙烷的加成，隨後將醯胺還原為胺 為了研究陽離子脂質中電荷數量的作用，對丙烯醯胺1與1，3-二氨基丙烷45的麥可加合物(Michael adduct)進行了研究。
路線18a
a(i)90℃，硼酸水溶液，16小時；(ii)含4M HCl的1，4-二噁烷，室溫，12小時；和(iii)BH3 步驟1化合物46、47和48的合成通過溫和加熱容器在氬氣氛中熔化150mL耐壓瓶中的N-十二烷基-丙烯醯胺1(15.4g，64mmol)，並加入3mL硼酸水溶液。向該熔化物中添加1，3-二氨基丙烷44(1.58g，21mmol)，並將該混合物在90℃加熱過夜。通過以CH2Cl2∶MeOH∶NEt3(90∶5∶5)為洗脫劑的TLC分析反應混合物。TLC顯示起始丙烯醯胺1幾乎完全被消耗。將反應混合物溶解於二氯甲烷(100mL)中，攪拌溶液和固體碳酸氫鈉，並在旋轉蒸發器中過濾並濃縮有機層。使用CH2Cl2∶MeOH∶NEt3(48∶1∶1至8∶1∶1)通過柱色譜(矽膠)純化該粗產物。該反應中的主要產物為三加成產物46。還分離了少量的四加成物47和雙加成物48。
N-十二烷基-3-{(2-十二烷基氨基甲醯基-乙基)-[3-(2-十二烷基氨基甲醯基-乙基氨基)-丙基]-氨基}-丙醯胺46。分離得到白色粉末狀三加成產物46(5.7g，35％)。MS m/z 793(MH+).1H NMR CDCl3δ0.87(t，J＝6.6Hz，9H)，1.20-1.30(m，60H)，1.42-1.66(m，6H)，2.33(t，J＝6Hz，4H)，2.38-2.46(m，4H)，2.60-2.70(m，4H)，2.84(t，2H)，3.15-3.28(m，6H)，6.65(bs，1H)，6.99(bs，3H). 4-[{3-[雙-(2-十二烷基氨基甲醯基-乙基)-氨基]-丙基}-(2-十二烷基氨基甲醯基-乙基)氨基]-N-十二烷基-丁醯胺47。還分離了少量的四加成產物47。
N-十二烷基-3-[-(2-十二烷基氨基甲醯基-乙基氨基)-丙基氨基]-丙醯胺48。分離得到奶油色粉狀的雙加成物48(1.6g，10％)。MS m/z 553(MH+).1HNMR CDCl3δ0.89(t，J＝6.6Hz，6H)，1.10-1.20(m，40H)，1.42-1.66(m，4H)，2.20(t，J＝6Hz，4H)，2.55(t，4H)，2.60(t，4H)，3.00(m，4H)，8.00(bs，2H). 步驟2將胺4、35和36轉化成其對應的鹽酸鹽49、50和51。
使用與實施例8所述的類似方法將胺46(5.5g)轉化成對應的鹽酸鹽49，分離得到白色粉末狀二鹽酸鹽49(5.73g，92％)。1H NMR DMSO-d6δ0.88(t，J＝7Hz，9H)，1.17-1.30(m，66H)，1.35-1.45(m，6H)，2.10-2.25(m，2H)，2.55-2.70(m，6H)，2.95-3.15(m，10H)，3.20-3.35(m，6H)，8.16(t，1H)，8.24(t，1H)，9.15(bs，1H)，10.65(bs，1H). 在與實施例8所述的類似方法中，使用4M HCl處理胺47，從而獲得二鹽酸鹽50。
在與實施例8所述的類似方法中，使用4M HCl處理胺48，從而獲得二鹽酸鹽51。
步驟3將胺46、47和48還原為胺52、53和54使用過量的乙硼烷將胺46在THF中回流過夜，隨後使用4M HCl處理，從而獲得多胺52的鹽酸鹽。
對47和48進行類似的處理，從而獲得作為其各自鹽酸鹽的對應還原產物53和54。
實施例19將多醯胺3、4和5還原成對應的多胺化合物 使用大量過量的乙硼烷將化合物3在THF中回流過夜，從而獲得對應的還原產物55。反應完成後，在進行檢驗(work-up)前使用4M HCl處理反應混合物，並分離產物(其鹽酸鹽)。同樣分別由對應的前體4和5獲得鹽酸鹽56和57。
路線19a
a(i)BH3·THF，回流 實施例20多胺烷基脂質——將醯胺還原為胺 由化合物32製備多胺60在THF(20ml)中加入化合物32(1.02g，1mmol)，向其中添加BH3·THF(60ml，含1M BH3的THF)，並回流2天。通過TLC監測反應。除去THF獲得白色殘留物，使用1M HCl處理該殘留物，並將其萃取到DCM中。對粗產物的色譜分離獲得純化合物60。
從化合物30和31製備多胺58和59在化合物60的製備中所述的類似條件下還原醯胺30和31，從而分別獲得化合物58和59。
路線20
實施例21多醯胺-多胺烷基的合成——使用滷代烷對胺進行烷基化 步驟1化合物62的製備在冰浴上冷卻含氯乙醯氯(10.31mL，129.37mmo)的DCM(200mL)溶液，並在1小時的時間內向其中滴加包含TEA(36.70ml，269.5mmol)的十二胺61(20.00g，107.81mmol)的二氯甲烷溶液。此時反應混合物變為黑褐色，在0℃下再繼續攪拌1小時。通過燒結漏鬥過濾反應混合物，使用EtOAc清洗，用氯仿稀釋，並依次使用水、碳酸氫鈉溶液、1M HCl和鹽水進行清洗。使用硫酸鈉乾燥有機層。除去溶劑，並通過矽膠柱色譜(5-50％EtOAc/己烷)純化殘留物，從而獲得棕色固體狀化合物62(26.00g，92％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ＝6.59(bs，1H)，4.03(s，2H)，3.25(q，J＝6.00Hz，2H)，1.54-1.49(m，2H)，1.45-1.15(m，18H)，0.86(t，J＝6.00Hz，3H).MSC14H28ClNO計算值261.19，實測值262.20(M+)。
步驟2化合物63、64和65的製備將三乙烯四胺2(1.00g，6.83mmol)和氯乙醯胺62(10.00g，5.5當量)一起加入到CH3CN/DMF(1∶3)的混合物中，向其中添加K2CO3(9.43g，10當量)和KI(50mg)，並在85℃加熱3天。將反應混合物過濾以除去固體，用DCM清洗，在真空中除去溶劑並色譜分離粗殘留物，從而獲得純產物63、64和65。
路線21
實施例22多醯胺-多胺烷基的合成——使用滷代烷和支鏈氨基烷基對胺進行烷基化 步驟1化合物67的製備在DCM(100mL)中加入氯乙醯氯(4.05mL，51mmol)並冷卻至0℃。在1小時的時間內向其中滴加N，N-雙十二烷基胺66(15.00g，42.41mmol)和TEA(14.43ml，2.5當量)的二氯甲烷溶液。此時反應混合物變為黑褐色，在添加完成後，在室溫下將反應混合物攪拌24小時。通過燒結漏鬥過濾反應混合物，使用EtOAc清洗，用氯仿稀釋，並依次使用水、碳酸氫鈉溶液、1M HCl和鹽水進行清洗。使用硫酸鈉乾燥有機層。在真空中除去溶劑並通過矽膠柱色譜(5-50％EtOAc/己烷)純化殘留物，從而獲得棕色液體狀所需化合物67(12.5g，69％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ＝4.04(s，2H)，3.30(m，4H)，1.50-1.45(m，2H)，1.40-1.20(m，18H)，0.87(t，J＝6.00Hz，3H).MSC26H52ClNO計算值430.15，實測值431.2(M+)。
步驟2化合物68、69和70的製備將三乙烯四胺2(0.500g，6.83mmo1)和氯乙醯胺67(8.10g，5.5當量)一起加入到CH3CN/DMF(1∶3)的混合物中，向其中添加K2CO3(4.72g，10當量)和KI(30mg)，並在85℃加熱3天。將反應混合物過濾以除去不溶的固體，用DCM清洗，除去溶劑並色譜分離殘留物，從而獲得化合物68、69和70。
路線22
實施例23N，N-二烷基丙烯醯胺對多胺的加成 為了研究向陽離子脂質添加更多疏水鏈的效果，使用雙十二烷基胺作為丙烯醯胺的前體。
路線23a
a(i)丙烯醯氯，-10～0℃，DIPEA，CH2Cl2，4小時；(ii)90℃，無溶劑，5天；和(iii)HCl/二噁烷 步驟1N，N-雙十二烷基丙烯醯胺71的合成 在-10℃下，於20分鐘的時間內向含雙十二烷基胺66(25g，70.7mmol)和二異丙基乙胺(18g，141mmol)的無水CH2Cl2(700mL)溶液中滴加含丙烯醯氯(7.68g，85mmol)的CH2Cl2(100mL)溶液。添加完成後，將反應混合物在0℃攪拌4小時，此後，反應混合物的TLC顯示反應完成。使用飽和NaHCO3溶液(200mL)、水(200mL)、鹽水(100mL)清洗反應混合物，並使用Na2SO4乾燥。濃縮有機層獲得產物71(28.4g，100％)，並將其直接用於下一步。1H NMR CDCl3δ0.94(t，J＝6.5Hz，6H)，1.05-1.69(m，40H)，3.15-3.60(dt，4H)，5.64(d，1H)，6.36(d，1H)，6.63(m，1H)。
步驟2三乙烯四胺2與化合物71的反應 使用胺2處理丙烯醯胺71，在常規檢查(work-up)和柱純化後，分離得到麥可加成反應產物72、73和74。
步驟3鹽酸鹽75、76和77的合成按照實施例8的描述，將所得的各個單化合物加入到二噁烷中，向該溶液中添加含4M HCl的二噁烷，並攪拌，從而獲得對應的鹽酸鹽。
實施例24在麥可加成反應的條件下使用單不飽和N-烷基丙烯醯胺對多胺進行烯基化 為了研究烷基鏈中雙鍵的作用，使用油胺作為丙烯醯胺79的前體。
路線24a
a(i)丙烯醯氯，-10～0℃，DIPEA，CH2Cl2，4小時；(ii)90℃，無溶劑，5天；和(iii)HCl/二噁烷 步驟1化合物79的合成在-10℃下，於20分鐘的時間內向含油胺78(26.75g，100mmol)和三乙胺(20g，200mmol)的無水CH2Cl2(200mL)溶液中滴加含丙烯醯氯(9.9g，110mmol)的CH2Cl2(100mL)溶液。添加完成後，將反應混合物在0℃攪拌4小時，此後，反應混合物的TLC顯示反應完成。使用飽和NaHCO3溶液(200mL)、水(200mL)、鹽水(100mL)清洗反應混合物，並使用Na2SO4乾燥。濃縮有機層獲得產物79(32g，100％)，並將其直接用於下一步。1H NMR CDCl3δ0.91(t，J＝6.5Hz，3H)，1.05-1.35(m，24H)，1.42(t，2H)，1.96(m，4H)，5.31(t，1H)，5.33-5.36(m，1H)，5.54(dd，1H)，6.02(dd，1H)，6.18(dd，1H)，8.03(bs，1H)。
步驟2化合物79與三乙烯四胺的反應 使用三乙烯四胺2處理丙烯醯胺79，在對麥可加成反應產物進行常規檢查和柱純化後獲得了純的化合物80、81和82。
步驟3鹽酸鹽83、84和85的合成按照實施例8的描述，將所得的各個單化合物(80、81或82)加入到二噁烷中，向溶液中添加含4M HCl的二噁烷，並攪拌，從而獲得對應的鹽酸鹽。
實施例25在麥可加成反應的條件下使用單不飽和N-烷基丙烯醯胺對二胺進行烯基化 路線25a
a(i)90℃、硼酸水溶液、16小時；和(ii)HCl/二噁烷 參照與實施例24類似的方法，使用二胺45處理丙烯醯胺79，在常規檢查和柱純化後，分離得到麥可加成反應產物86、87和88。使用含HCl的二噁烷處理由此獲得的游離胺，分別獲得對應的鹽酸鹽89、90和91。
實施例26在麥可加成反應的條件下使用多不飽和N-烷基丙烯醯胺對多胺進行烯基化 為了研究多不飽和在烷基鏈中的作用，使用亞油胺(linoleylamine)92作為丙烯醯胺93的前體。
路線26a
a(i)丙烯醯氯，-10～0℃，DIPEA，CH2Cl2，4小時；(ii)90℃，無溶劑，5天；和(iii)HCl/二噁烷 步驟1化合物93參照與實施例24中步驟1類似的方法，使用丙烯醯氯處理亞油胺92並分離得到對應的丙烯醯胺93。
步驟2化合物93與三乙烯四胺的反應 根據實施例3的描述，在存在硼酸的條件下，使用三乙烯四胺2處理丙烯醯胺93，在對麥可加成反應產物進行常規檢查和柱純化後獲得了純的化合物94、95和96。
步驟3鹽酸鹽97、98和99的合成按照實施例8的描述，將所得的各化合物(94、95或96)分別加入到二噁烷中，向溶液中添加含4M HCl的二噁烷，並攪拌，從而獲得對應的鹽酸鹽。
實施例27在麥可加成反應的條件下使用多不飽和N-烷基丙烯醯胺對二胺進行烯基化 路線27a
a(i)90℃、硼酸水溶液、16小時；和(ii)HCl/二噁烷 參照與實施例3類似的方法，在存在硼酸的條件下使用二胺45處理丙烯醯胺93，在常規檢查和柱純化後，分離得到麥可加成反應產物100、101和102。使用含HCl的二噁烷處理由此獲得的游離胺分別獲得了對應的鹽酸鹽103、104和105。
實施例28在麥可加成反應的條件下使用烷基丙烯酸酯對多胺進行烯基化 路線28a
a(i)甲醇-水，40℃或甲醇、水、硼酸，室溫 方法1在40℃下，將n-十二烷基丙烯酸酯(106)與三乙烯四胺2一起在甲醇-水中攪拌以獲得化合物107、108和109。通過色譜分離來分離產物。
方法2在40℃下，將n-十二烷基丙烯酸酯(106)與三乙烯四胺2一起在存在硼酸的甲醇-水中攪拌以獲得化合物107、108和109。通過色譜分離來分離產物。
實施例29在麥可加成反應的條件下使用烷基丙烯酸酯對二胺進行烯基化 路線29a
a(i)甲醇-水，40℃或甲醇、水、硼酸，室溫 方法1在40℃下，將n-十二烷基丙烯酸酯(106)與三乙烯四胺2一起在甲醇-水中攪拌以獲得化合物110、111和112。通過色譜分離來分離產物。
方法2在40℃下，將n-十二烷基丙烯酸酯(106)與三乙烯四胺2一起在存在硼酸的甲醇-水中攪拌以獲得化合物110、111和112。通過色譜分離來分離產物。
實施例30十八烷-9，12-二烯酸-3-二甲氨基-2-十八烷-9，12-二烯醯氧-丙酯3的合成
在室溫下，向亞油酸(25g，89.1mmol)的無水DMF(60mL)溶液中添加二異丙基乙胺(17mL，100mml)並攪拌，隨後添加3-(二甲氨基)-1，2-丙二醇(4.8g，40.5mmol)和EDCI(17.25g，89.9mmol)，並將該混合物在室溫下攪拌過夜。反應混合物的TLC(洗脫劑含20％EtOAc的己烷)顯示反應完成。將反應混合物傾入冰水中，並使用乙酸乙酯(2x100mL)萃取。使用水(100mL)、飽和NaHCO3(100mL)清洗所合併的有機層，並使用Na2SO4乾燥。濃縮有機層獲得粗產物，並通過柱色譜(矽膠，洗脫劑含20％EtOAc的己烷)純化。混合包含純產物的部分並進行濃縮。分離澄清液體狀的純酯(5.7g，22％)。MS m/z 645(M+H).1H NMR CDCl3δ0.88(t，J＝6.3Hz，6H)，1.20-1.39(m，28H)，1.61(t，J＝4.9Hz，12H)，2.03-2.08(m，8H)，2.26-2.38(m，10H)，2.44-2.56(m，2H)，2.76(t，J＝6.3Hz，4H)，4.09(dd，J＝6.1Hz & 11.9Hz，1H)，4.36(dd，J＝3.3 & 11.9Hz，1H)，5.29-5.34(m，1H)，5.34-5.41(m，8H).13C NMR CDCl3δ14.30，22.79，25.08，25.10，25.83，27.40，29.26，29.30，29.34，29.42，29.55，29.83，31.73，34.32，34.58，46.01，59.37，64.02，128.08，128.24，130.21，130.42，173.39，173.65. 實施例31使用擠出法製備脂質體的示例性方法 在100％乙醇中，製備ND98(120mg/ml)、膽固醇(25mg/ml)和C16-PEG-Cer-2000(100mg/ml)的母液。貯存於-20℃。製備製品前在37℃的水浴中加熱(由於膽固醇需要一段時間才能完全溶解，加熱時間達30分鐘是有益的)。
2X2ml製備 向15ml的Falcon管中添加 1)125ul脂質 2)200ul膽固醇 3)70ul PEG 4)5ul 100％乙醇 5)600ul 25mM乙酸鈉，pH 5 6)在旋渦混合器中溫和混合(調定為5) 7)添加20mg蔗糖 8)再次旋渦振蕩直至蔗糖溶解 9)添加1ml新製備(在新Falcon管中)的含1mg/ml siRNA的25mM乙酸鈉溶液(＝100ul的10mg/ml siRNA+900ul的25mM乙酸鈉)。
10)輕柔地旋渦振蕩(調定為1，使用Falcon管固定轉接器)20分鐘 11)15分鐘後(剩5分鐘時)，清洗擠出器 12)在40℃通過兩個200nm濾器擠出11次 13)在3,500MWCO Pierce盒中，室溫條件下，使用pH 7.4的PBS透析90分鐘 實施例32不使用擠出法製備脂質體的示例性方法 在100％乙醇中，製備ND98(120mg/ml)、膽固醇(25mg/ml)和C16-PEG-Cer-2000(100mg/ml)的母液。貯存於-20℃。製備製品前在37℃的水浴中加熱(由於膽固醇需要一段時間才能完全溶解，加熱達30分鐘是有益的)。
向15ml的Falcon管中添加 1)125ul脂質 2)200ul膽固醇 3)70ul PEG 4)495ul 100％乙醇 5)100ul水 6)製備1ml含1mg/ml siRNA的100-300mM乙酸鈉，pH～5 7)將含脂質的90％乙醇與含siRNA的乙酸鹽緩衝液快速混合 8)使用100-300mM乙酸鈉(pH～5)進行透析(或使用超濾法)以除去乙醇 9)使用PBS進行透析(或使用超濾法)以改變緩衝條件 實施例33對脂質體樣品中RNA進行定量的示例性方案 可使用以下方案以量化(1)捕獲siRNA的比例，和(2)脂質體中siRNA的總量。
材料 RiboGreen(Molecular Probes) 2％Triton X-100 TE緩衝劑 方案(以96孔板為例) 1.在TE緩衝劑中稀釋待測樣品，使siRNA濃度為～2ug/mL(0.4～4ug/mL)。標記樣品的稀釋比。
2.將每種樣品50uL加入到2個孔中(例如，將樣品加入到微孔板的2行孔中)。
3.向2個樣品孔之一(例如，上一行樣品)添加50uL TE緩衝劑。該樣品將用於測定「游離」siRNA。
4.向2個樣品孔中的另一個(例如，下一行樣品)添加50uL 2％TritonX-100。該樣品將用於測定「總」siRNA。
5.通過使用已知量的待定量siRNA製備標準siRNA稀釋液。由50uL 4ug/mL開始進行2倍稀釋。向每個標準樣品稀釋液中添加50uL 2％TritonX-100。
6.在室溫下溫育15分鐘。
7.向所有樣品中添加100uL稀釋的RiboGreen。以1∶100的稀釋比稀釋待用的RiboGreen。
8.使用FITC設定在螢光計(Victor2)上對微孔板進行讀數。
計算 孔內終體積為200uL。
RiboGreen的終稀釋比為1∶200。
Triton X-100為0.5％。
標準品為從1ug/mL開始的稀釋液。
繪製標準曲線，進行線性回歸分析。
測定捕獲％＝100*(1-「游離」信號/「總」信號) 測定[siRNA]首先使用標準曲線將「總」信號轉化成濃度，再乘以稀釋倍數。
實施例34配製到脂質體中的脂質部分的比較 通過測定脂質向靶標遞送siRNA部分的相對能力能夠檢測脂質組合物的有效性。例如，靶標的沉默說明siRNA被遞送到細胞中。本申請人比較了多種脂質體複合物，其分別包含以下脂質部分之一以及用以沉默VII因子(FVII)的siRNA。
首先，使用未純化的反應混合物。通過在不同的ND∶98單體比例(ND∶98＝1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1和6∶1)下合成產品，產生不同的ND98反應混合物。ND98是通過如上所示比例(即ND∶98＝1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1和6∶1)的ND與胺98的反應產生的，其中ND的結構如下

胺98的結構如下
以ND98∶膽固醇∶FED2000-CerC16∶siRNA＝15∶0.8∶7∶1(重量比)的比例配製脂質體。ND∶98比為1∶1和2∶1配製的脂質體在配製過程中發生沉澱，因此沒有進行進一步的表徵。
以下表1提供了使用不同單體比例(數字表示ND與單體98的比值)的脂質體的平均粒徑和捕獲百分比。
表1 圖1提供了在不同單體比例下使用2mg/kg siRNA的試驗劑量進行FVII沉默試驗的結果。該結果表明ND98五尾部分和/或ND98六尾部分為活性種類，也是ND986∶1製備中最為豐富的種類。如上所述，五尾部分是指在化合物中，起始原料胺98的5個氫原子與原料丙烯醯胺部分ND反應。如上所述，六尾部分是指在化合物中，原料胺98上的6個氫原子與丙烯醯胺部分ND反應。因此，「尾」的數量表示原料胺上發生反應的氫原子的數量。
實施例35優選脂質異構體的確定 本申請人純化了ND98脂質產物。ND98脂質部分為ND與胺98反應所得的脂質部分，其中ND的結構如下所示

胺98的結構如下
申請人:檢測了混合的ND98四尾異構體(即其中4個胺基氫與上述ND丙烯醯胺發生了反應)、單個ND98五尾結構異構體(即其中已經有5個胺基氫原子與上述ND丙烯醯胺反應)。五尾異構體的兩個實例如下所示
使用以下組分配製經純化的ND98產物的脂質體，所述組分的比例如下所示ND98∶膽固醇∶PEG2000-CerC16∶siRNA＝15∶5∶7∶1(重量比)。
以下表2提供了使用不同單體比例(數字表示ND與單體98的比值)的脂質體的平均粒徑和捕獲百分比。
表2 出於表2和圖2的目的ND981＝五尾化(異構體I)；ND982＝五尾化(異構體I+II)；ND983＝五尾化(異構體II)；ND984＝四尾化。
施予脂質體時siRNA劑量為2.5mg/kg，並評估FVII的沉默。圖2顯示了四尾異構體混合物、單個五尾異構體(即異構體I和II)，以及五尾異構體混合物(即異構體I和II)的結果。
實施例36優選的ND98異構體的測定 製備並純化六尾ND98的純化異構體。ND98的結構與上述實施例34和35的描述相對應。六尾是指胺98的所有氫原子都已與ND起始原料發生反應。採用該脂質為起始原料，按照以下比例ND98∶膽固醇∶PEG2000-CerC16∶siRNA＝15∶5∶7∶1(重量比)製備脂質體。圖3證明了ND98六尾異構體在siRNA遞送中的有效性，由此有效地沉默FVII。
實施例37使用不同ND98脂質起始原料的脂質體的粒徑 將多種具有ND98結構(如以上實施例34和35所示)的脂質起始原料配製成脂質體。測定脂質體的粒徑，其結果如下表3所示 實施例38擠出遊離的脂質體製品 使用ND98脂質製備脂質體複合物。該製品具有以下比例ND98∶膽固醇∶PEG2000-CerC16∶siRNA＝15∶5∶7∶1(重量比)。基本按照以上實施例32的描述，不進行擠出來製備脂質體。製備出兩個樣品，第一樣品100mM＝在100mM乙酸鈉中製備siRNA並在100mM乙酸鹽中進行第一透析步驟；第二樣品300mM＝在300mM乙酸鈉中製備的siRNA並在300mM乙酸鹽中進行第一透析步驟。
圖4顯示了FVII沉默試驗的結果，證明使用不同方法製備的製品的相對活性。
實施例39陽離子脂質7的區域選擇性合成——方案1 路線31a
a陽離子脂質7的區域選擇性合成——方法1 步驟1.化合物9的製備連續攪拌下，在冰浴上冷卻含三乙烯四胺1(48.83g，0.334mmol，購自於Sigma-Aldrich)的無水乙腈(500mL)。向該溶液中添加三氟乙酸乙酯(79.6mL，0.668mol)，並在添加完成後將反應混合物加熱至室溫並攪拌20小時。減壓除去溶劑和揮發物並將殘留物溶解於最低量的溫二氯甲烷(100mL)中，並在攪拌下向其中添加冷己烷。在冰上冷卻沉澱產物並過濾，從而獲得白色固體(112.2g，99％)。
步驟2.(2-{叔丁氧羰基-[2-(2，2，2-三氟-乙醯氨基)乙基]-氨基}-2-(2，2，2-三氟-乙醯氨基)乙基]-氨基甲酸叔丁酯113的合成 將三氟乙醯胺9(112.2g，0.332mol)溶解於CH2Cl2/THF(600mL/100mL)中，向其中添加二異丙基乙胺(129.25g，1mol)並在冰浴上攪拌。向反應混合物中滴加含二碳酸二叔丁酯(145g，0.664mol，購自Sigma Aldrich)的CH2Cl2(100mL)，並攪拌過夜。除去溶劑，並將殘留物與NaHCO3的飽和溶液(400mL)一起攪拌，使用己烷(100mL)清洗並在45℃真空乾燥過夜，從而獲得白色固體狀的雙Boc-化合物(167g，94％)。1H NMR for 113(DMSO-d6，400MHz)δ＝9.60-9.40(m，2H)，3.35-3.15(m，12H)，1.36(s，18H)MSC15H24F6N4O4計算值438.17，實測值439.20(M+)MSC20H32F6N4O6計算值538.22，實測值539.20(M+)。
步驟3.(2-氨基-乙基)-{2-[(2-氨基-乙基)-叔丁氧羰基-氨基]-乙基}氨基甲酸叔丁酯的合成 在不鏽鋼壓力反應器中加入乙醯胺113(167g，0.31mol)，並向其中加入含甲胺(33wt.％)的乙醇(200ml)溶液。將混合物加熱至90℃並攪拌24小時。通過質譜監測反應。減壓除去所有溶劑，並在80℃對殘留物進行高真空處理，從而獲得粘性液體狀的產物114(103g，96％)，該化合物無需進一步的純化即可用於下一步反應。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ＝3.20-3.00(m，4H)，2.62-2.38(m，8H)，1.32(s，9H).MSC11H26N4O2計算值246.21，實測值246.20(M+)。
步驟4.麥可加成反應產物115的合成 向壓力反應器中一起加入二胺114(103g，0.297mmol)、N-十二烷基丙烯醯胺(356g，1.487mol)和飽和的硼酸水溶液(30mL)，並在90℃加熱4天。通過TLC和質譜監測反應。將反應混合物萃取到二氯甲烷(DCM)中，依次使用NaHCO3溶液和鹽水清洗，並使用無水硫酸鈉乾燥。在真空中除去溶劑，並通過矽膠柱色譜(梯度洗脫，先為乙酸乙酯，然後為3-10％MeOH/DCM)純化由此獲得的殘留物，從而獲得淺黃色固體狀的化合物115(228g，59％)。MSC76H150N8O8計算值1303.16，實測值1304.20(M+)。
步驟5.二胺116的製備 將含4M HCl的二噁烷(500mL)添加到含雙boc-化合物115(228g，0.175mol)的甲醇(100mL)溶液中，並將該混合物在室溫下攪拌2天。通過質譜監測反應。在起始雙Boc-化合物完全消失後，過濾沉澱的鹽酸鹽，用THF(100mL)清洗並乾燥，從而獲得白色粉末狀的純鹽(178g，93％)。使用飽和NaHCO3(1L)處理上述鹽，並使用二氯甲烷(3x600mL)進行萃取。乾燥並濃縮所合併的有機萃取物，從而分離白色固體狀的四聚體(164g，85％)。MSC66H134N8O4計算值1103.05，實測值1104.10(M+)。
步驟6.化合物117的合成向壓力反應器中一起加入化合物116(164g，149mmol)、N-十二烷基丙烯醯胺(35.6g，149mmol)和飽和的硼酸水溶液(30mL)，並在90℃加熱3天。通過TLC和質譜監測反應的進程。將反應混合物萃取到二氯甲烷(DCM)中，依次使用NaHCO3溶液和鹽水清洗，並使用無水硫酸鈉乾燥。在真空中除去溶劑，並通過矽膠(2Kg)柱色譜(梯度洗脫，0∶5∶95至10∶10∶80％TEA/MeOH/DCM)純化由此獲得的殘留物，從而獲得淺黃色固體狀的化合物117(83.8g，42％)。MSC76H150N8O8計算值1303.16，實測值1304.20(M+)。通過TLC(定性)、HPLC和質譜對該材料和可信樣品進行比較。MSC81H163N9O5計算值1342.28，實測值1343.30(M+). 步驟7.鹽酸鹽7的合成 將胺117(54g，40mmol)溶解於乙醇(100mL)中，向其中添加200mL含2M HCl的醚，並將該混合物在室溫下攪拌過夜。向反應混合物中通入氮氣，並使排出物通過乾燥劑進入到10％的KOH溶液中。30分鐘後，將反應混合物濃縮至幹，將殘留物復溶於500mL無水乙醇中，並在旋轉蒸發器中濃縮該混合物。重複此過程一次，並將由此獲得的殘留物在43℃的真空爐中乾燥過夜。分離奶油色粉狀的純產物(59.5g，99％)。
實施例40陽離子脂質7的區域選擇性合成——方案2 方法1
步驟1連續攪拌下，在冰浴上冷卻帶頂置式攪拌器的5L四口燒瓶中的含三乙烯四胺1(200g，1.37mol，購自Sigma-Aldrich)的乙腈(2L)。向攪拌的所述溶液中添加三氟乙酸乙酯(388.5mL，2.74mmol)並攪拌20小時。減壓除去溶劑和揮發物，將殘留物與DCM/己烷的混合物一起研磨並過濾，從而獲得白色固體狀的化合物101(429g，93％)。由此獲得的產物無需進一步的純化即可用於下一步的反應。MSC10H16F6N4O2計算值338.12，實測值339.0(M+)。
步驟2將粗化合物101(427g，1.26mol)溶解於溶劑混合物(3L，THF/DCM(1∶2))中，並在冰水浴上攪拌。向反應混合物中添加二碳酸二叔丁酯((Boc)2O，270g，1.26mol，購自Sigma Aldrich)和DIEA(500mL，2.86mol)，並攪拌過夜。除去溶劑並將殘留物萃取到二氯甲烷(DCM，1000mL)中，依次使用NaHCO3溶液(500mL)、水(500mLx2)和鹽水清洗，使用無水硫酸鈉乾燥。在真空中除去溶劑，並將由此獲得的殘留物與DCM/己烷(2∶1)一起研磨並過濾。除去溶劑並在高真空下乾燥殘留物，從而獲得粘性液體狀的化合物102(523g)。
通過矽膠色譜(梯度洗脫，先為乙酸乙酯，隨後為3-10％MeOH/DCM)純化一部分化合物102，從而獲得粘性液體狀的化合物102(102.00g)。化合物102的1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ＝9.60-9.10(m，3H)，3.35-3.25(m，4H)，3.25-3.20(2，2H)，3.20-3.10(m，2H)，2.68-2.58(m，4H)，1.35(s，9H).MSC15H24F6N4O4計算值438.17，實測值439.20(M+)。
步驟3室溫下，在壓力反應器中將純化的化合物102(102.0g，233.40mmol)溶解於乙醇/甲胺(400ml，含33wt％甲胺的EtOH溶液)。將該混合物加熱至90℃，並攪拌2天。通過質譜監測反應。減壓除去所有溶劑，並在80℃對殘留物進行高真空處理，從而獲得粘性液體狀的產物103(58.00g，99％)，該化合物無需進一步的純化即可用於下一步反應。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ＝3.20-3.00(m，4H)，2.62-2.38(m，8H)，1.32(s，9H).MSC11H26N4O2計算值246.21，實測值247.20(M+)。
步驟4在壓力反應器中一起加入三胺103(56.00g，227.64mmol)、N-十二烷基丙烯醯胺(327.00g，1365mol)和飽和的硼酸水溶液(50mL)，並在90℃加熱6天。通過TLC和質譜監測反應。將反應混合物萃取到二氯甲烷(DCM)中，連續使用NaHCO3溶液(400mL)清洗，並使用無水硫酸鈉乾燥。在真空中除去溶劑，並通過矽膠柱色譜(梯度洗脫，先為乙酸乙酯，然後為3-10％MeOH/DCM)純化由此獲得的殘留物，從而獲得淺黃色固體狀的化合物104(186g，57％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ＝7.20(bs，1H)，7.05(bs，1H)，6.85(bs，1H)，6.74(bs，1H)，3.25-3.03(m，12H)，2.80-2.60(m，8H)，2.55-2.21(m，12H)1.52-1.45(m，10H)，1.42(s，9H)，1.34-1.20(m，100H)，0.87(t，J＝6.5Hz，15H).MSC86H171N9O7計算值1442.33，實測值1443.30(M+)。
步驟5向化合物105(184.00g，127.23mmol)的二噁烷(300ml)溶液中添加含4M HCl的二噁烷(400mL)。隨後將反應混合物攪拌過夜。通過質譜監測反應。使氮氣通過所述溶液，從而除去過量的HCl。在真空中除去溶劑並將殘留物與甲醇(500mLX3)共蒸發3次，從而獲得淺黃色粘性固體狀的四鹽酸鹽7(186.00g，98％)。通過TLC(定性)、HPLC和質譜對該材料和可信樣品進行比較。MSC81H163N9O5計算值1342.28，實測值1343.30(M+)。
方法2 按照方法1中步驟1和步驟2的描述製備化合物102。方法1中步驟2獲得的粗產物無需進一步的純化即可用於下一步反應。
步驟1室溫下，在壓力反應器中將化合物102(103.45g，238.90mmol，來自方法1步驟2的粗化合物)溶解於乙醇/甲胺(400ml，含33wt％甲胺的EtOH溶液)。將該混合物加熱至90℃，並攪拌2天。通過質譜監測反應。減壓除去所有溶劑，並在水浴上於80℃對殘留物進行高真空處理，從而獲得淺黃色粘性液體在的產物103(63.50g)，該化合物無需進一步的純化即可用於下一步反應。
步驟4按照方法1中步驟4的描述，將三胺103(63.50g，238mmol)、N-十二烷基丙烯醯胺(320.00g，1338mol)和飽和的硼酸水溶液(50mL)一起加入到壓力反應器中，並在90℃加熱6天。通過TLC和質譜監測反應。將反應混合物萃取到二氯甲烷(DCM)中，連續使用NaHCO3溶液(400mL)清洗，並使用無水硫酸鈉乾燥。在真空中除去溶劑，並通過矽膠柱色譜(梯度洗脫，先為乙酸乙酯，然後為3-10％MeOH/DCM)純化由此獲得的殘留物，從而獲得淺黃色固體狀的化合物104(65.2g，20％)。
步驟5向化合物105(65.00g，45mmol)中添加含2M HCl的醚(800mL)。隨後將反應混合物攪拌過夜。通過質譜監測反應。使氮氣通過溶液，從而除去過量的HCl。在真空中除去溶劑，並將殘留物與甲醇(500mLX3)共蒸發3次，從而獲得淺黃色粘性固體狀的四鹽酸鹽7(66g，98％)。通過TLC(定性)、HPLC和質譜對該物質和可信樣品進行比較。MSC81H163N9O5計算值1342.28，實測值1343.30(M+)。
方法3 按照方法1中步驟1和步驟2的描述製備化合物102。由方法1的步驟2獲得的粗產物無需進一步純化即可用於下一步反應。
步驟3室溫下，將化合物102(105.20g，240mmol，來自方法1的粗化合物)溶解於壓力反應器中的乙醇/甲胺(400ml，33wt％甲胺的EtOH溶液)中。將該混合物加熱至90℃，並攪拌2天。通過質譜監測反應。減壓除去所有溶劑，並在80℃水浴上對殘留物進行高真空處理，從而獲得淺黃色粘性液體狀的產物103(64.70g)，該化合物無需進一步的純化即可用於下一步反應。
步驟4向壓力反應器中一起加入三胺103(64.70g，240mmol)、N-十二烷基丙烯醯胺(370.00g，1569mol)和飽和的硼酸水溶液(50mL)，並在90℃加熱6天。通過TLC和質譜監測反應。將反應混合物萃取到二氯甲烷(DCM)中，連續使用NaHCO3溶液(400mL)清洗，並使用無水硫酸鈉乾燥。在真空中除去溶劑，並通過矽膠柱色譜(梯度洗脫，先為乙酸乙酯，然後為3-10％MeOH/DCM)純化由此獲得的殘留物，從而獲得淺黃色固體狀的化合物104(192g)。
步驟5按照實施例40方法1中步驟5的描述，從化合物104獲得所需鹽酸鹽化合物7。化合物7194g(98％)，為四鹽酸鹽。通過TLC(定性)、HPLC和質譜對該材料和可信樣品進行比較。MSC81H163N9O5計算值1342.28，實測值1343.30(M+)。
實施例41配製到具有不同PEG-脂質部分的多種締合複合物中的siRNA活性的比較 可以通過測定脂質將siRNA部分遞送到靶標的相對能力來檢測脂質組合物的有效性。例如，靶標的沉默說明siRNA被遞送到細胞中。本申請人已對締合複合物進行了比較，其中所述締合複合物包含圖5中所示的13種不同PEG-脂質部分之一以及用以沉默VII因子(FVII)的siRNA。
使用以下方法合成PEG-脂質1～13 路線1a
a路線1mPEG2000-1，2-二-O-烷基-sn3-氨基甲醯甘油酯 化合物5的製備將1，2-二-O-十四烷基-sn-甘油酯1(30g，61.80mmol)和N，N′-琥珀醯亞胺碳酸酯(DSC，23.76g，1.5當量)加入到二氯甲烷(DCM，500mL)中，並在冰水混合物上攪拌。向攪拌溶液中添加三乙胺(25.30mL，3當量)，隨後在室溫下將反應混合物攪拌過夜。通過TLC監測反應的進程。使用DCM(400mL)稀釋反應混合物並使用水(2X500mL)、NaHCO3水溶液(500mL)清洗有機層，隨後進行標準檢查。在室溫下，將所得殘留物在高真空中乾燥過夜。乾燥後，將由此獲得的粗碳酸酯3溶解於二氯甲烷(500mL)中，並在冰浴上攪拌過夜。在氬氣氛中，向攪拌的溶液中添加mPEG2000-NH24(103.00g，47.20mmol，購自日本NOF Corporation)和無水吡啶(80mL，過量)。隨後，在室溫下將反應混合物攪拌過夜。在真空中除去溶劑和揮發物，將殘留物溶解於DCM(200mL)中，並載入裝有乙酸乙酯的矽膠柱中。所述矽膠柱首先使用乙酸乙酯洗脫，隨後使用含5-10％甲醇的二氯甲烷進行梯度洗脫，從而獲得白色固體狀的所需PEG-脂質5(105.30g，83％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ＝5.20-5.12(m，1H)，4.18-4.01(m，2H)，3.80-3.70(m，2H)，3.70-3.20(m，-O-CH2-CH2-O-，PEG-CH2)，2.10-2.01(m，2H)，1.70-1.60(m，2H)，1.56-1.45(m，4H)，1.31-1.15(m，48H)，0.84(t，J＝6.5Hz，6H).MS範圍的實測值2660-2836。
化合物4b的製備將1，2-二-O-十六烷基-sn-甘油酯1b(1.00g，1.848mmol)和DSC(0.710g，1.5當量)一起加入到二氯甲烷(20mL)中，並在冰水混合物中冷卻至0℃。向其中添加三乙胺(1.00mL，3當量)並攪拌過夜。通過TLC跟蹤反應，由DCM稀釋，使用水(2次)和NaHCO3溶液清洗，並使用硫酸鈉乾燥。減壓除去溶劑，並使殘留物2b在高真空中過夜。該化合物無需進一步純化即可直接用於下一步反應。在氬氣氛中，將MPEG2000-NH23(1.50g，0.687mmol，購自日本NOF Corporation)和來自上一步的化合物2b(0.702g，1.5當量)溶解於二氯甲烷(20mL)中。將反應冷卻至0℃。向其中添加吡啶(1mL，過量)並攪拌過夜。通過TLC監測反應。在真空中除去溶劑和揮發物，並通過色譜(先後使用乙酸乙酯和5-10％MeOH/DCM進行梯度洗脫)純化殘留物，從而獲得白色固體狀的所需化合物4b(1.46g，76％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ＝5.17(t，J＝5.5Hz，1H)，4.13(dd，J＝4.00Hz，11.00Hz，1H)，4.05(dd，J＝5.00Hz，11.00Hz，1H)，3.82-3.75(m，2H)，3.70-3.20(m，-O-CH2-CH2-O-，PEG-CH2)，2.05-1.90(m，2H)，1.80-1.70(m，2H)，1.61-1.45(m，6H)，1.35-1.17(m，56H)，0.85(t，J＝6.5Hz，6H).MS範圍的實測值2716-2892。
化合物4c的製備將1，2-二-O-十八烷基-sn-甘油酯1c(4.00g，6.70mmol)和DSC(2.58g，1.5當量)一起加入到二氯甲烷(60mL)中，並在冰水混合物中冷卻至0℃。向其中添加三乙胺(2.75mL，3當量)並攪拌過夜。通過TLC跟蹤反應，由DCM稀釋，使用水(2次)和NaHCO3溶液清洗，並使用硫酸鈉乾燥。減壓除去溶劑，並使殘留物在高真空中過夜。該化合物而無需進一步純化即可直接用於下一步反應。在氬氣氛中，將MPEG2000-NH23(1.50g，0.687mmol，購自日本NOF Corporation)和來自上一步的化合物2c(0.760g，1.5當量)溶解於二氯甲烷(20mL)中。將反應冷卻至0℃。向其中添加吡啶(1mL，過量)並攪拌過夜。通過TLC監測反應。在真空中除去溶劑和揮發物，並通過色譜(先後使用乙酸乙酯和5-10％MeOH/DCM進行梯度洗脫)純化殘留物，從而獲得白色固體狀的所需化合物4c(0.92g，48％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ＝5.22-5.15(m，1H)，4.16(dd，J＝4.00Hz，11.00Hz，1H)，4.06(dd，J＝5.00Hz，11.00Hz，1H)，3.81-3.75(m，2H)，3.70-3.20(m，-O-CH2-CH2-O-，PEG-CH2)，1.80-1.70(m，2H)，1.60-1.48(m，4H)，1.31-1.15(m，64H)，0.85(t，J＝6.5Hz，6H).MS範圍的實測值2774-2948。
路線2a
a路線2mPEG2000-1，2-二-O-烷基-sn3-琥珀醯甘油酯 化合物6a的製備將1，2-二-O-十四烷基-sn-甘油酯1a(1.00g，2.06mmol)、琥珀酸酐(0.416g，2當量)和DSC(0.628g，2.5當量)一起加入到二氯甲烷(20mL)中，並攪拌過夜。通過TLC跟蹤反應，由DCM稀釋，使用冷的稀檸檬酸、水清洗，並使用硫酸鈉乾燥。減壓除去溶劑，並使殘留物在高真空中過夜。該化合物無需進一步純化即可直接用於下一步反應。在氬氣氛中，將MPEG2000-NH23(1.50g，0.687mmol，購自日本NOFCorporation)、來自上一步的化合物5a(0.660g，1.12當量)和HBTU(0.430g，1.13mmol)溶解於二氯甲烷/DMF(2∶1，20mL)的混合物中。向其中添加DIEA(0.358mL，3當量)並攪拌過夜。將反應混合物轉移到大燒瓶中，並減壓除去溶劑和揮發物。將殘留物在高真空中乾燥過夜，並通過色譜(先後使用乙酸乙酯和5-10％MeOH/DCM進行梯度洗脫)純化，從而獲得白色固體狀的所需化合物6a(0.822g，43％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ＝6.34-6.30(m，1H)，4.16(dd，J＝4.00Hz，11.00Hz，1H)，4.08(dd，J＝5.00Hz，11.00Hz，1H)，3.82-3.78(m，2H)，3.70-3.30(m，-O-CH2-CH2-O-，PEG-CH2)，2.64(t，J＝7.00Hz，2H)，2.43(t，J＝6.80Hz，2H)，1.76-1.72(m，2H)，1.56-1.48(m，4H)，1.34-1.16(m，48H)，0.85(t，J＝6.5Hz，6H).MS範圍的實測值2644-2804。
化合物6b的製備將1，2-二-O-十六烷基-sn-甘油酯1b(1.00g，1.848mmol)、琥珀酸酐(0.369g，2當量)和DMAP(0.563g，2.5當量)一起加入到二氯甲烷(20mL)中，並攪拌過夜。通過TLC跟蹤反應，由DCM稀釋，使用冷的稀檸檬酸、水清洗，並使用硫酸鈉乾燥。減壓除去溶劑，並使殘留物在高真空中過夜。該化合物無需進一步純化即可直接用於下一步反應。在氬氣氛中，將MPEG2000-NH23(1.50g，0.687mmol，購自日本NOFCorporation)、來自上一步的化合物5b(0.66g，1.03mmol)和HBTU(0.400g，1.05mmol)溶解於二氯甲烷/DMF(2∶1，20mL)的混合物中。向其中添加DIEA(0.358mL，3當量)並攪拌過夜。將反應混合物轉移到大燒瓶中，並減壓除去溶劑和揮發物。將殘留物在高真空中乾燥過夜，並通過色譜(先後使用乙酸乙酯和5-10％MeOH/DCM進行梯度洗脫)純化，從而獲得白色固體狀的所需化合物6b(0.300g，16％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ＝6.33-6.28(m，1H)，4.18(dd，J＝4.00Hz，11.00Hz，1H)，4.08(dd，J＝5.00Hz，11.00Hz，1H)，3.82-3.76(m，2H)，3.70-3.30(m，-O-CH2-CH2-O-，PEG-CH2)，2.65(t，J＝7.08Hz，2H)，2.44(t，J＝6.83Hz，2H)，1.76-1.68(m，2H)，1.57-1.48(m，4H)，1.32-1.17(m，56H)，0.86(t，J＝6.6Hz，6H).MS範圍的實測值2640-2822。
化合物6c的製備將1，2-二-O-十八烷基-sn-甘油酯1c(5.00g，8.37mmol)、琥珀酸酐(1.70g，2當量)和DMAP(2.55g，2.5當量)一起加入到二氯甲烷(50mL)中，並攪拌過夜。通過TLC跟蹤反應，由DCM稀釋，使用冷的稀檸檬酸、水清洗，並使用硫酸鈉乾燥。減壓除去溶劑，並使殘留物在高真空中過夜。該化合物無需進一步純化即可直接用於下一步反應。在氬氣氛中，將MPEG2000-NH23(1.50g，0.687mmol，購自日本NOFCorporation)、來自上一步的化合物5c(0.718g，1.03mmol)和HBTU(0.410g，1.08mmol)溶解於二氯甲烷/DMF(2∶1，20mL)的混合物中。向其中添加DIEA(0.350mL，3當量)並攪拌過夜。將反應混合物轉移到大燒瓶中，並減壓除去溶劑和揮發物。將殘留物在高真空中乾燥過夜，並通過色譜(先後使用乙酸乙酯和5-10％MeOH/DCM進行梯度洗脫)純化，從而獲得白色固體狀的所需化合物6c(1.1g，56％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ＝6.38-6.33(m，1H)，4.19(dd，J＝4.00Hz，11.00Hz，1H)，4.07(dd，J＝5.00Hz，11.00Hz，1H)，3.81-3.74(m，2H)，3.70-3.20(m，-O-CH2-CH2-O-，PEG-CH2)，2.63(t，J＝7.03Hz，2H)，2.43(t，J＝6.87Hz，2H)，1.76-1.68(m，2H)，1.57-1.48(m，4H)，1.32-1.17(m，64H)，0.86(t，J＝6.60Hz，6H).MS範圍的實測值2680-2922。
路線3a
a路線3mPEG2000-1，2-二-O-烷基-sn3-琥珀醯甘油酯 化合物8a的製備在氬氣氛中，將1，2-二-O-十四烷基-sn-甘油酯1a(0.300g，0.618mmol)、MPEG-琥珀酸酯7(1.00g，0.476mmol，購自日本NOFCorporation)、DCC(0.127g，1.3當量)和DMAP(0.058g，0.476mmol)加入到二氯甲烷(20mL)中，並攪拌過夜。通過TLC監測反應。攪拌過夜後，將反應混合物冷卻至0℃，並濾去沉的固體。減壓除去溶劑和揮發物，並通過色譜(先後使用EtOAc和5-10％DCM/MeOH進行梯度洗脫)純化所得殘留物，從而獲得白色固體狀的所需化合物8a(0.590g，48％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ＝4.25-4.18(m，2H)，4.08(dd，J＝5.60Hz，11.50Hz，1H)，3.80-3.73(m，2H)，3.70-3.30(m，-O-CH2-CH2-O-，PEG-CH2)，1.56-1.47(m，4H)，1.30-1.15(m，48H)，0.85(t，J＝6.60Hz，6H).MS範圍的實測值2440-2708。
化合物8b的製備在氬氣氛中，將1，2-二-O-十六烷基-sn-甘油酯1b(0.334g，0.618mmol)、MPEG-琥珀酸酯7(1.00g，0.476mmol，購自日本NOFCorporation)、DCC(0.127g，1.3當量)和DMAP(0.058g，0.476mmol)加入到二氯甲烷(20mL)中，並攪拌過夜。通過TLC監測反應。攪拌過夜後，將反應混合物冷卻至0℃，並濾去沉的固體。減壓除去溶劑和揮發物，並通過色譜(先後使用EtOAc和5-10％DCM/MeOH進行梯度洗脫)純化所得殘留物，從而獲得白色固體狀的所需化合物8b(0.930g，74％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ＝4.25-4.17(m，2H)，4.09(dd，J＝5.50Hz，11.50Hz，1H)，3.81-3.73(m，2H)，3.70-3.30(m，-O-CH2-CH2-O-，PEG-CH2)，1.58-1.47(m，4H)，1.30-1.17(m，56H)，0.86(t，J＝6.60Hz，6H).MS範圍的實測值2452-2760。
化合物8c的製備在氬氣氛中，將1，2-二-O-十八烷基-sn-甘油酯1c(0.369g，0.618mmol)、MPEG-琥珀酸酯7(1.00g，0.476mmol，購自日本NOFCorporation)、DCC(0.127g，1.3當量)和DMAP(0.058g，0.476mmol)加入到二氯甲烷(20mL)中，並攪拌過夜。通過TLC監測反應。攪拌過夜後，將反應混合物冷卻至0℃，並濾去沉澱的固體。減壓除去溶劑和揮發物，並通過色譜(先後使用EtOAc和5-10％DCM/MeOH進行梯度洗脫)純化所得殘留物，從而獲得白色固體狀的所需化合物8c(0.960g，75％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ＝4.27-4.20(m，2H)，4.10(dd，J＝5.80Hz，11.50Hz，1H)，3.83-3.74(m，2H)，3.70-3.35(m，-O-CH2-CH2-O-，PEG-CH2)，1.54-1.46(m，4H)，1.30-1.17(m，64H)，0.86(t，J＝6.60Hz，6H).MS範圍的實測值2508-2816。
路線4a
a路線4mPEG2000-1，2-二-O-醯基-sn3-琥珀醯甘油酯 化合物10a的製備在氬氣氛中，將1，2-二肉豆蔻醯-sn-甘油9a(0.317g，0.618mmol)、MPEG-琥珀酸酯7(1.00g，0.476mmol，購自日本NOFCorporation)、DCC(0.127g，1.3當量)和DMAP(0.058g，0.476mmol)加入到二氯甲烷(20mL)中，並攪拌過夜。通過TLC監測反應。攪拌過夜後，將反應混合物冷卻至0℃，並濾去沉澱的固體。減壓除去溶劑和揮發物，並通過色譜(先後使用EtOAc和5-10％DCM/MeOH進行梯度洗脫)純化所得殘留物，從而獲得白色固體狀的所需化合物10a(0.960g，78％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ＝5.26-5.20(m，1H)，4.30-4.08(m，6H)，3.81-3.73(m，2H)，3.70-3.40(m，-O-CH2-CH2-O-，PEG-CH2)，2.65-2.60(m，4H)，2.35-2.28(m，4H)，1.63-1.52(m，4H)，1.30-1.15(m，44H)，0.86(t，J＝6.60Hz，6H).MS範圍的實測值2468-2732. 化合物10b的製備在氬氣氛中，將1，2-二棕櫚醯-sn-甘油9b(0.352g，0.618mmol)、MPEG-琥珀酸酯7(1.00g，0.476mmol，購自日本NOFCorporation)、DCC(0.127g，1.3當量)和DMAP(0.058g，0.476mmol)加入到二氯甲烷(20mL)中，並攪拌過夜。通過TLC監測反應。攪拌過夜後，將反應混合物冷卻至0℃，並濾去沉澱的固體。減壓除去溶劑和揮發物，並通過色譜(先後使用EtOAc和5-10％DCM/MeOH進行梯度洗脫)純化所得殘留物，從而獲得白色固體狀的所需化合物10b(1.02g，81％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ＝5.26-5.19(m，1H)，4.30-4.05(m，6H)，3.80-3.40(m，-O-CH2-CH2-O-，PEG-CH2)，2.65-2.60(m，4H)，2.33-2.24(m，4H)，1.63-1.50(m，4H)，1.30-1.15(m，52H)，0.85(t，J＝6.60Hz，6H).MS範圍的實測值2524-2792。
化合物10c的製備在氬氣氛中，將1，2-二硬脂醯-sn-甘油9c(0.387g，0.618mmol)、MPEG-琥珀酸酯7(1.00g，0.476mmol，購自日本NOFCorporation)、DCC(0.127g，1.3當量)和DMAP(0.058g，0.476mmol)加入到二氯甲烷(20mL)中，並攪拌過夜。通過TLC監測反應。攪拌過夜後，將反應混合物冷卻至0℃，並濾去沉澱的固體。減壓除去溶劑和揮發物，並通過色譜(先後使用EtOAc和5-10％DCM/MeOH進行梯度洗脫)純化所得殘留物，從而獲得白色固體狀的所需化合物10c(1.04g，80％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ＝5.26-5.19(m，1H)，4.30-4.05(m，6H)，3.80-3.40(m，-O-CH2-CH2-O-，PEG-CH2)，2.66-2.59(m，4H)，2.31-2.26(m，4H)，1.63-1.52(m，4H)，1.30-1.15(m，52H)，0.85(t，J＝6.60Hz，6H).MS範圍的實測值2540-2844。
路線5a
a路線5膽甾醇基-mPEG2000 化合物13的製備在氬氣氛中，將MPEG2000-OH 11(6.00g，3mmol，購自Sigma-Aldrich)、膽固醇半琥珀酸酯12(1.50g，3.08mmol)和HBTU(1.23g，3.23mmol)溶解於二氯甲烷/DMF(2∶1，100mL)的混合物中。向其中添加DIEA(1.60mL，3當量)並攪拌過夜。減壓除去溶劑和揮發物。將殘留物在高真空中乾燥過夜，並通過色譜(先使用乙酸乙酯，然後使用5-10％MeOH/DCM進行梯度洗脫)純化，從而獲得白色固體狀的所需化合物13(5.05g，68％)。1H NMR(CDCl3，400MHζ)δ＝5.35-5.25(m，1H)，4.60-4.50(m，1H)，4.22-4.18(m，2H)，3.80-3.76(m，2H)，3.72-3.40(m，-O-CH2-CH2-O-，PEG-CH2)，2.64-2.56(m，4H)，2.31-2.20(m，3H)，2.01-0.8(m，44H).MS範圍的實測值2390-2654。
實施例42靶向PEG-脂質
化合物19的製備 步驟1將化合物14(2.00g，1.01mmol)和氯甲酸膽固醇酯15(0.453g，1.01mmol)一起加入到二氯甲烷(20mL)中。在冰水浴中冷卻該混合物。加入三乙胺(0.448ml)並將反應混合物攪拌過夜。通過TLC監測反應。除去溶劑，並通過矽膠色譜(先後為乙酸乙酯和5-10％MeOH/DCM)純化殘留物，從而獲得所需的化合物16(1.10g，45.40％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ＝5.35(m，1H)，5.15(m，1H)，3.40-3.85(m，O-CH2-CH2-O)，3.10-3.25(m，10H)，0.80-2.38(m，44H，Cholesterol).MS範圍的實測值2220-2490。
步驟2將化合物16(1.00g，0.417mmol)、化合物17(0.235g，0.542mmol)和HBTU(0.190g，0.5mmol)加入到DCM/DMF(20mL，2∶1)的混合物中。向其中添加DIEA並攪拌過夜。通過TLC監測反應，減壓除去溶劑，並通過色譜(5-10％MeOH/DCM)純化殘留物，從而獲得所需的化合物18(1.02g，87％)。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ＝7.52(d，J＝8.06Hz，1H)，7.33(t，J＝7.02Hz，1H)，7.25(t，J＝7.32Hz，1H)，5.27(m，1H)，5.18(d，J＝3.2Hz，1H)，4.92(dd，J＝3.17，11.23Hz，1H)，4.43(m，1H)，3.60-4.02(m，5H)，3.20-3.55(m，O-CH2-CH2-O)，2.90-3.10(m，10H)，2.05(s，3H)，1.96(s，3H)，1.84(s，3H)，1.77(s，3H)，0.80-2.38(m，44H，膽固醇).MS範圍的實測值2680-2990。
步驟3將化合物18(1.02g，0.362mmol)溶解於MeOH/DCM的混合物中(10mL)，向其中添加含0.5M NaOMe的甲醇溶液(過量)並攪拌過夜。通過TLC監測反應的進程。使用AcOH中和該混合物。在真空中除去溶劑，並通過色譜(5-10％MeOH/DCM)純化殘留物，從而獲得化合物19(280mg，30％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ＝5.38(m，1H)，4.02-4.06(m，7H)，3.30-3.80(m，O-CH2-CH2-O)，3.20-3.29(m，8H)，2.08(s，3H)，0.80-2.38(m，44H，膽固醇).MS範圍的實測值2600-2900。
實施例43靶向PEG-脂質
化合物23的製備 步驟1將化合物14(2.00g，1.01mmol)和化合物20(0.453g，1.01mmol)一起加入到二氯甲烷(20mL)中。在冰水浴中冷卻該混合物。加入吡啶(1mL，過量)並將反應混合物攪拌過夜。通過TLC監測反應。除去溶劑，並通過矽膠色譜(先後為乙酸乙酯和5-10％MeOH/DCM)純化殘留物，從而獲得所需的化合物21(400mg，15％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ＝5.20(m，1H)，4.05-4.20(m，2H)，3.20-3.80(m，O-CH2-CH2-O)，1.70-1.82(m，4H)，1.50-1.61(m，2H)，1.18-1.38(m，60H)，0.87(t，J＝6.30Hz，6H).MS範圍的實測值2400-2750。
步驟2將化合物21(0.415g，0.159mmol)、化合物17(0.100g，1.3當量)和HBTU(0.90g，1.15當量)加入到DCM/DMF(20mL，2∶1)的混合物中。向其中添加DIEA(0.2mL)並攪拌過夜。通過TLC監測反應，減壓除去溶劑，並通過色譜(3-10％MeOH/DCM)純化殘留物，從而獲得所需的化合物22(0.450g，94％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ＝6.21(d，J＝8.70Hz，1H)，5.33(d，J＝2.70Hz，1H)，5.15-5.20(m，2H)，4.55(d，J＝8.15Hz，1H)，4.01-4.20(m，4H)，3.20-3.90(m，O-CH2-CH2-O)，2.14(s，3H)，2.03(s，3H)，1.99(s，3H)，1.93(s，3H)，1.70-1.82(m，4H)，1.50-1.61(m，4H)，1.17-1.38(m，60H)，0.86(t，J＝6.32Hz，6H).MS範圍的實測值2800-3200。
步驟3將化合物22(0.450g，0.359mmol)溶解於MeOH/DCM的混合物中(5mL)，向其中添加含0.5M NaOMe的甲醇溶液(過量)並攪拌過夜。通過TLC監測反應的進程。使用AcOH中和該混合物。在真空中除去溶劑，並通過色譜(5-10％MeOH/DCM)純化殘留物，從而獲得化合物23(365mg，85％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ＝5.18(m，1H)，4.05-4.20(m，4H)，3.20-3.90(m，O-CH2-CH2-O)，2.05(s，3H)，1.71-1.80(m，4H)，1.50-1.61(m，4H)，1.17-1.38(m，60H)，0.87(t，J＝6.32Hz，6H).MS範圍的實測值2760-3000。
如圖6所示，在施用於受試者時，該製品可提供不同程度的FVII沉默。例如，製品3提供了相對高程度的FVII沉默，製品5、6和12同樣如此。
實施例44小鼠對製品LNP01給藥的耐受性 按照實施例45的描述製備組分為ND98∶膽固醇∶PEG-C14＝42∶48∶10(摩爾比)的空脂質體。隨後，向預製並擠出的空脂質體中添加不同量的siRNA，從而獲得初始總賦形劑∶siRNA的比例為30∶1、20∶1、15∶1、10∶1和5∶1(重量比)的製品。以5∶1的初始總賦形劑∶siRNA比例進行製備的製品導致製品中siRNA過量，即脂質的負載能力飽和。隨後，使用100,000MWCO膜及5體積的PBS通過切向流過濾除去過量的siRNA。然後，通過尾靜脈注射以10mg/kg siRNA的劑量將所得製品施用於C57BL/6小鼠。通過測量製品施用後24小時和48小時動物的體重增量來評估製品的耐受性，其結果顯示於圖7中。
實施例45首先形成未負載的複合物，再使用siRNA處理未負載的複合物從而形成締合複合物，並施用包含兩種治療劑的所述締合複合物 按照以下方式製備具有兩種不同核酸部分的締合複合物。在乙醇中製備ND98、膽固醇和PEG-C14的母液，其中ND98、膽固醇和PEG-C14的濃度分別為133mg/mL、25mg/mL和100mg/mL。隨後將脂質母液混合以產生摩爾比為42∶48∶10的ND98∶膽固醇∶PEG-C14。再將該混合物添加到緩衝水溶液中，從而在35％乙醇、100mM乙酸鈉(pH 5)中自發形成脂質納米顆粒。隨後，使用擠出機(Lipex，Northern Lipids)使未負載的脂質納米顆粒兩次通過0.08μm膜(Whatman，Nucleopore)，從而獲得大小為20-100nm的囊泡(unimodal vesicle)。然後，以7.5∶1(重量比)的總賦形劑∶siRNA比例，向預成形的未負載囊泡中添加適量的含siRNA的35％乙醇。然後，將所得混合物在37℃溫育30分鐘以使siRNA負載到脂質納米顆粒中。溫育後，通過使用PBS進行透析或切向流過濾來除去乙醇並置換緩衝劑。終製品通過0.2μm的濾器進行過濾除菌。圖8提供了用以說明賦形劑和治療劑的添加順序的流程圖。
按照實施例44的描述，配製比例為1∶1的靶向ApoB和VII因子的siRNA的混合物。按照實施例31的描述，分別單獨配製相同的ApoB-和VII因子-靶向性siRNA。隨後，按10μL/g動物體重的注射體積施用不同劑量的所述三種製品。施用後48小時，通過眼球後放血收集血清樣品，處死動物並取出肝臟。根據製造商所述的方法，使用顯色診斷試劑盒(Coaset Factor VII AssayKit，DiaPharma)測定血清VII因子的濃度。使用分支DNA(bDNA)試驗(Quantigene，Panomics)測定肝臟中ApoB和VII因子的mRNA水平，其結果顯示於圖9中。沒有觀察到兩種治療劑之間發生抑制的證據。實際上證明兩種治療劑在施用時均有效。
實施例46使用預製囊泡製備締合複合物的方法 脂質母液的製備 在乙醇中製備類脂質ND98·4HCl(lipidoid ND98·4HCl，MW 1487)、膽固醇和PEG-C14的母液，其中ND98、膽固醇和PEG-C14的濃度分別為133mg/mL、25mg/mL和100mg/mL。在50℃加熱母液以促進脂質溶解到溶液中。
空囊泡的製備 按照下述體積混合脂質母液，從而獲得42∶48∶10的ND98∶膽固醇∶PEG-C14摩爾比。同樣根據下表列出的體積製備水性混合物。

隨後，在磁力攪拌板上快速攪拌的同時，向水混合物中添加乙醇脂質混合物。一經混合即可自發形成類脂質囊泡。隨後，將所得囊泡擠過(2次)0.08μm的膜(Whatman，Nucleopore)，從而確定空囊泡的大小。所有操作均在室溫下進行。
空囊泡對siRNA的負載 通過將脫鹽的雙鏈siRNA溶解於50mM乙酸鈉(pH 5)中，以製備濃度為10mg/mL的siRNA母液。將適當體積的此siRNA母液與適當體積的乙醇混合，從而獲得含siRNA的35體積％乙醇稀釋溶液(參見下表)。
siRNA的稀釋 在磁力攪拌板上快速攪拌的同時，向623mL空囊泡混合物中添加277mLsiRNA稀釋溶液。然後，將所得組合混合物在37℃溫育30分鐘以負載siRNA。
超濾和末次0.2μm過濾 溫育後，將900mL負載的納米顆粒混合物稀釋到1.8L PBS中，從而獲得2.7L稀釋混合物。隨後，將該稀釋混合物濃縮至～1L，並使用利用雙層100,000MWCO筒的Sartorius TFF系統通過10體積PBS的切向流過濾進行滲濾。不向所述筒施加背壓，並將泵速設定為300rpm。置換緩衝劑後，將所得溶液濃縮至約2mg/mL siRNA。
使該溶液通過0.2μm的濾器(Whatman，Polycap 36AS)，從而進行末次過濾。
圖10顯示了說明此方法的流程圖。
實施例47粒徑對效力影響的比較 基本按照實施例46所述的方法形成締合複合物。然而，因為要基於大小評價複合物，所以使用不同的擠出膜，產生直徑分別為150nm、85nm、60nm和50nm的顆粒。負載到所述複合物中的siRNA靶向VII因子。
在VII因子沉默試驗中對該顆粒進行評價，證明相對於150nm、85nm和60nm的顆粒，50nm的顆粒最為有效。試驗結果顯示於圖11中。
實施例48未配製的核酸試劑與配製到締合複合物中的核酸試劑的半衰期比較 於37℃在人血清中評價配製到締合複合物中的siRNA在體外的半衰期。按照實施例46的描述製備締合複合物。出於比較的目的，還在人血清中對未配製的siRNA進行了體外評價。對於配製siRNA和未配製siRNA，還評價了通過HPLC測定的全長產物的百分比。如圖12所示，配製siRNA在人血清中的體外半衰期顯著延長。
實施例49具有不同鏈長的PEG脂質的締合物的效力比較 按照實施例46的描述製備締合複合物，其中PEG脂質的烷基鏈的長度不同。對鏈長為10、11、12、13、14、15和16的烷基進行評價，並比較其在VII因子沉默試驗中的效力。如圖13所示，根據試驗中的測量，13、14和15的鏈長顯示了最佳的沉默結果。
現已描述了本發明的多個實施方案。然而，應理解可進行多種改進而不脫離本發明的精神和範圍。因此，其他實施方案也在權利要求書的範圍之內。
權利要求
1.一種製品，其包含一種或多種化合物或其藥學上可接受的鹽，每個所述化合物獨立地具有式I所示的結構，
式(I)
其中
Xa和Xb在每次出現時分別獨立地為C1-6亞烷基；
n為0、1、2、3、4或5；R分別獨立地為H，
RaRb Rc Rd Re
其中，在所述製品中，至少約80％的式(I)化合物分子中的至少n+2個R基團不是H；
m為1、2、3或4；Y為O、NR2或S；
R1為烷基、烯基或炔基；其每一個任選被一個或多個取代基取代；和
R2為H、烷基、烯基或炔基；其每一個任選被一個或多個取代基取代；
條件是，如果n＝0，則至少n+3個R基團不是H。
2.如權利要求1所述的製品，其中R不是H時，R為Ra。
3.如權利要求1所述的製品，其中R不是H時，R為Rb。
4.如權利要求1所述的製品，其中R不是H時，R為Rc。
5.如權利要求1所述的製品，其中R不是H時，R為Rd。
6.如權利要求1所述的製品，其中R不是H時，R為Re。
7.如權利要求1所述的製品，其中式(I)中n+2個R基團不是H。
8.如權利要求1所述的製品，其中式(I)中n+3個R基團不是H。
9.如權利要求1所述的製品，其中式(I)中n+4個R基團不是H。
10.如權利要求1所述的製品，其中n＞0，式(I)中NR的至少一個R為H。
11.如權利要求1所述的製品，其中式(I)中NR2的至少一個R為H。
12.如權利要求1所述的製品，其中至少80％的分子為一種結構異構體。
13.如權利要求12所述的製品，其中式(I)中n+2個R基團不是H。
14.如權利要求12所述的製品，其中式(I)中n+3個R基團不是H。
15.如權利要求12所述的製品，其中式(I)中n+4個R基團不是H。
16.如權利要求1所述的製品，其中在至少約90％的式(I)化合物分子中，至少n+2個R基團不是H。
17.如權利要求1所述的製品，其中在至少約95％的式(I)化合物分子中，至少n+2個R基團不是H。
18.如權利要求1所述的製品，其中在至少約99％的式(I)化合物分子中，至少n+2個R基團不是H。
19.如權利要求1所述的製品，其中n為2。
20.如權利要求1所述的製品，其中n為0。
21.如權利要求1所述的製品，其中Xa和Xb為C2亞烷基。
22.如權利要求1所述的製品，其中n為0，Xb為亞乙基或亞丙基。
23.如權利要求1所述的製品，其中n＞1，至少有一個Xa不同。
24.如權利要求1所述的製品，其中R不是H時，R為
25.如權利要求24所述的製品，其中Y為O或NR2。
26.如權利要求24所述的製品，其中m為2。
27.如權利要求24所述的製品，其中Y為O或NR2，m為2。
28.如權利要求24所述的製品，其中m為1。
29.如權利要求1所述的製品，其中至少有一次出現的R1為烷基。
30.如權利要求1所述的製品，其中R1每次出現時均為烷基。
31.如權利要求1所述的製品，其中R1為烷基，R2為H。
32.如權利要求1所述的製品，其中R1和R2為烷基。
33.如權利要求1所述的製品，其中至少有一次出現的R1為烯基。
34.如權利要求1所述的製品，其中至少有一次出現的R1為烯基。
35.如權利要求1所述的製品，其中R不是H時，R為Ra，並且其中Y為O或NH。
36.如權利要求35所述的製品，其中Y為O。
37.如權利要求35所述的製品，其中Y為NH。
38.如權利要求35所述的製品，其中R1為烷基。
39.如權利要求38所述的製品，其中R1為C10-30烷基。
40.如權利要求39所述的製品，其中R1為C12烷基。
41.如權利要求35所述的製品，其中n為2。
42.如權利要求41所述的製品，其中Xa每次出現均為C2亞烷基，且Xb為C2亞烷基。
43.如權利要求35所述的製品，其中m為2。
44.如權利要求1所述的製品，其中n為2，且R不是H時，R為Ra。
45.如權利要求44所述的製品，其中R1為烷基。
46.如權利要求45所述的製品，其中R1為C10-18烷基。
47.如權利要求46所述的製品，其中R1為C12烷基。
48.如權利要求44所述的製品，其中Y為O。
49.如權利要求44所述的製品，其中Y為NH。
50.如權利要求44所述的製品，其中Xa每次出現均為C2亞烷基，且Xb為C2亞烷基。
51.如權利要求44所述的製品，其中m為2。
52.權利要求1的製品，其中NR中的至少一個R為H，且R不是H時，R為Ra，並且其中Y為O或NH。
53.如權利要求52所述的製品，其中Y為O。
54.如權利要求52所述的製品，其中Y為NH。
55.如權利要求52所述的製品，其中R1為烷基。
56.如權利要求55所述的製品，其中R1為C10-30烷基。
57.如權利要求56所述的製品，其中R1為C12烷基。
58.如權利要求52所述的製品，其中n為2。
59.如權利要求58所述的製品，其中Xa每次出現均為C2亞烷基且Xb為C2亞烷基。
60.如權利要求52所述的製品，其中m為2。
61.如權利要求1所述的製品，其中n為2，NR中的至少一個R為H，且R不是H時，R為Ra，並且其中Y為O或NH。
62.如權利要求61所述的製品，其中R1為烷基。
63.如權利要求62所述的製品，其中R1為C10-18烷基。
64.如權利要求63所述的製品，其中R1為C12烷基。
65.如權利要求61所述的製品，其中Y為O。
66.如權利要求61所述的製品，其中Y為NH。
67.如權利要求61所述的製品，其中Xa每次出現均為C2亞烷基，且Xb為C2亞烷基。
68.如權利要求61所述的製品，其中m為2。
69.如權利要求1所述的製品，其中NR2中的至少一個R為H，R為Ra，並且其中Y為O或NH。
70.如權利要求69所述的製品，其中Y為O。
71.如權利要求69所述的製品，其中Y為NH。
72.如權利要求69所述的製品，其中R1為烷基。
73.如權利要求72所述的製品，其中R1為C10-30烷基。
74.如權利要求73所述的製品，其中R1為C12烷基。
75.如權利要求69所述的製品，其中n為2。
76.如權利要求69所述的製品，其中Xa每次出現均為C2亞烷基，且Xb為C2亞烷基。
77.如權利要求69所述的製品，其中m為2。
78.如權利要求1所述的製品，其中n為2，NR2中的至少一個R為H，R為Ra，並且其中Y為O或NH。
79.如權利要求78所述的製品，其中R1為烷基。
80.如權利要求79所述的製品，其中R1為C10-18烷基。
81.如權利要求80所述的製品，其中R1為C12烷基。
82.如權利要求78所述的製品，其中Y為O。
83.如權利要求78所述的製品，其中Y為NH。
84.如權利要求78所述的製品，其中Xa每次出現均為C2亞烷基，且Xb為C2亞烷基。
85.如權利要求78所述的製品，其中m為2。
86.如權利要求1所述的製品，其中n為0，X為亞丙基。
87.如權利要求86所述的製品，其中一個R為H。
88.如權利要求86所述的製品，其中R不是H時，R為Ra。
89.如權利要求86所述的製品，其中R1為烷基。
90.如權利要求89所述的製品，其中R1為C10-30烷基。
91.如權利要求90所述的製品，其中R1為C12烷基。
92.如權利要求86所述的製品，其中Y為O。
93.如權利要求86所述的製品，其中Y為NH。
94.如權利要求86所述的製品，其中m為2。
95.如權利要求1所述的製品，其中
n為2；
Xa在每次出現時均為C2亞烷基，且Xb為C2亞烷基；並且
其中
各個R為H或式
表示的Ra；
m為2；
Y為NH或O；
R1為C12烷基。
96.如權利要求95所述的製品，其中至少80％的式(I)化合物分子為一種結構異構體。
97.如權利要求95所述的製品，其中Y為NH。
98.如權利要求97所述的製品，其中至少80％的式(I)化合物分子為一種結構異構體。
99.如權利要求98所述的製品，其中R在5次出現中為Ra。
100.如權利要求95所述的製品，其中在至少80％的式(I)化合物分子中，R在5次出現中為Ra。
101.如權利要求100所述的製品，其中Y為NH。
102.如權利要求95所述的製品，其中式(I)的化合物為其無機鹽或其有機鹽。
103.如權利要求102所述的製品，其中式(I)的化合物為其氫滷酸鹽。
104.如權利要求103所述的製品，其中式(I)的化合物為其鹽酸鹽。
105.如權利要求1所述的製品，其中所述鹽酸鹽包括的範圍為從1當量HCl至n+2當量HCl。
106.如權利要求1所述的製品，其包含式(I)化合物的水合物。
107.如權利要求1所述的製品，其中式(I)的化合物為有機酸的鹽。
108.如權利要求107所述的製品，其中所述鹽為乙酸鹽。
109.如權利要求108所述的製品，其中所述乙酸鹽包括的範圍為從1當量乙酸鹽到n+2當量乙酸鹽。
110.如權利要求107所述的製品，其中所述鹽為甲酸鹽。
111.如權利要求108所述的製品，其中所述甲酸鹽包括的範圍為從1當量甲酸鹽到n+2當量甲酸鹽。
112.如權利要求1所述的製品，其中R1包含烯基部分。
113.如權利要求112所述的製品，其中R1包含順式雙鍵。
114.如權利要求1所述的製品，其中所述製品包含小於11重量％的
式(III)
其中，X和n如權利要求1中式(I)的定義。
115.如權利要求1所述的製品，其中所述製品包含小於90重量％的
式(IV)
其中，Y和R1如權利要求1中式(I)的定義。
116.如權利要求1所述的製品，其包含多種式(I)的化合物。
117.如權利要求116所述的製品，其包含下式化合物的混合物
式(I′) 式(I″)
其中，在式(I′)中，至少5個R基團為Ra。
118.如權利要求117所述的製品，其中式(I′)和式(I″)的存在比例為約1∶2～約2∶1。
119.式(II)化合物的製備方法，
式(II)
其中
Xa和Xb在每次出現時分別獨立地為C1-6亞烷基；
n為0、1、2、3、4或5；且
其中
每個R分別獨立地為H或下式表示的Ra
m為2；
Y為O、NR2或S；
R1為烷基或烯基；
R2為H或C烷基或烯基；
所述方法包括在存在促進劑的條件下使式(III)的化合物
式(III)
與式(IV)的化合物
式(IV)
反應。
120.式(II)化合物的製備方法，
式(II)
其中
Xa和Xb在每次出現時分別獨立地為C1-6亞烷基；
n為0、1、2、3、4或5；且
其中
每個R分別獨立地為H或下式表示的Ra
m為2；
Y為O、NR2或S；
R1為烷基或烯基；
R2為H或C烷基或烯基；
所述方法包括在存在淬滅劑的條件下使式(III)的化合物
式(III)
與式(IV)的化合物
式(IV)
反應。
121.式(II)化合物的製備方法，
式(II)
其中
Xa和Xb在每次出現時分別獨立地為C1-6亞烷基；
n為0、1、2、3、4或5；且
其中
每個R分別獨立地為H或下式表示的Ra
m為2；
Y為O、NR2或S；
R1為烷基或烯基；
R2為H或烷基或烯基；
所述方法包括使式(III)的化合物
式(III)
與式(IV)的化合物反應，
式(IV)
其中，所述反應混合物包含約0.8～約1.2摩爾當量的式(III)化合物以及約3.8～約6.5摩爾當量的式(IV)化合物。
122.如權利要求121所述的方法，其中所述反應混合物包含約0.8～約1.2摩爾當量的式(III)的化合物以及約5.5～約6.5摩爾當量的式(IV)化合物。
123.如權利要求122所述的方法，其中所述反應混合物包含約1摩爾當量的式(III)的化合物以及約6摩爾當量的式(IV)化合物。
124.如權利要求121所述的方法，其中所述反應混合物包含約1摩爾當量的式(III)化合物以及約5摩爾當量的式(IV)化合物。
125.式(II)化合物的製備方法，
式(II)
其中
Xa和Xb在每次出現時分別獨立地為C1-6亞烷基；
n為0、1、2、3、4或5；且
其中
每個R分別獨立地為H或下式表示的Ra
m為2；
Y為O、NR2或S；
R1為烷基或烯基；
R2為H或烷基或烯基；
所述方法包括在存在硼酸和水的條件下使式(III)的化合物
式(III)
與式(IV)的化合物反應的兩步工藝，
式(IV)
其中，第一步涉及包含約0.8～約1.2摩爾當量的式(III)化合物以及約3.8～約4.2摩爾當量的式(IV)化合物的反應混合物，第二步涉及添加約0.8～1.2摩爾當量的式(IV)化合物。
126.式(II)化合物的製備方法，
式(II)
其中
Xa和Xb在每次出現時分別獨立地為C1-6亞烷基；
n為0、1、2、3、4或5；且
其中
每個R分別獨立地為H或下式表示的Ra
m為2；
Y為O、NR2或S；
R1為烷基或烯基；
R2為H或烷基或烯基；
所述方法包括使式(III)化合物
式(III)
與式(IV)化合物反應，
式(IV)
並從反應混合物中分離至少一種式(II)的結構異構體，從而提供包含式(II)的結構異構體的基本純化的製品。
127.如權利要求126所述的方法，其中使用色譜分離法是從反應混合物中分離式(II)的結構異構體。
128.如權利要求127所述的方法，其中所述色譜分離法是使用快速矽膠柱色譜分離異構體。
129.如權利要求128所述的方法，其中所述色譜分離法是使用矽膠通過重力分離異構體。
130.如權利要求128所述的方法，其中所述色譜分離法是使用移動床色譜分離異構體。
131.如權利要求128所述的方法，其中所述色譜分離法是使用液相色譜(LC)分離異構體。
132.如權利要求131所述的方法，其中所述色譜分離法是使用正相HPLC分離異構體。
133.如權利要求131所述的方法，其中所述色譜分離法是使用反相HPLC分離異構體。
134.如權利要求126所述的方法，其中所述基本純化的製品包含至少約80％的式(II)的結構異構體。
135.如權利要求134所述的方法，其中所述基本純化的製品包含至少約90％的式(II)的結構異構體。
136.如權利要求135所述的方法，其中所述基本純化的製品包含至少約95％的式(II)的結構異構體。
137.式(V)化合物或其藥學上可接受的鹽的製備方法，
式(V)
其中
Xa和Xb在每次出現時分別獨立地為C1-6亞烷基；
n為0、1、2、3、4或5；且
其中
每個R分別獨立地為H或下式表示的Ra
m為1；
Y為O、NR2或S；
R1為烷基或烯基；
R2為H或烷基或烯基；
所述方法包括使式(III)化合物
式(III)
與式(VI)化合物反應，
Q＝Cl或Br或I
式(VI)
以提供式(V)的化合物或其藥學上可接受的鹽。
138.如權利要求137所述的方法，其中所述其藥學上可接受的鹽為式(V)化合物的鹽酸鹽。
139.式(X)的化合物和其藥學上可接受的鹽，
式(X)
其中
R1和R2分別獨立地為H、任選被1-4個R5取代的C1-C6烷基、任選被1-4個R5取代的C2-C6烯基、或C(NR6)(NR6)2；
R3和R4分別獨立地為烷基、烯基、炔基，並分別任選地被氟、氯、溴或碘取代；
L1和L2分別獨立地為-NR6C(O)-、-C(O)NR6-、-OC(O)-、-C(O)O-、-S-S-、-N(R6)C(O)N(R6)-、-OC(O)N(R6)-、-N(R6)C(O)O-、-O-N＝C-、OR、-OC(O)NH-N＝C-或-NHC(O)NH-N＝C-；
L1-R3和L2-R4可共同形成縮醛、縮酮或原酸酯，其中R3和R4的定義如上所述並且也可以為H或苯基；
R5為氟、氯、溴、碘、-OR7、-N(R8)(R9)、-CN、SR10、S(O)R10、S(O)2R10；
R6為H、C1-C6烷基；
R7為H或C1-C6烷基；
各個R8和R9獨立地為H或C1-C6烷基；
R10為H或C1-C6烷基；
m為1、2、3、4、5或6；
n為0、1、2、3、4、5或6。
140.如權利要求139所述的化合物，其中所述化合物為其無機鹽。
141.如權利要求140所述的化合物，其中所述化合物為其氫滷酸鹽。
142.如權利要求141所述的化合物，其中所述化合物為其鹽酸鹽。
143.如權利要求139所述的化合物，其中所述化合物為其有機鹽。
144.如權利要求139所述的化合物，其中R1和R2分別獨立地為C1-C3烷基。
145.如權利要求139所述的化合物，其中R1為甲基。
146.如權利要求139所述的化合物，其中R2為甲基。
147.如權利要求139所述的化合物，其中R1和R2均為甲基。
148.如權利要求139所述的化合物，其中R1為H、甲基、乙基、異丙基或2-羥乙基。
149.如權利要求148所述的化合物，其中R2為H。
150.如權利要求148所述的化合物，其中R2為甲基。
151.如權利要求148所述的化合物，其中R2為乙基。
152.如權利要求148所述的化合物，其中R2為丙基。
153.如權利要求148所述的化合物，其中R2為異丙基。
154.如權利要求139所述的化合物，其中R2為H、甲基、乙基、丙基或異丙基。
155.如權利要求139所述的化合物，其中R1為H、甲基、乙基、異丙基或2-羥乙基，R2為H、甲基、乙基、丙基或異丙基。
156.如權利要求139所述的化合物，其中m為1。
157.如權利要求139所述的化合物，其中n為1。
158.如權利要求139所述的化合物，其中m和n均為1。
159.如權利要求139所述的化合物，其中L1為-NR6C(O)-或-C(O)NR6-。
160.如權利要求139所述的化合物，其中L1為-OC(O)-或-C(O)O-。
161.如權利要求139所述的化合物，其中L1為S-S-。
162.如權利要求139所述的化合物，其中L1為-N(R6)C(O)N(R6)-。
163.如權利要求139所述的化合物，其中L1為-OC(O)N(R6)-或-N(R6)C(O)O-。
164.如權利要求139所述的化合物，其中L1為-O-N＝C-。
165.如權利要求139所述的化合物，L1為-OC(O)NH-N＝C-或-NHC(O)NH-N＝C-。
166.如權利要求139所述的化合物，其中L2為-NR6C(O)-或-C(O)NR6-。
167.如權利要求139所述的化合物，其中L2為-OC(O)-或-C(O)O-。
168.如權利要求139所述的化合物，其中L2為S-S-。
169.如權利要求139所述的化合物，其中L2為-N(R6)C(O)N(R6)-。
170.如權利要求139所述的化合物，其中L2為-OC(O)N(R6)-或-N(R6)C(O)O-。
171.如權利要求139所述的化合物，其中L2為-O-N＝C-。
172.如權利要求139所述的化合物，L2為-OC(O)NH-N＝C-或-NHC(O)NH-N＝C-。
173.如權利要求139所述的化合物，其中L1和L2均為-NR6C(O)-或-C(O)NR6-。
174.如權利要求139所述的化合物，其中L1和L2均為-OC(O)-或-C(O)O-。
175.如權利要求139所述的化合物，其中L1和L2均為S-S-。
176.如權利要求139所述的化合物，其中L1和L2均為-N(R6)C(O)N(R6)-。
177.如權利要求139所述的化合物，其中L1和L2均為-OC(O)N(R6)-或-N(R6)C(O)O-。
178.如權利要求139所述的化合物，其中L1為NR6C(O)-，L2為-S-S-。
179.如權利要求139所述的化合物，其中L1為-OC(O)-，L2為-S-S-。
180.如權利要求139所述的化合物，其中L1為-OC(O)N(R6)-或-N(R6)C(O)O-，L2為-S-S-。
181.如權利要求139所述的化合物，其中L1為-N(R6)C(O)N(R6)-，L2為-S-S-。
182.如權利要求139所述的化合物，其中L1-R3和L2-R4共同構成縮醛、縮酮或原酸酯。
183.如權利要求139所述的化合物，其中R3和R4分別獨立地為烷基。
184.如權利要求139所述的化合物，其中R3和R4均為C6-C28烷基。
185.如權利要求184所述的化合物，其中L1和L2分別獨立地為-S-S-、-OC(O)N(R6)-或-N(R6)C(O)O-。
186.如權利要求139所述的化合物，其中R3為烷基。
187.如權利要求139所述的化合物，其中R4為烷基。
188.如權利要求139所述的化合物，其中R3為烯基。
189.如權利要求139所述的化合物，其中R4為烯基。
190.如權利要求139所述的化合物，其中R3和R4分別獨立地為烯基。
191.如權利要求190所述的化合物，其中R3和R4分別獨立地為C6-C30烯基。
192.如權利要求190所述的化合物，其中R3和R4均為相同的烯基。
193.如權利要求139所述的化合物，其中每個R3和R4包含2個雙鍵基團。
194.如權利要求193所述的化合物，其中所述雙鍵中的至少一個具有Z構型。
195.如權利要求193所述的化合物，其中所述兩個雙鍵均具有Z構型。
196.如權利要求190所述的化合物，其中R3和R4中的至少一個為下式(II)結構
式(II)
其中
x為1～8的整數；且
y為1～10的整數。
197.如權利要求196所述的化合物，其中R3和R4均為式(II)。
198.如權利要求190所述的化合物，其中至少一個所述雙鍵具有E構型。
199.如權利要求198所述的化合物，其中所述兩個雙鍵均具有E構型。
200.如權利要求198所述的化合物，其中R1和R2中的至少一個為下式(III)結構
式(III)
其中
x為1～8的整數；且
y為1～10的整數。
201.如權利要求200所述的化合物，其中R1和R2均為式(III)。
202.如權利要求190所述的化合物，其中R1和R2各包含三個雙鍵。
203.如權利要求202所述的化合物，其中至少一個所述雙鍵具有Z構型。
204.如權利要求203所述的化合物，其中至少兩個所述雙鍵具有Z構型。
205.如權利要求204所述的化合物，其中所述三個雙鍵均具有Z構型。
206.如權利要求190所述的化合物，其中R1和R2中的至少一個為下式(IV)結構
式(IV)
其中
x為1～8的整數；且
y為1～10的整數。
207.如權利要求206所述的化合物，其中R1和R2均為式(IV)。
208.如權利要求190所述的化合物，其中至少一個所述雙鍵具有E構型。
209.如權利要求208所述的化合物，其中至少兩個所述雙鍵具有E構型。
210.如權利要求209所述的化合物，其中所述三個雙鍵均具有E構型。
211.如權利要求210所述的化合物，其中R1和R2中的至少一個為下式(IV)結構
式(V)
其中
x為1～8的整數；且
y為1～10的整數。
212.如權利要求212所述的化合物，其中R1和R2均為式(V)。
213.一種包含式(X)化合物的製品。
214.式(X)化合物的製備方法，
式(X)
其中
R1和R2分別獨立地為C1-C6烷基，其任選被1-4個R5取代；
R3為烷基、烯基、炔基；
L1為-OC(O)-；
R5為-OR7、-N(R8)(R9)、-CN、SR10、S(O)R10、S(O)2R10；
R6為H、C1-C6烷基；
R7為H或C1-C6烷基；
R8和R9分別獨立地為H或C1-C6烷基；
R10為H或C1-C6烷基；
m和n分別獨立地為1、2、3、4、5或6；
所述方法包括在存在偶聯劑的條件下使式(VI)化合物
式(VI)
與式(VII)化合物反應，
式(VII)
從而提供式(X)化合物。
215.如權利要求214所述的方法，其中所述偶聯劑為碳二亞胺。
216.如權利要求215所述的方法，其中所述偶聯劑為EDCI。
217.形成締合複合物的方法，其包括在存在緩衝劑的條件下，使權利要求1或權利要求213的脂質製品與治療劑相接觸，其中所述緩衝劑
具有足夠的強度以使式I分子中所有的氨基充分質子化；
以100～300mM存在；
其存在濃度提供的質子化作用顯著強於20mM的相同緩衝劑。
218.通過權利要求217的方法製備的締合複合物。
219.形成締合複合物的方法，其包括在包含至少約90％乙醇的混合物中，使權利要求1或權利要求213的脂質製品與治療劑相接觸，並快速混合所述脂質製品與所述治療劑，從而提供直徑小於約200uM的顆粒。
220.如權利要求219所述的方法，其中所述顆粒的直徑小於約50uM。
221.形成締合複合物的方法，其包括在存在緩衝劑的條件下，使權利要求1或權利要求213的脂質製品與治療劑相接觸，其中所述緩衝劑的濃度為約100mM～約300mM。
222.締合複合物，其包含權利要求1或權利要求213的製品和核酸。
223.如權利要求222所述的締合複合物，其還包含聚乙二醇化的脂質。
224.如權利要求222所述的締合複合物，其還包含結構性部分。
225.如權利要求224所述的締合複合物，其中所述結構性部分為膽固醇。
226.如權利要求222所述的締合複合物，其中所述核酸為siRNA。
227.如權利要求226所述的締合複合物，其中所述核酸為經修飾而具有降解抗性的siRNA。
228.如權利要求226所述的締合複合物，其中所述核酸為通過多糖骨架修飾而被修飾的siRNA。
229.如權利要求226所述的締合複合物，其中所述siRNA靶向一個或多個目的基因。
230.如權利要求229所述的締合複合物，其中所述一個或多個目的基因為在肝臟中內源表達的基因。
231.如權利要求230所述的締合複合物，其中所述目的基因為apoB。
232.如權利要求230所述的締合複合物，其中所述目的基因為FVII。
233.如權利要求230所述的締合複合物，其中所述目的基因為PCSK9。
234.如權利要求230所述的締合複合物，其中所述目的基因為VEGF。
235.如權利要求230所述的締合複合物，其中所述目的基因為KSP(eg5)。
236.如權利要求230所述的締合複合物，其中所述目的基因為鐵調素。
237.如權利要求230所述的締合複合物，其中所述目的基因為HCV。
238.如權利要求222所述的締合複合物，其中所述核酸為單鏈核酸或其衍生物。
239.如權利要求238所述的締合複合物，其中所述核酸為反義核酸。
240.如權利要求238所述的締合複合物，其中所述核酸為小RNA。
241.如權利要求238所述的締合複合物，其中所述核酸為小RNA的反義寡核苷酸(antagomir)。
242.權利要求241所述的締合複合物，其中所述核酸針對於小RNA-122。
243.權利要求241所述的締合複合物，其中所述核酸針對於小RNA-181。
244.權利要求241所述的締合複合物，其中所述核酸針對於小RNA-155。
245.權利要求241所述的締合複合物，其中所述核酸針對於小RNA-16。
246.如權利要求222所述的締合複合物，其還包含結構性部分和聚乙二醇化的脂質，其中權利要求1或權利要求213所述的製品、結構性部分、聚乙二醇化的脂質和核酸的重量比為(8-22)∶(0.4-10)∶(0.4-12)∶(0.4-2.2)。
247.如權利要求246所述的締合複合物，其中所述結構性部分為膽固醇。
247.如權利要求247所述的締合複合物，其中所述比例為(10-20)∶(0.5-8.0)∶(5-10)∶(0.5-2.0)。
248.如權利要求248所述的締合複合物，其中所述比例為15∶0.8∶7∶1。
249.如權利要求246所述的締合複合物，其中所述脂質體的平均直徑在10nm～750nm之間。
250.如權利要求249所述的締合複合物，其中所述締合複合物的平均直徑在30nm～200nm之間。
251.如權利要求250所述的締合複合物，其中所述締合複合物的平均直徑在50nm～100nm之間。
252.如權利要求222所述的締合複合物，其中所述製品少於未反應脂質的15重量％。
253.藥學上可接受的組合物，其包含權利要求1或權利要求213所述的製品。
254.藥學上可接受的組合物，其包含權利要求222所述的締合複合物。
255.哺乳動物的治療方法，其包括向所述哺乳動物施用治療量的權利要求222所述的締合複合物。
256.如權利要求1所述的製品，其中所述製品包含下式之一或下式的混合物，其中除非在下式中有明確說明，否則R不是H，
257.如權利要求1所述的製品，其中所述製品基本由下式之一或下式的混合物組成，
258.如權利要求257所述的製品，其中R均為
259.如權利要求258所述的製品，其中R均為
260.如權利要求256或257所述的製品，其中R1為C10-C18烷基(如C12烷基)或C10-C30烯基。
261.如權利要求256所述的製品，其中R為
262.如權利要求261所述的製品，其中R1為C10-C18烷基。
263.如權利要求261所述的製品，其中R1為C12烷基，R2為H。
264.如權利要求253所述的製品，其中式(I)如下所示，其中除非有明確說明，否則R不是H，
R為
265.如權利要求264所述的製品，其中R1為C12烷基，R2為H。
266.如權利要求256所述的製品，其中式(I)如下所示，其中除非有明確說明，否則R不是H，
R為
267.如權利要求266所述的製品，其中R1為C12烷基，R2為H。
268.如權利要求1所述的製品，其中式(I)如下所示，其中除非有明確說明，否則R不是H，
269.如權利要求268所述的製品，其中R為
270.如權利要求269所述的製品，其中R1為C10-C18烷基或C10-C30烯基。
271.如權利要求268所述的製品，其中R為
272.如權利要求271所述的製品，其中R1為C10-C18烷基或C10-C30烯基，R2為H。
271.包含多種脂質部分和治療劑的締合複合物的形成方法，所述方法包括
在乙醇和NaOAc緩衝水溶液中混合多種脂質部分，從而獲得顆粒；和
向所述顆粒添加治療劑，從而形成所述締合複合物。
272.如權利要求271所述的方法，其中所述脂質部分以存在於100％乙醇溶液中而提供。
273.如權利要求271所述的方法，其中所述多種脂質部分包含陽離子脂質。
274.如權利要求273所述的方法，其中所述陽離子脂質為權利要求1或權利要求213所述的脂質。
275.如權利要求274所述的方法，其中所述陽離子脂質為以下脂質之一或其混合物
276.如權利要求271所述的方法，其中所述多種脂質部分包括PEG-脂質。
277.如權利要求276所述的方法，其中所述PEG-脂質具有以下結構
其中，
L1和L2分別獨立地為鍵或C(O)；
R1和R2分別獨立地為烷基、烯基或炔基；其每一個任選被一個或多個取代基取代；
X為-C(O)NH-、C(S)NH、-C(O)C1-3烷基C(O)NH-；或-C(O)C1-3烷基C(O)O-；
m為0-11的整數，且
n為1-500的整數。
278.如權利要求277所述的方法，其中所述PEG-脂質為
279.如權利要求271所述的方法，其中所述多種脂質部分包括結構性脂質。
280.如權利要求279所述的方法，其中所述結構性脂質為膽固醇。
281.如權利要求271所述的方法，其還包括擠出包含脂質的顆粒。
282.如權利要求271所述的方法，其中在添加治療劑之前擠出包含脂質的顆粒。
283.如權利要求271所述的方法，其中所述治療劑為核酸。
284.如權利要求283所述的方法，其中所述核酸為siRNA。
284.如權利要求283所述的方法，其中所述核酸為經修飾而具有降解抗性的siRNA。
285.如權利要求283所述的方法，其中所述核酸為通過多糖骨架修飾而被修飾的siRNA。
286.如權利要求283所述的方法，其中siRNA與親脂部分結合。
287.如權利要求284所述的方法，其中所述siRNA靶向一個或多個目的基因。
288.如權利要求287所述的方法，其中所述一個或多個目的基因為在肝臟中內源表達的基因。
289.如權利要求288所述的方法，其中所述目的基因為apoB。
290.如權利要求288所述的方法，其中所述目的基因為FVII。
291.如權利要求288所述的方法，其中所述目的基因為PCSK9。
292.如權利要求288所述的方法，其中所述目的基因為VEGF。
293.如權利要求288所述的方法，其中所述目的基因為KSP(eg5)。
294.如權利要求288所述的方法，其中所述目的基因為鐵調素。
295.如權利要求288所述的方法，其中所述目的基因為HCV。
296.如權利要求283所述的方法，其中所述核酸為單鏈核酸或其衍生物。
297.如權利要求296所述的方法，其中所述核酸為反義核酸。
298.如權利要求296所述的方法，其中所述核酸為小RNA。
299.如權利要求296所述的方法，其中所述核酸為反義小RNA(antagomir)。
300.如權利要求271所述的方法，其中所述締合複合物包含陽離子脂質、結構性脂質、PEG-脂質和核酸。
301.如權利要求300所述的方法，其中所述陽離子脂質、結構性脂質、PEG-脂質和核酸的摩爾比為(36-48)∶(42-54)∶(6-14)。
302.如權利要求301所述的方法，其中所述陽離子脂質、結構性脂質、PEG-脂質和核酸的摩爾比為(38-46)∶(44-52)∶(8-12)。
303.如權利要求302所述的方法，其中所述陽離子脂質、結構性脂質、PEG-脂質和核酸的摩爾比為約42∶48∶10。
304.如權利要求271所述的方法，其中總賦形劑與核酸的重量比小於約15∶1。
305.如權利要求304所述的方法，其中總賦形劑與核酸的重量比為約10∶1。
306.如權利要求305所述的方法，其中總賦形劑與核酸的重量比為約7.5∶1。
307.如權利要求305所述的方法，其中總賦形劑與核酸的重量比為約5∶1。
308.如權利要求300所述的方法，其中所述陽離子脂質具有以下結構
所述PEG-脂質具有以下結構
所述結構性脂質為膽固醇。
309.如權利要求308所述的方法，其中所述陽離子脂質、結構性脂質和PEG-脂質的摩爾比為(38-46)∶(44-52)∶(8-12)。
310.如權利要求309所述的方法，其中所述陽離子脂質、結構性脂質、PEG-脂質和核酸的摩爾比為約42∶48∶10。
310.如權利要求308所述的方法，其中總賦形劑與核酸的重量比小於約15∶1。
311.如權利要求310所述的方法，其中總賦形劑與核酸的重量比為約10∶1。
312.如權利要求310所述的方法，其中總賦形劑與核酸的重量比為約7.5∶1。
313.如權利要求310所述的方法，其中總賦形劑與核酸的重量比為約5∶1。
314.通過權利要求271-313中任一項的方法製備的締合複合物。
315.締合複合物，其包含陽離子脂質、結構性脂質、PEG-脂質和核酸，其中所述陽離子脂質為以下脂質之一或其混合物
所述PEG-脂質具有以下結構
所述結構性脂質為膽固醇。
316.如權利要求315所述的締合複合物，其中所述核酸為siRNA。
317.如權利要求315所述的締合複合物，其中所述陽離子脂質具有下式結構
318.如權利要求315所述的方法，其中所述陽離子脂質、結構性脂質、PEG-脂質和核酸的摩爾比為(36-48)∶(42-54)∶(6-14)。
319.如權利要求318所述的方法，其中所述陽離子脂質、結構性脂質、PEG-脂質和核酸的摩爾比為(38-46)∶(44-52)∶(8-12)。
320.如權利要求319所述的方法，其中所述陽離子脂質、結構性脂質、PEG-脂質和核酸的摩爾比為約42∶48∶10。
321.如權利要求315所述的方法，其中總賦形劑與核酸的重量比小於約15∶1。
322.如權利要求321所述的方法，其中總賦形劑與核酸的重量比為約10∶1。
323.如權利要求321所述的方法，其中總賦形劑與核酸的重量比為約7.5∶1。
324.如權利要求321所述的方法，其中總賦形劑與核酸的重量比為約5∶1。
325.式(XV)的化合物，
式(XV)
其中，
L1和L2分別獨立地為連接鍵或C(O)；
R1和R2分別獨立地為烷基、烯基或炔基；其每一個任選被一個或多個取代基取代；
X為-C(O)NH-、-C(S)NH、-C(O)C1-3烷基C(O)NH-；或-C(O)C1-3烷基C(O)O-；
m為0～11的整數，且
n為1～500的整數。
326.如權利要求325所述的化合物，其中L1和L2均為連接鍵。
327.如權利要求325所述的化合物，其中L1和L2均為C(O)。
328.如權利要求325所述的化合物，其中R1和R2分別獨立地為烷基。
329.如權利要求328所述的化合物，其中R1和R2分別獨立地為C6-C28烷基，例如C10-C18烷基，如C14烷基。
330.如權利要求325所述的化合物，其中R1和R2均為烷基，例如長度相同的直鏈烷基，如C6-C28烷基，如C10-C18烷基，如C14烷基或C16烷基。
331.如權利要求330所述的化合物，其中R1和R2分別獨立地為C14烷基。
332.如權利要求325所述的化合物，其中式XV表示外消旋混合物。
333.如權利要求325所述的化合物，其中式XV表示光學純的『R』異構體(例如，具有R對映異構體過量的化合物，如至少約95％ee，或大於97％ee，如98％ee或99％ee)。
334.如權利要求325所述的化合物，其中式XV表示光學純的『S』異構體(例如，具有R對映異構體過量的化合物，如至少約95％ee，或大於97％ee，如98％ee或99％ee)。
335.如權利要求325所述的化合物，其中R1和R2分別獨立地為烯基，例如R1和R2分別獨立地為C6-C30烯基，或R1和R2為相同的烯基。
336.如權利要求335所述的化合物，其中每個R1和R2包含單個雙鍵，例如為E或Z構型的單個雙鍵。
337.如權利要求335所述的化合物，其中每個R1和R2包含兩個雙鍵。
338.如權利要求325所述的化合物，其中X為-C(O)NH-，從而提供下式(XV′)的化合物
式(XV′)。
339.如權利要求325所述的化合物，其中X為-C(O)C1-3烷基C(O)O-。
340.如權利要求325所述的化合物，其中m為1-10的整數，例如2-4的整數或整數2。
341.如權利要求325所述的化合物，其中n為1-500的整數，例如40-400、100-350、40-50或42-47的整數。
342.如權利要求325所述的化合物，其中所述化合物為式(XV′)的化合物，
式(XV′)
其中，L1和L2均為連接鍵。
343.如權利要求342所述的化合物，其中R1和R2分別獨立地為烷基，例如為C6-C28烷基，如C10-C18烷基，如C14烷基。
344.如權利要求343所述的化合物，其中R1和R2均為烷基，例如長度相同的直鏈烷基，如C6-C28烷基，如C10-C18烷基，如C14烷基或C16烷基。
345.如權利要求342所述的化合物，其中m為1-10的整數，例如2-4的整數或整數2。
346.如權利要求342所述的化合物，其中n為1-500的整數，例如40-400或40-50的整數。
347.如權利要求342所述的化合物，其中所述化合物為式(XV′)的化合物，其中L1和L2均為連接鍵，R1和R2均為烷基(例如C6-C28烷基，如C10-C18烷基，優選C14烷基)，n為約40～～400的整數。
348.如權利要求325所述的化合物，其中所述化合物具有下式(XVI)的結構
式(XVI)
其中，重複PEG部分的平均分子量為2000，n值在42～47之間。
349.如權利要求348所述的化合物，其中所述式XVI的化合物為具有優選的絕對構型『R』的立體異構體(例如，R對映異構體過量90％、95％、97％、98％、99％)。
全文摘要
本發明描述了用於施予基於核酸的治療劑的組合物和方法，所述組合物例如締合複合物，如脂質體和脂質複合物(lipoplexes)。
文檔編號A61K31/70GK101616677SQ200780044738
公開日2009年12月30日 申請日期2007年10月3日 優先權日2006年10月3日
發明者穆希亞·曼努哈蘭, 卡蘭託塔赫爾·G·拉吉夫, 埃金·阿肯克, K·納拉亞南納爾·加亞普拉卡什, 穆圖薩米·傑拉曼, 馬丁·A·邁爾 申請人:阿爾尼拉姆醫藥品有限公司